PL136958B1 - Method of isolation of polyfungine from the culture of highefficient mutant of streptomyces noursei var. polifungini strain - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji po¬ lifunginy z grzybni uzyskanej po przesaczeniu brze¬ czki fermentacyjnej, wytworzonej przy uzyciu wy¬ sokowydajnego mutanta nr R 851/26/77, otrzyma¬ nego sposobem wg opisu patentowego nr 87 664, szczepu Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581, na pozywce, w której jako jedyne zródlo wegla stosowano olej sojowy wg opisu patentowe¬ go nr 93 436.Sposób izolowania polifunginy z brzeczek ma¬ cierzystego szczepu Streptomyces noursei var. po¬ lifungini ATCC 21581, wg opisu patentowego nr 71259, dotyczyl wyodrebniania tego antybiotyku z brzeczek uzyskanych na podlozu zawierajacym ja¬ ko zródlo wegla glukoze i skrobie ziemniaczana.Sposób ten okazal sie nieprzydatny w przypadku izolowania polifunginy z brzeczek uzyskanych przy uzyciu tego szczepu i tluszczów roslinnych oraz zwierzecych jako jedynego zródla wegla wg opisu patentowego nr 81 600, a tym bardziej przy uzyciu nowego, róznego od szczepu macierzystego, mutanta R 851/26/77 tego szczepi*.Znany sposób izolowania polifunginy polegal na przemywaniu odsaczonej grzybni woda, a nastepnie acetonem i ekstrahowaniu zawartego w niej an¬ tybiotyku metanolem i w koncowym etapie na o- czyszczaniu surowego osadu antybiotyku przez od- mywanie go rozpuszczalnikami organicznymi lub ich roztworami wodnymi.Przemywanie grzybni acetonem przed ekstrakcja 19 15 20 nie usuwa jednak w dostatecznym stopniu zanie¬ czyszczen, które przechodza nastepnie do ekstraktów metanolowych. Opisana metoda ekstrakcji samym metanolem byla niekorzystna, gdyz ponadto wy¬ magala jeszcze stosowania duzych objetosci roz¬ puszczalnika, co prowadzilo do zmniejszonego ste¬ zenia antybiotyku w ekstraktach, przy czym eks¬ trakty te zawieraly oprócz antybiotyku zanieczysz¬ czenia z grzybni nie usuniete acetonem.Opracowano nowy sposób izolacji polifunginy stanowiacy istote niniejszego wynalazku, który to sposób pozwala na otrzymywanie antybiotyku o wlasciwej czystosci i z dobra wydajnoscia.Sposobem wg wynalazku wydzielona z brzeczki fermentacyjnej grzybnie, przemyta woda, traktuje sie roztworem dwóch rozpuszczalników organicz¬ nych, w tym jednego mieszajacego sie z woda, jak metanol lub tetrahydrofuran i drugiego nie mie¬ szajacego sie z woda, jak chlorowcopochodne alka- nów i alkenów, np. chlorek metylenu, czterochloro- etylen, weglowodory alifatyczne i aromatyczne, np. eter naftowy, toluen, estry, np, octan butylu, keto¬ ny, np. keton metyloizobutylowy, alkohole, np. bu¬ tanol. Najkorzystniejszym okazal sie- roztwór meta¬ nolu i czterochloroetylenu w stosunku 1:1 obj/obj, który usuwa wiekszosc zanieczyszczen, w tym rów¬ niez kwasy tluszczowe wytworzone obok polifunginy w procesie biosyntezy.Z tak przygotowanej grzybni ekstrahuje sie po- lifungine metanolowowodnym roztworem CaCl2 w 136 958i takiej ilosci aby 1—10 moli CaCl2 przypadalo na 1 mol antybiotyku, zawierajacym 2—30% wody.Wobec znacznie lepszej rozpuszczalnosci kompleksu wapniowego polifunginy niz samej polifunginy uzy¬ skuje sie wysokie stezenie antybiotyku w ekstrak¬ tach, 3—4 razy wyzsze niz przy stosowaniu meta¬ nolu bez CaCl2. Ponadto stwarza to mozliwosc uzy¬ skiwania tych stezen w srodowisku uwodnionego metanolu.Zmniejszenie zawartosci wody w roztworze me¬ tanolowym oraz zwiekszenie ilosci CaCl2 od wyzej podanych, prowadzi wprawdzie do zwiekszenia szybkosci ekstrakcji lecz pogarsza jej selektywnosc, poniewaz równolegle z ekstrakcja polifunginy ek¬ strahowane sa sole wapniowe kwasów tluszczowych.Sole te sa nierozpuszczalne przy zawartosci wody 20 do 30% w metanolowym roztworze, kompleksu polifunginy z CaCl2. Zawartosc te uzyskuje sie przez odparowanie metanolu z ekstraktów lub przez dodanie wody, co wiaze sie z oznaczaniem zawar¬ tosci wody w kazdym z ekstraktów. Przy tej za¬ wartosci wody w ekstraktach wytracaja sie sole wapniowe kwasów tluszczowych.Kompleks wapniowy polifunginy rozklada sie do czystej polifunginy pod wplywem wody, gdy za¬ wartosc jej w, roztworze metanolowowodnym prze¬ kracza 30%. Stad koniecznosc zachowania zawar¬ tosci wody 20—30% na etapie wytracania soli wa¬ pniowych kwasów tluszczowych. W tym zakresie zawartosci wody kompleks wapniowy polifunginy jest dobrze rozpuszczany w roztworze metanolowo- wodnym, natomiast sole wapniowe kwasów tlusz¬ czowych wytracaja sie w postaci osadu.Zwiekszajac zawartosc wody w roztworze krys- talizacyjnym do ponad 30% kompleks wapniowy polifunginy rozklada sie do wolnej polifunginy, któ¬ ra ulega wytraceniu. Sole wapniowe sa komplekso- wane w formie latwo rozpuszczalnych zwiazków w lugach pókfystalizacyjnych w zakresie wartosci pH 4-^7. W wyniku tego sposobu postepowania uzy¬ skuje sie preparaty polifunginy o sladowej zawar¬ tosci wapnia i wysokiej aktywnosci biologicznej.Sposobem wg wynalazku krystalizacje polifunginy z przesaczu uzyskanego po odsaczeniu wytraconych soli kwasów tluszczowych, prowadzi sie w srodo¬ wisku pH 4^—7, uzyskanym przez dodanie kwasów kompleksujacych wapn, takich jak kwas cytryno¬ wy, winowy, wersehowy oraz ich buforów. Z uzy¬ skanego w ten sposób roztworu o stezeniu anty¬ biotyku okolo 150 tys. j/ml, krystalizuje sie póli- fungine dodajac do niego wode lub oddestylowujac metanol tak, aby zawartosc wody w mieszaninie krystalizacyjnej wynosila korzystnie objetosciowo 6$_l_gO,/o, ewentualnie szczepiac ten roztwór kry¬ stalicznym preparatem antybiotyku. Proces krysta¬ lizacji prowadzi sie w temperaturze 0° do +5°C, osad odsacza, przemywa acetonem i suszy pod pró¬ znia w temperaturze pokojowej.Stosujac wyzej opisana metode wg wynalazku, oprócz korzystnego zwiekszenia wydajnosci proce¬ su, uzyskuje sie takze wysoka czystosc produktu.Przemywanie grzybni, zwlaszcza metanolowym roz¬ tworem czterochloroetylenu, najskuteczniej usuwa tluszcze, barwniki i kwasy tluszczowe ulatwiajac dalszy! przebieg procesu izolacji, zas stosowanie 958 4 metanolowego roztworu CaCl2, zamiast samego me¬ tanolu, daje wysokie stezenie antybiotyku w eks¬ traktach i w istotny sposób zmniejsza objetosc eks¬ traktów, w wyniku czego uzyskuje sie znaczne u- 1 proszczenie , procesu izolacji polifunginy w skali przemyslowej.Przyklad I. 250 g grzybni o aktywnosci 300 tys. j/g, otrzymanej w procesie saczenia brzeczki fermentacyjnej, przemywa sie woda, zawiesza w 0 500 ml roztworu czterochloroetylenu w metanolu (1:1 obj/obj), a.,nastepnie koryguje pH do 6,6—7,0 przy uzyciu 10% roztworu wodnego kwasu cytry¬ nowego lub trójetyloaminy i miesza sie intensyw¬ nie w ciagu 2 godzin, saczy, po czym przemywa 5 200 ml metanolu. Tak odmyta grzybnie ekstrahuje sie trzema porcjami po 400 ml metanolu zawiera¬ jacego odpowiednio 5,2 i 1 g CaCl2 • 6 H20, naste¬ pnie przemywa sie 200 ml metanolu; Ekstrakty i przemywki laczy sie, odparowuje pod próznia w 0 temperaturze +25°C do uzyskania roztworu o za¬ wartosci wody 25—30%. Wytracony w czasie odpa¬ rowania osad soli wapniowych kwasów tluszczo¬ wych odsacza sie, wartosc pH przesaczu koryguje 10% rozworem kwasu cytrynowego do pH 5,5, na- 5 stepnie dodaje sie 0,5 g krystalicznej polifunginy i calosc odparowuje w prózni w temperaturze +25°C do takiej objetosci, aby zawartosc wody wynosila 33—35% w stosunku do zawartosci meta¬ nolu, a nastepnie dodaje sie takie ilosci wody, aby 1 uzyskac trzykrotny nadmiar wody w stosunku do metanolu; pH koryguje sie do wartosci 6,8 przy uzyciu trójetyloaminy i prowadzi krystalizacje an¬ tybiotyku w ciagu 5 godzin w temperaturze +4°C.Osad saczy sie, zawiesza w acetonie w ilosci 1 g * osadu w 3 ml i po odsaczeniu przemywa 50 ml acetonu. Osad suszy sie pod próznia w temperatu¬ rze pokojowej do zawartosci wody nie wyzszej niz 5%. Otrzymuje sie 8,5 g osadu o mocy 7000 j/mg (oznaczenie mikrobiologiczne), co stanowi 74,6% 1 wydajnosci w przeliczeniu na zawartosc antybio¬ tyku w grzybni.Przyklad II. 250 g przemytej woda grzybni o aktywnosci 350 000 j/g zawiesza sie w 500 ml roztworu czterochloroetylenu w metanolu, korygu¬ je pH 10% roztworem wodnym kwasu cytrynowe¬ go lub trójetyloamina do 6,6—7,0 i miesza sie in¬ tensywnie w ciagu 2 godzin, a nastepnie saczy i przemywa grzybnie 150 ml metanolu. Tak odmy¬ ta grzybnie ekstrahuje sie 300 ml metanolu po uprzednim dodaniu do niego 10 g CaCl2 • 6 H20.Ekstrakcje powtarza sie jeszcze dwukrotnie uzywa¬ jac za kazdym razem 300 ml metanolu zawierajace¬ go odpowiednio 2 i Ig CaCl2 • 6 H20, a nastepnie przemywa sie wyekstrahowana grzybnie 300 ml me- 55 tanolu. Ekstrakty i przemywki laczy sie, uzupelnia woda do stezenia 25%, saczy od osadu soli wapnio¬ wych i koryguje pH kwasem wersenowym do 5,0, saczy ponownie i dodaje taka ilosc wody do prze¬ saczu, aby uzyskac trzykrotny nadmiar wódy w 60 stosunku do metanolu. Krystalizacje prowadzi sie 5 godzin w temperaturze +5°C. Osad saczy sie, za¬ wiesza w acetonie w ilosci 1 g osadu w 3 ml, a po odsaczeniu przemywa sie 50 nil acetonu. Osad suszy sie pod próznia w temperaturze pokojowej do za- w wartosci wody riie wyzszej niz 5%. Otrzymuje siey 136 958 5 6 8,9 g osadu o mocy 6900 j/mg (oznaczenie mikro¬ biologiczne), co stanowi 70,2% wydajnosci w prze¬ liczeniu na zawartosc antybiotyku w grzybni.Przyklad III. 250 g grzybni o aktywnosci 280 000 j/g zawiesza sie po uprzednim przemyciu woda, w 500 ml roztworu toluenu w tetrahydrofu- ranie (1,5 : 1 obj/obj) i miesza sie przez godzine w pH wartosci 4,0—4,2 uzyskanym po zakwaszeniu kwasem cytrynowym. Grzybnie saczy sie i przemy¬ wa 100 ml tetrahydrofuranu. Tak odmyta grzyb¬ nie ekstrahuje sie czterema porcjami po 300 ml metanolu zawierajacego odpowiednio 3, 2, 1 g CaCh* • 6 H20 i dodaje do kazdego ekstraktu wode do zawartosci 30D/o, po czym saczy sie osad wytraco¬ nych soli wapniowych kwasów tluszczowych. Po¬ laczone ekstrakty zakwasza sie kwasem winowym do wartosci pH 4,5 i odparowuje do uzyskania czte¬ rokrotnego nadmiaru wody w stosunku do metano¬ lu, a nastepnie koryguje pH trójetanoloamina do pH 6,5. Krystalizacje antybiotyku prowadzi sie 5 godzin w temperaturze 0°C. Osad saczy sie i za¬ wiesza w acetonie w ilosci 1 g osadu w 3 ml, a nastepnie przemywa 50 ml acetonu. Osad suszy sie pod próznia bez ogrzewania do wartosci wody nie wyzszej niz 5%. Otrzymuje sie 6 g osadu o mocy 7 300 j/mg (oznaczenie mikrobiologiczne), co stano¬ wi 62,2% wydajnosci w przeliczeniu na zawartosc antybiotyku w grzybni.Przyklad IV. 250 g przemytej woda grzybni o aktywnosci 350 000 j/g zawiesza sie w 500 ml te- trahydrofuranu, koryguje wartosc pH 10% roztwo¬ rem wodnym kwasu cytrynowego lub trójetyloami- na do 6,6—7,5 i miesza intensywnie w ciagu 2 go¬ dzin, a nastepnie saczy i przemywa grzybnie 150 ml metanolu. Tak odmyta grzybnie ekstrahuje sie 300 ml metanolu, po uprzednim dodaniu do niego 10 g CaCh-6 H20v Ekstrakcje powtarza sie jeszcze dwukrotnie uzywajac do ekstrakcji po 300 ml me¬ tanolu zawierajacego po 5 g CaCl2 • 6 H20. Ekstrak¬ ty laczy sie, dodaje wode do zawartosci 25%, od¬ sacza wytracony osad soli wapniowych kwasów tluszczowych. Ekstrakty zakwasza sie 5% wodnym buforem cytrynowym o pH 4,0 do wartosci pH 5,0, po czym dodaje sie taka ilosc wody, aby uzyskac jej dwukrotny nadmiar w stosunku do metanolu i prowadzi krystalizacje w czasie 5 godzin w tem¬ peraturze +4°C. Nastepnie osad saczy sie, zawie¬ sza go w acetonie w proporcji 1 g mokrego osadu w 3 ml acetonu, a po odsaczeniu przemywa 50 ml acetonu. Osad suszy sie pod próznia w temperatu¬ rze pokojowej. Otrzymuje sie 7,8 g polifunginy o aktywnosci 7200 j/mg (oznaczenie mikrobiologiczne) co stanowi 65% wydajnosci w przeliczeniu na za¬ wartosc antybiotyku w grzybni.Zastrzezenie patentowe Sposób izolacji polifunginy z hodowli wysokowy- dajnego mutanta R 851/26/77 szczepu Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581 na pozywce, w której jedynym zródlem wegla jest olej sojowy, polegajacy na przemyciu grzybni kolejno woda i rozpuszczalnikiem organicznym i ekstrakcji, zna¬ mienny tym, ze grzybnie wydzielona z brzeczki fermentacyjnej i przemyta woda przemywa sie na¬ stepnie rozpuszczalnikiem organicznym mieszaja¬ cym sie z woda, takim jak metanol lub tetrahydro- furan albo mieszanina rozpuszczalnika mieszajace¬ go sie z woda z rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda, takim jak chlorowcopochodne alkanów i alkenów, weglowodory alifatyczne i aromatycz¬ ne, etery, ketony, korzystnie roztworem metanolu i czterochloroetylenu w stosunku 1 : 1 obj/obj, po czym z grzybni ekstrahuje sie polifungine metano- lowowodnym roztworem chlorku wapnia, zawiera¬ jacym 1—10 moli CaCl2 na 1 mol antybiotyku oraz 2—30% wody, a nastepnie z ekstraktu odparowuje sie metanol albo dodaje wode tak, aby zawartosc jej wynosila 20—30%, odsacza sie wytracone sole wapniowe kwasów tluszczowych, zwieksza zawar¬ tosc wody powyzej 30%, koryguje pH przesaczu do wartosci 4—7 kwasem wersenowym, winowym, cy¬ trynowym lub ich buforami i prowadzi krystaliza¬ cje polifunginy dodajac do ekstraktów wode badz oddestylowujac metanol tak, aby zawartosc jej w mieszaninie krystalizacyjnej wynosila korzystnie objetosciowo 60—80%, ewentualnie szczepi roztwór krystalicznym preparatem antybiotyku po czym wy¬ tracony osad antybiotyku odsacza sie. 10 15 20 25 30 35 4* PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób izolacji polifunginy z hodowli wysokowy- dajnego mutanta R 851/26/77 szczepu Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581 na pozywce, w której jedynym zródlem wegla jest olej sojowy, polegajacy na przemyciu grzybni kolejno woda i rozpuszczalnikiem organicznym i ekstrakcji, zna¬ mienny tym, ze grzybnie wydzielona z brzeczki fermentacyjnej i przemyta woda przemywa sie na¬ stepnie rozpuszczalnikiem organicznym mieszaja¬ cym sie z woda, takim jak metanol lub tetrahydro- furan albo mieszanina rozpuszczalnika mieszajace¬ go sie z woda z rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda, takim jak chlorowcopochodne alkanów i alkenów, weglowodory alifatyczne i aromatycz¬ ne, etery, ketony, korzystnie roztworem metanolu i czterochloroetylenu w stosunku 1 : 1 obj/obj, po czym z grzybni ekstrahuje sie polifungine metano- lowowodnym roztworem chlorku wapnia, zawiera¬ jacym 1—10 moli CaCl2 na 1 mol antybiotyku oraz 2—30% wody, a nastepnie z ekstraktu odparowuje sie metanol albo dodaje wode tak, aby zawartosc jej wynosila 20—30%, odsacza sie wytracone sole wapniowe kwasów tluszczowych, zwieksza zawar¬ tosc wody powyzej 30%, koryguje pH przesaczu do wartosci 4—7 kwasem wersenowym, winowym, cy¬ trynowym lub ich buforami i prowadzi krystaliza¬ cje polifunginy dodajac do ekstraktów wode badz oddestylowujac metanol tak, aby zawartosc jej w mieszaninie krystalizacyjnej wynosila korzystnie objetosciowo 60—80%, ewentualnie szczepi roztwór krystalicznym preparatem antybiotyku po czym wy¬ tracony osad antybiotyku odsacza sie. 10 15 20 25 30 35 4* PL