PL154777B1 - Sposób wytwarzania nowego fenylokarbaminianu - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	OPIS PATENTOWY	154 777
	Patent dodatkowy do patentu nr---	Int. Cl.5 C07C 271/44
w	Zgłoszono: 88 03 04 /P. 271009/ Pierwszeństwo ——-	gnuwu
URZĄD PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 89 09 18
RP	Opis patentowy opublikowano: 1991 12 31

Twórca w<^nalezku

Uprawniony z patentu: Sandoz A.G.,

Bazylea /Szwajcaria/

SPOSÓB WYTWARZANIA NOWEGO FENYLOKARBAMINIANU

Przedmiotem wynalazku Jest sposób wytwarzania nowego fenylokarbaminianu o aktywności antycholinoesterazy.

W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania /S/-N-etylo-3-//l-mirnetylomrnino/ etylo/NNminetylofnnylkkabbaminianu o wzorze przedstawionym na rysunku w postaci soli addycyjnej z kwasem. 3ak widać ze wzoru, związek przedstawiony na rysunku w postaci wolnej zasady ma znak obrotu /-/. Oednakże w postaci soli addycyjnej z kwasem może być /+/ lub /-/. Na przykład znak obrotu wodorowinianu Jest /♦/. Wynalazek obejmuje postać soli addycyjnej z kwasem, niezależnie od znaku obrotu.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że enancjomer /-/ związku o wzorze przedstawionym na rysunku i jego farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasem, określane dalej Jako związki wytwarzane sposobem według wynalazku, wykazują wyraźne i selekfwne hamowanie acetylocholinoesterazy.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku nie były dotychczas ujaWnione w literaturze.

Sposób według wynalazku wytwarzania przedstawionego no rysunku związku w postaci soli oddycyjnej z kwasem, polega na tym, że rozdziela sią enancjomery /+/-N-etylo-3-//l-diraetylo/ omino/etyli/-N-mftylofenyiokabbaminianu za pomocą tworzenia soli, stosując np. kwas di-O,O’-p/ tiluoiiowinowy lub 3-blomokam0oro/1O-su0looowy i nastąpnie frakcjonowanej krystalizacji, po czym otrzymany związek przeprowadza się w sól addycyjną z kwasem.

Racemat w postaci wolnej zasady otrzymuje sią przez amidowenie oć-m—lydroksyfenyloetylodimetyloaiiny odpowiednim halogenkiem kkrbomollu. Sole addycyjne z kwasem wolnej zasady o wzorze przedstawionym na rysunku moZna ^^i^^^zoć z wolnej zasady w znany sposób. Obejmują one na przykład wodorowinian.

154 777

154 τη

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazuję działanie farmakologiczne, jak wykazano w standardowych testach i są stosowane Jako środki farmaceutyczna. Szybko docierają do centralnego układu nerwowego po podaniu szczurom podskórnie, dootrzewnowe lub doustnie. Wywwerają wpływ na seleki^ne hamowwnle działania acetylocholinoasterazy w obszarze mózgu, przy czym hipokampowy i korowy enzym jest bardziej hamowany niż acetylocholinoesteraza pochodząca z rdzenia ciała prążkowanego i mostu. Ponadto mają długi czas działania.

Następujące wyniki ilustrują przykładowo farmakologiczny profil związków wytwarzanych sposobem według wynalazku w porównaniu z odpoweedniil izomerami 1 ^cenetami. Związek A Jest związkiem wytwarzanym sposobem według wynalazku w postaci wodorowwnianu. Związek B Jest izomerem optycznym tej soli. Symbol C oznacza mieszaninę racemiczną związku wytwarzanego sposobem według wynalazku 1 jago izomeru optycznego w postaci chlorowodorku. Elektrycznie wywołane ^βΟΙιιΙζ H-ecetylocholiny ze skrawków hipokampu szczurów. Ulewania nie elektrycznie 3 3

H-ecetylocholiny / H-ACh/ ze skrawków hipokampu szczurów stanowi funkcjonalny model ln vltro do badania presynaptycznych auskarynowych autoreceptorów agonistów i antagonistów. Ten model można również stosować Jako pośrednią metodą oceny leków, które hamują łcetylocholinoztterłzą /AChE/. Hłioweaił aktywności AChE prowadzi do ^emulowania endogennej ACh, która wówczas wzajemnie oddziaływuje z prasynaptycznyml muskarynowymi autoreceptor^a^^ i dalej hamuje uwa^ienie H-ACh.

Skrewki hipokampu szczura Wistar, 180 - 200 g/ otrzymuje sią przez poprzeczne pocięcie zdrowych skrawków hipokampu w odstępie 0,4 mm nożem do tkanek /cllwaine. Skrewkl hipokampu otrzymane z szczurów inkubie si^ę przez ³⁰ minut w temperaturze ²³°C w S ml medium Krebsa-Singera zawierającym 0,1 uCi H-choliny i przenosi do komory do przechładzania przechładza z medium Krebsa zawierającym 10 yu/ hθmichoSinium-3 z szybkością 1,2 al/rnin.

w tempera turze 30°C. Zlzieranie 5 minutow^h frakcji przechodzonej substancji rozpocz^yna s^ię po 60 minutach przechadzania. Owa okresy elektrycznej stymula^i /2Hz impulsy prostokątne msec, 10 mA, 2 min/ stosuje się po 70 min. /S^/ i po 125 min. /Sg/ przechadzania. Badane substancje są dodawane 30 min. przed Sg 1 są obecne w medium przechładzającym aż do 145 min. przechadzania. Na koniec eksperymentów skrawki roztwarza się w stężonym kwasie mrówkowym i oznacza zawartość trytu w tub8tancji przechodzonej i roztworzonych skrawkach. Wypływ trytu wyraża się jako frakcyjna szybkość wypływu trytu na minutę. Elektrycznie wywołany wypływ trytu oblicza się przez odejmowanie ekstrapoSowanegs głównego wypływu trytu od całkowitego wypływu trytu podczas dwóch minut elektrycznej stymu^ac^ i następujących 13 minut i wyraża jako procentową zawartość trytu w momenie rozpoczęcia zbierania próbki. Wpływ leku na wypływ trytu wywołany stymulacją wyraża się stosunkiem S^/S^. Wszystkie próby przeprowadzano podwójnie stosując 12 kanałowy system przechodzenia. Dla obliczeń stosuje się program kompo^Towy.

W tym teście związek A hamuje elektrycznie wywołane lwełniłnie H-ACh ze skrawków hipokampu w przybliżeniu 40% /100yuM/, podczas gdy racemit C /lOOyu// hamuje w przybliżeniu 25%. Hamuj ce działanie związku A i racematu C może być antagonizowane atropiną. Te wyniki są porównywał ne z hamującym działaniem AChE. Związek B jest w tym modelu nieaktywny.

Haiowenie acetylochslinoettzrazy w różnych obszarach mózgu szczurów. W tym teście są stosowane preparaty AChE różnych obszarów mózgu szczurów /kora, hipokampus, ciało prążkowane/ i oznaczane Jest IC₅q /stężenie hamujce wyuM/. Preparaty enzymu są uprzednio inklbowanz z inhibisozim 15 minut przed oznaczaniem.

Aktywność AChE mierzy się według metody opisanej przez Eimmana /Arch. Biochem. Biophys 82, 70, 1959/. Tkankę mózgu szczura hsimsezizuje się w zimnym buforze fosfo^ownym o pH 7,3 /0,25 mM/ zawierającym 0,1% Rioomi Χ-100. Po odwirowaniu podwwelokrotności przezroczystego nadsączu stosuje się juko źródło enzymu. Enzym inkubuje się wstępnie z różnymi stężeniami inhibitora. Po różnych czasach dodaje się substrat /acetylotSochslinoSodek 0,5 mM/ i oznacza się pozostającą aktywność.

Wyniki są podane w tabeli.

154 777

Tabela

• ^C50 '	Kora i
	zwięzek A 1	2,8	1 l
	zwózek 8 i	16,1	a
	rac^^^t C ________ i_	3,2	I 1

r

Hipokamp	a - u -	Ciało prężkow^e
3.7	a |	3,0
14,5		13.8
3.9	a - U ·	3.2

□ak wynika z tabeli ham^»^an^e AChE związkiem A jest nieznacznie większe niż recemetem C, podczas gdy zwięzek 8 jest znacznie anlej aktywny.

Hamowwnle ecetylocholinoesterezy ex vivo w różnych obszarach Mózgu szczurów.

minut po podaniu różnych dawek zwięzku A mierzy się aktywność AChE w różnych obszarach mózgu szczurów ex vivo. Metoda jest opisana poi^yaj. Uzyskano wartości IC^g 7yummll/kg dla ciała prążkowanego przy podawaniu doustnym, 4 yjamla/kg dla hipokampu przy podawaniu doustnym i 2 ^imoj/kg dla kory przy podawaniu doustnym. Wartości ICgQ otrzmmane po podaniu racematu C sę dla wszystkich badanych obszarów 2-3 krotnie wyższa. Sześć godzin po podaniu zwięzku A /10yummH/kg douetnia/ AChE w ciele prążkowanym jest Jeszcze hamowane w 16%, podczas gdy w tym samym czasie aktywności w korze i hipokampie sę hamowane kolejno w 39% i 44%.

Próby in vivo. Oddziaływanie na metabolizm dopem.ny

W eksperymentach ostrych 1 subchronicznych stosowano szczury płci męskiej OPA o wadze 150 - 200 g. Zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnych okresach światła i. ciemności. Zwierzęta zabijano zawsze między godzinę 11,00 a 13,00. Mózgi wycinano natychalast, preparowano na lodzie według metody Głowińskiego i Iversena, 3. Neurochem. 13, 655 /1966/, zaarażano na suchym lodzie i próbki tkanek przechowywano w temperaturze -80°C aż do analizy·

Dopaminę i jej metabbHty DOPAC /kwas 3.4-dίhydfoksyfenylolctowy/ i HVA /kwas hoιyywanlllnowy/ oznacza się w ekstraktach tkanki Bózgowej , które otrzymuje się przez homooenizację przecho wywanych próbek tkanki w 0.1 N HCl zawierający 0.05 aM kwasu askorbinowego, a następnie odwirowaniθ· Stosuje się tkanki ciała prężkowanego i kory.

Oznaczanie meeebolitów prowadzi się stoeujęc technikę chrommtoogafU gazowej /fragmentografii yasowat//GCMS/ opisanę przez Karoum i in., 0. Neuronem. 25, 653 /1975/ i Catabeni i in.. Science 178, 166 /1972/ lub metodę fJ^uoi^omti^^^z^nę opisanę przez Waldemynef i Matre, Analyt. Biochem. 51, 474 /1973/. Ekstrakty tkanek dla metody GCMS otrzyuje się przez dodanie znanych ilości deuterowniych monoamin i ich poszczególnych aetabolit<to Jako wzorców wewaitrznych.

Metabolizm dopaminy w ciele prężkowany zwiększa się po podaniu zwięzków A i 8 i racmatu C. Ta właściwość Jest konsekwencję akumylaαJi acetylocholiny ^^wo^^^j przez te związki. Jednakże zwięzek A jest bardziej aktyny niż zwięzek B i raceaat C w zwiększaniu stężenia metabolitu dopaminy ciała prążkowanego. Wpływ auskaryny i nikotyny na wykorzystanie glukozy w mÓZgU.

Zalany w funkcjonowaniu aktywności CNS sę zwięzane z odmienny wykorzystaniem deokeyglukozy /OO^/ w mózgu, które noże być uwidocznione jednocześnie w kilku obszarach mózgu przy zastosowaniu rudίograflczinJ ^^tody Sokoloff i in., 3.Neurochem. 28, 897 /7977/. Podawanie laków cholinergicznych bezpośrednio /agonisty ^skary^^e/ lub pośrednio /akumulacja acetylocholiny/ wyc^Je w tym modelu charakterystyczny wzór “odcisku* moOyZikując regionalny metabolizm glukozy.

Stosuje się szczury Wistar płci męskiej o wadze ISO - 200 g. Laki podaje się w różnych dawkach i różnym i drogami /dożylnie, doustnie, ófó-otΓzewiowo/ zwierzętom. ^^^--deoksyglukozę /125^/*9/ wstrzykuje się 45 minut przed zrbicney zwierząt. Mzgl natychmiast wycina się. zwr^a ^-o ^tny^βr^tur^z ^i°^OC. a następnie tnle na skrawki o ^uboścl 20Minrz^z się gęstości optyczne obrazów radiograficznych według yoO-ZlkacJl Sokoooff i innych.

Po doustnym podaniu zwięzków A i 8 /7,5 ^imola/kg/ obserwuje się znaczne zmiany w wykorzystaniu OOG w różnych obszarach aózgu szczurów. Wpływ zwięzku A jest silniejszy niż wpływ zwięzku 8 podczas poczętkowych 30 ainut. Najbardziej wyraźne zmiany znajduję się w widzialnych

154 777 obszarach 1 wzgórzu wybrzuszonym,jak również w Jądrze z poprzeczną mdą.

Poziomy acetylocholiny w różnych obszarach mózgu szczurów.

Działanie związków A i B i racematu C jako inhibitorów in vlvo oznacza się przez pomiar poziomów ACh w różnych obszarach mózgu szczurów w różnych czasach po podaniu leku.

Stosuje się szczury OFA o wadze 200 - 230 g. Zwierzęta zabija się przez napromieniowanie mikrofalami zogniskowane na głowie /moc robocza 6 kw, napromieniowanie 2450 MHz, czas 1,7 s, Pueschner Mikrowellen-Energietechnik, Bremaa/. Mózgi usuwa się,preparuje według Glowins^ego 1 Iversena /1966/ 1. ^przec^howuje w temperaturze -70°C aż ^do analiz^y. Części mózgu htmotee/zuja się w 0,1 M kwasie nadchlooowym zawierającym wewnntrzne deuterowane wzorce ACh-d^ 1 ^/οΠοΗ/»/^^ Po odwirowaniu endogenne ACh 1 Ch razem z ich dauterowa/ymi wariantami ekstrahuje się dipikryooaminę /2,2*,4,4',6,6* -hak8anitrtdifenyloaminą/ w dichlooometanie jako parę jonową. Częóci Ch pochodzące z chlorku propionylu 1 uzyskaną mieszaninę ACh i pochodnych propylochollny demmtyluje sią benzenotioOβnem sodu i poddaje analizie metodę fragmentografU masowej według 3adnano 1 in. Anal. Blochem., 55, 438 - 448 /1973/.

Pojedyncze podawania doustne 25 yjamol/kg zwiększa stężanie ACh w ciele prążkowanym, korze i hipo^i^ie. Maksymalny afekt osiąga się około 30 minut po doustnym podaniu i zanika on przez następne 3-4 godziny. W korze i hipokampie poziomy ACh sę jednak znacznie wyższe po 4 godzinach w porównaniu z próbami kontrolnymi. Efekty sę zależna od dawkk. Wpływ związku B jest znacznie słabszy niż wywołany przez racemat C i wpływ racemat C jest znacznie słabszy niż wywołany przez związek A. Ponadto związki wytwarzane sposobem według wynalazku sę dobrze toJ^eo^wane 1 aktywne doustnie i maję długi czas działania, na przykład w powyższym i innych testach standardowych. Zwięzki wytwarzana sposobem według wynalazku nadają się do leczenie otępienia starczego, choroby Alzheimera, plęsawicy Huntingtona, zwolnionej dyskinezy, hiperkinezy, mani, ostre zaburzenia dezorientacji, zespołu Downa 1 atakaj! Friedricha. Dawka dzienna wynosi od około 0,1 do około 25 mg, na przykład około 0.1 do około 5 mg związku wytwarzanego sposobem według wynalazku, razem ze stałym lub ciekłym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem Związki wytwarzane sposobem według wynalazku służę na przykład do leczenia otępienia starczego choroby Alzheimera, plęsawicy HungtΙ^^/β, zwolnionej dyskinezy, hiperki/azł, mani, ostrych zaburzeń dezotiθntaaJ1, zespołu Downa 1 ataksji Fridricha. Stosowane órodki farmaceutyczne zawierają związek wytwarzany sposobem według wynalazku w połączeniu z co najmniej jednym farmaceutycznym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Takie kompooycJa mogą być wytwarzane w ko/Wθn/Jonθlny sposób.

Wynalazek ilustruje następujący przykład, w którym temperatury sę /ieskorygowα/e i są wyrażone w stopniach Celsjusza.

Przyk ład. Sposób wytwarzania wodorowinianu /S/-N-etylo-3-//l-miΓełylammint/ γ tyloZ-N-metylo fenyloka rbamin ianu.

130 g /+-/-!'l--etyto-3-//l-diιnetylia/tno/łtylo/-m-mettlo/entiokarbamlnOanu i 210 g monohydratu kwasu /'«‘/-di-0.0'-pttoltilo/tnowego rozpuszcza się ogrzewając w 1,3 1 mieszaniny metanolu i wody w stosunku 2:1. Sól wytrąconą po ochłodzeniu odsącza się i krystalizuje trzykrotnie z mieszaniny metanolu i wody w stosunku 2:1. Enanccomme-/S/ jest wydzielany przez rozdzielenie mi^ędz^y 1 ^{- -}a^OH i eter. //^θη · -3^2,1° /c « ⁵ w eranolu/. Wodooowinian t^ytułowego związku /z etanolu/ topnieje w temperaturze 123-125 . /^6/ d +4,7 je = 5 w etanolu/.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie iαtentowe

   Sposób wytwarzania nowego /S/-N-etytO3^-//l-mΓmłty0omm/oo/eetylo-·-m-Γełylof/łytokarbaminianu o wzorze przedstaw^n^ na rysunku w postaci soli addycyjnej z kwasem, znamienny t y m, że rozdziela się Γ/Γ/Jjtmerł /+/—-ełyto33-//l-mimetylomm/no/ełyto/-NimΓtłlofenylokarbaiinia/u za pomocą tworzenia soli i frakcjonowanej krystalizacci, po czym otrzymany związek przeprowadza się w sól addycyjną z kwasem.