Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania chlorku kwasu 4-N,N-dwumetylo-aminoazo- benzeno-4*-naftalenosulfonowego /DABNS-4C1/, majacego szczególne zastosowanie jako odozynnik do wykrywania i oznaczania amin, aminokwasów, peptydów i bialek, a mogacego równiez reagowac ze zwiazkami posiadajacymi grupy tiolowe lub fenolowe, wykrywanie i oznaczanie grup aminowych, fenolowych lub tiolowych, stanowi bardzo wazny problem w praktyoe analitycznej.Wiele produktów naturalnych, a takze syntetyzowanych na skale przemyslowa, moze zawierac w swoim skladzie wymienione uprzednio grupy funkcyjne. Jedna z bardzo waznych biologicznie grup zwiazków chemicznych sa: aminokwasy, peptydy i bialka. Metody analizy skladów ilosciowych jak i jakosciowych tych zwiazków sa przedmiotem zainteresowania wielu róznych dyscyplin. Meto¬ dy te sa czesto bardzo pracochlonne i nie zawsze niezawodne. Nie mniej wazna grupe zwiazków biologicznie czynnych stanowia aminy, które w reakcji z azotynami moga tworzyc odpowiednie N-nitrozopochodne, te zas jak wiadomo sa substancjami o silnym dzialaniu rakotwórczym. Ponie¬ waz aminy moga wystepowac w wielu produktach zywnosciowych, na przyklad rybach, nalezy opra¬ cowac metody umozliwiajace szybkie ilosciowe ich oznaczanie, w celu stwierdzenia przy stanowia one zagrozenie dla srodowiska biologicznego czlowieka.Znanych jest wiele róznych odczynników poprawiajacych i ulatwiajacych detekcje amin, ami¬ nokwasów, peptydów i bialek oraz stosowanych do ich wykrywania, po raz pierwszy w 194-5 r.F. sanger zastosowal 1-fluoro»2,4-dwunitrobenzen jako odczynnik do analizy aminokwasów, pepty¬ dów i bialek dajacy tzw. DNP pochodne /Biochem. j. 39, 507, 1945/. Znane jest takze stosowa¬ nie fenyloizotiooyjanianu, który z aminokwasami tworzy pochodne fenylotiohydantoiny /PTfi/, te zas sluza do okreslania sekwenoji aminokwasów w bialkach. /Acta Chem. Scand 4, 283, 1950/. Bo podobnych celów stosowano takze chlorek kwasu 1-N,H-dwumetyloaminonaftaleno-5-sulfonowego /LANS-Cl/ /Biochem. J. 51, 155, 1952/.Jednym z najnowszych reaktywnych odczynników majacych zastosowanie do wykrywania i ozna- ozania aminokwasów, peptydów i bialek j^st chlorek kwasu 4-N,N-dwunetyloamino-asobenzeno-4#- ¦ulfonowego /DABS-Cl/ /Anal« chem. 47, 163^ » 1975/. Odczynnik ten byl równiez zastosowany do2 132 813 oznaczania naturalnie wystepujacych amin w produktaoh spozywczyol przy zastosowaniu wysoko¬ cisnieniowej cieczowej chromatografii /imal. Chem. 52, 630, 1980/, Powyzszy odczynnik posia¬ da wiele zalet w stosunku do poprzednio stosowanych, a miedzy inrymi jest on trwaly podczas przechowywania w róznych warunkach, podobnie jak pochodne DABS-amlnokwasów, peptydów i bia¬ lek otrzymane przy zastosowaniu tego odozynnika. Pochodne aminokwasów maja intensywna czer¬ wona barwe, co ulatwia ich wykrywanie w czasie rozdzialu metodami chromatograficznymi, wy¬ soka czulosc tego odczynnika pozwalajaca na wykrywanie aminokwasów, peptydów czy bialek w ilosci rzedu 10" - 10" mola stawia go w czolówce znanych i stosowanych tego typu reagen¬ tów.Poszukiwanie nowych odczynników reagujacych z grupami aminowymi, tiolowymi lub fenolo¬ wymi w dalszym ciagu interesuje wielu specjalistów zarówno z zakresu ochrony srodowiska jak równiez technologów, analityków kontroli jakosci z przemyslu, a takze zajmujacych sie bada¬ niami strukturalnymi i wyznaczaniem struktury 1-rzedowej bialek, tj. sekwencji aminokwasów.Metody analizy amin, aminokwasów, peptydów i bialek wymagaja ciaglego doskonalenia.Tendencje rozwojowe ida w dwu kierunkach; poszukiwania nowych odczynników dajacych po¬ chodne o zmniejszonej polarnosci amin czy aminokwasów, oraz poszukiwanie odczynników zwiek¬ szajacych czulosc detekcji metodami fotornetrycznymi stosowanymi w wysokosprawnej chromato¬ grafii kolumnowej.Stwierdzono, ze takie wymogi spelniaja analogi chlorku kwasu 4-N,N-dwumetyloaminoazo- benzene-4#-sulfonowego /DABS-Cl/ zawierajace w swojej budowie oprócz pierscienia benzenowe¬ go, pierscien naftalenowy np. DABNS-4 Cl. Jak stwierdzono, wprowadzenie pierscienia nafty¬ lowego w miejsce pierscienia benzenowego w DABS-Cl, zwieksza ciezar czasteczkowy i podwyz¬ sza próg czulosci reakcji wykrywania amin, aminokwasów, peptydów lub bialek, a ponadto wply¬ wa na zmniejszenie polarnosci tych zwiazków, co w konsekwencji zapewnia polepszenie rozdzia¬ lów metodami chromatograficznymi.Chlorek kwasu 4-N,K-dwumetyloaminoazobenzeno-4' -naftalenosulfonowego DABNS-4 Cl, wedlug znanych metod otrzymywany jest przez chlorowanie soli sodowej kwasu 4-N,N-dwumetyloamino- azobenzeno-4#-naftalenosulfonowego /DABNS-40Na/, polegajace na ucieraniu jej z pieciochlor- kiem fosforu, a nastepnie przez wydzielanie utworzonego sulfochlorku ze srodowiska reakcji.Zasadnicza niedogodnoscia tej metody jest bardzo niska wydajnosc spowodowana prowadzeniem reakcji chlorowania krystalicznego stalego produktu jakim jest DABNS-40Na przy pomocy PClc, który jest równiez cialem stalym. Mechaniczne rozoieranie tej mieszaniny nie zapewnia odpo¬ wiedniego kontaktu reagentów, przez co uzyskuje sie niski stopien schlorowania DABNS-40Na.Obecnie nieoczekiwanie okazalo sie, ze proces chlorowania soli sodowej kwasu 4-N,N-dwu- metyloaminoazobenzeno-4'-naftalenosulfonowego /DABNS-40Na/ mozna przeprowadzic z dobra wy¬ dajnoscia stosujac do tego celu chlorek tionylu SOClp z dodatkiem chlorku formamidyniowego jako katalizatora. Wedlug wynalazku, sól sodowa kwasu 4-N,N-dwumetyloaminoazobenzeno-4'-na¬ ftalenosulfonowego /DABNS-40Na/, chloruje sie mieszanina skladajaca sie z chlorku tionylu S0C12 i chlorku dwumetyloformamidyniowego uzytych w proporojach od 100:0,1 do 1:1, korzyst¬ nie 20:1 zastosowanych w 50-100$ nadmiarze w stosunku do masy soli sodowej, przy czym prooes chlorowania prowadzi sie w temperaturze 20-80°c, zwlaszcza 60°C, przy jednoczesnym intensyw¬ nym mieszaniu, korzystnie przy uzyciu ultradzwieków przez okres 15-240 minut, po ozym mie¬ szanine reakcyjna zabezpiecza sie przed dostepem wilgoci i pozostawia na okres 12 godzin a nastepnie oddestylowuje sie nadmiar SOClp pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze okolo 60 C, zas prawie sucha pozostalosc przemywa sie woda destylowana z dodatkiem lodu i zakwaszo¬ na kwasem solnym; odmyty, surowy produkt poddaje sie suszeniu w temperaturze 30-50°c do sta¬ lej wagi, a po wysuszeniu prowadzi sie proces ekstrakcji ciaglej DABNS-4C1 przy uzyciu roz¬ puszczalników organicznych.Dodatek chlorku dwumetyloformamidyniowego do chlorku tionylu wplywa bardzo korzystnie na proces chlorowania soli sodowej DABNS-40Na zwiekszajac wydajnosc produktu koncowego DABNS-4C1, który jest zwiazkiem trwalym, wysoce reaktywnym, posiadajacym wysoki molowy wspól-132 815 5 czynnik absorbancji, co wplywa bardzo korzystnie na obnizenie granicy wykrywalnosci ponizej 10 mola aminokwasów, peptydów czy bialek. Uzyskane DABNS-pochodne sa równiez trwale i posiadaja obnizone wlasciwosci hydrofilowe, co wplywa korzystnie na uzyskanie dobrych roz¬ dzialów analitycznych metodami chromatograficznymi.Przyklad, W celu otrzymania barwnika azowego bedacego sola sodowa kwasu 4—N,H- dwumetyloaminoazobenzeno-4#-naftalenosulfonowego /DABKS-40Na/, odwazono 22,3 g /0,1 u/ kwasu naftionowego i rozpuszczono w mieszaninie 150 cnr wody z dodatkiem 12 g bezwodnego weglanu sodu, dodajac równoczesnie 14 g /0,2 M/ azotynu sodowego w 50 cnr wody. Mieszanine ta wkrapla- no do oziebionego do 0°C roztworu stezonego kwasu solnego w ilosci 50 cm w czasie 1 godziny tak, aby temperatura mieszaniny utrzymywala sie w granicach 0°c, dodajao równiez pewna ilosó pokruszonego lodu, calosc poddawano mieszaniu w czasie dalszych dwu godzin utrzymujac tempe¬ rature w poblizu 0°C. Po tym czasie dodawano roztwór 20 g mocznika w 100 cm wody oraz 20 g bezwodnego octanu sodu. Utrzymujac temperature mieszaniny w przedziale od 0 io +3°C dodawano 15 cnr /0,1m/ N,N-dwumetyloaniliny rozpuszczonej w 75 cm^ lodowatego kwasu octowego, zawar¬ tosc naczynia reakcyjnego poddawano dalszemu ciaglemu mieszaniu w lacznym czasie okolo 20 go¬ dzin, a nastepnie saczono i przemywano 10# roztworem kwasu octowego. Po wykrystalizowaniu otrzymano 51 g barwnika azowego w postaci krysztalów koloru oranzowego, co stanowilo okolo 80# wydajnosci teoretycznej. Otrzymany w ten sposób barwnik azowy, odwazano w ilosci 18,9 g /0,05m/ DABNS-40tfa i dodawano porcjami do 30 cnr chlorku tionylu zawierajacego 2 g chlorku formamidyniowego. Nastepnie calosc poddawano dzialaniu pola ultradzwiekowego, o natezeniu 25 KHz w czasie 60 minut, przy jednoczesnym ogrzewaniu do temperatury 60°c na lazni wodnej.Po uplywie tego ozasu mieszanine reakcyjna pozostawiano w eksykatorze prózniowym nad bezwod¬ nym chlorkiem wapniowym na okres 12 godzin, po czym oddestylowano nadmiar SOClo z lazni wod¬ nej pod próznia. Pozostalosc po oddestylowaniu chlorku tionylu mieszano dokladnie z 500 cnr wody destylowanej z lodem zakwaszonej 10 cnr stezonego kwasu solnego, a nastepnie saczono przemywajac 500 cnr wody z lodem. Po dokladnym wysuszeniu surowy produkt poddawano ekstrakcji ciaglej bezwodnym acetonem.Uzyskany ekstrakt poddawano oziebianiu i po wykrystalizowaniu odsaczano wydzielone krysztaly DABNS-4C1. Przesacz poddawano zageszczeniu przez oddestylowanie okolo polowy obje¬ tosci acetonu i po kolejnym oziebieniu roztworu uzyskiwano dalsze porcje krysztalów DABNS-4C1.Laczna wydajnosc produktu wynosila 8,5 g co stanowi ok, 40# wydajnosci teoretycznej. Otrzy¬ many krystaliczny produkt, ma postac blyszczacych krysztalów, koloru zlocisto-zielonego po roztarciu z odcieniem morelowym i temperature topnienia 272-274°C.Sumaryczny sklad zwiazku byl nastepujacy: CjgH^glUS02Clf a ciezar czasteczkowy wynosil: M=375,855. Sklad ilosciowy podstawowych pierwiastków wynosil: C-57,85# obliczone teoretycznie, oraz 57,97# oznaczone ilosciowo, H-4,514# obliczone teoretycznie oraz 4,06# oznaczone ilos¬ ciowo, N-11,24% obliczone teoretycznie oraz 11,065# oznaczone ilosciowo, wyznaczono równiez widma w zakresie UV/Vis, które posiadaly maksima absorbancji w eterze dwuetylowym w zakresie uTprzy*max=260 nm, oraz ^ max=*80 nm w swietle widzialnym zas w acetonie \ mai=500 nm.Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania chlorku kwasu 4-N,wdwumetyloaminoazobenzeno-4*-naftalenosulfonowego /MBNS-4C1/ przez chlorowanie soli sodowej kwasu 4-N,N-dwumetyloaminoazobenzeno-4#-naftaleno¬ sulfonowego /DABNS-40Na/ i nastepnie ekstrakcje wytworzonego produktu rozpuszczalnikami orga¬ nicznymi, znamienny tym, ze sól sodowa kwasu 4-N,N-dwumetyloazinoazobenzeno-4#- naftalenosulfonowego /DABNS-40Na/ chloruje sie mieszanina skladajaca sie z chlorku tionylu SOclp i ohlorku dwumetyloformamidyniowego uzyta w proporcjach od 100:0,1 do 1:1, korzystnie 20; 1 zastosowana w 50-100^ nadmiarze w stosunku do soli sodowej, przy czym proces chlorowa¬ nia prowadzi sie w temperaturze 20-80°C, zwlaszcza 60°C przy jednoczesnym intensywnym miesza¬ niu, korzystnie przy uzyciu ultradzwieków przez okres 15-240 minut, po czym po calkowitym4 132 813 przereagowaniu w warunkach zabezpieczajacych przed dostepem wilgoci, oddestylowuje sie nadmiar SOclp, korzystnie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 60°C, a nastepnie z pozostalosci po przemyciu wyodrebnia sie produkt reakcji przez ekstrakcje rozpuszczalnikami organicznymi.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 cgz.Ona 100 zl PL