PL167224B1 - Sposób stabilizowania enzymatycznej aktywności alkalicznej fosfatazy - Google Patents

Abstract

Sposób stabilizowania enzymatycznej' aktywności alkalicznej fosfatazyw roztworach ewentualnie zawierających środki zapobiegające rozwojowi mikroflory lub liofilizowanych preparatach alkalicznej fosfatazy, znamienny tym, że do roztworu alkalicznej fosfatazy dodaje się sól magnezową kwasu organicznego w ilości co najmniej 0,001 mola/l, utrzymując pH roztworu w granicach 5-7, korzystnie octan magnezu w ilości 0,001 -1 mola/l, propionian magnezu 0,001 - 1 mola/l, mrówczan magnezu 0,001 - 1,2 mola/l lub mleczan magnezu 0,001 - 0,12 mola/l, po czym ewentualnie roztwór poddaje się liofilizacji.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób stabilizowania enzymatycznej aktywności alkalicznej fosfatazy w roztworach i liofilizatach. Alkaliczna fosfataza jest enzymem występującym w tkankach ludzi i zwierząt oraz w niektórych gatunkach mikroflory.

Bogatym źródłem alkalicznej fosfatazy jest dwunastnica bydła, która często stanowi materiał do produkcji tego enzymu. Biochemiczna rola alkalicznej fosfatazy w organizmie ludzkim niejest dokładnie poznana. Zwiększoną aktywność alkalicznej fosfatazy stwierdzono w surowicy krwi przy niektórych rodzajach schorzeń nerek i wątroby. Zjawisko to wykorzystano w testach ułatwiających rozpoznanie chorych tkanek.

Preparaty alkalicznej fosfatazy o aktywności powyżej 1000 j/mg białka są potrzebne do sporządzania zestawów odczynników immunologiczno - enzymatycznych stosowanych do wykrywania patogenów roślinnych, na przykład według testów Elisa.

Enzymatyczna aktywność alkalicznej fosfatazywydzielonej z organizmu i przechowywanej w postaci preparatów może ulegać zmniejszeniu, aż do całkowitej inaktywacji. Aktywność tego enzymu zależy od zastosowanych substancji stabilizujących, pH i temperatury.

W celu optymalnego wykorzystania alkalicznej fosfatazy i uzyskania w miarę porównywalnych wyników istnieje potrzeba stabilizowania jej preparatów przeznaczonych do analityki i diagnostyki.

Znany jest sposób stabilizacji alkalicznej fosfatazy przy pomocy roztworu siarczanu amonowego lub roztworu chlorku sodowego o stężeniu 3 mole/l i pH 7,6 lub też roztworu gliceryny o stężeniu 50% wagowych i pH 7,5. W celu wzmocnienia efektu stabilizacji do roztworu dodaje się środki zapobiegające rozwojowi mikroflory na przykład alkohole butylowe.

Z patentu DD 237 326 Al znana jest liofilizacja alkalicznej fosfatazy w roztworze zawierającym 10% wagowych glukozy. Tak otrzymany liofilizat po 21 dobach przechowywania w temperaturze 37°C charakteryzował się mniejszym spadkiem enzymatycznej aktywności w porównaniu do próby kontrolnej.

Z przeprowadzonych doświadczeń wynika, że stabilizowane znanymi substancjami preparaty alkalicznej fosfatazy przechowywane w temperaturze 4°C tracą stopniowo enzymatyczną aktywność. Przykładem mogą być 1% wodne roztwory alkalicznej fosfatazy o aktywności 2500 j/mg białka, stabilizowane roztworem o stężeniu 3 mole NaCl/l, które po 8 miesiącach przechowywania w temperaturze 4°C zmniejszyły swoją aktywność 760 - 1300j/mg białka.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że sole magnezowe kwasów organicznych, korzystnie octan magnezowy w ilości 0,001 -1 mola/l roztworu wodnego lub propionian magnezowy w ilości 0,001 -1 mola/l roztworu wodnego lub mrówczan magnezowy w ilości 0,001 -1,2 mola/l roztworu wodnego lub mleczan magnezowy w ilości 0,001 - 0,12 mola/l roztworu wodnego,

16*7224 skutecznie chronią enzymatyczną aktywność alkalicznej fosfatazy w roztworach wodnych korzystnie o pH 5-7.

Działanie ochronne tych soli prawdopodobnie zwązane jest z magnezem, gdyż pierwiastek ten jest istotnym składnikiem alkalicznej fosfatazy. Sole magnezowe kwasów organicznych, w porównaniu do stosowanych dotychczas substancji stabilizujących mają inne właściwości buforowe, higroskopijne i inną rozpuszczalność w wodzie, co niewątpliwie ma także wpływ na efekt stabilizacyjny.

Szczególnie octan magnezowy wyróżnia się dużą przydatnością dla ochrony enzymatycznej aktywności alkalicznej fosfatazy przechowywanej w postaci roztworów wodnych, gdyż przy stężeniu powyżej 0,25 mola/l sól ta jednocześnie zabezpiecza aktywność fosfatazy, a także roztwór wodny przed rozwojem mikroflory. Zbliżonymi właściwościami ochronnymi charakteryzuje się propionian magnezowy. Natomiast stosowanie mrówczanu magnezowego wymaga dwukrotnie większego stężenia tej soli dla dorównania efektom uzyskiwanym przy stosowaniu octanu magnezowego, zaś mleczan magnezowy, który charakteryzuje się małą rozpuszczalnością w wodzie wynoszącą 0,12 mola/l, ma w efekcie niniejszy zakres przydatności.

Nieoczekiwanie stwerdzono również, że sole magnezowe kwasów organicznych skutecznie chronią enzymatyczną aktywność alkalicznej fosfatazy w liofilizatach. Szczególnie korzystne działanie wykazują octan magnezowy i propionian magnezowy, w przypadku gdy zawartość tych soli, w liofilizacje wynosi 2-15% wagowych oraz gdy roztwór wodny przed podaniem procesowi liofilizacji ma pH 6,0 - 6,5.

Wodne roztwory alkalicznej fosfatazy, zawierające do 0,25 mola/l octanu lub propionianu magnezowego lub też do 0,5 mola/l mrówczanu magnezowego można przechowywać, jak stwierdzono, przez co najmniej roczny okres czasu w stanie zamrożonym. Natomiast roztwory te, przechowywane w temperaturze 20°C także nie tracą enzymatycznej aktywności, jeżeli doda się do nich substancje zapobiegające rozwojowi mikroflory na przykład takie jak alkohole butylowe, które są trwałe w roztworach wodnych o pH 5 - 7 i nie wpływają ujemnie na aktywność enzymu. Korzystne jest stosowanie 5 - 7% (V/V) dodatku alkoholu n-butylowego lub II rzędowego alkoholu butylowego.

Przykładowo liofilizacja roztworów o stężeniu 1 -1,5% wagowych alkalicznej fosfatazy oczyszczonej od białek towarzyszących, po dodaniu octanu magnezowego w ilości takiej, że w gotowym liofilizacie zawartość tej soli wynosi 7% wagowych, w pełni chroni jej enzymatyczną aktywność również podczas długotrwałego, jak stwierdzono, co najmniej rocznego przechowywania w temperaturze 20°C. Tak mała zawartość soli magnezowej w liofilizacie fosfatazy umożliwia jego stosowanie w testach immunologicznych Elisa z pominięciem dializy.

Przykład I. Otrzymany został wodny roztwór o stężeniu 1,5% wagowych alkalicznej fosfatazy o aktywności enzymatycznej 2500 j/mg białka, w którym stężenie octanu magnezowego wynosiło 0,7 mola/l, zaś pH 6,7.

Po rocznym okresie przechowywania roztworu, w temperaturze około 20°C jego aktywność enzymatyczna nie uległa zmianie.

Przykład II. Otrzymany został wodny roztwór o stężeniu 1,2% wagowych alkalicznej fosfatazy o aktywności enzymatycznej 2000 j/mg białka, w którym stężenie propionianu magnezowego wynosiło 0,7 mola/l, zaś pH 5,7.

Po rocznym okresie przechowywania roztworu, w temperaturze około 20°C jego aktywność enzymatyczna nie uległa zmianie.

Przykład III. Otrzymany został wodny roztwór o stężeniu 0,2% wagowych alkalicznej fosfatazy o aktywności enzymatycznej 2000 j/mg białka, w którym stężenie mrówczanu magnezowego wynosiło 0,9 mola/l, zaś pH 6,2. Po rocznym okresie przechowywania roztworu w temperaturze około 20°C jego aktywność enzymatyczna nie uległa zmianie.

Przykład IV. Otrzymany został wodny roztwór o stężeniu 0,5% wagowych alkalicznej fosfatazy o aktywności enzymatycznej 2000 j/mg białka, w którym stężenie octanu magnezowego wynosiło 0,1 mola/l, zaś pH 6,0. Do roztworu dodano 5% objętościo4

167 224 wych alkoholu n-butylowego. Po rocznym okresie przechowywania roztworu w temperaturze około 20°C jego aktywność enzymatyczna nie uległa zmianie.

Przykład V. Otrzymany został wodny roztwór o stężeniu 0,5% wagowych alkalicznej fosfatazy o aktywności enzymatycznej 2000 j/mg białka, w którym stężenie mleczanu magnezowego wynosiło 0,1 mola/l, zaś pH 6,5. Do roztworu dodano 7% objętościowych alkoholu n-butylowego. Po rocznym okresie przechowywania roztworu w temperaturze około 20°C jego aktywność enzymatyczna nie uległa zmianie.

Przykład VI. Otrzymany został wodny roztwór o stężeniu 1,5% wagowych alkalicznej fosfatazy o aktywności enzymatycznej 3000 j/mg białka, w którym stężenie octanu magnezowego wynosiło 0,002 mola/l, zaś pH 6,0. Roztwór w znany sposób liofilizowano w szklanych ampułkach. Po rocznym okresie przechowywania liofilizatu w temperaturze około 20°C jego aktywność enzymatyczna nie uległa zmianie.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zl.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób stabilizowania enzymatycznej aktywności alkalicznej fosfatazy w roztworach ewentualnie zawierających środki zapobiegające rozwojowi mikroflory lub liofilizowanych preparatach alkalicznej fosfatazy, znamienny tym, że do roztworu alkalicznej fosfatazy dodaje się sól magnezową kwasu organicznego w ilości co najmniej 0,001 mola/l, utrzymując pH roztworu w granicach 5-7, korzystnie octan magnezu w ilości 0,001 -1 mola/l, propionian magnezu 0,001 -1 mola/l, mrówczan magnezu 0,001 -1,2 mola/l lub mleczan magnezu 0,001 - 0,12 mola/l, po czym ewentualnie roztwór poddaje się liofilizacji.