PL180433B1 - Białkowa faza stacjonarna do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej i sposób jej otrzymywania - Google Patents

Abstract

Białkowa faza stacjonarna do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej, która utworzonajest poprzez immobilizowanie cząsteczek białka na ziarnach nośnika krzemionkowego, znamienna tym, że na ziarnach nośnika krzemionkowego osadzona jest keratyna. 2. Sposób otrzymywania białkowej fazy stacjonarnej do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej, polegający na immobilizowaniu cząsteczek białka na ziarnach nośnika krzemionkowego, znamienny tym, że oczyszczoną keratynę rozpuszcza się w sulfotlenku dimetylu, korzystnie w proporcjachw zakresie od 1:20 do 1:25, miesza się i ogrzewa, korzystnie przez 12-36 godzin, w temperaturze 140-180°C pod chłodnicą zwrotną, a następnie w otrzymanym roztworze zawiesza się w temperaturze pokojowej krzemionkę, korzystnie w proporcji w zakresie 1,0-2,0 części wagowych krzemionki na 20 części wagowych roztworu keratyny w sulfotlenku dimetylu, po czym wkrapla się wodę korzystnie przy intensywnym mieszaniu, a następnie odsącza się osad, który przemywa się dużymi ilościami wody na przemian z acetonem i/lub izopropanolem, po czym przemyty osad suszy się, korzystnie w temperaturze pokojowej.

Description

Przedmiotem wynalazku jest białkowa faza stacjonarna do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej i sposób jej otrzymywania, przeznaczona zwłaszcza do testowania związków chemicznych, które są potencjalnymi kandydatami na leki, jak również do pomiarów względnej zdolności związków chemicznych do przechodzenia przez naskórek lub kumulowania się w nim.

Fazy stacjonarne do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej, zawierające immobilizowane na krzemionce białka znalazły szerokie zastosowanie w analityce chemicznej. Analityczna zaleta tych faz polega na zdolności do rozdziału enancjomerów związków chiralnych i wynika z chiralności naturalnych białek.

Znane są białkowe fazy stacjonarne do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej, które zawierają immobilizowane albuminy surowicy krwi ludzkiej i bydlęcej oraz ludzką kwaśną oą-glikoproteinę. Fazy te znalazły szczególne zastosowania w analizie niektórych leków chiralnych. Otrzymywane są metodami syntezy chemicznej, w wyniku której następuje utworzenie wiązań chemicznych między cząsteczką białka i ziarnem nośnika krzemionkowego.

Znane sposoby otrzymywania białkowych faz stacjonarnych do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej są skomplikowane i otrzymane znanymi sposobami te fazy sądrogie. Ponadto fazy te nie są uniwersalne i nie wykazują powinowactwa do wielu substancji chemicznych, w tym szeregu leków.

Celem wynalazku jest opracowanie nowej białkowej fazy stacjonarnej do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej, która pozwoliłaby na rozdzielanie ważnych biologicznie związków chemicznych, których dotychczas nie można było rozdzielić na znanych białkowych fazach stacjonarnych. Celem wynalazku jest również opracowanie łatwego sposobu otrzymywania tej nowej białkowej fazy stacjonarnej.

Nieoczekiwanie okazało się, że immobilizowana, na zasadzie fizycznej adsorpcji powierzchniowej, na ziarnach nośnika krzemionkowego keratyna posiada korzystne właściwości rozdzielcze.

Sposób otrzymywania immobilizowanej na ziarnach nośnika krzemionkowego keratyny według wynalazku polega na tym, że keratynę rozpuszcza się w sulfotlenku dimetylu, korzystnie w proporcjach wagowych w zakresie od 1 : 20 do 1 : 25, miesza się i ogrzewa, korzystnie przez okres 12-36 godzin, w temperaturze 140-180°C pod chłodnicą zwrotną. Następnie w otrzyma180 433 nym roztworze zawiesza się w temperaturze pokojowej krzemionkę, korzystnie w proporcji w zakresie 1,0-2,0 części wagowych krzemionki na 20 części wagowych roztworu keratyny w sulfotlenku dimetylu. Następnie wkrapla się wodę korzystnie przy intensywnym mieszaniu, po czym zbiera się na sączku osad i przemywa się wodą na przemian z acetonem i/lub izopropanolem, do uzyskania bezbarwnego przesączu. Osad suszy się korzystnie w temperaturze pokojowej. Wysuszony osad stanowi białkową fazę stacjonarną do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej.

Białkowa faza stacjonarna do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej według wynalazku jest przydatna, w szczególności do badań względnej zdolności związków do przechodzenia przez naskórek lub kumulowania się w nim. Badania te prowadzone są w przypadku leków, kosmetyków, zanieczyszczeń środowiskowych oraz niektórych środków odżywczych, zaś faza ta umożliwia szybkie i precyzyj ne badania porównawcze tego powinowactwa, co z kolei oszczędza koszty badań, a także wpływa na zmniejszenie zapotrzebowania na zwierzęta zużywane w badaniach farmakologicznych i kosmetologicznych.

Przykład. Odważa się 2,0 g keratyny oczyszczonej i przenosi do kolby okrągłodennej, po czym dodaje się do niej 40 ml sulfotlenku dimetylu i ogrzewa się na łaźni olejowej w temperaturze 160°C,podchłodnicązwrotną, mieszając intensywnie za pomocąmieszadła magnetycznego przez okres 24 godzin. Po upływie tego czasu powstały ciemnobrązowy, klarowny roztwór keratyny studzi się w temperaturze pokojowej i przesącza przez sączek membranowy z włókna szklanego. Przesącz przenosi się do kolby okrągłodennej, dodaje się do niego 3,0 g krzemionki do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej i mieszaninę miesza się za pomocą mieszadła magnetycznego. Po czym w trakcie mieszania powoli wkrapla się do zawiesiny krzemionki w roztworze keratyny około 120 ml wody oczyszczonej. Zawiesinę odsącza się na sączku membranowym i wielokrotnie płucze się wodą na zmianę z acetonem do momentu aż wypływać będzie przezroczysty przesącz. Odsączoną i przemytą zawiesinę suszy się w temperaturze pokojowej. Tak otrzymaną faząnabija się kolumnę HIBAR 12,5 cm o średnicy 4 mm przy użyciu pompy Mercka w izopropanolu przy P_max równym 300 barów.

Skuteczność otrzymanej kolumny badano przez przeprowadzenie chromatografii przy użyciu fazy, składającej się w 95% z 0,5MNaH₃P04 o pH = 4,16 i w 5% z izopropanolu. Badania te polegały na tym, że chromatografię przeprowadzono w tych samych warunkach, przepuszczając zarówno przez kolumnę z białkową fazą stacjonarną otrzymaną sposobem według wynalazku, jak i przez kolumnę z fazą krzemionkową, różne substancje. Czasy martwe wyznaczono roztworem azotynu potasowego. Detekcja odbywała się spektrofotometrycznie przy długości fali 254 nm. Zastosowano zestaw do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej firmy Waters Associates, USA.

Uzyskane wyniki zamieszczono w tabeli, w której podano współczynniki pojemnościowe retencji k = (t_R- t₀)/t₀ na obu kolumnach, gdzie t_Rjest czasem retencji oznaczanego związku, a t₀ jest czasem martwym uzyskanym po wprowadzeniu na kolumnę azotynu potasowego.

Tabela

Substancja chromatografowana	k
faza keratynowa według wynalazku	faza krzemionkowa
1	2	3
Anilina	0,23	0,35
Feniramina	2,43	7,59
Kofeina	0,57	1,01
Metoprolol	0,81	1,95
Nikotyna	1,84	4,35

180 433

c. d. tabeli

1	2	3
Prometazyna	2,34	3,70
Benzonitryl	0,60	0,49
p-Dinitrobenzen	1,41	0,64
Toluen	0,88	0,23
p-Chlorofenol	2,05	0,15
p-Cyanofenol	0,96	0,11
Fenol	0,42	0,14
p-Iodofenol	6,57	0,19
Ketoprofen	7,20	0,20
Ketorolak	3,27	0,18
Klonazepam	6,15	0,78
Kwas benzoesowy	0,47	0,18

Zwiększone powinowactwo fazy keratynowej do pochodnych fenoli oraz kwasu benzoesowego, dokumentowane przez wartości k w tabeli, dowodzi przydatności nowej fazy do szacowania potencjalnych oddziaływań substancji chemicznych ze składnikami naskórka.

Na rysunku zaś przykładowo przedstawiono chromatogramy uzyskane w wyniku analizy maleinianu feniraminy, na którym 1 przedstawia chromatogram uzyskany na białkowej fazie stacjonarnej według wynalazku, zaś 2 przedstawia chromatogram uzyskany na fazie krzemionkowej.

Na kolumnie keratynowej według wynalazku pik anionu maleinianowego występuje po około 1,75 min., a pik zasady feniraminy po około 5 min. Na kolumnie krzemionkowej pik anionu maleinianowego występuje po około 1,25 min., a pik zasady feniraminy po około 11,5 min.

Wyniki te świadczą o zwiększonym powinowactwie fazy keratynowej do analitu kwasowego i fazy krzemionkowej do analitu zasadowego. Potwierdza to, że białkowa faza stacjonarna według wynalazku ma korzystne specyficzne właściwości rozdzielcze, zwłaszcza jeśli chodzi o substancje różniące się parametrami kwasowo-zasadowymi. Faza ta zatrzymuje związki o charakterze kwasowym i obojętnym znacznie silniej niż czysta faza krzemionkowa, zaś znacznie słabiej związki zasadowe, co ma szczególne znaczenie do badań substancji aplikowanych na skórę, zwłaszcza leków i kosmetyków.

180 433

Ο

ην

Minutęs

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Białkowa faza stacjonarna do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej, która utworzona jest poprzez immobilizowanie cząsteczek białka na ziarnach nośnika krzemionkowego, znamienna tym, że na ziarnach nośnika krzemionkowego osadzona jest keratyna.
2. 2. Sposób otrzymywania białkowej fazy stacjonarnej do wysoce sprawnej chromatografii cieczowej, polegający na immobilizowaniu cząsteczek białka na ziarnach nośnika krzemionkowego, znamienny tym, że oczyszczoną keratynę rozpuszcza się w sulfotlenku dimetylu, korzystnie w proporcjach w zakresie od 1 : 20 do 1 : 25, miesza się i ogrzewa, korzystnie przez 12-36 godzin, w temperaturze 140-180°C pod chłodnicą zwrotną, a następnie w otrzymanym roztworze zawiesza się w temperaturze pokojowej krzemionkę, korzystnie w proporcji w zakresie 1,0-2,0 części wagowych krzemionki na 20 części wagowych roztworu keratyny w sulfotlenku dimetylu, po czym wkrapla się wodę korzystnie przy intensywnym mieszaniu, a następnie odsącza się osad, który przemywa się dużymi ilościami wody na przemian z acetonem i/lub izopropanolem, po czym przemyty osad suszy się, korzystnie w temperaturze pokojowej.