PL155985B1

PL155985B1 - Sposób wytwarzania nowego antybiotyku F-0769 PL PL PL PL

Info

Publication number: PL155985B1
Application number: PL1987264409A
Authority: PL
Priority date: 1986-03-04
Filing date: 1987-03-03
Publication date: 1992-01-31
Also published as: JPS6310797A; DE3772591D1; AU6959187A; AU589255B2; EP0235795B1; JPH072759B2; CA1302926C; EP0235795A2; ATE66926T1; PL264409A1; EP0235795A3; US4904470A; CN87102651A

Abstract

Sposób wytwarzania nowego antybiotyku F-0769 wykazujacego nastepujace wlasciwosci: / 1/ wyglad zewnetrzny: proszek o barwie bialej i jasnozóltej, / 2/ temperatura topnienia: 245-250°C, / 3 / skrecalnosc wlasciwa: [ a]D 25 = -37,5° / c = 1, m etanol/, / 4 / rozpuszczalnosc w rozpuszczalnikach: rozpuszczalny w metanolu, etanolu, acetonie, chloroformie, octanie etylu i benzenie, nierozpuszczalny w wodzie i heksanie, /5 / analiza elementarna /% , znaleziono/: C 57,53, H 7,36,0 21,17, N 12,97,/ 6/w idm o absorpcji w nadfiolecie/na podstawie pomia- rów w metanolu/: jak przedstawiono na fig. 1, ? max/E1 % 1 cm/ = 213 nm /466/, 286 /200/, / 7/ widmo absorpcji w podczerwieni /n a podstawie pomiarów w KBr/: jak przedstawiono na fig. 2, / 8/ widma jadrowego magnetycznego rezonansu / na podstawie pomiarów w ciezkim chloro- formie/ : widmo 1H-NMR jak przedstawiono na fig. 3, oraz widmo 13C-NMR jak przedstawiono na fig. 4, / 9 / rozróznienie miedzy charakterem zasadowym, kwasowym a obojetnym: substancja obojetna, /1 0 / analiza aminokwasów: w wyniku hydrolizy z uzyciem 6 N kwasu solnego w temperaturze 110°, w ciagu 18 godzin wykryto aminokwasy, to jest treonine, waline i leucyne, / 11/ reakcje barwne: dodatni wynik reakcji z jodem i reakcji z nadmanganianem potasowym, a ujemny wynik reakcji z ninhydryna i z chlorkiem zelazowym, / 12/ chromatografia cienkowar- stwowa / przy zastosowaniu zelu krzemionkowego, Art. 5715, produkcji Merck Co./, PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku F-0769 przyspieszającego wzrost i zwiększającego wydajność paszy dla zwierząt domowych i ptactwa, oraz posiadającego własności przeciwnowotworowe.

Prowadząc prace nad antybiotykami wyodrębniono pewną ilość drobnoustrojów z rozmaitych gleb w celu poszukiwania użytecznych antybiotyków i badania antybiotyków wytwarzanych przez wyodrębnione drobnoustroje. W wyniku tego stwierdzono, że w przypadku, gdy Streptomyces violaceusnigar szczep F-0769 należący do rodzaju Streptomyces, wyodrębniony z gleby zalanego pola ryżowego w Kitaamarune-machi, Sakata-shi, Akita-ken, Japonia, hodowany jest w odpowiednim podłożu hodowlanym, w podłożu tym gromadzi się antybiotyk o wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej wobec bakterii Gram-dodatnich. Antybiotyk ten wyodrębniono i porównano ze znanymi antybiotykami pod względem właściwości fizykochemicznych i biologicznych, potwierdzając w ten sposób, że jest to antybiotyk nowy i nazwano go antybiotykiem F-0769.

Stwierdzenie tego jest podstawą niniejszego wynalazku. Według wy nalazku, sposób wytwarzania antybiotyku F-0769 wykazującego następujące właściwości: /1/ wygląd zewnętrzny: proszek o barwie białej i jasnożółtej, /2/ temperatura topnienia: 245-250°C, /3/ skręcalność właściwa: [ff]D⁵ — -37,5° /c=l, metanol/, /4/ rozpuszczalność w rozpuszczalnikach: rozpuszczalny w metanolu, etanolu, acetonie, chloroformie, octanie etylu i benzenie, nierozpuszczalny w wodzie i heksanie, /5/ analiza elementarna /%, znaleziono/: C 57,53, H 7,36, O 21,17, N 12,97, /6/ widmo absorpcji w nadfiolecie /na podstawie pomiarów w metanolu/: jak przedstawiono na fig. 1 λ msut/E i cm// ⁼ 213nm/466/, 286 /200/, /7/ wdmo absorpcji w podczerwieni /na podstawie

155 985 pomiarów w KBr/: jak przedstawiono na fig, 2, /8/ widma jądrowego magnetycznego rezonansu /na podstawie pomiarów w ciężkim chloroformie/: widmo ¹H-NMR jak przedstawiono na fig. 3, oraz widmo ¹³C-NMR jak przedstawiono na fig. 4, /9/ rozróżnienie między charakterem zasadowym, kwasowym a obojętnym: substancja obojętna, /10/ analiza aminokwasów w wyniku hydrolizy z użyciem 6 N kwasu solnego w temperaturze 110°, w ciągu 18 godzin wykryto aminokwasy, to jest treoninę, walinę i leucynę, /11/ reakcje barwne: dodatni wynik reakcji z jodem i reakcji z nadmanganianem potasowym, a ujemny wynik reakcji z ninhydryną i z chlorkiem żelazowym, /12/ chromatografia cienkowarstwowa /przy zastosowaniu żelu krzemionkowego, Art. 5715, produkcji Merck Co./,

Układ rozpuszczalników Wartość Rf octan etylu 0,16 octan etylu - metanol /5:1/ 0,33 chloroform - metanol /10: 1/ 0,68 octan etylu - aceton /1:1/ 0,31 aceton - benzen /5:1/ 0,40, /13/ masa cząsteczkowa: na podstawie pomiaru metodą Rasta/: około 745, polega na tym, że prowadzi się hodowlę drobnoustroju wytwarzającego antybiotyk F-0769, należącego do rodzaju Streptomyces, a następnie z produktu hodowli wyodrębnia się antybiotyk F-0769, przy czym jako drobnoustrój stosuje się Streptomyces violaceusnigar F-0769.

Wynalazek zostanie obecnie opisany szczegółowo w odniesieniu do jego korzystnych zastosowań.

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia widmo absorpcji antybiotyku F-0769 w nadfiolecie, na podstawie pomiarów metanolu, fig. 2 - widmo absorpcji antybiotyku F-0769 w podczerwieni na podstawie pomiarów w KBr, fig. 3 - widmo 1 H-NMR antybiotyku F-0769, na podstawie pomiarów w ciężkim chloroformie, fig. 4 - widmo ⁿC-NMR antybiotyku F-0769, na podstawie pomiarów w ciężkim chloroformie.

Drobnoustrojem, którego można użyć do produkcji antybiotyku F-0769, może być jakikolwiek drobnoustrój należący do rodzaju Streptomyces, dopóki zdolny jest on do wytwarzania antybiotyku F-0769.

Jako specyficzny przykład drobnoustroju stosowanego w sposobie według niniejszego wynalazku można wymienić Streptomyces violaceusnigar szczep F-0769, który został zdeponowany w Fermentation Research Institute of Japan dnia 24 lutego 1986 pod numerem depozytu FERM 8663, i przeniesiony do depozytu międzynarodowego 28 stycznia 1987 pod numerem FERM BP-1264.

W sposobie według niniejszego wynalazku można również zastosować naturalnie lub sztucznie uzyskane mutanty Streptomyces violaceusnigar szczep F-0769, inne drobnoustroje należące do rodzaju Streptomyces lub jakiegokolwiek innego rodzaju, albo drobnoustroje zmodyfikowane przez zabiegi genetyczne w celu nabycia zdolności do wytwarzania antybiotyku F-0769, dopóki zdolne są one do wytwarzania antybiotyku F-0769.

Charakterystyka mikologiczna szczepu-0769 wytwarzającego antybiotyk według niniejszego wynalazku jest następująca. Szczep F-0769, stosowany w sposobie według wynalazku, ma strzępki rozgałęzione, przy czym strzępki powietrzne, wystające w przestrzeń powietrzną, są rozfragmentowane, z utworzeniem dziesięciu, lub większej ilości spiralnych zarodników o pomarszczonej powierzchni.

W hydrolizacie całych komórek wykrywa się kwas L,L-di-aminopimelinowy, jednakże nie wykrywa się kwasu mezodiamino-pimelinowego. Jako składnik cukrowy wykrywa się galaktozę. Nie wykrywa się jednak arabinozy, ksylozy i madurozy. Na podstawie tej charakterystyki określa się szczep-F-0769 jako szczep należący do rodzaju Streptomyces z Actinomycetales, Streptomycetaceae.

Streptomyces violaceusnigar szczep F-0769 ma następujące właściwości mikrobiologiczne.

I. Charakterystyka morfologiczna.

Grzybnia podstawowa jest dobrze rozwinięta i rozgałęziona, przy czym średnica każdego strzępka wynosi około 1,5 X 1,0μπι. Powierzchnia hodowli narasta i często marszczy się. Grzybnia dobrze przylega do szeregu podłóż hodowlanych, takich jak agarowe podłoże hodowlane drożdżowo-skrobiowe, agarowe podłoże hodowlane drożdżowo·-maltozowe lub agarowe podłoże

155 985 hodowlane sacharazowo-azotanowe. Grzybnia powietrzna jest dobrze rozwinięta. Przednie końce rozfragmentowanych zarodników są spiralne ze skręceniem średnio 4 lub 5 razy i tworzą łańcuchy zarodników, ale rozgraniczenia między przyległymi zarodnikami w łańcuchach zarodników nie są wyraźne. Nie obserwuje się sporangium, sklerocjum lub koremium.

II. Charakterystyka hodowlana.

Badania prowadzone zgodnie z metodą badania przedstawioną przez E. B. Shirlinga i wsp. [International Journal of Systematic Bacteriology, 16, 313-340 /1966/]. Dodatkowo wykorzystano znane podłoża hodowlane i metody badawcze.

Zabarwienie określano pod standardowym źródłem światła w postaci lampy ksenonowej przy użyciu jako standardów zabarwienia Color Harmony Manuał, wyd. IV, 1958. Po znalezieniu liszki o odpowiadającej barwie, zabarwienie przedstawiono najpierw pospolitą nazwą, po czym, w nawiasach, podano kod barwnej fiszki.

Następujące dane, jeżeli tego inaczej nie sprecyzowano, przedstawiają stan wzrostu w wyniku hodowli w ciągu 3 tygodni w temperaturze 28°C na płytce z agarowym podłożem hodowlanym.

/1/ Podłoże hodowlane sacharozowo-azotowe /Difco-Czapeck's Solution Ag^i^./. Wzrost jest dobry. Barwa jasnej kości słoniowej-skorupki jajka do musztardowo-złotej - starego złota, bambusowo-płowo-żółta /2ca-2ne, 2gc/. Grzybnia powietrzna przylega słabo. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

/2/ Podłoże hodowlane glukozowo-asparaginowe. Szczep rośnie dobrze i rozprzestrzenia się. Barwa jasno-pszeniczna-jasnokukurydziana do bambusowo-płowożółtej /2ea-2gc/. Grzybnia powietrzna przylega słabo i ma barwę białawą. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

/3/ Podłoże hodowlane glicerynowo-asparaginowe /ISP-5, Difco/. Wzrost nie jest dobry. Barwa jasnej kości słoniowej-skorupki jajka. Nie ma przylegającej grzybni powietrznej. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

/4/ Agarowe podłoże hodowlane skrobiowe /ISP-4, Difco, Inorganic salt-starch agar/. Wzrost początkowo jest dobry, ale stopniowo pogarsza się. Barwa jasnej kości słoniowej-skorupki jajka. Grzybnia powietrzna przylega dobrze i jest ciemnawa /barwa niemal szara, 10fe/. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

/5/ Agarowe podłoże hodowlane tyrozynowe /ISP-7, Difco, Tyrosine agar/. Szczep rośnie dobrze i rozprzestrzenia się. Barwa przytłumiona brązowo-szara /2ge/ do czarnej. Grzybnia powietrzna rośnie bardzo dobrze i jest proszkowata. Barwa melonowożółta /3ga/. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

/6/ Agarowe podłoże odżywcze. Wzrost nie jest dobry. Grzybnia powietrzna nie rośnie obficie. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

/7/ Agarowe podłoże hodowlane drożdżowo-maltozowe /ISP-2, Difco, yeast-malt extract agar/. Szczep rośnie bardzo dobrze i rozprzestrzenia się. Barwa musztardowa-starego złota /21e/ do topazowo-irysowej /3ne/. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

/8/ Podłoże hodowlane z mąką owsianą /ISP-3, Difco/. Szczep rośnie dobrze i rozprzestrzenia się. Barwa beżowoszara-mysia /niemal szara 3ih/. Rozpuszczalny pigment ma barwę jasnożółtą.

/9/ Agarowe podłoże hodowlane drożdżowo-skrobiowe. Wzrost jest dobry, hodowla powiększa się i rozprzestrzenia. Barwa miodowo-złota-jasnozłota /2ic/. Grzybnia powietrzna rośnie bardzo dobrze. Barwa czarno-śliwkowa. Nie obserwuje się rozpuszczalnego pigmentu.

III. Charakterystyka fizjologiczna.

/1/ Zakres temperatur, w którym następuje wzrost /agarowe podłoże hodowlane drożdżowo-skrobiowe, pH przed wyjałowieniem 7,2, z użyciem cieplarki z gradientem temperatury, wzrost w drugim tygodniu/: temperatura optymalna 30°C-33,2°C. Temperatura umożliwiająca wzrost 12^OC-38,5°C.

/2/ Upłynnianie żelatyny /hodowla kłuta na podłożu glukozowo-peptonowo-żelatynowym/: wynik dodatni.

/3/ Koagulacja i peptonizacja mleka odtłuszczonego /Difco, mleko odtłuszczone, 28°C i 37°C/: 28°C peptonizacja: wynik dodatni; koagulacja: wynik ujemny. 37°C peptonizacja: wynik dodatni; koagulacja: wynik ujemny.

155 985 /4/ Tworzenie melaniny: agarowe podłoże hodowlane tyrozynowe: wynik ujemny; podłoże hodowlane, w którym następuje tworzenie się melaniny: wynik ujemny /po upływie tygodnia wynik słabo dodatni,/; agarowe podłoże hodowlane peptonowo-drożdżowe z żelazem: wynik ujemny; bulionowe podłoże hodowlane z triptone i ekstraktem drożdżowym: wynik ujemny.

/5/ Rozpuszczalność adeniny, ksantyny, hipoksantyny i tyrozyny: hipoksantyna, tyrozyna: wynik dodatni; adenina: wynik słabo dodatni; ksantyna: wynik ujemny.

/6/ Tolerancja na NaCl /agarowe podłoże hodowlane drożdżowo-skrobiowe + chlorek sodowy/: Wzrost do 4%. Przy 7% nie ma wzrostu.

/7/ Wykorzystanie źródła węgła /agarowe podłoże hodowlane do badania wykorzystywania węgla, Difco, 28°C, w drugim tygodniu hodowli./: wynik dodatni: D-glukoza, D-ksyloza, D-fruktoza, sacharoza, i-inozyt, L-ramnoza, rafinoza, D-mannit, L-arabinoza, salicyna; wynik ujemny: nie ma.

Szczep ten został zidentyfikowany jako szczep należący do Streptomyces violaceusnigar, ponieważ wykazuje on dobrą zgodność ze Streptomyces violaceusnigar /Waksman-Curtis/ Waksman-Henrici, pod tym względem, że łańcuchy zarodników są spiralne, a powierzchnia zarodników jest pomarszczona; w niektórych podłożach hodowlanych część grzybni powietrznej przekształca się w wilgotne czarne plamy w miarę upływu czasu hodowli; tolerancja na NaCl wynosi 4% do poniżej 7%; oraz, wykorzystuje on wszystkie źródła węgla. To też, szczep ten nazwano Streptomyces violaceusnigar szczep F-0769.

Antybiotyk F-0769 wytwarzany sposobem według wynalazku otrzymuje się za pomocą prowadzenia hodowli Streptomyces violaceusnigar szczep F-0769 w podłożu hodowlanym zawierającym substancje odżywcze zwykle wykorzystywane przez promieniowce. Np., jako źródła węgla można użyć glukozy, gliceryny, sacharozy, dekstryny, skrobi itd. Jako źródło azotu można zastosować mąkę sojową, zarodniki pszenicy, pepton, ekstrakt mięsny, ekstrakt drożdżowy, namok kukurydziany, sól amonową itd. Dalej, jeżeli jest to niezbędne, można użyć soli nieorganicznych, takich jak węglan wapniowy, chlorek potasowy, siarczan magnezowy i fosforany.

Jeśli chodzi o metodę hodowli, stosowana jest hodowla w podłożu płynnym. Waninki hodowli, takie jak temperatura hodowli, czas itd. dobiera się tak, aby były one odpowiednie dla wzrostu użytego drobnoustroju i dla wytwarzania antybiotyku z maksymalną wydajnością. Produkcja antybiotyku osiąga maksimum wtedy, gdy hodowlę, przy mieszaniu z napowietrzaniem, prowadzi się w temperaturze wynoszącej od 25°C do 35°C w ciągu 92 do 144 godzin.

Wytworzony i nagromadzony w podłożu hodowli antybiotyk F-0768 wyodrębnia się z niego i oczyszcza z wykorzystaniem zwykłych sposobów postępowania. I tak np., można użyć sposobu wykorzystującego różnicę rozpuszczalności między antybiotykiem a zanieczyszczeniami, a także sposobu wykorzystującego różnicę w adsorpcji, przy czym można sposoby te stosować osobno albo w kombinacji, względnie wielokrotnie.

Analizę ilościową wytworzonego antybiotyku F-0769 i oznaczenie aktywnej frakcji prowadzono metodą z zastosowaniem płytek agarowych z Bacillus subtilis ATCC szczep 6633 jako drobnoustrojem testowym.

Typowym przykładowym sposobem wyodrębniania i oczyszczania antybiotyku F-0769 jest sposób następujący.

Antybiotyk F-0769 znajduje się w podłożu hodowli i komórkach drobnoustroju. Z podłoża hodowli ekstrahuje się go octanem etylu, octanem butylu, chloroformem itp, wykorzystując jego rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych. Z komórek drobnoustroju można go wyekstrahować acetonem zawierającym wodę, a następnie rozpuszczalnik organiczny oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Antybiotyk ekstrahuje się z pozostającego wodnego roztworu octanem etylu. Obydwa ekstrakty łączy się ze sobą i następnie zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymuje się surowy ekstrakt zawierający antybiotyk F-0769.

Następnie surowy produkt oczyszcza się z zastosowaniem chromatografii adsorpcyjnej, takiej jak chromatografia kolumnowa na tlenku glinowym lub krzemionce. Frakcję aktywną zbiera się, zatęża i suszy, w wyniku czego otrzymuje się antybiotyk F-0769 o wyższej czystości.

Następnie produkt ten poddaje się dalszemu oczyszczaniu, z zastosowaniem kolumnowej chromatografii żelowej przy użyciu Sephadex LH-20 /produkcji Pharmacia./. Frakcję aktywną

155 985 zbiera się, zatęża i suszy, w wyniku czego otrzymuje się antybiotyk F-0769 o czystości jeszcze wyższej, w postaci proszku.

Tak otrzymany antybiotyk F-0769 według niniejszego wynalazku wykazuje następujące właściwości fizyko-chemiczne i biologiczne.

/ 1/ Wygląd zewnętrzny: proszek o barwie białej lub jasnożółtej;

/ 2/ Temperatura topnienia: 245-250°C;

/ 3/ Skręcalność właściwa: [o]c?= -37,5°/c = 1, metanol/;

/ 4/ Rozpuszczalność w rozpuszczalnikach: rozpuszczalny w metanolu, etanolu, acetonie, chloroformie, octanie etylu i benzenie, nierozpuszczalny w wodzie i heksanie;

/ 5/ Analiza elementarna: znaleziono %: C 57,53, H 7,36,0 21,17, N 12,97;

/6/ W idmo absorpcji w nadfiolecie /na podstawie pomiarów w metanolu: jak przedstawiono na figurze 1

A max/E 1 cm/ 213nm/466/, 286/200/;

/ 7/ Widmo absorpcji w podczerwieni /na podstawie pomiarów w KBr/: jak przedstawiono na figurze 2;

/ 8/ Widma jądrowego rezonansu magnetycznego /na podstawie pomiarów w ciężkim chloroformie/:

widmo 1H-NMR jak przedstawiono na figurze 3, oraz widmo ^UC-NMR jak przedstawiono na figurze 4;

/ 9/ Rozróżnienie między charakterem zasadowym, kwasowym a obojętnym: substancja obojętna;

/10/ Analiza aminokwasów: w wyniku hydrolizy z użyciem 6 N kwasu solnego w temperaturze 110°C, w ciągu 18 godzin wykryto aminokwasy, to jest treoninę, walinę i leucynę;

/11/ Reakcje barwne: dodatni wynik reakcji z jodem i reakcji z nadmanganianem potasu, a ujemny wynik reakcji z ninhydryną i chlorkiem żelazowym;

/12/ Chromatografia cienkowarstwowa /przy zastosowaniu żelu krzemionkowego, Art. 5715, produkcji Merck Co./:

Układ rozpuszczalników Wartość Ri

Octan etylu 0,16

Octan etylu - metanol /5:1/ 0,33

Chloroform - metanol /10:1/ 0,68

Octan etylu - aceton/1: 1/ 0,31

Aceton - benzen /5:1/ 0,40 /13/ Masa cząsteczkowa: /na podstawie pomiaru metodą Rasta/: około 745;

/14/ Aktywność przeciwbakteryjna: aktywność przeciwbakteryjną przedstawiono w tabeli 1.

Aktywność tę mierzono agarową metodą rozcieńczeniową .

Tabela 1

Drobnoustrój testowy	Najmniejsze stężenie hamujące //rg/ml/
1 2
Staphylococcus aureus FDA 209P JC-2	0,78
Staphylococcus aureus Tcrajima	0,78
Staphylococcus aureus MS 353	0,78
Streptococcus pyogenes Cook	0,78
Micrococcus luteus ATCC 9412	0,78
Bacillus subtilis ATCC 6633	0,2
Escherichia coli NIHJ JC-2	>100
Salmonella typhi	>100
Serratia marcescens IAM 1184	>100
Proteus mirabilis 1FO 3849	>-100
Enterobacter cloacae 963	>100
Pseudomonas aeruginosa IFO 3445	>100
Candida albicans	>100
Piricularia oryzae	>100

155 985

1 2
Alternaria mali	>100
Cochliobolus miyabeanus	>100
Clostridium perfringens B 103-252	1,56
Clostridium difficile V-6	1,56
Peptocoecus prevotii V-72	1,56
Eubacterium moniliforme V-45	1,56
Eubacterium lentum 0612	1,56
Bacteroides fragilis GM-7000	>100
Veillonella parvula 0574	>100
Fusobacterium varium B-1083	>100

Antybiotyk F-0769 wykazuje wysoką aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich.

Przyjmuje się, że antybiotyk F-0769 wytwarzany sposobem według wynalazku należy do ogólnej klasy antybiotyków peptydowych. Tym niemniej jednak, z porównania ze znanymi substancjami pod względem właściwości fizykochemicznych i biologicznych, takich jak widmo absorpcji w nadfiolecie, widmo absorpcji w podczerwieni i rezultaty analizy aminokwasów, wynikało, że nie było znanej substancji, która odpowiadałaby substancji wytwarzanej sposobem według wynalazku. Dokładniej, nie było innego antybiotyku peptydowego wykazującego absorpcję w nadfiolecie przy 213 i 286 nm, która jest charakterystyczna dla substancji wytwarzanej sposobem według niniejszego wynalazku. Można wspomnieć antybiotyk 1415 [Naturę, 187/4742/, 1029-1030/1960/] lub antybiotyk NRC-501 [Mikrobiol, 16, 337-343 /1976/] jako substancje wykazujące podobną absorpcję, lecz każdy z tych antybiotyków różni się od substancji antybiotycznej wytwarzanej sposobem według wynalazku składem aminokwasowym. Tak więc substancję wytworzoną sposobem według wynalazku określono jako antybiotyk nowy.

Antybiotyk F-0769 wywiera szczególnie silny wpływ przeciwbakteryjny na bakterie Gram-dodatnie i oczekuje się, że będzie użyteczny jako środek przeciwbakteryjny lub dodatek do paszy, szczególnie jako środek przyspieszający wzrost i zwiększający wydajność paszy dla zwierząt domowych i ptactwa, zawierający antybiotyk F-0769 jako składnik czynny, co dotyczy też sposobu przyspieszania wzrostu zwierząt domowych i ptactwa oraz zwiększania wydajności ich paszy polegającego na tym, że zwierzętom i ptactwu podaje się antybiotyk F-0769 w skutecznej ilości. Dalej, antybiotyk F-0769 ma właściwości przeciwnowotworowe i oczekuje się, że będzie on użyteczny jako środek przeciwnowotworowy.

Wynalazek zostanie obecnie opisany z dalszymi szczegółami, z odniesieniem się do przykładów. Tym niemniej jednak, należy rozumieć, że zakres niniejszego wynalazku nie jest w żaden sposób ograniczony do tych specyficznych przykładów.

Przykład I. Otrzymywanie antybiotyku F-0769.

Jako podłoże do hodowli posiewowej stosuje się bulion hodowlany o pH 7,8 /przed wyjałowieniem/, zawierający 1% glukozy, 3% skrobi, 0,1% ekstraktu mięsnego, 0,4% drożdży piwnych, 0,2% chlorku sodowego, 2,5% mąki sojowej i 0,1% węglanu wapniowego.

Po 70 ml podłoża do hodowli posiewowej 'wprowadza się do każdej z 500 ml kolb Erlenmeyera, po czym każdą kolbę inokuluje się Streptomyces violaceusnigar szczep F-0769 /FERM BP 1264/ i prowadzi się hodowlę, przy wstrząsaniu, w temperaturze 28°C, w ciągu 48 godzin. Następnie przenosi się 1 litr tego bulionu z hodowlą posiewową do tanku zawierającego 100 litrów podłoża hodowlanego produkcyjnego.

Podłoże hodowlane produkcyjne w swoim składzie zawiera 1,5% glukozy, 4,5% skrobi, 0,1% ekstraktu mięsnego, 0,4% drożdży piwnych, 0,2% chlorku sodowego, 2,5% mąki sojowej, 0,1% węglanu wapniowego, 0,05% CoCl2’6 H20,0,05% FeSC>47 H2O i 0,2% środka przeciwpieniącego CA-123 /produkcji Nippon Oil and Fat Co., Ltd./ /pH 7,0 przed wyjałowieniem/. Hodowlę prowadzi się w temperaturze 30°C w ciągu 96 godzin przy mieszaniu z napowietrzaniem. Powietrze wprowadza się w ilości 100 litrów/min przy 200 obrotach mieszadła/min.

Po zakończeniu hodowli, wartość pH bulionu hodowlanego doprowadza się do 8,0 i po dodaniu 4% Celite jako pomocy filtracyjnej, brzeczkę sączy się w celu oddzielenia przesączu od komórek bakteryjnych. Następnie, do komórek tych dodaje się 100 litrów mieszaniny acetonu /90%/ i wody i całość miesza się w ciągu godziny. Następnie mieszaninę sączy się i oddestylowuje

155 985 aceton pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymuje się 10 litrów roztworu wodnego. Tak otrzymany roztwór wodny łączy się z przesączem hodowli i całość poddaje dwukrotnie ekstracji 50 litrami octanu etylu. Ekstrakt octanowy tak uzyskany zatęża się i otrzymany koncentrat poddaje adsorpcji na kolumnie z tlenkiem glinowym /średnica 5,5 cm X 10 cm/ uprzednio poddanym działaniu octanu etylu, a następnie rozwija się ją metanolem, w wyniku czego eluuje się aktywną frakcję. Frakcję aktywną zbiera się i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem, dzięki czemu metanol oddestylowuje, w wyniku czego otrzymuje się 75g substancji o konsystencji oleju.

Następnie, tak otrzymaną oleistą substancję rozpuszcza się w niewielkiej ilości chloroformu i poddaje adsorpcji na kolumnie upakowanej żelem krzemionkowym z chloroformem, a następnie kolumnę rozwija się mieszaniną rozpuszczalników złożoną z chloroformu i metanolu /100:3/. Frakcję aktywną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy, w wyniku czego otrzymuje się 12g antybiotyku F-0769 jako produktu surowego w postaci proszku. Następnie, 12g tak otrzymanego produktu surowego w postaci proszku rozpuszcza się w małej ilości octanu etylu i poddaje adsorpcji na kolumnie upakowanej żelem krzemionkowym z octanem etylu, po czym kolumnę rozwija się octanem etylu. Frakcję aktywną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy, w wyniku czego otrzymuje się 3,3g antybiotyku F-0769 jako produkt surowy w postaci proszku. Następnie, 3,3 g tak otrzymanego produktu surowego w postaci proszku rozpuszcza się w metanolu i poddaje chromatografii żelowej na kolumnie upakowanej Sephadex LH-20 z metanolem.

Frakcję zatęża się i suszy, w wyniku czego otrzymuje się 2,7g antybiotyku F-0769 w postaci proszku o barwie białej lub jasnożółtej. Temperatura topnienia 245-250°C.

Przykład II. Środek - dodatek do paszy.

Antybiotyk F-0769 1%

Skrobia kukurydziana 99%

Obie te substancje proszkuje się i miesza z otrzymaniem jednolitej mieszaniny, w wyniku czego otrzymuje się przedmieszkę zawierającą 1% antybiotyku F-0769.

Przykład III. Badanie wydajności karmy na kurczętach. Badany czynnik i pasza.

Antybiotyk F-0769 w ilości 0,10 lub 20 ppm miesza się z otrzymaniem jednolitej mieszaniny z karmą dla kurcząt w postaci kompletnej mieszanki paszowej /produkcji Oriental Yeast Co./.

Kurczęta użyte do badań. Każdej, złożonej z 10 osobników, grupie kurcząt /kurek// Shever-Star-Bro, hodowanych na mięso, podaje się bez ograniczenia karmę w ciągu 8 tygodni i dokonuje się pomiarów wagi ciała i ilości spożytej karmy. Otrzymane wyniki przedstawia tabela 2.

Stwierdzono, że w rezultacie dodania do karmy antybiotyku F-0769, współczynnik zapotrzebowania na karmę polepszył się o 3-4%, a przyrost wagi polepszył się o 5-6%.

Tabela 2

Gru- pa	Ilość antybiotyku F-0769 dodanego do karmy /ppm/	Średnia waga przy , rozpoczęciu badań /g/	Średni przyrost wagi podczas okresu badania /g/	Średnia ilość karmy spożytej podczas okresu badania /g/	Współczynnik zapotrzebowania na karmę*'	Polepszenie współczynnika zapotrzebowania na karmę**' /%/
1	10	93,5	2449,8	5290,1	2,159	3,1
2	20	94,0	2460,1	5299,0	2,154	3,3
3	0	93,5	2325,0	5179,5	2,228	-

W tabeli 2 użyto następujących oznaczeń.

Średnia ilość karmy ^X/Współczynnik spożytej podczas okresu badania zapotrzebowania = _______ na karmę Średni przyrost wagi podczas okresu badania , Współczynnik zapotrzebwania x 'Polepszenie współczynnika na karmę gdy dodano F-0769 zapotrzebowania na karmę w/%/ = (1-____X 100

Współczynnik zapotrzebowania na karmę gdy nie dodano antybiotyku

Przykład IV. Badanie wydajności paszy na świniach. Świnie użyte do badań: gatunek rasy krajowej

155 985

Pasza podstawowa a/ Od początku badania do zakończenia 4 tygodni: 60% ziarna /kukurydza, pszenica, jęczmień/, 15% makuchów sojowych, 15% paszy pochodzenia zwierzęcego /mleko odtłuszczone w proszku, mączka rybna/ i 10% innych składników /enzym, węglan wapniowy, fosforan potasowy, chlorek sodowy itd./.

b/ Od 4 do 12 tygodni: 78% ziarna /kukurydza, miro, pszenica/, 13% makuchów sojowych, 5% mączki rybnej i 4% innych składników /węglan wapniowy, fosforan wapniowy, chlorek sodowy itd./.

Sposób postępowania.

Trzydzieści młodych świń, średnio 35-dniowych, dzieli się na 3 grupy, z których każda składa się z 10 świń, tak że średnia waga byłaby zasadniczo równa. Antybiotyk F-0769 dodaje się do paszy podstawowej w ilości, odpowiednio 0,5 i 10 ppm. Następnie te trzy grupy świń karmi się odpowiadającymi im paszami w ciągu 12 tygodni. Następnie dokonuje się pomiarów wagi ciała i ilości spożytej paszy. Otrzymane wyniki przedstawia poniższa tabela 3.

Stwierdzono, że w rezultacie dodania do paszy antybiotyku F-0769, współczynnik zapotrzebowania na paszę polepszył się o 4-6%, a przyrost wagi polepszył się o 5-8%.

Tabela 3

Gru- p^a	Ilość antybiotyku F-0769 dodanego do paszy /ppm/	Średnia waga przy rozpoczęciu badań /kg/	Średni przyrost wagi podczas okresu badania /kg/	Średnia ilość paszy spożytej podczas okresu badania /kg//	Współczynnik zapotrzebowania X/ na paszę '	Polepszenie współczynnika zapotrzebowania XX na paszę /%/
1	5	8,20	45,80	107,0	2,336	4,5
2	10	8,22	47,02	108,9	2,316	5,3
3	0	8,22	43,73	107,0	2,446	-

W tabeli 3 użyto następujących oznaczeń:

Średnia ilość paszy ^X/Współczynmk spożytej podczas okresu badania zapotrzebowania = ___ na paszę Średni przyrost wagi podczas okresu badania

Współczynnik zapotrzebowania na paszę ^xx/Polepszenie współczynnika gdy dodano F-0769 zapotrzebowania na paszę w /%/ = (1- _f X 1(0)

Współczynnik zapotrzebowania na paszę gdy nie dodano antybiotyku

PrzykładV. Badanie wydajności paszy na przeżuwaczach. Bukaty użyte do badań: Holstein.

Koncentrat paszowy.

71,5% ziarna /kukurydza, miro, jęczmień/, 11,5% sieczki i otrąb /kukurydziana pasza glutenowa, otręby pszenne, makuchy z otrąb ryżowych/, 5,5% makuchów z roślin oleistych /makuchy sojowe, makuchy lniane/ oraz 11,5% innych składników /mąka z lucerny, melas, fosforan wapniowy, chlorek sodowy,/.

Sposób postępowania.

Piętnaście wykastrowanych bukatów Holstein, 8-miesięcznych dzieli się na trzy grupy, z których każda składa się z 5 bukatów, tak że średnia waga ciała będzie zasadniczo równa. Do podstawowego koncentratu paszowego dodaje się antybiotyk F-0769 w ilości, odpowidno 0,7,5 i 15 ppm. Trzy grupy bukatów karmi się odpowiadającymi im paszami. Opórcz tego, skarmia się wysuszoną słomę ryżową, jako paszę surową, w ilości 1 kg na bukata. Otrzymane wyniki przedstawia poniższa tabela 4.

Stwierdzono, że w rezultacie dodania do paszy antybiotyku F-0769, współczynnik zapotrzebowania na paszę polepszył się o 4-6%, a przyrost wagi polepszył się o 7-8%.

155 985

Tabela 4

Gru- pa	Ilość antybiotyku F-0769 dodanego do paszy /ppm/	Średnia waga przy rozpoczęciu badań /kg/	Średni przyrost wagi podczas okresu badania /kg/	Średnia ilość paszy spożytej podczas okresu badania /kg/	Współczynnik zapotrzebowania na pasz.ę^x/	Polepszenie współczynnika zapotrzebowań i a XX/ na paszę /%/
1	7,5	321	301	2340	7,774	5,9
2	15	320	303	2382	7,861	4,8
3	0	323	281	2320	8,256	-

W tabeli 4 użyto następujących oznaczeń:

Średnia ilość paszy ^Współczynnik spożytej podczas okresu badania zapotrzebowania = -,--na paszę Średni przyrost wagi podczas okresu badania _ Współczynnik zapotrzebowania na paszę *^x'Polepszenie współczynnika gdy dodano F-0769 zapotrzebowania na paszę w/%/ =(1- - X100 i

Współczynnik zapotrzebowania na paszę gdy nie dodano antybiotyku

Na podstawie poprzednich przykładów badawczych III-V oczekuje się, że antybiotyk wytworzony sposobem według wynalazku będzie użyteczny jako dodatek paszowy.

Stężenie antybiotyku F-0769 jako środka zwiększającego wydajność paszy jest zmienne, w zależności od rodzaju i wieku zwierząt i ptactwa oraz w zależności od okresu lub częstotliwości karmienia. Tym niemniej jednak, zazwyczaj znajduje się ono w zakresie od 1 do 200 ppm, korzystnie od 2 do 100 ppm.

Antybiotyk można zmieszać z paszą bezpośrednio, albo po sformułowaniu go w odpowiednią postać z nośnikiem lub adiuwantem. Inaczej, można go podawać w wodzie pitnej.

W zależności od rodzaju zwierząt lub ptactwa, antybiotyku można użyć w kombinacji z innym czynnikiem, np. innym antybiotykiem, takim jak salinomycyna, monensyna lub lasalocyd, znany jako środek przeciw kokcydiozie dla ptactwa domowego.

Dalej, antybiotyku F-0769 można także użyć w kombinacji z innymi czynnikami przeciwbakteryjnymi lub czynnikami hormonalnymi, albo z innymi substancjami naturalnymi wykazującymi efekty zwiększania wydajności paszy, ich ekstraktami, antybiotykami lub związkami syntetycznymi.

Przykład VI. Badanie aktywności przeciwnowotworowej.

Antybiotyk F-0769 podaje się dootrzewnowo myszom BDFi z nowotworem, mającym po 388 komórek nowotworowych, i bada się aktywność przeciwnowotworową, w wyniku czego stwierdzono, że antybiotyk ten wykazuje skuteczną aktywność przeciwnowotworową w dawce od 0,08 do 1,25 mg/kg.

Oceny dokonuje się na tej podstawie, że w przypadku, w którym stosunek dni przeżycia w grupie leczonej do dni przeżycia w grupie bez antybiotyku /to znaczy T/C %/ wynosi co najmniej 130%, antybiotyk określa się jako „skuteczny. Otrzymane wyniki przedstawia tabela 5.

Tabela 5

Dawka antybiotyku F-0769 /mg/kg/	T/C /%/	Ocena
1,25	133	Skuteczny
0,625	133	Skuteczny
0,313	133	Skuteczny
0,156	133	Skuteczny
0,080	133	Skuteczny

Na podstawie powyższych wyników oczekuje się, że antybiotyk F-0769 będzie użyteczny jako środek przeciwnowotworowy.

Przykład VII. Badanie toksyczności ostrej.

Toksyczność ostrą określa się na podstawie przeżycia lub śmierci w cięgu 2 tygodni od podania antybiotyku myszom samcom JCL/ICR, 5-tygodniowym, o wadze ciała 21-23 g. LDso po podaniu dootrzewnowym wynosiła około 20 mg/kg.

FIG.h

FIG.3

FIG 2

FIG.1

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania nowego antybiotyku F-0769 wykazującego następujące właściwości: /1/ wygląd zewnętrzny: proszek o barwie białej i jasnożółtej, /2/ temperatura topnienia: 245-250°C, /3/ skręcalność właściwa: [ct]D⁵ = -37,5° /c = 1, metanol/, /4/ rozpuszczalność w rozpuszczalnikach: rozpuszczalny w metanolu, etanolu, acetonie, chloroformie, octanie etylu i benzenie, nierozpuszczalny w wodzie i heksanie, /5/ analiza elementarna /%, znaleziono/: C 57,53, H 7,36, O 21,17, N 12,97, /6/ widmo absorpcji w nadfiolecie /na podstawie pomiarów w metanolu/: jak przejawiono na fi^g. 1, Amwt/Eicm/ = ²13nm/⁴⁶6/^{, 286} /²°% /7/ wtfmo a^bsor^pcjⁱ w ^po^dczerwieni /na podstawie pomiarów w KBr/: jak przedstawiono na fig. 2, /8/ widma jądrowego magnetycznego rezonansu /na podstawie pomiarów w ciężkim chloroformie./: widmo ¹H-NMR jak przedstawiono na fig. 3, oraz widmo ¹³C-NMR jak przedstawiono na fig. 4, /9/ rozróżnienie między charakterem zasadowym, kwasowym a obojętnym: substancja obojętna, /10/ analiza aminokwasów: w wyniku hydrolizy z użyciem 6 N kwasu solnego w temperaturze 110°, w ciągu 18 godzin wykryto aminokwasy, to jest treoninę, walinę i leucynę, /11/ reakcje barwne: dodatni wynik reakcji z jodem i reakcji z nadmanganianem potasowym, a ujemny wynik reakcji z ninhydryną i z chlorkiem żelazowym, /12/ chromatografia cienkowarstwowa /przy zastosowaniu żelu krzemionkowego, Art. 5715, produkcji Merck Co./,

Układ rozpuszczalników Wartość Rf octan etylu 0,16 octan etylu - metanol /5:1/ 0,33 chloroform - metanol /10: 1/ 0,68 octan etylu - aceton/1: 1/ 0,31 aceton - benzen /5: 1/ 0,40, /13/ masa cząsteczkowa: na podstawie pomiaru metodą Rasta/: około 745, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę drobnoustroju wytwarzającego antybiotyk F-0769, takiego jak Streptomyces violaceusnigar F-0769, a następnie z produktu hodowli wyodrębnia się antybiotyk F-0769.