PL168969B1

PL168969B1 - Sposób przystosowania rozmnożonych poprzez kulturę tkankową roślin do bezpośredniego wysadzania w gruncie

Info

Publication number: PL168969B1
Application number: PL29412092A
Authority: PL
Inventors: Ferenc Foglein
Original assignee: A And F Foglein Kerteszeti Bt; A Verschoor Fa
Priority date: 1992-04-06
Filing date: 1992-04-06
Publication date: 1996-05-31
Also published as: PL294120A1

Abstract

1. Sposób przystosowania rozmnożonych poprzez kulturę tkankową roślin do bezpośredniego wysadzania w gruncie, znamienny tym, że rośliny, rozmnożone na znanej drodze poprzez kulturę tkankową, hoduje się dalej w jednym lub kilku etapach na pożywkach, których ciśnienie osmotyczne odpowiada zawartości 0,2-0,4 M sacharozy, przy czym w przypadku wieloetapowej hodowli ciśnienie osmotyczne pożywki nastawia się z etapu na etap na wyższą wartość w obrębie podanego zakresu, a otrzymane tą drogą rośliny wysadza się bezpośrednio w gruncie korzystnie oznaczając granice pól.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób przystosowania, zaaklimatyzowania rozmnożonych poprzez kulturę tkankową roślin do bezpośredniego wysadzana w gruncie.

Techniki rozmnażania roślin poprzez mikrorozmnażanie, kulturę tkankową zyskują światowe znaczenie. Polegają one w istocie na tym, że w jałowych warunkach z relatywnie małych części rośliny hoduje się kompletne rośliny na pożywkach zawierających hormony, witaminy i składniki pokarmowe. Dzięki odpowiedniemu składowi tych pożywek można uzyskać tworzenie się licznych pędów roślinnych bądź też ukorzenienie się tych powstałych pędów.

Tak ukorzenione rośliny nie są jednak odpowiednie do natychmiastowego sadzenia w ogrodzie lub w gruncie, gdyż ich struktura tkankowa jest luźna, są one wrażliwe na promieniowanie nadfioletowe, wysuszenie i na zmienną temperaturę. Doznają one oparzeń wskutek promieniowania słonecznego, tracą swą zawartość wody i wreszcie giną. Z tego powodu laboratoria kultur tkankowych zwykle dysponują cieplarnią, foliownikami lub innymi obiektami z zamkniętą przestrzenią powietrzną, albo też zajmują one przynajmniej te tzw. powierzchnie zahartowywujące (E.F. George i P.D. Sherrington: Plant Propagation by Tissue Culture, Exegetics Ltd., strona 42, Anglia, 1984).

W cieplarniach, foliownikach rośliny te stopniowo przyzwyczaja się do ostrzejszych warunków, do niższej wilgotności względnej powietrza, do silniejszych wahań temperatury i do intensywniejszego oświetlenia. Ten proces przyzwyczajania wymaga około 6-8 tygodni i przy tym ginie około 10-80% pierwotnie w laboratorium wyhodowanych roślin. Wskutek tego traci się nie tylko wiele nakładów roboczych i materiału, lecz musi się również uwzględnić to, że hartowanie w odrębnej komorze powietrznej powoduje poważne koszty. Foliownik jest nieco tańszy niż cieplarnia, jednakże eksploatowanie go w zimie i wczesną wiosną jest problematyczne.

Istnieje zatem zapotrzebowanie na sposób wytwarzania kultury tkankowej, za pomocą którego można byłoby wyhodować rośliny nadające się do natychmiastowego wysadzenia na otwartej przestrzeni. Taki sposób dotychczas nie istnieje, rozmnożone poprzez kulturę tkankową rośliny zawsze sadzi się w gruncie tylko po odpowiednim przystosowaniu.

168 969

Wynalazek wychodzi z założenia, że czynniki, oddziaływujące na roślinę w warunkach polowych, takie jak wahania temperaturowe, czasowe braki wody, opady, wiatr itp., są odpowiedzialne za powstawanie tych zahartowanych roślin, za takie zmiany, które z wyhodowanej poprzez kulturę tkankową, wrażliwej i luźną strukturę tkankową wykazującej rozsady wykształcają roślinę przybierającą habitus swego gatunku. Jeżeli wspomniane czynniki możnaby doprowadzić do działania już w toku kultury tkankowej, to nie trzeba byłoby roślin ukorzenionych na jałowej pożywce poddawać czasochłonnemu procesowi zahartowywania, czy przystosowywać do warunków gruntowych.

Zahartowywujące czynniki oczywiście mogą w kulturze tkankowej nie zostać wytworzone. Okazało się możliwe jednak ukształtowanie jednego bądź drugiego czynnika.

Wchłaniane wody przez rośliny polega na ciśnieniu osmotycznym, dokładniej: na różnicy między ciśnieniem osmotycznym gleby i ciśnieniem osmotycznym panującym w korzeniach rośliny. Izotoniczne ciśnienie rośliny w warunkach naturalnych odpowiada w przybliżeniu ciśnieniu osmotycznemu 3M roztworu cukru, w warunkach in vitro ciśnienie to jest nieco niższe i odpowiada około 0,25 M roztworowi cukru. Jeżeli panuje susza, to ciśnienie osmotyczne gleby jest większe niż ciśnienie osmotyczne w komórkach korzeni rośliny, dlatego też gleba odbiera wodę korzeniom i rośliny łakną wody. Jeżeli osmotyczne ciśnienie gleby jest większe niż izotoniczne ciśnienie roślin, to odbieranie wody może być tak silne, że złączenie poszczególnych komórek ze sobą wskutek zachodzącego we obrębie tych komórek tworzenia się protoplastów całkowicie ustaje.

Wynalazek opiera się na stwierdzeniu, że w naczyniach hodowlanych, w których na ogół panuje 100% wilgotność względna powietrza, można dla roślin wywołać stan braku wody, jeśli do pożywki wprowadzi się co najmniej jeden, do nastawiania ciśnienia osmotycznego odpowiedni dodatek, który wytwarza ciśnienie osmotyczne rzędu 0,2-0,4 M roztworu cukru, i/lub jeśli temperaturę długotrwale obniży się do temperatury 2-10°C. Obniżenie temperatury wywołuje równie braki wody w roślinie, gdyż przeponowe procesy wchłaniania wody zależą od temperatury. Drogą zmieniania obu wspomnianych czynników - ciśnienia osmotycznego i temperatury - można zahartowywujące działanie warunków naturalnych symulować już w toku kultury tkankowej i dzięki temu rośliny te nadają się do bezpośrednio następującego wysadzania w gruncie. Dla rośliny ma jednakowe znaczenie to, czy nie ma wody, czy też jest woda, której ona nie może wchłonąć: na podwyższone ciśnienie osmotyczne pożywki bądź na obniżoną temperaturę roślina nieoczekiwanie reaguje przez intensywniejsze ukorzenianie i przekształcenie swego habitusu.

Sposób przystosowania, zaaklimatyzowani rozmnożonych poprzez kulturę tkankową roślin do bezpośredniego wysadzania w gruncie polega przeto według wynalazku na tym, że rośliny, rozmnożone na znanej drodze poprzez kulturę tkankową, hoduje się dalej w jednym lub kilku etapach na pożywkach, których ciśnienie osmotyczne odpowiada zawartości 0,2-0,4 M sacharozy, przy czym w przypadku wieloetapowej hodowli ciśnienie osmotyczne pożywki nastawia się z etapu na etap na wyższą wartość w obrębie podanego zakresu, a otrzymane tą drogą rośliny wysadza się bezpośrednio w gruncie bądź w tym celu oznacza granice pól.

Wyhodowane tak rośliny nieoczekiwanie nadają się do bezpośredniego, bez żadnego hartowania, natychmiastowego wysadzania w gruncie lub do przechowywania w ciągu co najmniej 30 dni w temperaturze 2-10°C, korzystnie w ciągu 3-4 miesięcy w niskiej temperaturze 5-10°c, zwłaszcza w ciągu 30-50 dni w temperaturze 5°C.

Dodatkom, stosowanym do nastawiania ciśnienia osmotycznego, stawia się tylko dwa wymagania. Jednym z nich jest to, żeby substancja ta głównie wywierała wpływ na ciśnienie osmotyczne. Liczne naturalne oligomery i polimery, np. agar, żelatyna, mają tylko bardzo nikłe ciśnienie osmotyczne (d'Ans, Lax: Taschenbuch fur Chemiker und Physiker, 2 wyd., strona 909, Springer-Verlag Berlin-Gottigen-Heidelberg).

Jak wiadomo, ciśnienie osmotyczne zależy nie od natury stosowanej substancji, lecz od ilości cząstek obecnych w środowisku. 34,2 g sacharozy (cukru trzcinowego) w 1 litrze wody (0,1 mola) wywiera takie samo ciśnienie osmotyczne, jak 3,37 g KCl/litr, gdyż w przypadku tego ostatniego należy uwzględnić nie tylko mniejszą masę cząsteczkową, lecz również fakt, że sól ta dysocjuje i dzięki jonom chloru i jonom potasu oddzielnie jako cząstkom wnosi przyczynek

168 969 do ciśnienia osmotycznego. Okoliczności te są znane fachowcowi, a potrzebne ilości stosowanej substancji można łatwo obliczyć. Drugim wymaganiem jest to, żeby dodatek nie był fitotoksyczny. Wyklucza to np. sole sodowe.

Spośród zasadniczo stosowanych substancji korzystnymi są te, które w technice kultur tkankowych i tak stosuje się, np. sacharozę, inne cukry, cukroalkohole, sole pokarmowe, stosowane do pożywek, itp.

Ponieważ wchłanianie wody przez roślinę, polegające na ciśnieniu osmotycznym, jest zasadą dość uniwersalną, można sposób według wynalazku podobnie stosować dla drewniejących roślin i dla roślin nie wykształcających drewniejącego trzonka, pod warunkiem, że dana roślina w ogóle nadaje się do rozmnażania poprzez kulturę tkankową. Niżej wyszczególniono niektóre rośliny, na których z powodzeniem zastosowano już sposób według wynalazku: drzewa i krzewy ozdobne, np. wierzby i rododendron; gatunki warzyw, takie jak szparagi, pomidory, brokuł, cykoria, dynia, melon, kalarepa, ogórki, ziemniaki, buraki; rośliny doniczkowe, takie jak anturium, fikus, saintpaulia, monstera, ananas, diffenbachia, begonia, cyklamen, dracena wonna i geranium; rośliny cebulkowe, takie jak gladiole, frezje, hiacynty, irysy i inne lilie; kwiaty cięte, takie jak astry, róże, chryzantemy, orchidee, dzwonki, goździki i gerbery.

Rośliny, wyhodowane sposobem według wynalazku, można wysadzać bezpośrednio na polu, w ogrodzie lub w szkółce drzewnej. Udział roślin przeżywających jest wyższy niż w przypadku roślin poddanych sposobowi zwykłego przystosowania. Ponieważ wysadzanie roślin następuje bezpośrednio z segmentów kultury tkankowej, toteż sposób ten nazwano sposobemTissue-Culture-Direct (czyli sposobem-TCD), a wytworzone rośliny nazwano roślinami-TCD.

Podane niej przykłady objaśniają bliżej sposób według wynalazku, nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. Limonium latifolium - sposób dwuetapowy.

Limonium latifolium (wieloletnią roślinę ozdobną) rozmnożono na tradycyjnej pożywce o następującym składzie:

NH4NO3	1600	mg	CoCl2-6H2O	0,025	mg
KNO3	1900	mg	mezoinozytol	100	mg
CaCl2-2H2O	440	mg	witamina B1	0,1	mg
MgSO4-7H2O	370	mg	witamina B6	0,5	mg
Na2EDTA+FeSO4· 7H2O	25	mg	kwas nikotynowy	0,5	mg
H3BO3	6,2	mg	glicyna	2,0	mg
MnSO4-4H2O	22,3	mg	kinetyna	2,0	mg
ZnSO4-4H2O	8,6	mg	kwas α-naftylooctowy	0,02	mg
KJ	0,83	mg	sacharoza	30000	mg
Na2MoO4-2H2O	0,25	mg	agar	11000	mg
CuSO4-5H2O	0,025	mg	pH=5,7.

Substancje te są zawarte w 1 litrze pożywki, tzn. pożywka zawiera 3% sacharozy i 1,1% agaru. Należy zauważyć, że zawartość sacharozy w tej tradycyjnej pożywce plasuje się dużo poniżej ilości potrzebnych do nastawienia ciśnienia osmotycznego na żądaną wartość. W pożywce tej sacharoza służy jako źródło energii dla roślin prawie nie asymilujących w warunkach kultury tkankowej.

Po osiągnięciu dostatecznego stopnia rozmnożenia (około 30000 sztuk) rośliny przesadzono na pożywkę ukorzeniającą o następującym składzie:

168 969

NH4NO3	1600	mg
KNO3	1900	mg
CaCl2'2H2O	440	mg
MgSO4-7H₂O	370	mg
Na₂EDTA+FeSO4-7H2O	25	mg
Η3ΒΟ3	6,2	mg
MnSO4-4H₂O	22,3	mg
ZnSO4-4H₂O	8,6	mg
KJ	0,83	mg
Na2MoO4-2H₂O	0,25	mg

CoC1₂-6H2O 0,025 mg mezoinozytol 100 mg witamina B i 0,5 mg witamina Bó 1,0 mg kwas nikotynowy 5,0 mg kwas pantotenowy kwas 2,5 mg a-naftylo octowy 0,02 mg sacharoza 70000 mg agar 11000 mg pH=5,7.

Przy tym każdorazowo wprowadzono 10 roślin do szklanki o pojemności 400 ml Zawar tość cukru i ciśnienie osmotyczne tej pożywki ukorzeniającej są więcej niż dwukrotnie wyższe od odpowiednich wartości w pożywce rozmnażającej. Pożywka ukorzeniająca ma ciśnienie osmotyczne, które odpowiada osmotycznemu ciśnieniu 0,21 M sacharozy Na tej pożywce rozpoczęło się przekształcanie roślin. Gdy rośliny osiągnęły wysokość 5-6 cm i rozpoczęły ukorzenianie się, to przesadzono je na trzecią pożywkę, która od drugiej pożywki różniła sie tym, że zawierała 110 g/litr (0,32 mola) sacharozy i 250 mg/litr węgla aktywnego.

Zadaniem węgla aktywnego było zabezpieczenie już utworzonych korzeni przed światłem Porcjami po 25 ml tej pożywki napełniono przejrzyste kubki z tworzywa sztucznego o lekko stożkowym kształcie i o wysokości 6 cm, po zakrzepnięciu pożywki wsadzono do każdego kubka jedną roślinę, po czym kubek zamknięto jałową pokrywką. Kubek utrzymywano w temperaturze 22-25 C wobec oświetlenia dziennego, aż system korzeniowy całkowicie przerósł pożywkę Tym samym roślma-TCD była gotowa i mogła ona bez przystosowywania być wysadzana w gruncie bądź składowana w chłodni w temperaturze 5-10 C w ciągu 3-4 miesięcy

Przykład Π. Wytwarzanie roślin-TCD Spathyphulum. ^J

Z rozmnożonych na znanej drodze poprzez kulturę tkankową roślin Spathyphylum fna kwiaty doniczkowe nadająca się roślina ozdobna) nacięto tzw. mikrosadzonki tj pędy bez korzeni. Te wsadzono do kubków z tworzywa sztucznego o wysokości 6 cm, które do wysokości 2-3 cm napełniono pożywką ukorzeniającą według przykładu I. Do każdego kubka wsadzano po trzy mikrosadzonki bądź potrójnie rozgałęzioną mikrosadzonkę. Kubki utrzymywano w temperaturze 22°C wobec oświetlenia dziennego. Rośliny te w ciągu około 6 tygodni osiągnęły jakość-TCD. Można je było bez prowadzonego w cieplarni przystosowania sadzić odraL w doniczkach i oferować do handlu.

Przykład ΠΙ. Gerbera jamesoni w postaci rośliny-TCD.

Gerberę jamesoni rozmnożono na zwykłej drodze poprzez kulturę tkankową po czym ukorzeniono. Gdy korzenie osiągnęły długość 1-1,5 cm, rośliny te przesadzono do kubków z tworzywa sztucznego, napełnionych pożywką do wysokości 2-3 cm. Pożywka odpowiadała pożywce ukorzeniającej według przykładu I, lecz zawierała 130 g/litr sacharozy i 500 mg/litr węgla aktywnego. Po upływie 6 tygodni można było rośliny wysadzać. ⁶

Przykład IV. Wytwarzanie roślin-TCD ogórka w dwóch etapach.

Klony rozmnożonych na znanej drodze poprzez kulturę tkankową hybrydów-Fl ogórka ułożono na pożywce ukorzeniającej. Jej skład odpowiadał składowi podanemu w przykładzie I lecz zawierała ona 50 g/litr sacharozy i 0,01 mg/litr kwasu naftylooctowego. Na tej pożywce hodowano rośliny aż do osiągnięcia stadium 4-5 liści, po czym te ukorzenione rośliny przesadzo no na pożywkę, która zawierała 50 g/litr glukozy i 0,01 mg/litr kwasu naftylooctowego (ciśnienie osmotyczne 50 g/litr glukozy odpowiada ciśnieniu osmotycznemu 100 g sacharozy) Na tej pożywce rośliny te hodowano jeszcze co najmniej w ciągu 2 tygodni, po czym wysadzono lub utrzymywano w temperaturze 5-10°C.

Przykład V. Wytwarzanie roślin-TCD szparaga,

a) Przygotowanie materiału rozmnożeniowego

Ukorzenione w znany sposób rośliny nanoszono w warunkach jałowych na zestaloną pożywkę. Skład tej pożywki odpowiadał składowi pierwszej pożywki z przykładu I, lecz nie

168 969 zawierał żadnych hormonów roślinnych. Kolby szklane, obsadzone 15-20 roślinami, inkubowano w temperaturze 17°C wobec krótkiego fotoperiodu w ciągu 21 dni. Inkubowanie zakończono, gdy obok świeżego pędu pojawił się pączek o długości 1-2 mm. Pączek, znajdujący się w stanie spoczynkowym, oddzielono wraz z kawałkiem korzeni, albo podzielono korzenie, i kawałki te wsadzono do świeżych kolb, aż było do dyspozycji około 10000 roślin doświadczalnych.

b) Wytwarzanie roślin-TCD drogą chłodzenia

Część tych wytworzonych roślin umieszczono w chłodni i tam przechowywano w temperaturze 5°C. Co 10 dni pobierano kilka kolb, a zawarte w nich rośliny wysadzano w gruncie w temperaturze gleby 25°C (optymalnej dla szparagów). Przed wysadzeniem przycinano stare pędy na wysokość 0,5 cm. Troszczono się o to, żeby gleba w ciągu dłuższego okresu pozostała całkowicie wolna od chwastów. Przed sadzeniem glebę nawodniono, po czym wytyczono bruzdę o głębokości 12 cm i w niej zarobiono substancję zatrzymującą wodę (pęczniejące polimery akrylowe, torf, itp.). Na tej warstwie zasadzono rośliny, po czym przykryto warstwę ziemi o grubości 8-10 cm. Glebę ugnieciono za pomocą lekkiego walca. W odstępach 10-dniowych obserwowano zasadzone rośliny. Wschody roślin w funkcji czasu trwania chłodzenia zestawiono w podanej niżej tabeli.

Tabela

Czas przechowywania w temperaturze 5°C (dni)	% wzeszłych roślin	Czas wzejścia (dni)
0	11	40
10	50	25
30	80	15
40	96	10
50	100	10

Z tabeli wynika, że rośliny traktowane według wynalazku pewniej wschodzą, i to szybciej niż rośliny nietraktowane, z których wzeszły tylko niektóre i to dopiero po upływie 40 dni.

c) Wytwarzania roślie -TCD drogą zmian ciśnienia oemotoczneyo

Drugą część roślin przygotowanych według punktu a), sadzono na pożywce, która odpowiadała pożywce ukorzeniającej według przykładu I, lecz w 1 litrze zawierała 0,3 mola sacharozy. Rośliny te wobec ciągłego oświetlenia w temperaturze 25°C hodowano na tej pożywce w ciągu 30 dni, po czym wyjmowano z kolb, a znajdujące się na nich stare pędy przycinano tak, jak w punkcie b). Rośliny te zasadzono w omówiony sposób w gruncie o temperaturze 25°C. Rośliny te zachowywały się tak, jak zwykłe rozsady szparagowe.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób przystosowania rozmnożonych poprzez kulturę tkankową roślin do bezpośredniego wysadzania w gruncie, znamienny tym, że rośliny, rozmnożone na znanej drodze poprzez kulturę tkankową, hoduje się dalej w jednym lub kilku etapach na pożywkach, których ciśnienie osmotyczne odpowiada zawartości 0,2-0,4 M sacharozy, przy czym w przypadku wieloetapowej hodowli ciśnienie osmotyczne pożywki nastawia się z etapu na etap na wyższą wartość w obrębie podanego zakresu, a otrzymane tą drogą rośliny wysadza się bezpośrednio w gruncie korzystnie oznaczając granice pól.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do nastawienia ciśnienia osmotycznego stosuje się sacharozę, glukozę, sole pokarmowe roślin lub dowolne mieszaniny wyszczególnionych substancji.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rośliny wraz z pożywką z ostatniego etapu pojedynczo sadzi się w jałowych warunkach w przezroczystych kubkach z tworzywa sztucznego i w nich dalej hoduje.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rośliny te przechowuje się w ciągu 30-50 dni w temperaturze 5°C.