Przedmiotem wynalazku jest prosty i wydajny sposób otrzymywania chlorku kwasu 5-na- ftaleno-1-azo-/4 -diraetyloaminobenzeno/-3ulfonowego /DABNS-5-C1/, majacego szczególne za¬ stosowanie jako odczynnik do wykrywania i oznaczania amin, aminokwasów, peptydów i bialek* Aminokwasy, peptydy i bialka stanowia bardzo wazna z biologicznego punktu widzenia grupe zwiazków chemicznych, których metody analizy skladów ilosciowych jak i jakosciowych sa przedmiotem zainteresowania biologów, chemików, lekarzy oraz wielu innych specjalistów.Równie wazna grupe zwiazków biologicznie czynnych stanowia aminy, których N-nitrozowe zwiazki sa substancjami o dzialaniu rakotwórozyra, wystepujacymi w wielu produktach zywno¬ sciowych. Istnieje zatem koniecznosc ich szybkiego oznaczania ilosciowego w celu stwier¬ dzenia, czy stanowia one zagrozenie dla srodowiska biologicznego czlowieka* Aminokwasy naleza do grupy zwiazków chemicznych, która nie absorbuje swiatla w nad¬ fiolecie powyzej 220 nm, natomiast aminokwasy aromatyczne wykazuja charakterystyczne ma¬ ksimum absorbcji w zakresie 250 - 285 nm* Dlatego tez analiza tej waznej biologicznie grupy polaczen wymaga otrzymywania ich barwnych pochodnych.Metody derywatyzacji aminokwasów mozna podzielic na dwie grupy: derywatyzacje po ko¬ lumnie chromatograficznej oraz przed kolumna. Standardowe metody analizy aminokwasów opie¬ raja si© o metode Moore i Steina /J*Biol.Chem, 211, 893, 195V rozwinieta technicznie przez Spackmana i in. /Anal.Chem. 30, 1190, 1958A Mieszanina aminokwasów jest rozdzielana w ko¬ lumnie jonitowej i wykrywana dzieki reakcji z ninhydryna. Metoda ta byla zmodyfikowana i udoskonalona przez zastosowanie mikrokolumn, oraz ukladu z detekcja fluorescencyjna w celu dostosowania Jej do wykrywania pikomolowych ilosci aminokwasów. Innym rozwiazaniem jest przedkolumnowa derywatyzacja aminokwasów i rozdzial metoda IIPLC. Jedna z najbardziej in¬ teresujacych nowych metod derywatyzacji jest otrzymywanie pochodnych z aldehydem o-fta¬ lowym* Metoda jest prosta, czula i powtarzalna, ale nie moze byc stosowana do aminokwasówa \kk 2^9 zawierajacych grupe iminowa /prolina, hydroksyprolina/. V ostatnioh latach opracowano szereg nowych, barwnych odczynników do derywataoji przedkoluranowej,, takich jak chlorek dabsylu /DABS-Cl/ lub chlorek dabnaylu /DABNS-*f-Cl/. Oba te odczynniki reaguja z wiekszo¬ scia aminokwasów w sposób ilosciowy 1 powtarzalny w odpowiednio dobranych warunkach* Na podkreslenie zasluguje fakt szczególnej reaktywnosci tych odczynników z grupami lmino- wysd. proliny 1 hydreksyproliny. Jeszcze nowszym z tej grupy zwiazków, jako odozynników do wykrywania amin, aminokwasowi peptydów 1 bialek jest chlorek kwasu 5-naftaleno-1-azo- -/fc#-dimetyloaminobenzeno/-sulfonowego /DABNS-5-C1/, którego zastosowanie podwyzsza próg ozulosoi reakeji i zapewnia polepszenie rozdzialów metodami chromatograficznymi.DABNS-5-C1 wedlug znanych dotychczas metod otrzymywany jest przez chlorowanie soli sodowej kwasu 5-naftaJ.eno-1-azo-/4#-dime tyloanri.nobenzeno/-sulfonowego /"DaBNS-5-ONa/ po¬ legajace na ucieraniu jej z pieciochlorkiem fosforu, a nastepnie przez wydzielenie utwo¬ rzonego sulfoohlorku. Niedogodnoscia tej metody jest bardzo niska wydajnosc, gdyz proces ohlorowania prowadzony jest w fazie stalej miedzy dwoma krystalicznymi substancjami Jakimi sa DADNS-5-ONa oraz PCI,.* Postepem w zakresie tej syntezy bylo opracowanie sposobu chloro¬ wania soli sodowej kwasu 5-naftaleno- 1-azo-/*t -dimetyloarainobenzeno/-sulfonowego za pomo- ca chlorku tionylu z dodatkiem chlorku formamidyniowego jako katalizatora /polski opis patentowy nr 132812/.Obecnie stwierdzono, ze wydajnosc reakcji chlorowania soli sodowej kwasu 5-naftaleno- -1azo-/*l*-dimotyloaminobenzeno/-sulfonowego mozna podwyzszyc, a co za tym idzie obnizyc loszty produkcji DAJ3NS-5-C1, poprzez zastosowanie mieszanin ohlorujacyoh w postaci roztwo¬ ru lub zawiesiny zawierajacych pieciochlorek fosforu w tlenochlorku fosforu, piecioclilo- rek fosforu w chlorku metylenu lub pieciochlorek fosforu w chlorku tionylu z jednoczes¬ nym wspomaganiem procesu przez dzialanie ultradzwieków na srodowisko reakcji.Wedlug wynalazaku, sól Sodowa kwasu 5-naftaleno-1-azo-/*l#-dimetyloaminobenzeno/-sul¬ fonowego /DABNS-5-ONa/ chloruje sie wymieniona mieszanina chlorujaca zawierajaca skladni¬ ki w stosunku wagowym korzystnie 1:1f uzyta w 50 - 150 £-wym nadmiarze w stosunku do masy soli sodowej, przy czym proces prowadzi sie w temperaturzo 10 - 60 C zwlaszcza w 15 -25 C przy jednoczesnym mieszaniu i dzialaniu ultradzwieków na mieszanine reakcyjna przez okres 0,5 - 5f0 godzin. Po calkowitym przereagowaniu substratów w warunkach zabezpieczajacych przed dostepem wilgoci , oddestylowuje sie nadmiar cieklych skladników mieszaniny chloru¬ jace j/S0_Cl lub CIIpCl, lub P0C1«/ pod próznia, zas sucha lub prawie sucha mase reakcyjna przemywa sie, korzystnie woda z lodem, a po wysuszeniu w temperaturze hO - 60 C, produkt reakcji wyodrebnia sie przez ekstrakcje bezwodnymi rozpuszczalnikami organicznymi.Zaleta sposobu wedlug wynalazku jest mozliwosc przeprowadzenia roakcji chlorowania DADNS-5-0Na z dosc duza wydajnoscia w stosunku do znanych dotychczas sposobów, siegajaca przecietnie 55 £ wydajnosci teoretycznej z zadumaniem dobrój Jakosci produktu koncowego.Mozliwosc prowadzenia reakcji w kilku wariantach recepturowych, jesli chodzi o zastosowa¬ nie mieszaniny chlorujacej poszerza game znanych rodzajów syntez DADNS-5-C1 i lagodzi trudnosc zaopatrzenia w substraty potrzebne do prowadzenia reakcji chlorowania.Przyklad I. Do kolby stozkowej dodano 20g DADNS-5-0Na oraz skladniki miesza- niny chlorujacej w postaci 30g PCI,, i 25 cm POCl^ i po wymieszaniu zawartosci kolba za¬ mknieto chlodnice zwrotna i umieszczono ja w wannie pluczki ultradzwiekowej wypelnionej woda o temperaturze 17 C. Mieszanine reakcyjna poddawano dzialaniu ultradzwieków przez okres 1 godziny utrzymujac temperature wody w wannie w granicach 17 - 22 C. Po tym czasie kolbe z mieszanina reakcyjna odstawiono do nastepnego dnia do eksykatora prózniowego z bezwodnym CaClp, zabezpieczajac w ten sposób pólprodukt przed dostepem wilgoci. Naste¬ pnie oddestylowano nadmiar P0C1« na lazni wodnej przy uzyciu prózniowej pompki wodnej. 3 Prawie sucha mase reakcyjna zmieszano z 5°0 era wody z lodem i saczono przemywajac osad dalsza porcja okolo 500 om wody destylowanej. Przemyty surowy produkt wysuszono w tempe-iWl 2k9 3 raturze 60 C a nastepnie ekstrahowano w sposób ciagly bezwodnym acetonem w aparacie Sochle- ta uzyskujac w ten sposób 11f3g DABNS-5-C1 w postaci krystalicznego proszku koloru wisnio¬ wego o temperaturze topnienia 172 - 173 C# Wydajnosc reakcji chlorowania wyniosla okolo 56,5 % wydajnosci teoretycznej* Otrzymany zwiazek mial wzór sumaryczny c1oH1iCNoSOpCl a ciezar czasteczkowy M = 373,855« Sklad ilosciowy podstawowych pierwiastków wynosil: C - 57f83 $ teoretycznie9 - oznaczono 57f90 jC II - *iy3l4 % teoretycznie - oznaczono ^,165 % N - 11,2^ % teoretycznie - oznaczono 11,12 % Wyznaczono równiez widma w zakresie UV/Vis9 które posiadaly maksima absorbancji w eterze dwuotylowym w zakresie UV przy X _ = 230 nm i 315 nm oraz A = 4^0 nm w swietle wi- * »• max max dzialnym, zas w aoetonief\ = h60 nm.Przyklad II# Do kolby stozkowej dodane 20g DADNS-5-ONa oraz'skladniki miesza- 3 niny chlorujacej w postaci 30g PCI- i 30 cm CII Cl- i postepowano dalej Jak w przykladzie I. Otrzymano 10,6 g DABNS-5-C1 w postaci krystalicznego proszku koloru wisniowego o tempe¬ raturze topnienia 175 C. Wydajnosc reakcji chlorowania wynosila okolo 53 % wydajnosci teore¬ tycznej* Otrzymany zwiazek o wzorze sumarycznym i ciezarze czasteczkowym jak w przykladzie I posiadal równiez identyczne widma w zakresie UV/Vis, Oznaczony analitycznie sklad podsta¬ wowych pierwiastków byl nastepujacy: C - 57,93 £, H - ^»205 £, N - 11,15 £• Przyklad III# Do kolby stozkowej dodano 20g DABNS-5-ONa oraz skladniki tnie- 3 szanlny chlorujacej w postaci 30g PCI- i 25 cm S0C12 oraz postepowano dalej jak w przy¬ kladach I. Otrzymano 11,2g DABNS-5-C1 w postaci krystalicznego proszku koloru wisniowego o temperaturze topnienia 173 - 17^ C. Wydajnosc reakcji chlorowania wynosila okolo 56 % wydajnosci teoretycznej. Oznaczony analitycznie sklad ilosciowy podstawowych pierwiastków wynosil; C - 57,92 £, II - 4,162 %, N - 11,18 %0 Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania chlorku kwasu 5-naf taleno- 1-azo-/'l -diirtGtyloaiidnobenzcno/-sulfo- nowego przez chlorowanie soli sodowej kwasu 5-naftaleno-1-azo-/'l -dimotyloawinobenzeno/-sul- fonowego i nastepnie ekstrakcje wytworzonego produktu rozpuszczalnikiem organicznym, znam ie nn y t y ni, ze sól sodowa kwasu 5-noftaleno-1-azo-/^l -dirne tyloamino bonzono/- -sulfonowego chloruje sie mieszanina chlorujaca w postaci roztworu lub zawiesiny zawieraja¬ ca pieciochlorek fosforu w tlenochlorku fosforu, pieciochlorek fosforu w chlorku metylenu lub pieciochlorek fosforu w chlorku tionylu w stosunku wagowym korzystnie 1:1, uzyta w 50 - 150^-owym nadmiarze w stosunku do masy soli sodowej, przy czym proces prowadzi sie w temperaturze 10 - 60 C, zwlaszcza w 15 - 25 C przy jednoczesnym mieszaniu i dzialaniu ultra¬ dzwieków na mieszanine reakcyjna przez okres 0,5-5 godzin, po czym po calkowitym prze- reagowaniu substratów w warunkach zabezpieczajacych przed dostepem wilgoci, oddostylowuje sie pod próznia nadmiar cieklych skladników mieszaniny chlorujacej, natomiast sucha lub prawie sucha mase reakcyjna przemywa sie, korzystnie woda z lodem, a po wysuszeniu w tem¬ peraturze kO - 60 C produkt reakcji wyodrebnia sie znanym sposobem przez ekstrakcje bezwo¬ dnymi rozpuszczalnikami organicznymi PLThe subject of the invention is a simple and efficient method for the preparation of 5-naphthalene-1-azo- (4-diraethylaminobenzene) -3ulfonic acid chloride (DABNS-5-C1), which is particularly useful as a reagent for the detection and determination of amines, amino acids, peptides and proteins * Amino acids, peptides and proteins are a group of chemical compounds very important from the biological point of view, the methods of analyzing quantitative and qualitative composition of which are of interest to biologists, chemists, doctors and many other specialists. Amines are also an important group of biologically active compounds, whose N-nitroso compounds are carcinogenic substances found in many food products. Therefore, there is a need for their rapid quantification in order to determine whether they pose a threat to the biological environment of man * Amino acids belong to the group of chemical compounds that do not absorb light in the ultraviolet above 220 nm, while aromatic amino acids show a characteristic minimum absorption in the range of 250 - 285 nm * Therefore, the analysis of this biologically important group of connections requires the preparation of their colored derivatives. The methods of amino acid derivatization can be divided into two groups: post-chromatographic and pre-column derivatizations. Standard methods of amino acid analysis are based on the method of Moore and Stein (J*Biol.Chem, 211, 893, 195V, technically developed by Spackman et al. /Anal.Chem. 30, 1190, 1958A The amino acid mixture is separated in an ion exchange column and detected by reaction with ninhydrin. This method was modified and improved by the use of microcolumns and a system with fluorescence detection to adapt it to the detection of picomolar amounts of amino acids. Another solution is the pre-column derivatization of amino acids and the splitting method IIPLC. One of the most interesting new derivatization methods is the synthesis of phthalaldehyde derivatives. The method is simple, sensitive and reproducible, but cannot be applied to the amino acids kk 2 ^ 9 containing the imine group (proline, hydroxyproline). In recent years, a number of new colored reagents for precolurate derivatization, such as dabsyl chloride / DABS-Cl / or dabnayl chloride / DABNS- * f-Cl /, have been developed. Both of these reagents react quantitatively and reproducibly under appropriately selected conditions with most amino acids. It should be emphasized that these reagents are particularly reactivity with the lminosd groups. proline and hydroxyproline. An even newer of this group of compounds as reagents for the detection of amines, the amino acid of peptides and proteins is 5-naphthalene-1-azo- - / fc # -dimethylaminobenzene / -sulphonic acid chloride / DABNS-5-C1 /, the use of which increases the ozulose threshold DABNS-5-C1, according to methods known so far, is obtained by chlorination of sodium salt of 5-naphthaJ.ene-1-azo- / 4 # -dimethylanri.nobenzene / -sulfonic acid / "DaBNS-5". - It consists of grinding it with phosphorus pentachloride, and then by isolating the formed sulfo-chloride. The disadvantage of this method is very low efficiency, because the chlorination process is carried out in the solid phase between two crystalline substances, such as DADNS-5-ONa and PCI, * An improvement in this synthesis was the development of a method of chlorination of sodium salt of 5-naphthalene-1-azo - (* t-dimethylarainobenzene) sulfonic acid with thionyl chloride with the addition of formamidinium chloride as a catalyst (Polish patent specification No. 132812). It has now been found that the efficiency of the chlorination reaction of the sodium salt of 5-naphthalene--1azo - (* l * -dimotylaminobenzene / -sulfonic acid) can be increased, and thus lower costs of production of DAJ3NS-5 -C1, by the use of chlorinating mixtures in the form of a solution or suspension containing phosphorus pentachloride in phosphorus oxychloride, phosphorus pentocylide in methylene chloride or phosphorus pentachloride in thionyl chloride while assisting the process by ultrasounds on the reaction environment, according to the invention. Sodium salt of 5-naphthalene-1-azo-(l'-dimethylaminobenzene) -sulfonic acid (DABNS-5-ONa) is chlorinated in said chlorinating mixture containing ingredients in a weight ratio of preferably 1: 1f used in 50 - 150 In excess of the weight of the sodium salt, the process is carried out at a temperature of 10 - 60 C, especially at 15 -25 C, with simultaneous mixing and the action of ultrasounds on the mixture. shares for 0.5 - 5 hours. After the reactants have completely reacted under conditions preventing the access of moisture, the excess liquid components of the chlorinating mixture J (S0_Cl or CIIpCl, or POC1) are distilled off under vacuum, and the dry or almost dry reaction mass is washed, preferably with ice water, and then After drying at a temperature of h0 - 60 ° C, the reaction product is isolated by extraction with anhydrous organic solvents. The advantage of the method according to the invention is the possibility of carrying out the chlorination reaction of DADNS-5-0Na with quite high efficiency compared to the previously known methods, reaching an average of 55 £ of theoretical yield with thoughtfulness of the quality of the final product. The possibility of carrying out the reaction in several recipe variants, when it comes to the use of a chlorinating mixture, extends the range of known types of DADNS-5-C1 syntheses and reduces the difficulty of supplying the substrates needed for the chlorination reaction. Example I. For a conical flask. 20g of DADNS-5-0Na and scla Chlorinating mixture in the form of 30 g of PCI and 25 cm of POCl and after mixing the contents of the flask, the reflux condenser was closed and placed in an ultrasonic rinse bath filled with water at 17 ° C. The reaction mixture was subjected to ultrasound for 1 hour, keeping temperature of water in the bath in the range of 17 - 22 C. After this time, the flask with the reaction mixture was placed in a vacuum desiccator with anhydrous CaClp over the next day, thus protecting the intermediate against moisture. The excess POC1 was then distilled off in a water bath using a water vacuum pump. 3 The almost dry reaction mass was mixed with 5 ° C ice water and drained, washing the precipitate with a further portion of about 500 µm distilled water. The washed crude product was dried at 60 ° C and then continuously extracted with anhydrous acetone in the Sochlet apparatus, thus obtaining 11.3 g of DABNS-5-C1 in the form of a cherry-colored crystalline powder with a melting point of 172-173 C # The efficiency of the chlorination reaction was about 56.5% of theoretical efficiency * The obtained compound had the total formula c1oH1iCNoSOpCl and the molecular weight M = 373.855 «The quantitative composition of the basic elements was: C - 57f83 $ theoretically9 - determined 57f90 jC4% II - * andyy3l , 165% N - 11.2 ^% theoretically - determined 11.12% The spectra in the UV / Vis9 range were also determined, which had absorbance maxima in the diethyl ether in the UV range at X _ = 230 nm and 315 nm and A = 4 ^ 0 nm in light * »• max working value, while in aoetonief \ = h60 nm. Example II # 20g of DADNS-5-ONa and components of the chlorinating mixture in the form of 30g PCI- and 30 cm CII are added to the conical flask Cl- and it was done further as in example I. 10.6 g of DABNS-5-C1 were obtained in the form of a cherry-colored crystalline powder with a melting point of 175 C. The yield of the chlorination reaction was about 53% of the theoretical yield. * The obtained compound with the total formula and molecular weight as in example I also had identical spectra in the range of UV / Vis, The analytically determined composition of the basic elements was as follows: C - 57.93 £, H - 205 £, N - 11.15 £ • Example III # To the flask 20 g of DABNS-5-ONa and the chlorinating cutting ingredients in the form of 30 g of PCI and 25 cm SOC12 were added to the cone, and the procedure was continued as in Examples I. 11.2 g of DABNS-5-C1 was obtained in the form of a cherry-colored crystalline powder with mp 173-17 ° C. The yield of the chlorination reaction was about 56% of theoretical value. Analytically determined quantitative composition of basic elements was; C - £ 57.92, II - 4.162%, N - 11.18% 0 Patent claim Method for the preparation of 5-naphthalene-1-azo- (1-diirthyl) thylaiidinobenzene / -sulfonic acid chloride by chlorination of sodium acid 5 -naphthalene-1-azo - (1-dimotylavinobenzene) -sulfonic acid and subsequent extraction of the obtained product with an organic solvent, characterized by the fact that the sodium salt of 5-nophthalene-1-azo - (1-dirne tylamino bonzono) The chlorinating mixture is chlorinated as a solution or suspension containing phosphorus pentachloride in phosphorus oxychloride, phosphorus pentachloride in methylene chloride or phosphorus pentachloride in thionyl chloride in a weight ratio of preferably 1: 1, used in a 50-150% excess. relative to the weight of the sodium salt, the process being carried out at a temperature of 10-60 ° C, especially at 15-25 ° C, while stirring and applying ultrasounds to the reaction mixture for a period of 0.5-5 hours, and then - reacting the substrates under safe conditions The excess liquid components of the chlorinating mixture are distilled under vacuum, while the dry or almost dry reaction mass is washed, preferably with ice water, and after drying at a temperature of about 60 ° C, the reaction product is isolated by a known method by extracting without food With any organic solvents PL