PL153459B1 - A method of 3-azidenucleosides production - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 153 459 POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 86 09 15 (P. 261404)

Pierwszeństwo: 85 09 27 Wielka Brytania

Int. Cl.⁵ C07H 19/073

URZĄD

PATENTOWY

RP

CZYTEf HIA OGÓLNA

Zgłoszenie ogłoszono: 88 07 21

Opis patentowy opublikowano: 1991 12 31

Twórca wynalazku--Uprawniony z patentu: The Wellcome Foundation Limited, Londyn (Wielka Brytania)

Sposób wytwarzania nowych 3'-azydonukleozydów

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych 3'-azydonukleozydów oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych pochodnych. Związki te są użyteczne do wytwarzania środków farmakologicznych znajdujących zastosownie w terapii, szczególnie w leczeniu i zapobieganiu chorobom wywoływanym przez infekcje wirusowe i bakteryjne.

W dziedzinie chemioterapii przeciwwirusowej istnieje niewiele leków skutecznie zwalczających wirusy, ze względu na trudność atakowania wirusa bez uszkadzania komórek gospodarza. Przez długi czas zakładano, ze względu na skrajanie pasożytniczy charakter wirusów, że wszelkie niezbędne warunki dla rozmnażania się wirusów są stwarzane przez komórkę gospodarza. .Ostatnio ustalono, że różne stadia cyklu życiowego wirusa, różne dla różnych gatunków, są determinowane przez sam wirus i te stadia mogą być wrażliwe na atak, gdyż różnią się wystarczająco od jakichkolwiek funkcji komórki gospodarza. Stwierdzono jednak, że ze względu na duże podobieństwo funkcji wirusa i gospodarza, trudno jest dobrać skuteczne leczenie. Z tego powodu, związki zidentyfikowane jako odpowiednie do leczenia infekcji wirusowych są zwykle nieco toksyczne dla gospodarza. Idealny lek jest nietoksyczny w stężeniu skutecznym przeciwwirusowo, ale gdy brak jest takiego, związek powinien charakteryzować się dobrym wskaźnikiem terapeutycznym, to znaczy stężenie, przy którym wykazuje on toksyczność powinno być znaczenie większe od stężenia, przy którym obserwuje się aktywność przeciwwirusową.

Jedną z grup wirusów, której przypisuje się ostatnio szczególne znaczenie, są retrowirusy. Retrowirusy tworzą podgrupę wirusów RNA, które aby mogły być replikowane muszą najpierw „transkrybować odwrotnie RNA w ich genomie w DNA (termin „transkrypcja zwykle oznacza syntezę RNA z DNA). W fazie, w której ma postać DNA, genom wirusowy może zostać włączony w genom komórki gospodarza, co pozwala mu na pełne wykorzystywanie maszynerii transkrypcja/translacja komórek nosiciela. Po włączeniu, DNA wirusa jest w zasadzie nieodróżnialny od DNA nosiciela i w tym stanie wirus może trwać tak długo jak długo żyje komórka. Ponieważ jest on w tej postaci w zasadzie niewrażliwy na żaden atak, zwalczanie musi być stosowane w innym stadium cyklu życiowego wirusa i w razie potrzeby musi być kontynuowane aż do śmierci komórek zarażonych wirusem.

153 459

HTLV-I i HTLV-II są retrowirusami znanymi z tego, że wywołują białaczkę u ludzi. Szczególnie szeroko są rozpowszechnione infekcje HTLV-I i są one odpowiedzialne za wiele przypadków śmiertelnych na całym świecie w ciągu każdego roku.

Gatunek retrowirusa został również reprodukcyjnie wyizolowany od pacjentów cierpiących na AIDS. Chociaż został on wyczerpująco scharakteryzowany, to trwają jeszcze spory co do ustalenia międzynarodowej nazwy wirusa. Znany jest on obecnie jako wirus III limfotropii ludzkich komórek T HTLV III/, retrowirus związany z chorobą AIDS (ARV) lub wirus związany z białaczką limfatyczną (LAV). Wydaje się jednak, że jako nazwa międzynarodowa przyjmuje się wirus związany z brakiem odporności u ludzi (HIV). Wykazano, że ten wirus zakaża i niszczy komórki T zawierające znacznik powierzchniowy 0KT4 i obecnie przyjęto ogólnie pogląd, że jest on czynnikiem sprawczym AIDS. Pacjent stopniowo traci te zespoły komórek T, zostaje zdezorganizowana ogólna równowaga systemu odpornościowego, zmniejsza się zdolność zwalczania innych infekcji i wzrasta podatność na różne infekcje często kończące się śmiercią. Tak więc zwykle przyczyną śmierci chorych na AIDS są towarzyszące infekcje, takie jak zapalenie płuc lub nowotwory, które mogą być wywoływane przez wirusy, a niekoniecznie śmierć może być bezpośrednio spowodowana na skutek zarażenia wirusem HIV. Innymi chorobami związanymi z zakażeniem HIV są trombocytopenia i mięsak Kaposi'ego.

Ostatnio wyodrębniono HIV także z innych typów tkanek, takich jak komórki B wytwarzające znacznik T4, makrofagi oraz tkanki nie związane z krwią w ośrodkowym układzie nerwowym. Infekcje ośrodkowego układu nerwowego niekoniecznie są związane z klasycznym AIDS i stwierdza się je u pacjentów z bezobjawowymi infekcjami HIV. Zakażenie wirusem HIV ośrodkowego układu nerwowego jest związane z postępującą demielinizacją, prowadzącą do wyniszczenia i takimi objawami jak encefalopatia, postępujące trudności w mówieniu, ataksja i dezorientacja. Innymi schorzeniami związanymi z zakażeniem HIV są bezobjawowe nosicielstwo, postępująca uogólniona białaczka limfatyczna (PGL) oraz zespół (ARC) związany z AIDS.

Uważa się obecnie, że niektóre chroniczne infekcje neurologiczne są wywoływane przez retrowirusy. Należą do nich np. stwardnienie rozsiane u ludzi, wirusowe zapalenie mózgu u kóz i infekcje „visna-maedi“ u owiec.

Znane są doniesienia dotyczące testowania 3'-azydonukleozydów wobec różnych retrowirusów, takich jak np. wirus białaczki Frienda (FLV) lub wirus atakujący myszy i szczury. Np. Krieg i wsp. podają w Exp. Celi Res., 116, 21-29 (1978), że 3'-azydo-3'-dezoksytymidyna jest aktwyna wobec FLV w testach in vitro. Ostertag i wsp. stwierdzają, w Proc. Nat. Acad. Sci., 71,4980-4985 (1974), na podstawie aktywności przeciwwirusowej wobec FLV i braku toksyczności wobec komórek, że 3'-azydo-3'-dezoksytymidyna „może korzystnie zastąpić bromodzoksyurydynę w leczeniu chorób wywoływanych przez wirusy DNA“. Natomiast De Clerq i wsp. w Biochem. Pharm., 29,1849-1851 (1980) stwierdzili sześć lat później, że 3'-azydo-3'-dwudezoksytymidyna nie wykazuje znaczącej aktywności wobec jakichkolwiek wirusów w ich testach, w tym wobec takich wirusów DNA jak szczepionki, HSVI oraz wirus ospy wietrznej i półpaśćca (VZV).

Bakterie są także problemem w terapii, gdy jako żywe organizmy charakteryzują się takimi samymi procesami życiowymi jak inne organizmy, a więc substancje toksyczne wobec nich są prawie podobnie toksyczne wobec innych organizmów. Ponadto doświadczenie wykazało, że szczepy bakteryjne rozwijają po pewnym czasie oporność wobec zwykle stosowanych środków przeciwbakteryjnych.

Stwierdzono, że pewne opisane poniżej nowe 3'-azydonukleozydy są użyteczne w terapii zakażeń wirusowych i bakteryjnych, w szególności zakażeń retrowirusami, takimi jak HIV, oraz zakażeń bakteriami Gram-ujemnymi, w tym także szczepami Gram-ujemnymi opornymi wobec zwykle stosowanych środków przeciwbakteryjnych.

Zakażenia retrowirusami atakują często ośrodkowy układ nerwowy, w związku z czym szczególną zaletą tych nowych związków, jak wykazały to doświadczenia, jest zdolność przekraczania bariery mózgowej w skutecznych klinicznie ilościach.

Sposobem według wynalazku wytwarza się nowe 3'-azydonukleozydy o ogólnym wzorze 1, w którym R¹ oznacza grupę hydroksylową lub aminową, R² oznacza atom chlorowca, a linia przerywana w pozycjach 2-6 wskazuje obecność wiązań pojedyńczych lub podwójnych, przy czym

153 459 3 względne pozycje tych wiązań są zdeterminowane zdolnością występowania tautomerii ketoenolowej, oraz farmakologicznie dopuszczalne estry i sole tych związków.

Korzystną grupę nukleozydów pirymidynowych tworzą pochodne cytydynowe, np. związki o wzorze 1, w którym R¹ oznacza grupę aminową, zwłaszcza takie, w których grupa 3'-azydowa występuje w konfiguracji erytro (grupa azydowa skierowana „w dół“), oraz pochodne tymidynowe i urydynowe (np. związki o wzorze 1, w którym R¹ oznacza grupę hydroksylową, a grupa 3'-azydowa występuje w konfiguracji erytro albo trec) (grupa azydowa skierowana „do góry“), oraz nukleozydy nienasycone między pozycjami 5 i 6.

Dalszą grupę korzystnych związków o wzorze 1 stanowią takie związki, w których jeden lub większa liczba podstawników R¹ i R² ma znaczenie podane poniżej, a mianowicie: R¹ oznacza grupę aminową, R² oznacza atom chloru lub bromu, gdy R¹ oznacza grupę hydroksylową, oraz 5'-pochodne tych związków, w tym estry alkilowe o prostych lub rozgałęzionych łańcuchach, ewentualnie podstawione grupą karboksylową (np. bursztynian), Ci-e-tioestry, ewentualnie podstawione estry arylowe, mezylany, glukoroniany albo jedno-, dwu- lub trójfosforany.

Grupa 3'-azydowa może występować w dowolnej konfiguracji ale szczególnie korzystna jest konfiguracja erytro, a korzystnymi farmakologicznie pochodnymi są 5'-estry prostych kwasów organicznych, korzystnie o 1-18 atomach węgla.

Określenie „farmakologicznie dopuszczalna pochodna oznacza farmakologicznie dopuszczalną sól, ester lub sól takiego estru, albo każdy inny związek, który po poddaniu biorcy jest zdolny (bezpośrednio lub pośrednio) do wytwarzania macierzystego 3'-azydonukleozydu lub jego skutecznego terapeutycznie metabolitu albo produktu rozkładu. Przykładem pochodnej nieestrowej jest pochodna, w której atomy węgla w pozycjach 5' i 2 są połączone przez atom tlenu tworząc grupę anhydro.

Korzystnymi estrami związków o wzorze 1 są estry kwasów karboksylowych, w których niekarbonylowa grupa ugrupowania estrowego jest prostą lub rozgałęzioną grupą alkilową, alkoksyalkilową (np. metoksymetylową), aryloalkilową (np. benzylową), aryloksyalkilową (np. fenoksymetylową), arylową (np. fenylową ewentualnie podstawioną atomem chlorowca, grupą C1-4alkilową lub Ci-4-alkoksylową), estry sulfonianowe, takie jak alkilo- lub aryloalkilosulfonylowe (np. metanosulfonylowy), oraz estry jedno-, dwu- lub trójfosforanowe. Jakiekolwiek uwagi odnoszące się do powyższych związków, dotyczą również ich farmakologicznie dopuszczalnych soli.

Jeśli nie podano inaczej, grupa alkilowa w powyżej opisanych estrach zawiera 1-18, a zwłaszcza 1-4 atomów węgla. Grupa arylowa w powyższych estrach jest korzystnie grupą fenylową.

Przykładami farmakologicznie dopuszczalnych soli związków o wzorze 1 i ich farmakologicznie dopuszczalnych pochodnych są sole z zasadami, takie jak sole metali alkalicznych (np. sodowa), metali ziem alkalicznych (np. magnezowa), sole amonowe i sole amoniowe zawierające kation o wzorze NX^X4 (X oznacza grupę Ci -4-alkilową) oraz sole z kwasami nieorganicznymi, takie jak chlorowodorek.

Związki o wzorze 1 i ich farmakologicznie dopuszczalne pochodne można wytwarzać stosując znane sposoby i techniki, opisane np. w następujących publikacjach: Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, 1, 321 (1968), T. A. Krenitsky i wsp., J. Med. Chem.,26, 981 (1983), Nucleic Acid Chemistry, Improved and New Synthetic Processes, Methods and Techniąues, część 1 i 2, wydawcy L. D. Townsend i R. S. Tipson, J. Woley, 1978, J. R. Horwitz i wsp., J. Org. Chem., 29, 2076-2078 (1964), M. Imazawa i wsp., J. Org. Chem., 43,15, 3044-3048 (2978), K. A. Watanabe i wsp., J. Org. Chem., 45 3274(1980), orazR. P. Glińskii wsp., J. Chem. Soc. Chem. Commun.,915 (1970). Można też stosować sposoby analogiczne do opisanych w tych publikacjach.

Sposób wytwarzania związków o ogólnym wzorze 1 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych estrów i soli, polega na tym, że związek o ogólnym wzorze 2, w którym R ma wyżej podane znaczenie, poddaje się działaniu środka chlorowcującego, po czym ewentualnie przeprowadza się powstały związek o wzorze 1 w jego farmakolgicznie dopuszczalny ester lub farmakologicznie dopuszczalną sól i/lub przeprowadza się ester lub sól związku o wzorze 1 w związek o wzorze 1 lub winny farmakologicznie dopuszczalny ester lub inną farmakologicznie dopuszczalną sól związku o wzorze 1.

W przypadku wytwarzania związków o wzorze 1, w którym R² oznacza atom chloru, jako środek chlorowcujący korzystnie stosuje się kwas m-chloronadbenzoesowy.

153 459

W przypadku wytwarzania związków o wzorze 1, w którym R² oznacza atom bromu, jako środek chlorowcujący korzystnie stosuje się brom w kwasie octowym.

Związek o wzorze 1 można przeprowadzić w farmakologicznie dopuszczalny fosforan lub inny ester w reakcji odpowiednio ze środkiem fosforylującym, np. POCI3 lub środkiem estryfikującym, np. halogenkiem kwasowym lub bezwodnikiem. Związki o wzorze 1 i ich estry można przeprowadzać w farmakologicznie dopuszczalne sole, stosując w tym celu znane sposoby, np. działając odpowiednią zasadą. Jeśli otrzymuje się pochodną związku o wzorze 1, to można ją przeprowadzać w związek macierzysty, np. drogą hydrolizy.

Jak już wyżej wspomniano, związki o wzorze 1 i ich farmakologicznie dopuszczalne pochodne wykazują szczególnie dużą aktywność w przypadku infekcji retrowirusami i bakteriami Gram-ujemnymi.

Określenie „infekcja retro wirusowa, dotyczy infekcji wywoływanych przez wirusy, które w swoim cyklu życiowym wykorzystują odwrotną transkryptazę.

Bakteriami, wobec których stwierdzono dobrą aktywność są: Escherichia coli, Salomonella dublin, Salomonella typhosa, Salomonella typhimurium, Shigella flexneri, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholerae, Vibrio anąuillarum, Enterobacter aerogenes, Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae, Yersinia enterocolitica, Pasteurella haomolytica, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris. Są to drobnoustroje wywołujące takie schorzenia jak biegunka podróżna, zakażenia układu moczowego, czerwonka, dur brzuszny i cholera u ludzi, oraz choroby zwierząt, takie jak zapalenie jelit u nowonarodzonych cieląt, zapalenie jelit u świń odstawionych od matki oraz posocznica u kurcząt.

Związki o wzorze 1 i ich farmakologicznie dopuszczalne pochodne wykazują szczególnie dobrą aktywność wobec następujących wirusów: wirusy limfotropii ludzkich komórek T (HTLV), zwłaszcza HTLV-I, HTLV-II i HTLV-III (HIV), wirus białaczki kotów, wirus anemii zakaźnej u koni, wirus zapalenia stawów u kóz i inne podobne wirusy, a także inne ludzkie wirusy, takie jak wirus hepatitis B, wirus Epsteina Barra (EBV) oraz czynnik sprawczy stwardnienia rozsianego (MS). Stwierdzono, że związki te także skutecznie leczą mięsaka Kaposi'ego (KS) oraz trombocytopenię (TP). W tych przypadkach (MS, KS i TP) oraz infekcje wirusem zapalenia stawów u kóz, użyteczne są związki o wzorze 1, w którym A oznacza ugrupowanie tyminy. Służą one do leczenia i zapobiegania takim chorobom i stosowane są do wytwarzania leków przeznaczonych do zwalczania lub zapobiegania takim chorobom.

Aktywność związków i ich pochodnych wobec tak szerokiego zakresu infekcji bakteryjnych i wirusowych ma oczywiście wielkie znaczenie w medycynie i nowy sposób działania pozwala na stosowanie powyższych związków w terapii złożonej dla zmniejszenia możliwości narastania oporności. Leki złożone są szczególnie użyteczne, gdyż 3'-azydonukleozydy mają zaskakującą zdolność wzmacniania działania innych środków terapeutycznych.

Jest zrozumiale, że odpowiednie związki i środki złożone mogą być również stosowane razem z innymi zabiegami immunologicznymi, np. podczas transplantacji szpiku kostnego i limfocytów.

Różne infekcje retrowirusowe opisane powyżej, np. AIDS, są zwykle połączone z towarzyszącymi infekcjami.Tak więc, zrozumiałe jest, że np. połączenie 3'-azydo-3'-dezoksytymidyny (ATZ) i acycloviru będzie szczególnie użyteczne w leczeniu pacjentów cierpiących na AIDS i równocześnie zarażonych wirusem opryszczki. Natomiast połączenie AZT i 9-[(2-hydroksy-l-hydroksymetyloetoksy)metylo]-guaniny będzie użyteczne w leczeniu pacjentów chorych na AIDS i rówocześnie zarażonych cytomegalowirusem.

Związki o wzorze 1 oraz ich farmakologicznie dopuszczalne estry i sole objęte tutaj określeniem „substancja czynna mogą być podawane w celach leczniczych dowolną odpowiednią drogą, to znaczy doustnie, doodbytniczo, donosowo, miejscowo (dopoliczkowo i podjęzykowo), dopochwowo i pozajelitowo (podskórnie, domięśniowo, dożylnie i śródskórnie). Korzystna droga podawania zależy od stanu i wieku biorcy, charakteru infekcji i wybranej substancji czynnej.

Na ogół odpowiednia dawka wynosi 3,0-120 mg/kg ciężaru ciała biorcy na dzień, korzystnie

6-90 mg/kg ciężaru ciała na dzień, a najkorzystniej 15-60 mg/kg ciężaru ciała na dzień. Żądaną dawkę korzystnie podaje się w dwóch, trzech, czterech, pięciu, sześciu lub większej liczbie mniejszych dawek w odpowiednich przedziałach czasu. Mniejsze dawki mogą być podawane w postaci jednostek dawkowania, zawierających np. 10-1500 mg, korzystnie 20-1000 mg, najkorzystniej 50153 459

700 mg substancji czynnej. Doświadczenia z 3'-azydo-3'-dezoksytymidyną sugerują, że powinna być podawana taka dawka by osiągnąć maksymalne stężenie substancji czynnej w surowicy wynoszące około 1-75 mikromoli, korzystnie około 2-50 mikromoli, najkorzystniej około 3-30 mikromoli. Można to osiągnąć, np. przez wstrzykiwanie dożylne 0,1-5% roztworu substancji czynnej, ewentualnie w solance, lub podając doustnie substancję czynną w postaci dużej pigułki w dawce około 100 mg/kg. Żądany poziom we krwi można utrzymywać drogą ciągłego wlewu podając substancję czynną w dawce około 0,01-5,0 mg/kg/godzinę, lub drogą periodycznego wlewu w dawce około 0,4-15 mg/kg.

Środki złożone można podawać w sposób podobny do opisanego powyżej, stosując żądane dawki terapeutyczne substancji czynnej i dodatkowego środka terapeutycznego. Dawkowanie środka złożonego zależy od rodzaju chroby, stosowanej substancji czynnej i dodatkowego środka terapeutycznego i innych czynników klinicznych, takich jak ciężar i stan pacjenta oraz drogi podawania. Jak wspomniano powyżej, substancja czynna i dodatkowy środek terapeutyczny mogą być podawane jednocześnie (np. w postaci jednorodnego preparatu farmceutycznego) lub oddzielnie (np. w postaci oddzielnych preparatów farmaceutycznych). Na ogół środek złożony można podawać miejscowo, doustnie, doodbytniczo lub pozajelitowo) np. dożylnie, podskórnie lub śródskórnie).

W szczególności, środki złożone, w których drugim składnikiem jest inhibitor transportu nukleozydu, można podawać biorcy w zwykły sposób. Podanie drogą doustną substnacji czynnej w dawce 1-200 mg/kg/dzień, korzystnie 5-50 mg/kg/dzień, jest na ogół wystarczające. Przy podawaniu pozajelitowym wystarczająca jest na ogół dawka substancji czynnej wynosząca 1-100 mg/kg/dzień, korzystnie 2-30 mg/kg/dzień. Ilość inhibitora transportu nukleozydu w środku złożonym jest niezależna od ilości substancji czynnej i powinna być wystarczająca do efektywnego hamowania transportu nukleozydu. Korzystnie jego dawka wynosi 0,1-100 mg/kg/dzień, a zwłaszcza 1-20 mg/kg/dzień.

Środki złożone, w których drugim składnikiem jest inhibitor wydzielania nerkowego lub inhibitor glukuronidacji lub oba te inhibitory mogą być podawane pacjentom w zwykły sposób. Przy podawaniu doustnym na ogół jest wystarczająca dawka substancji czynnej wynosząca 1200 mg/kg/dzień, korzystnie 5-50 mg/kg/dzień. Natomiast przy podawaniu pozajelitowym wystarczająca na ogół dawka substancji czynnej wynosi 1-100 mg/kg/dzień, korzystnie 230 mg/kg/dzień. Ilość inhibitora wydzielania nerkowego (glukuronidacji w środku złożonym jest niezależna od ilości substancji czynnej i wystarczająca jego dawka wynosi 4-100 mg/kg/dzień, korzystnie 5-60 mg/kg/dzień, najkorzystniej 10-40 mg/kg/dzień.

W przypadku środków złożonych, w których drugim składnikiem jest interferon, korzystna dawka substancji czynnej wynosi 5-250 mg/kg/dzień, a odpowiednia efektywna dawka interferonu wynosi 3 X 10^e-6X 10 jednostek międzynarodowych na metr kwadratowy powierzxhni ciała na dzień. Substancję czynną i interferon można podawać w stosunku odpowiadającym dawce substancji czynnej wynoszącą od około 5 mg/kg/dzień na 3 X 10⁶ jednostek międzynarodowych interferonu na metr kwadratowy do około 250 mg/kg/dzień na 10 X 10⁶ jednostek międzynarodowych interferonu na metr kwadratowy na dzień, korzystnie od około 5 mg/kg/dzień na 4 X 10⁶ jednostek międzynarodowych interferonu dziennie na metr kwadratowy do około 100 mg/kg/dzień na 6 X 10⁶ jednostek międzynarodowych interferonu na metr kwadratowy na dzień.

Interferon podaje się korzystnie przez wstrzykiwanie (podskórne, domięśniowe lub dożylne) natomiast substancję czynną korzystnie podaje się doustnie lub przez wstrzykiwanie, ale można ją podawać jakimkolwiek opisanym tutaj sposobem. Interferon i substancję czynną można podawać razem lub oddzielnie i dzienna dawka każdej z tych substancji jest podawana w dawkach podzielonych.

W przypadku środków złożonych, w których drugim składnikiem jest inny terapeutyczny nu kleozyd, odpowiednia skuteczna dawka doustna substancji czynnej wynosi 2,5-50 mg/kg ciężaru ciała na dzień, korzystnie 5-10 mg/kg/dzień, a odpowiednia skuteczna dawka drugiego terapeutycznego nukleozydu wynosi 5-100 mg/kg/dzień, korzystnie 15-75 mg/kg/dzień. Przy podawaniu doustnym korzystny stosunek substancji czynnej do drugiego terapeutycznego nukleozydu wynosi od około 1:1 do 1:10, korzystniej od około 1:2 do 1:8. Odpowiednia skuteczna dawka dożylna substancji czynnej wynosi na ogół około 1,5-15 mg/kg/dzień, a terapeutycznego nukleozydu około

5-30 mg/kg/dzień. Przy podawaniu dożylnym korzystnym jest by stosunek substancji czynnej do drugiego terapeutycznego nukleozytydu wynosił około 2:1 - 1:20, korzystniej około 1:2-1:10.

153 459

Oba składniki środka złożonego podaje się korzystnie doustnie lub przez wstrzykiwanie. Mogą być one podawane razem lub oddzielnie i dzienna dawka każdego z nich może być podawana w dawkach podzielonych.

W przypadku środków złożonych, w których drugim składnikiem jest środek przeciwbaktiyjny, odpowiednia skuteczna dawka substancji czynnej wynosi 2,5-50 mg/kg/dzień, korzystnie

5-10mg/kg/dzień, a odpowiednia skuteczna dawka środka przeciwbakteryjnego wynosi 21000 mg/kg/dzień, korzystnie 50-500 mg/kg/dzień . Korzystny stosunek substancji czynnej do środka przeciwbakteryjnego wynosi od 20:1 do 1:500, korzystnie od 2:1 do 1:125.

Można także wytwarzać środki złożone z trzech lub większej liczby środków terapeutycznych. Np. środek zawierający 3'-azydo-3'-dezoksytymidynę (ATZ) oraz acylovir i probenecid ma podwójną zaletę, gdyż daje zarówno wzmocnienie aktywności (AZT) jak i zwiększenie jej dostępności. Można też wytwarzać środki zawierające związek o wzorze 2 oraz dwa lub większą liczbę środków terapeutycznych tego samego rodzaju, np. łącząc AZT oraz sulfadimidine i trimethoprin.

Chociaż możliwe jest podawanie substancji czynnej samej, to korzystnie podaje się ją w postaci preparatów farmaceutycznych. Preparaty takie zawierają co najmniej jedną substancję czynną zdefiniowaną powyżej w połączeniu z jednym lub większą liczbą dopuszczalnych nośników i ewentualnie innymi środkami terapeutycznymi. Każdy nośnik musi być „dopuszczalny w tym sensie, że jest zgodny z innymi składnikami preparatu i nie jest szkodliwy dla pacjenta. Należą do nich preparaty odpowiednie do stosowania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego (dopoliczkowego) i podjęzykowego, dopochwowego oraz pozajelitowego (podskórnego, domięśniowego, dożylnego i śródskórnego). Preparaty mogą korzystnie mieć postać jednostek dawkowania i mogą być sporządzane dowolnymi dobrze znanymi w farmacji metodami, polegającymi na zmieszaniu substancji czynnej z nośnikiem, który stanowi jedną lub większą liczbę substancji pomocniczych. Na ogół, preparaty sporządza się mieszając starannie substancje czynne z nośnikiem ciekłym lub dobrze sproszkowanym nośnikiem stałym, względnie oboma nośnikami i następnie w razie potrzeby, nadając produktowi odpowiednią postać.

Preparaty odpowiednie do podawania doustnego mogą mieć postać jednostek dawkowania, takich jak kapsułki, opłatki lub tabletki, zawierających określoną ilość substancji czynnej, proszków lub granulek, roztworów lub zawiesin wodnych lub niewodnych albo ciekłych emulsji typu olej w wodzie lub typu woda w oleju. Substancja czynna może być również podawana w postaci pigułek, po widełek lub pasty.

Tabletki można sporządzać przez wytłaczanie lub odlewanie, ewentualnie razem z jedną lub większą liczbą substancji pomocniczych. Tabletki wytłaczane można wytwarzać stosując odpowiednie urządzenie i substancję czynną w postaci proszku lub granulek, ewentualnie zmieszaną ze środkiem wiążącym (np. powidonem, żelatyną, hydroksypropylometylocelulozą), środkiem poślizgowym, obojętnym rozcieńczalnikiem, środkiem konserwującym, środkiem dezintegrującym (np. glikolanem sodowo-skrobiowym, usieciowanym powidonem, usieciowaną karboksymetylocelulozą sodową), środkiem powierzchniowo czynnym lub środkiem dyspergującym. Tabletki odlewane można wykonywać stosując odpowiednie urządzenie i mieszaninę sproszkowanego związku zwilżonego obojętnym ciekłym rozcieńczalnikiem. Tabletki mogą ewentualnie być powlekane lub nacinane i mieć postać umożliwiającą powolne lub kontrolowane uwalnianie substancji czynnej. W celu uzyskania odpowiedniego poziomu uwalniania można stosować np. w różnych proporcjach hydroksypropylometylocelulozę.

Preparatami odpowiednimi do stosowania miejscowego w ustach są tabletki do ssania zawierające substancję czynną w podstawie smakowej, zwykle sacharozie i gumie arabskiej lub tragakantowej, tabletki zawierające substancję czynną w obojętnej podstawie, takiej jak żelatyna lub gliceryna, albo sacharoza i guma arabska, oraz płyny do przemywania ust zawierające substancję czynną w odpowiednim ciekłym nośniku.

Do podawania doodbytniczego można stosować takie preparaty jak czopki zawierające odpowiednią podstawę, taką jak masło kakowe lub salicylan.

Preparatami odpowiednimi do podawania dopochowowego są pessaria, tampony, kremy, żele, pasty, pianki lub preparaty do rozpylania, zawierające poza substancją czynną odpowiednie dla rodzaju preparatów nośniki.

153 459

Ί

Preparatami odpowiednimi do podawania pozajelitowego są wodne i niewodne, izotoniczne, jałowe roztwory do wstrzykiwania, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, bakteriostatyki i substancje potrzebne do uzyskania roztworu izotonicznego z krwią biorcy, oraz wodne i niewodne jałowe zawiesiny, które mogą zawierać środki dyspergujące i zagęszczające. Preparaty takie mogą być umieszczone w jedno- lub wielodawkowych, zamykanych pojemnikach, np. ampułkach i fiolkach. Mogą być również przechowywane w postaci liofilizatu wymagającego bezpośrednio przed użyciem dodania jałowego ciekłego nośnika, np. wody do wstrzykiwania. Roztwory i zawiesiny można sporządzać z jałowych proszków, granulek i tabletek, opisanych powyżej.

Korzystnymi preparatami w postaci jednostek dawkowania są preparaty zawierające dawkę dzienną lub część dawki dziennej lub odpowiednią porcję substancji czynnej.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można także stosować w postaci preparatów weterynryjnych, wytwarzanych sposobami znanymi w weterynarii. Przykładami takich preparatów weterynaryjnych są:

(a) preparaty do podawania doustnego, takie jak lekarstwa ciekłe (np. wodne lub niewodne roztwory lub zawiesiny), tabletki lub duże pigułki, garnulki lub pastylki do mieszania z paszą, pasty do podawania na język, (b) preparaty do podawania pozajelitowego, np. podskórnego, domięśniowego lub dożylnego, takie np. jak jałowe roztwory lub zawiesiny, albo (gdy jest to wskazane) do podawania dopiersiowego, kiedy to zawiesinę lub roztwór wprowadza się do wymienia przez brodawkę, (c) preparaty do podawania miejscowego, takie jak krem, maść lub preparat do natrysku, stosowane na skórę, albo (d) preparaty do podawania dopochwowego, takie jak pessaria, kremy lub pianki.

Jest zrozumiałe, że powyżej opisane preparaty są także odpoweidnią postacią dla środków złożonych, zarówno w przypadku podawania równoczesnego jak i oddzielnego. Można je sporządzać w podobny do opisanego sposób.

Jest także zrozumiałe, że poza składnikami wspomnianymi powyżej preparaty mogą zawierać inne środki stosowane w zależności od typu preparatu, np. preparaty doustne mogą zawierać takie dodatkowe środki, jak środki słodzące, zagęszczające lub smakowe.

Poniżej opisano badania biologiczne, których wyniki dowodzą przeciwwirusowego działania związków o wzorze 1.

A. Badania kliniczne. Dwom pacjentom chorym na AIDS podawano doustnie 3'-azydo-3'dezoksytymidynę (AZT) w dawce 2 mg/kg co 8 godzin w 1 i 2 dniu leczenia. W 2 i 3 dniu pacjentom podawano także do 6 godzin 500 mg probencidu (PB) oraz pojedyńczą dawkę AZT w 3 dniu. Szczytowy (C_maxl i bezpośredni (Cmin) poziomy AZT w 3 dniu (po podaniu probenecidu) były znacznie wyższe niż odpowiednie poziomy w 1 dniu, co wyraża się trzykrotnym spadkiem całkowitego klirensu (Cl/F) i przedłużeniu średniego okresu półtrwania (tl/2) AZT (0,88 w stosunku do 1,73 godziny) podczas podawania PB. Średni stosunek AZT związanego z glukuronidem do AZT w moczu był znacznie zmniejszony z 7,3 do 2,4, po podawaniu PB. Podstawowe parametry farmakokinetyczne AZT, przed i po wspólnym podaniu z PB, zestawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Pacjent nr	AUC (godzina) W	Cmax Gtzm)	Cmin 0/m)	Tmax godziny	Cl/F (ml/minutę/ 70 kg	tl/2 godziny
1. AZT/PB	10,41	6,13	0,15	0,25	829,50	1,84
2. AZT/PB	10,00	6,46	0,27	0,50	921,00	1,61
średnio	10,21	6,30	0,21	0,38	875,25	1,73
standardowe odchylenie (±)	0,29	0,23	0,08	0,18	64,70	0,16
1. AZT	3,70	3,74	0,00	0,50	2333,80	0,87
2. AZT	3,04	2,51	0,00	0,31	3027,00	0,89
średnio	3,37	3,13	0,00	0,41	2680,40	0,88
standardowe odchylenie U)	0,47	0,87	0,00	0,13	480,17	0,01

153 459

B. Aktywność przeciwwirusowa. Wzmocnienie aktywności przeciw wirusowi białaczki Frienda (FVL) 3'-azydo-3'-dezoksytymidyny (AZT) przez inhibitory transportu nukleozydu, dilazep, dipyridamole i 6-(4-nitrobynzylotio-9-/ł-D-rybofuranozylo)purynę pokazano w tabeli 2. Komórki FG-10 posiewano na płytkach dzień przed zakażeniem wirusem FLV. Po upływie 1 godziny po zakażeniu podawano testowane związki lub środki w znanych stężeniach. Płytki inkubowano w ciągu 3 dni, pożywkę zastępowano świeżą pożywką McCoy'a 5 A i inkubowano w ciągu następnych 3 dni, po czym oznaczano stężenie zastosowanego związku i środka dające 50% inhibicji łysinek. Wyniki podano w tabeli 2. Ani dipyridamole (10//m) ani dizalep (5pm) nie wykazują same zauważalnego działania przeciwwirusowego.

Tabela 2

Związek/środek	ED50 (nM) azydotymidyny
AZT	5
AZT +1 pm dipyridamole	1
AZT + 5 pm dipyridamole	0,5
AZT + lOpm dipyridamole	0,2
AZT + 5pm dilazepu	0,5
AZT + 5 pm 6-(4-nitronbenzylotio)-9β-D-rybofuranozylopuryny	3

C. Aktywność 3'-azydo-3'-dezoksytymidyny (AZT) wobec ITP. Pacjentom, u których stwierdzono 38 000 mm^-3 płytek krwi i uznanych za chorych na trombocytopenię (liczba płytek 100 000 mm^-3) podawano w ciągu 6 tygodni dożylnie 5 mg/kg AZT co 6 godzin. Liczba płytek wzrastała w tym czasie do 140 000 mm^-3. Dawkowanie wtedy zmieniono, podając 5 mg/kg co 4 godziny doustnie, w ciągu 4 tygodni. Następnie przerwano podawanie na okres 4 tygodni i po 2 tygodniach obserwowano spadek ilości płytek do 93 000 mm^-3 a po 4 tygodniach do 70 000 ”³. Leczenie wznowiono podając doustnie dawkę 5mg/kg/4 godziny w ciągu 5 tygodni, obserwując wzrost ilości płytek do 194 000 mm^-3. Zmniejszenie dawki do 2,5 mg/kg/4 godziny doustnie dało niewielkie zmniejszenie ilości płytek ale nie do wysokości, przy której można by uznawać wystąpienie ITP.

D. Leczenie mięsaka Kaposi'ego 3'-azydo-3'-dezoksytymidyną (AZT). W tych badaniach, dziewięciu pacjentom, u których stwierdzono mięsaka Kaposi'ego (KS), podawano AZT i zaobserwowano następujące skutki.

Całkowite wyleczenie osiągnięto u jednego pacjenta, u trzech obserwowano cofanie się uszkodzeń, u dwóch choroba zatrzymała na pierwotnym poziomie, a u trzech uszkodzenia się zwiększały. Uzyskany 50% skutek terapii jest porównywalny z korzystną stosowaną obecnie terapią KS za pomocą rekombinantowego cr-interferonu.

E. Aktywność środka AZT/acyclovir przeciw wirusowi HIV in vitro. Stosując metodę analogiczną do opisanej w punkcie H, środki złożone z AZT i acycloviru (ACV) testowano in vitro na skuteczność przeciw wirusowi HIV. Sam ACV wykazuje małą aktywność, w stężeniu 16//g/ml (najwyższe badane) zapewniają mniej niż 30% ochrony, natomiast AZT w stężeniu 8μΜ chroni w tej metodzie w 100%. W tabeli 3 pokazano połączenia tych dwóch leków wymagane dla 100% ochrony.

Tabela 3

ACV (pm/ml)	AZT (pM)
—	0
8	0,5
2	1
1	4
0	8

153 459 9

Powyższe dane wykazują, że ACV wzmacnia około trzykrotnie aktywność przeciwwirusową AZT.

F. Aktywność środka AZT (interferon przeciw wirusowi HIV in vitro. Komórki jednojądrowe obowdowej krwi (PBMC) od zdrowych surowiczoujemnych ochotników nie zawierających HIV otrzymywano drogą sedymentacji heparynizowanej krwi metodą Ficoll-Hypaque. Komórki traktowano 10pg/ml fotohemaglutyniny (PHA) i hodowano w podłożu RPMI1640 z dodatkiem 20% surowicy z płodu cielęcia, natybiotyków, l-glutaminy i 10%interIeukiny-2(IL-2,Elctronucleonics, Bethesda, MD). Po upływie 4-6 dni od potraktowania PHA komórki wprowadzono w stężeniu 4 X 10⁵ komórek/ml do 25 ml kolb zawierających 5 ml podłoża i poddawano działaniu leku i wirusa w sposób poniżej. Dzień zakażenia wirusem określany jest jako dzień O. W 4 dniu dodawano świeżą pożywkę. Każdego trzeciego-czwartego dnia pobierano próbkę zawiesiny komórek do analizy i zastępowano pożywką nie zawierającą komórek. Doświadczenia 2 i 4 zakończono po 14 dniach a doświadczenia 1 i 3 po 16 dniach.

Źródłem wirusa była wolna od komórek ciecz znad zakażonych wirusem HIV komórek H9 zamrażanych w porcjach w temperaturze -70°C. Dawka wirusa zakażająca w 50% hodowlę tkankową (TCID50) wynosiła 10⁸/ml.

Przeprowadzono cztery oddzielne doświadczenia z zastosowaniem PBMC od różnych dawców (tabela 4). W doświadczeniu 1 oba leki dodawano przed potraktowaniem komórek wirusem. Próbki zawierające 40 X 10^e komórek zdyspergowano w 20 ml pożywki zawierającej 10⁸TCIDso wirusa w ciągu 1 godziny, po czym przemyto je trzykrotnie i powtórnie zdyspergowano w pożywce nie zawierającej wirusa. W doświadczeniach 2 i 4 komórki inkubowano w ciągu 24 godzin w pożywce zawierającej lub nie zawierającej rekombinantowego interferonu a (rlFNaA), po czym traktowano AZT i wirusem. Wirus dodawano bezpośrednio do hodowli w małej objętości pożywki i nie przemywano. W doświadczeniach 2,3 i 4 inokula wirusowe zawierały odpowiednio 4 X 10’, 10³ i 2 X 10³ TCIDeo· Stężenie leku korygowano wraz z każdą zmianą, pożywki utrzymując w ten sposób pierwotne jej stężenie. We wszystkich doświadczeniach badano serie dwukrotnych rozcieńczeń określonego środka złożonego z rlFNaA i AZT. Każde stosowane stężenie rlFNaA i AZT badano także oddzielnie dla uzyskania punktu odniesienia.

We wszystkich doświadczeniach stosowano po dwie hodowle dla każdego stężenie i dla zakażonych i nie zakażonych próbek kontrolnych. W doświadczeniu 1 stosowano 3,2 μΜ AZT i 128 jednostek/ml rlFNaA i 5 dwukrotnych rozcieńczeń środka złożonego. W doświadczeniach 2 i 3 stosowano 0,16μΜ i 128 jednostek/ml rlFNaA i 3-4-krotne rozcieńczenie tego środka złożonego. W doświadczeniu 4 stosowano 0,08μΜ AZT i 128 jednostek/ml rlFNaA i 2 krotne rozcieńczenie tego środka złożonego.

Po upływie około 1 tygodnia, hodowle badano co 3-4 dni na obecność wirusów. Komórki badano na obecność antygenów HIV drogą pośredniej immunofluorescencji, zaś ciecze z nad komórek badano na aktywność odwrotnej transkryptazy (RT), ilość wirusów i antygen p24 wirusa HIV metodą radioimmunologiczną. Do obliczenia efektu działania środka złożonego stosowano analizę działania mieszaniny leków opisaną przez Chou i Talalaya w Advances in Enzyme Regulation, 22, 27-55 (1984).

Dane także opracowano stosując technikę izobologramu, czyli metodę geometryczną wyznaczania współdziałania leków. Stężenie AZT dające pożądany efekt (np. 50% inhibicji) odkładano na osi poziomej a stężenie rlFNaA, przy którym uzyskiwano taki sam efekt, na osi pionowej. Powyższe punkty łączono linią i nanoszono stężenie składników w środku złożonym dające taki sam efekt. Jeśli punkt ten leży poniżej linii, środek złożony uważa się za synergistyczny.

W doświadczeniu 1 wszystkie stężenia AZT dawały pełny efekt inhibitowania, co uniemożliwiało ocenę połączonych efektów. W doświadczeniach 2-4 obserwowano synergistyczne współdziałanie dwóch składników (tabela 4-9). Synergizm był oczywisty i utrzymywał się nawet wtedy, gdy działanie samego rlFNaA było bardzo nieznaczne. Obliczenie synergizmu wykonywano stosując analizę działania mieszaniny leków do danych RT z doświadczeń 2-4, ilości wirusów z doświadczeń 2 i 3 oraz danych RIA z doświadczenia 4. Dane z metody izobologramu także wykazywały synergizm.

153 459

Tabela 4

Doświadczenie	Metoda szczepienia HIVa/	Ilość dodawanego HIV (TCIDso)	Czas dodawania leków
rlFNaA	AZT
1	A	10*	0	0
2	B	4Χ103	-24 godziny	0
3	B	103	-24 godziny	0
4	B	2Χ103	-24 godziny	0

(a) Metoda A: 40 X 10® komórek zdyspergowano w 20 ml pożywki zawierającej 10® ICID5oHIV, przetrzymywano 1 godznę po czym przemywano i powtórnie dyspergowano. Metoda B: Wskazaną ilość wirusa dodawano do 2 X 10® komórek w pożywce; komórek nie przemywano.

Tabela 5

Doświadczenie 2, dzień 10

Wpływ rlFNaA i AZT na średnie wartości odwrotnej transkryptazy (cpm/10® komórek X 10³)

AZT (μΜ) -	rlFNaA (jednostki/ml)
0	8	16	32	64	128
0	205	173	150	193	169	151
0,01	159	85
0,02	110		42
0,04	71			10
0,08	31				4
0,16	7					1

Tabela 6

Doświadczenie 3, dzień 13 Wpływ rlFNaA i AZT na średnie wartości RT (cpm/10® komórek X 10³)

AZT (μΜ) -	0	16	rlFNaA (jednostki/ml)	128
32	64
0	157	143	117	117	130
0,02	51	10
0,04	10		0
0,08	2			0
0,16	5				0

Tabela 7

Doświadczenie 4, dzień 11 Wpływ rlFNaA i AZT na średnie wartości RT (cpm/10* komórek X 10³)

AZT/pm	rlFNaA (jednostki/ml)
0	32	64	128
0	32	5	4	2
0,02	’ 8	1
0,04	4		0
0,08	1			0

153 459

Tabela 8

Doświadczenie 3, dzień 13 Wpływ rlFNffA i AZT na ilość wirusa (TCIDso/ml)

AZT (μιη)	rlFNcrA (jednostki/ml)
0	16	32	64	128
0	105'7	io5·8	ΙθΜ	io8·1	IO80
0,02	w4·8	io1·9
0,04	103		<101'9
0,08	101’9			<10’9
0,16	CIO1'9				<io1·9

Tabela 9

Doświadczenie 4, dzień 14 Wpływ rlFNcrA i AZT na HIV P24/*·¹

AZT Gum)	rlFNaA (jednostki/ml)
0	32	64	128
0	200-300	100-200	50-100	25-30
0,02	100-200	2,2
0,04	25-30		1,0
0,08	11,2			0,8

^,al Poziomy HIV p24 są podawane w ng białka/ml

Tabela 10 Wskaźniki dla AZT/rlFNaA obliczone z danych RT
Doświadczenie	Dni w hodowli	Wskaźniki przy różnych procentach inhibicji RT
50%	90%	95%
2	7	2,14	0,34	0,23
2	10	0,37	0,30	0,28
3	6	0,26	0,73	1,39
3	13	0,12	0,15	0,17
3	16	<0,01	0,02	0,05
4	8	0,01	0,03	0,04
4	14	0,02	0,07	0,12

Wartości wskaźników (CI) wyznaczono rozwiązując równanie dla różnych stopni inhibicji RT. Wartości CI<1 wskazują na synergizm, Wartości CI otrzymywano stosując nie wykluczającą się wzajemnie postać równania, wartości otrzymywane dla wykluczających się wzajemnie postaci były zawsze nieco niższe.

G. Badania synergizmu przeciwbakteryjnego in vitro 3'-azydo-3'-dezoksytymidynę i 8 znanych środków przeciwbakteryjnych (zestawionych w tabeli 11) traktowano w ciągu 30 minut Ν,Ν-dwumetyloformamidem. Za pomocą mikromiareczkowania sporządzono rozcieńczenia stosując pożywkę Wellcotest.

Przed badaniem synergizmu, dla każdego związku oznaczano indywidualnie wartości MIC wobec drobnoustroju testowego (E. coli CN314). W tebeli 11 podano wartości MIC dla każdego leku.

Serie dwukrotnych rozcieńczeń testowanych leków lub 3'-azydo-3'-dezoksytymidyny przygotowywano w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania. Zawartość płytek z odpowiednimi rozcieńczeniami łączono, otrzymując serie 192 rozcieńczeń/środek złożony. Stosowano rów12

153 459 nież próby kontrolne zawierające same związki. Najwyższym stosowanym stężeniem leku było stężenie o dwukrotnej wartości jego MIC (tabela 11).

Płytki testowe zakażono hodowlą posiewową bakterii zawierającą około 5 X 10® CFU/ml i następnie inkubowano w ciągu 18 godzin w temperaturze 27°C. Notowano wzrost bakterii lub jego brak dla każdego wgłębienia i oznaczono wartości MIC. Dzieląc wartości MIC środka złożonego przez wartość MIC każdego pojedynczego składnika wyliczono „cząstkowe stężenie inhibitujące (FIC), po czym wyliczono sumę cząstkowych stężeń. Wynik około 0,5 lub mniej wykazuje na występowanie synergizmu.

Tabela 11

Najmniejsze stężenie inhibitujące (MIC) samych testowanych leków

Związek	MIC Oig/ml)
Tobramycyna	0,4
Kwas fuzydynowy	1000
Chloramfenikol	3,1
Klindamycyna	100
Erytromycyna	25
Ryfampicyna	6,2
3'-azydo-3'-dezoksytymidyna	1,0
Trimethoprim	0,125
Sulfadimidine	32

Wyniki badania synergizmu przedstawiono w tabeli 12.

Tabela 12

Badania synergizmu: środki złożone z AZT i innych środków przeciwbakteryjnych

Środek złożony	Optymalne wartości MIC (/yg/ml) Lek/AZT	Wsakźnik FIC
Tobramycyna/AZT	0,2/0,125	0,25
Kwas fuzydynowy/AZT	250/0,03	0,28
Chloramfenikol/AZT	1,6/0,06	0,31
Klindamycyna/AZT	12,5/0,25	0,375
Erytromycyna/AZT	6,2/0,25	0,5
Ryfampicyna/AZT	3,1/0,06	0,56
Trimethoprim/AZT	0,004/0,5	0,504
Sulfamidine/AZT	0,25/0,125	0,375

H. Aktywność in vitro 3'-azydonukleozydów przeciw HIV. Aktywność in vitro 3'-azydonukleozydów (leków) badano na dwóch liniach komórek, a mianowicie H9 (linia komórkowa T OKT4⁺, pozwalająca na replikację HIV ale częściowo oporna na cytopatologiczne działanie HIV) oraz TM3 (klon komórek T, specyficznych dla anatoksyny tężyczki i wybranych ze względu na szybki wzrost i cytopatologiczne działanie HIV).

Badania inhibicji prowadzono w następujący sposób. Komórki TM3 były stymulowane przez antygen i napromieniowane (4000 radów, 40 Cy) świeże jednojądrowe komórki obwodowej krwi (PBM) i hodowano je w całkowitej pożywce zawierającej 15% objętościowych interleukiny-2 (II-2, pozbawiona lektyny, Cellular Products, Bufallo, NY), w ciągu 6 dni przed rozpoczęciem badania. Komórki ATH 8 stosowano bez stymulowania antygenem. Po traktowaniu w ciągu 30 minut 2/zg preparatu Polybrene na ml, komórki T (2 X 10®) pastylkowano, traktowano w ciągu 45 minut HIV, dyspergowano powtórnie w 2 ml świeżego podłoża i inkubowano w probówkach hodowlanych w temperaturze 37°C, w nawilżonym powietrzu zawierającym 5% CO2. Komórki kontrolne

153 459 traktowano podobnie ale nie poddawano działaniu wirusem. Komórki traktowano w sposób ciągły IL-2 i lekiem. Gdy w takim badaniu stosowano komórki ATH8, minimalna dawka cytopatologiczna wynosiła pięć cząstek wirusa na komórkę. W doświadczeniach w równoległej hodowli komórkowej, 5 X 10⁴ śmiertelnie napromieniowanych (10 000 radów) wytwarzających HIV RF-II komórek H9 lub niezakażonych komórek H9 dodawano do 2X 10⁵ komórek T. W różnych okresach czasu obliczano całkowitą ilość żywych komórek w hemocytometrze pod mikroskopem, stosując metodę barwienia błękitem tryptanowym. Wyniki doświadczeń przedstawiono w tabeli 13.

Tabela 13

Związek EDao (pM)

3'-azydo-2',3'-dwudezoksycytydyna 10

3'-azydo-5-bromo-2',3'-dwudezoksyurydyna 5

3'-azydo-5-bromo-2',3'-dwudezoksycytydyna 5

Kwas (E)-3-[ 1 -(3'-azydo-2',3'-dezoksy-/S-Derytro-pentofuranozylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2,4dwuoksypirymidynylo]-2-akrylowy 100

Aktywność przeciwbakteryjna in vitro 3'-azydonukleozydów.

W tabeli 14 przedstawiono aktywność przeciwbakteryjną 3'-azydonukleozydów wobec różnych gatunków bakterii, podając wartości najmniejszego stężenia inhibitującego (MIC).

Jako standard stosowano trimethoprim (TMP) a jako pożywkę agar testowy Wellcotest do oznaczania wrażliwości z dodatkiem 7% hydrolizowanej krwi końskiej.

Tabela 14

Drobnoustrój	MIC (μ/ml)
1	2	3	4	5	6	7	8 Standard
E. coli	0,l>	>100	10	0,l>	10	0,l>	10	10 >100
Salmonella typhimurium	0,l>	10	10	0,l>	100	10	10	>100 0,5
Salomonella typhosa	0,l>	0,l>	10	0,l>	0,l>	10	10	0,l> 0,1
Enterobacter serogenes	0,l>	10	>100	100	100	10	10	>100 0,5
Citro. freundii	10	10	10	0,l>	10	10	10	>100 0,5

Wartości MIC podane w tabeli 14 oznaczono stosując następujące związki 1 - 8.

1) 3'-azydo-3'-dezoksy-4-tiotymidyna

2) 3'-azydo-3'-dezoksy-5'-O-acetylo-4-tiotymidyna

3) 3'-azydo-3'-dezoksy-2-dezoksy-2-tiotymidyna

4) 5'-acetylo-3'-azydo-3-benzoilo-3'-dezoksytymidyna

5) l-(5'-0-acetylo-3'-azydo-2',3'-dwudezoksy-j3-D-erytro-pentofuranozylo)-5-metylo-4-(l,2,4-triazolilo-l)-2(lH)pirymidynon

6) l-(3'-azydo-2',3'-dwudezoksy-/3-D-erytro-pentofuranolozjylo)-2-benzyloksy-5-metylo-4(lH)-pirymidynon

7) 3'-azydo-3'-dezoksy-2-metoksytymidyna

8) 3'-azydo-5-bromo-2',3'-dwudezoksyurydyna.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, w których skrót 1.1. oznacza temperaturę topnienia. Przykład I. Wytwarzanie 3'-arydo-5-chloro-2',3'-dwudezoksyurydyny.

Do ochłodzonego do temperatury 0°C roztworu 0,25 g (1 mmol) 3'-azydo-2',3'-dwudezoksyurydyny w 2 ml bezwodnego dwumetyloacetamidu (DMAC) dodano 2 ml 0,5 m roztworu chlorowodoru w DMAC, a następnie dodano w dwóch porcjach 0,277 g (1,6 mmola) kwasu mchloronadbenzoesowego w ciągu 10 minut i mieszaninę pozostawiono by osiągnęła temperaturę pokojową. Po upływie 2 godzin do mieszaniny dodano 4 ml wody i roztwór przesączono. Wodny roztwór DMAC wyekstrahowano eterem etylowym (3X3 ml), po czym eter odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany olej wprowadzono do kolumny wypełnionej żelem krzemionkowym i przeprowadzono elucję mieszaniną chloroformu i metanolu (15:1, objętościowo). Odpowiednie frakcje połączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a uzyskany olej poddano

153 459 krystalizacji z eteru etylowego. Otrzymano 58,5 mg (0,2 mmola, 20%) związku tytułowego o 1.1. 169-170°C.

Widmo UV: pH 1, A_ma« = 276 nm (ε = 7400), Λ min = 239 nm (ε = 500); pH 13, A_max = 274 nm (ε = 6400); A_mi_n = 249 nm (ε = 3800).

Widmo H¹ NMR DMSO-d₆(<5: 8,29)(s, 1H, 6-H), 6,04(t, 1H, l'-H, J = 5,5 Hz), 5,49-5,29 (m, 1H, 5'-OH), 4,44-4,20 (m, 1H, 3'-H), 3,88-3,71 (m, 1H, 4'-H), 3,71-3,53 (m, 2H, 5'-H), 2,63-2,31 (m, 2H, 2'-H).

Analiza elementarna dla C9H10N5O4CI Obliczono: C 37,58 H 3,50 N 24,35 Cl 12,32

Stwierdzono: C 37,67 H 3,54 N 24,39 Cl 12,40.

Przykład II. Wytwarzanie 3'-azydo-5-bromo-2',3'-dwudezoksyurydyny.

Ze znanej 5'-azydo-2,3'-dwudezoksyurydyny (0,827 g, 3,3 mmola) [T. A. Krenitsky i wsp., J. Med. Chem., 26, 891 (1983)] otrzymano 3'-azydo-5-bromo-2',3'-dwudezoksyurydynę drogą najpierw acetylowania grupy 5'-hydroksylowej za pomocą 15 ml bezwodnika octowego a następnie bromowania w pozycji 5 za pomocą 0,566 g bromu w 0,5 ml kwasu octowego. Czerwonobrązowy roztwór mieszano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a uzyskany olej utarto z eterem etylowym. Olej rozpuszczono w metanolowym roztworze amoniaku w celu usunięcia grupy acetylowej. Żądany produkt wyodrębniono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym przy użyciu do elucji mieszaniny chloroformu i metanolu (95:5, objętościowo). Otrzymano z wydajnością 32% związek tytułowy o 1.1.148-149°C.

Przykład III. Wytwarzanie treo-3'-azydo-5-bromo-2',3'-dwudezoksyurydyny.

Treo-3'-azydo-5-bromo-2',3'-dwudezoksyurydynę wytwarzano z 2'-dezoksyurydyny w pięcioetapowym cyklu reakcji.

Grupę 5'-hydroksylową 2'-dwuzoksyurydyny zabezpieczono w zwykły sposób grupą trójfenylometylową. Grupę 3'-hydrosylową poddano mezylowaniu. Grupę 3'-azydową wprowadzono dodając 22 g (40 mmoli) 2'-dezoksy-3'-mezylo-5'-tritylourydyny do roztworu 7.84 g (120 mmoli, 3 równoważniki) azydku sodowego w 380 ml dwumetyloformamidu, w temperaturze 80°C. Reakcję prowadzono w ciągu 35 godzin, po czym mieszaninę wlano do 2 litrów lodowatej wody i wytrącony osad odsączono. Produkt wyodrębniono chromatograficznie na żelu krzemionkowym stosując do elucji mieszaninę chloroformu i metanolu (1:1, objętościowo). Wydajność 51%. Grupę 5'hydroksylową odblokowano w reakcji z 80% kwasem octowym, prowadzonej na łaźni wodnej w ciągu 25 minut. Po ochłodzeniu odsączono wytrącony tritylokarbinol, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany gęsty olej poddano chromatografii chloroformu i metanolu (85:15, objętościowo). Treo-3'-azydo-2',3'-dwudezoksyurydynę poddano bromowaniu w pozycji 5, postępując dokładnie tak samo jak to opisano w przypadku bromowania erytro-3'azydo-2',3'-dwudezoksyurydyny.

Widmo UV: pH 1, A_max = 280nm (ε = 9400), Amin = 244 nm (ε = 2600); pH 13, A_max = 276 nm (ε = 6700); Amin = 251 nm (ε = 3700).

Widmo H¹ NMR (DMSO-de)ó: 11,86 (s, 1H, 3-NH), 8,02 (s, 1H, 6-H), 5,99 (dd, 1H, Ji«, _2a =3,0 Hz, J<2b'= 7,5 Hz, Γ-Η),4,05 (m, 1H,4'-H), 3,71 (m,2H, 5'-H),2,72(m, 2H, lb), 2,18 (m, 1H, 2a').

Analiza elementarna dla C9HioBRN₅04.0,25H20,0,1C₂H402 Obliczono: C 32,25 H 3,21 N 20,44 Br 23,32

Stwierdzono: C 32,17 H 3,21 N 20,33 Br 23,19.

Przykład IV. Wytwarzanie treo-3'-azydo-5-chloro-2',3'-dwudezoksyurydyny.

Postępując podobnie jak w przypadku wytwarzania 3'-azydo-5-chloro-2',3'-dwudezoksyirydyny (przykład I) otrzymano 0,15 g (0,5 mmola, 25%) związku tytułowego o 1.1. 65°C.

’ Widmo UV: pH 1, A_max = 278 i 212nm (ε = 8900), A_min = 240nrn (ε=1600);ρΗ 13, A_max= 275 nm (ε = 6600); A _min = 248 nm (ε = 3300).

153 459

Widmo H¹ NMR (DMSO-de) δ: 11,89 (s, 1H, NH), 7,94 (s, 1H, 6-H),6,00 (dd, 1H, l'-H, J = 2,93 i 4,64 Hz), 5,1 (t, 1H, 5'-OH, J = 5,l Hz), 4,50-4,46 (m, 1H, 3H), 4,08-4,03 (m, 1H, 4-H), 3,71 (t, 2H, 5-H,J = 5,32 Hz), 2,77-2,67 (m, 1H, 2'_b-H), 2,23-2,16 (m, 1H, 2'_a-H).

Analiza elementarna dla C9H10N5O4CI.O, lH2O.O,lC4HeO2 Obliczono: C 37,85 H 3,72 N 23,48 CJ 11,89

Stwierdzono: C 37,94 H 3,91 N 23,23 Cl 11,86

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych 3'-azydonukleozydów o ogólnym wzorze 1, w którym R¹ oznacza grupę hydroksylową lub aminową, R² oznacza atom chlorowca, a linia przerywana oznacza obecność wiązań pojedynczych lub podwójnych, oraz farmakologicznie dopuszczalnych estrów i soli tych związków, znamienny tym, że związek o ogólnym wzorze 2, w którym R ma wyżej podane znaczenie, poddaje się działaniu środka chlorowcującego, po czym ewentualnie przeprowadza się powstały związek o wzorze 1 w jego farmakologicznie dopuszczalny ester lub farmokologicznie dopuszczalną sól i/lub przeprowadza się się ester lub sól związku o wzorze 1 w związek o wzorze 1 lub w inny farmakologicznie dopuszczalny ester lub inną farmakologicznie dopuszczalną sól związku o wzorze 1.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 2, w którym R¹ oznacza grupę hydroksylową lub aminową, mający grupę 3'-azydową w konfiguracji erytro.

   Wzór 1

   153 459

   R¹

   N3

   Wzór 2

   Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz

   Cena 3000 zł