PL133386B2 - Process for enzymatic hydrolysis of a,b and c lanatosides and their desacetyl derivatives - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 1986 09 30 Int. Cl.3 C07J 19/00 CZY ftLNiA Urzedu P-^fn.-w.,- fllsiil! i • Twórcywynalazku: Janina Zurkowska, Mieczyslawa Darmetko Uprawniony z patentu tymczasowego: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa (Polska) Sposób enzymatycznej hydrolizy lanatozydów A, B i C oraz ich dezacetylowych pochodnych Wynalazek dotyczy sposobu enzymatycznej hydrolizy lanatozydów A, B i C oraz ich dezacety¬ lowych pochodnych. W wyniku tej hydrolizy otrzymuje sie digitoksyne, gitoksyne i digoksyne oraz ich acetylowe pochodne. W lecznictwie stosowane sa jako glikozydy nasercowe digitoksyna, alfa-acetylodigitoksyna, digoksyna i beta-digoksyna oraz syntetyczna pochodna gitoksyny w formie piecioacetylogitoksyny.Znany sposób otrzymywania wyzej wymienionych zwiazków polega na hydrolitycznym oddzieleniu glukozy, czwartego koncowego cukru w lancuchu bocznym lanatozydów lub dezacety- lolanatozydów A, B, C w taki sposób, aby nie zostala naruszona struktura pozostalych dezoksy- cukrów. Jest to mozliwe jedynie na drodze enzymatycznej z zastosowaniem enzymu typu betaglukozydazy. Enzymy swoiscie dzialajace na wiazania betaglikozydowe miedzy czasteczka glukozy a trzecia z kolei digitoksoza lub acetylodigitoksoza lancucha cukrowego wystepuja w wielu zródlach biologicznych pochodzenia roslinnego lub zwierzecego. Izolowano je równiez z plesni, drobnoustrojów czy rzezniczych odpadów poubojowych. Enzymy te wykazuja przewaznie zrózni¬ cowana swoistosc enzymatyczna w stosunku do lanatozydów i dezacetylolanatozydów A, B i C.Juz poprzednio stwierdzono (Zukrowska J., Adamiec A., Herba Polonica 20 (3) 270-283 /1975/), ze ekstrahowana ze slodu jeczmiennego i oczyszczona frakcja bialek enzymatycznych poprzez selektywne wytracanie siarczanem amonu i saczenie molekularne na kolumnie sephadeksydowej nie wykazuje swoistosci hydrolitycznej w stosunku do lanatozydów A, B i C, natomiast hydrolizuje odacetylowane pochodne tych zwiazków czyli dezacetylolanatozydy A, BiC.Istote wynalazku stanowi enzematyczna hydroliza lanatozydów A, B i C oraz ich dezacetylo¬ wych pochodnych za pomoca enzymów wyizolowanych z ziarna slodu jeczmiennego lub jeczmie¬ nia. Slód jeczmienny lub jeczmien ekstrahuje sie woda, buforem fosforanowym badz octanowym.Ekstrakt zawiera beta-glukozydaze obok szeregu bialek enzymatycznych i bez oczyszczania jest stosowany do hydrolizy. Wykazuje on aktywnosc nie tylko w stosunku do dezacetylowych pochod¬ nych lanatozydów A, B i C lecz równiez do glikozydów natywnych czyli lanatozydów A, B i C. W wyniku hydrolizy dezacetylowych pochodnych lanatozydów A, B i C otrzymuje sie odpowiednio digitoksyne, gitoksyne i digoksyne, a hydroliza lanatozydów A, B i C daje odpowiednie pochodne2 133386 ( acetylowe digitoksyny, gitoksyny i digoksyny, w postaci izomeru al^a, które mozna ewentualnie zhydrolizowac w srodowisku alkalii, korzystnie za pomoca amoniaku w roztworze metanolowym.Wedlug wynalazku hydrolize enzymatyczna przeprowadza sie w; srodowisku buforu fosfora¬ nowego lub octanowego o pH 5-6, korzystnie o pH 5,2-5,5, do którego dodaje sie ekstrakt slodowy lub jeczmienny oraz alkohol, zwlaszcza metanol. Stezenie alkoholu, od 10% do 20% korzystnie 12-15%, jest tak dobrane, aby bialka enzymatyczne nie ulegaly denaturacji i wytraceniu w postaci nieaktywnego osadu i wkraplane alkoholowe roztwory odpowiednich lanatozydów A, B i C lub ich dezacetylowych pochodnych pozostawaly w roztworze hydrolizatów. Hydrolize prowadzi sie w temperaturze 35-45°C, korzystnie 38-42°C, w czasie 16-30 godzin, korzystnie 18-24 godziny.W sposobie wedlug wynalazku warunki reakcji hydrolizy zostaly tak dobrane, ze reakcja przebiega z wysoka wydajnoscia rzedu 80-90%. Glikozydy poddawane hydrolizie nie wytracaja sie po wprowadzeniu do hydrolizatów, natomiast w toku reakcji produkty hydrolizy wydzielaja sie czesciowo w postaci krystalicznego osadu, który mozna latwo oddzielic w znany sposób. Osiaga sie przez to wydatne zmniejszenie ilosci rozpuszczalników organicznych takich jak benzen, trójchlo¬ roetylen lub chloroform, koniecznych do selektywnej ekstrakcji produktów hydrolizy.Przyklad I. Do 850 ml wody destylowanej wlewa sie 25ml buforu fosforanowego o pH 5,2-5,5 a nastepnie 30-40 ml ekstraktu enzymatycznego, przygotowanego przez wytrzasniecie w ciagu 1 godziny 50 g drobno zmielonego slodu jeczmiennego lub jeczmienia ze 100 ml wody lub wody z buforem fosforanowym lub octanowym o pH 5,0-5,5 (o skladzie 80 ml wody i 20 ml buforu) i odsaczeniu przez karbowany saczek bibuly filtracyjnej. Doprowadza sie pH otrzymanej miesza¬ niny do pH 5,2-5,5, ogrzewa do temperatury 38-42°C, dodaje 5 ml toluenu, umieszcza w termosta¬ cie i rozpoczyna wkraplanie roztworu odpowiedniego dezacetylolanatozydu A, B lub C, otrzymanego przez rozpuszczenie Ig substancji w 100ml metanolu. Roztwór metanolowy gliko¬ zydu wkrapla sie przez 30 minut przy wolnym mieszaniu, a nastepnie pozostawia w termostacie w temperaturze 38-42°C na okres 18-24 godzin wolno mieszajac. Po tym okresie czasu hydrolizat ochladza sie do temperatury pokojowej, a nastepnie saczy pod próznia. Przesacz (A) pozostawia do dalszego przerobu, a odsaczony osad rozpuszcza sie w 150-200 ml metanolu, miesza przez 1 godzine, odsacza od wytraconych metanolem resztek bialek enzymatycznych i przemywa doklad¬ nie 10-15 ml metanolu. Osad odrzuca sie, a przesacz zageszcza do 50 ml (I).Przesacz (A) zageszcza sie do 100-150 ml przy temperaturze 40°C i zawarte w nim glikozydy ekstrahuje trzykrotnie uzywajac kazdorazowo po 50 ml chloroformu wysyconego woda destylo¬ wana. Polaczone ekstrakty chloroformowe przemywa sie jeden raz 30 ml wody destylowanej wysyconej chloroformem i zageszcza do sucha, a utworzony osad rozpuszcza w 30-50 ml metanolu i laczy z roztworem metanolowym (I), dodaje 0,5 g wegla aktywnego, miesza i saczy pod próznia, przemywajac wegiel 10-15 ml metanolu. Otrzymany klarowny i bezbarwny roztwór metanolowy zageszcza sie, otrzymujac digitoksyne, gitoksyne lub digoksyne w postaci krystalicznej z wydajnos¬ cia 80-90%.Przyklad II. Postepuje sie jak w przykladzie I z tym, ze do przygotowanej mieszaniny hydrolizatu wkrapla sie metanolowy roztwór odpowiedniego dezacetylolanatozydu A, B, C przy¬ gotowany w nastepujacy sposób: 1 g odpowiedniego lanatozydu A, B lub C rozpuszcza sie w 50 ml metanolu, dodaje 10 ml wody i 10 ml 25% roztworu amoniaku, hydrolizuje w ciagu 40-48 godzin w temperaturze 40°C, zakwasza za pomoca lodowatego kwasu octowego do pH 5-5,5 i rozciencza dodajac 50 ml metanolu.Przyklad III. Do 1250 ml buforu octanowego o pH 5,2-5,5 dodaje sie 50 ml metanolu i 5 ml toluenu. Nastepnie wlewa sie 125 ml ekstraktu enzymatycznego otrzymanego przez wytrzasniecie z woda 150 g drobno zmielonego slodu jeczmiennego lub jeczmienia. Uzyskana mieszanine o pH 5,2-5,5 ogrzewa sie do temperatury 38-40°C, umieszcza w termostacie i rozpoczyna wkraplanie roztworu 1 g odpowiedniego lanatozydu A, B lub C rozpuszczonego w 100 ml metanolu. Wkrapla¬ nie trwa okolo 30 minut. Hydrolize prowadzi sie 18-24 godziny przy wolnym mieszaniu. Po zakonczeniu procesu hydrolizat ochladza sie za pomoca wody z lodem, a nastepnie saczy. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób enzymatycznej hydrolizy lanatozydów A, B i C oraz ich dezacetylowych pochód nych za pomoca enzymu typu beta-glukozydazy otrzymanego ze slodu jeczmiennego lub jeczmie-i ) j { \ 133386 3 i < nia, znamienny tym, ze slód jeczmienny lub jeczmien poddaje sie ekstrakcji woda, buforem fosforanowym badz octanowym i otrzymany ekstrakt dodaje sie do buforowego roztworu wodno- alkoholowego o pH 5-6 i zawartosci alkoholu 10-20%, a nastepnie przy temperaturze 35-45°C wkrapla sie alkoholowy roztwór odpowiedniego lanatozydu A, B i C lub jego dezacetylowa pochodna i prowadzi sie hydrolize przy stalej temperaturze 35-45°C w czasie 16-30 godzin, nastepnie wyodrebnia sie produkty hydrolizy w znany sposób, przy czym alfa-acetylowe pochodne digitoksyny, gitoksyny i digoksyny poddaje sie ewentualnie hydrolizie alkalicznej korzystnie za pomoca metanolowego roztworu amoniaku.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze slód jeczmienny lub jeczmien wytrzasa sie z woda lub z buforem fosforanowym badz octanowym o pH 5-5,5.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hydrolize prowadzi sie w srodowisku buforu fosforanowego badz octanowego, korzystnie przy pH 5,2-5,5 z dodatkiem alkoholu, zwlaszcza metanolu, korzystnie do stezenia 12-15%.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hydrolize prowadzi sie korzystnie w temperatu¬ rze 38-42°C w czasie 18-24 godziny. PL