PL123535B1 - Process for preparing 11alfa-hydroxysteroids - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 11 a-hydroksysteroidów serii pregnanu na drodze bioikonwersji przy uzyciu szczepu z rodzaju Cy- lindirocladium, gatunku Cylindrocladium simplex- -Meyer (M. A. Litwinow — Gpredielitiel Mikros- kopiczeskich Poczwienmych Gribow, Leningrad 1967; zdeponowany w Kolekcji Instytutu Mikrobio¬ logii Uniwersytetu Lódzkiego; Polska, nr 2358) o jednokierunkowej zdolnosci transformacji pól¬ produktów w syntezie zwiazków z grupy kortiko- steroidów: Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie zwia¬ zek o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza atom wodoru, grupe hydroksylowa ewentual¬ nie zestryfikowana reszta kwasu organicznego o 2 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru, grupe hydroksylowa lub grupe a- lub /tf-metylowa albo razem z Ri grupe izopropylidenodwuoksylowa, X oznacza atom wodoru lub chlorowca lub grupe a- lub /?nmetylowa, a Z jest wiazaniem po¬ jedynczym lub podwójnym miedzy weglami 1 i 2.W celu otrzymania zwiazku o wzorze 1, zwiazki o wzorze ogólnym 2, w którym Ri, R2, X i Z maja wyzej podane znaczenie, a R3 oznacza wodór lub reszte kwasu organicznego jedno- lub dwukar- boksylowego, poddaje sie reakcji hydiroksylacji w pozycji 11 a przy uzyciu dobnoustroju Cylindro¬ cladium simplex-Meyer nr 2358 w formie grzybni wegetatywnej lub tez zarodników. W przypadku, gdy w suibstracie R3 stanowi reszte kwasu karbo- 15 20 25 30 ksylowego, w czasie 11 a-hydiroksylacji nastepuje równoczesnie hydroliza na C-21 i otrzymuje sie produkt o wzorze ogólnym 1.Z patentów polskich nr 68275 i nr 114034 znany jest szczep Metarrhizium velutinum M-6, który wykazuje zdolnosc hydroksylacji 11 a-kortaksolonu i 6a-fluoro-16a-metylokorteksoloou. Z opisu paten¬ towego nr 114034 wynika, ze szczep ten nie trans¬ formuje pochodnej korteksolonu, zawierajacej grupe metylowa w pozycji 16 fi* Z patentu polskiego nr 90658 znany jest takze szczep Hyphoderma roseum zdolny do 11 a-hydro* ksylacji róznych pochodnych korteksolonu, lecz szczep ten nie ma wlasciwosci transformowania niektórych zwiazków steroidowych objetych wzo¬ rem ogólnym 2, na przyklad takiego, w którym R\ oznacza 16/?-metyl, Ri oznacza atom wodoru lub reszte kwasu organicznego jednokarboiksylowego lub dwukarboksylowego, X oznacza atom wodoru, a Z stanowi wiazanie pojedyncze lub podwójne.Ponadto szczep Hyphoderma roseum przeksztalca pochodne korteksolonu stosLunjkowo w niewielkim stezeniu okolo 0,4 g w 1 litrze, a wydajnosc otrzy¬ manych 11 a-hydroksyzwiazków nie przekracza 50°/o.Wprowadzenie podstawnika tlenowego w po¬ zycji 11 steroidów stanowi istotne zagadnienie w produkcji leków kortyikoidowych. Jak dotad nie istnieja efektywne metody chemiozine umozliwia¬ jace przeprowadzenie tej reakcji. Znany jest szereg 123 535123 535 drobnoustrojów zdolnych do 11 a-hydroksylacji.Niektóre z nich jednak daja równiez reakcje w pozycji 1 /? lub 6 /?, jak na przyklad Absidia orchi- dis (Appl. Microbiol. 11 256 (1963)), ozy nalezacy do tej samej rodziny Moniliaceae Botrytis reptons) J. Gem. Appl. Microbiol. (Tokyo) 7, 341 (1961)).W innych przypadkach natomiast przemiana nie jest stereoselektywna i w efekcie uzyskuje sie mieszanine 11 a i 11/?-hydrOksypochodmych opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 3 054 625)., Nieoczekiwanie okazalo sie, ze dirobnoustroije z rodzaju Cylindrocladium, a zwlaszcza gatunek simpleks-Meyer, dotychczas nie stosowane w bio- transformacji steroidów, wykazuja zdolnosc jedno¬ kierunkowej i siereospecyficznej hydroksylacji po¬ chodnych korteksolonu z wysoka wydajnoscia do 70°/o. Ponadto drobnoustroje te odznaczaja sie sta- ' bilnoscia i zdolnoscia do szybkiego i obfitego wzrostu na odpowiednio dobranych i latwo dostep¬ nych- podlozach^ a takze odpornoscia na zakazenia.Drobnoustroje Cylindrocladiuim simpex-Meyer pro¬ wadza do pozadanej przemiany przy stezeniach umozliwiajacych ekonomicznie uzasadnione prowa¬ dzenie procesów w skali przemyslowej. Uzyski¬ wane produkty sa jednorodne i wystarcza tylko standardowa krystalizacja bez klopotliwego oczysz¬ czania---ma^kolumnie chromatograficznej.Wedlug wynalazku substrat steroidowy poddaje sie dzialaniu grzyba Cylindrocladium simplex w hodowli tlenowej na pozywkach zawierajacych przyswajalne zródla azotu i wegla. Substrat mozna dodawac do odpowiednio namnozonej kultury w brzeczce fermentacyjnej, mozna równiez dodawac do zawieszonej *w wodzie lub roztworze buforowym grzybni uprzednio odsaczonej lub odwirowanej.Substrat dodaje sie w postaci zawiesiny w wodzie, lub roztworu w rozpuszczalnikach organicznych mieszajacych sie z woda, takich jak: metanol, etanol, aceton, dwumetyloformamid lub diwume- tylosulfotlenek lub tez w postaci suchej, dokladnie rozdrobnionej substancji. W tym ostatnim przypad¬ ku korzystne jest dodawanie do roztworu srodków powierzchniowoczynnych. Steroid dodaje sie jed¬ norazowo lub w kilku porcjach.Hydroksylujaca aktywnosc szczepu i otrzymywa¬ nie wysokich wydajnosci procesoi transfocrmacji zaleza równiez od doboru i proporcji1 skladników pozywki zapewniajacych wlasciwy wzrost drobno¬ ustroju i równoczesnie zdolnosci stymulowania jed¬ nokierunkowej biotransformacji. Jako zródlo wegla stosuje sie weglowodany, takie jak skrobia, glu¬ koza lub sacharoza; jako zródlo organicznego azotu stosuje sie make kukurydziana, sojowa, pepton, ekstrakt drozdzowy oraiz aminokwasy. Poza tym w celu uzyskania wlasciwego wzrostu hodowli i prawidlowej przemiany dodaje sie nieograniczone zwiazki azotu i fosforu, a takze witaminy i jony metali w postaci rozpuszczalnych w wodzie soli.Proces 11 a-hydroksylacji przebiega w warunkach odpowiedniego mieszania i napowietrzania. W wa¬ runkach laboratoryjnych wlasciwe parametry uzys¬ kuje sie stosujac trzesawke obrotowa od 220 do 350 obr./minute, korzystnie stosuje sie 300 obr./mi¬ nute. Reakcja przebiega w temperaturze 28—30°C i przy wartosci pH 6,0 do 6,5. 10 15 20 25 30 40 45 50 Ten sam efekt transformacji uzyskuje sie pod¬ dajac substrat dzialaniu samych zarodników za¬ wieszonych w wodzie lub roztworze buforowym.Po zakonczonej reakcji 11 a-hydroksylacji pro¬ dukt wyodrebnia sie przez ekstrakcje rozpuszczal¬ nikami nie mieszajacymi sie z woda, takimi jaK chloroform, chlorek metylenu, metyloizobutylo- keton, n-butainol lub ich mieszaninami o odpo¬ wiednim skladzie. Ekstrakt zawierajacy steroid odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a otrzymany surowy produkt oczyszcza sie przez prosta krystalizacje.Przyklad I. Szczep Cylindrocladium simplex hodowano w ciagu 7 dni w temperaturze 28°C na podlozu stalym o skladzie: ekstrakt drozdzowy 4 g brzeczka browarnicza 8°Blg 750 ml glukoza 4 g agar 20 g woda destylowana do 1 litra Po uzyskaniu dobrze zarodnikujacej kultury skos zmywano 3 ml wody destylowanej. Uzyskana za¬ wiesine szczepiono 50 ml pozywki w kolbie po¬ jemnosci 500 mi zawierajacej make sojowa 30 g sacharoze 10 g KH2P04 5 g wode destylowana do 1 litra Pozywke uprzednio wysterylizowano w ciagu 40 minut w temperaturze 120°C. Wartosc pH po sterylizacji wynosila 6,8. Pozywke w kolbie imku- bowano w ciagu 24 godzin w warunkach tlenowych na trzesawce obrotowej o 300 obr./minute, w tem¬ peraturze 28°C. Biorac po 10 ml dobrze wyrosnie¬ tej kultury szczepiono pozywke w 5 kolbach za¬ wierajacych po 100 ml wysterylizowanej pozywki o nastepujacym skladzie: pepton 10 g ekstrakt drozdzowy 6 9 KH2PO4 5 g glukoza 40 g woda destylowana do 1 litra Pozywka zostala uprzednio wysterylizowarna w ciagu 30 minut w temperaturze 120°C. Wartosc pH po sterylizacji wynosila 6,5. Po 38 godzinach ho¬ dowli w warunkach napowietrzania i mieszania na trzesawce obrotowej o 300 obr./minute do ros¬ nacej kultury w kolbach dodano po 50 mg 17 a- -21-dihydroksy-4-pregnen-3,20-dionu rozpuszczone¬ go w acetonie. Biokonwersje prowadzono w takich samych warunkach jak wzrost kultury. Przebieg biokonwersji kontrolowano metoda chromatografii cienkowarstwowej. Po okolo 48 godzinach proces byl zakonczony. Produkt reakcji wydzielano na drodze ekstrakcji chloroformem. Ekstrakt przemy¬ wano, zatezano pod zmniejszonym cisnieniem a po¬ zostalosc oczyszczono przez krystalizacje z acetonu Otrzymano 155 mg 11 a 17 a, 21-trihydroksy-4-preg- nen-3,20-dionu o temperaturze topnienia 215—217°Cf [a] D + 113° (1%, metanol), ^max 242 nm, E^m 400.Przyklad II. Proces prowadzono analogicznie jak w przykladzie I przy uzyciu szczepu Cylin¬ drocladium simplex z tym, ze do inkubacji stoso¬ wano pozywke plynna o nastepujacym skladzie;123 535 ekstrakt drozdzowy 2.5 g aminokwasy 4,0 g KH2P04 4,0 g brzeczka browarnicza 8° Big 100 ml woda destylowana do 1 litra Pozywke sterylizowano w ciagu 30 minut w tem¬ peraturze 108°C. Wartosc pH po sterylizacji wyno¬ sila 6,5. Kolbe inkufoowano 24 godziny na trzesawce obrotowej przy 300 oibr./miioute w temperaturze 28°C. Biorac po 10 ml inokulum wyrosnietej kul¬ tury zaszczepiono 5 kolb zawierajacych po 100 ml pozywki sterylizowanej w temperaturze 120°C w ciagu 40 minut o nastepujacym skladzie: maka sojowa ' 30 g sacharoza 10 g KH2P04 5 g NaNOs 2 g MgS04 0,5 g FeS04 0,01 g CaCl2 0,5 g woda destylowana do 1 litra Po 42 godzinach inkubacji do 5 kolb dodano po 200 mg 21-hemiibursztynianu 16 /?-metylo-17 a, 21- -dihydroksy-4-preignen-3,2Q-dionu. Zakonczenie pro¬ cesu nastepowalo po 40 godzinach. Izolacje i oczysz¬ czania produktu prowadzono jak w przykladzie I.Otrzymano 500 mg 16 /?-metylo-ll a, 17 a, 21-tri- hydroiksy-4-pregnen-3,20-diodlu o temperaturze top¬ nienia 204—206°C: X max 242 nm, E }^m 400; [a] £+ + 103° (1% aceton).Przyklad IIJ. Proces natmnazania prowadzono analogicznie jak w przykladzie I z tym, ze po 48 godzinach inkubacji hodowle filtrowano przez wate szklana. W czasie saczenia grzybnia zatrzy¬ muje sie na wacie a do przesaczu przechodza za¬ rodniki. Zarodniki odwirowano, przemyto woda w celu eliminacji skladników pozywki i zawieszono w buforze fosforanowym o wartosci pH 7,0 Nas¬ tepnie dodano 6 a-fluoro-16 a-metylo-17 a,21-dihyd- roksy-4-pregnen-3,20-dion w ilosci po 40 mg na kolbe. Biokonwersja trwa okolo 60 godzin. Po izo¬ lacji jak w przykladach I i II otrzymano 6 a-fluoro- -16 a-metylo-11 a, 17 a,21-trihydroksy-4 - pregnen- 3,20-dion z wydajnoscia 70% teoretycznej. Produkt ma temperature topnienia 217—220°C; ^max238 nm, Ei?m 3go» Md 80° (l0/o 96°/o metanol).Przyklad IV. Proces prowadzono jak w przy¬ kladzie I z tym, ze namnozona grzybnie saczono na lejku Buchnera, grzybnie przemyto woda i za¬ wieszono w wodzie. Do zawiesiny dodano roztwór steroidu i po 45 godzinach proces zakonczono.Sposób izolacji oiraz wydajnosc i jakosc produktu jak w przykladzie I.Przyklad V. Sposobami podanymi w przy¬ kladach I, II, III i IV otrzymano takze nastepujace zwiazki: 6a-fluoro-ll a, 17a, 21-trihydroksy-4^preg- nen-3,20-dion o temperaturze topnienia 194^8°C, 5 [a] l2 +103° (1%, 96% metanol) 4max 238 nm, E }Jm 380, z 6 a-iluoro-lla, 21-dihyd:roksy-4-preg- nen-3,20-dionu; 16 a-metylo-11 a, 17a,21-trihydroksy- -4-pregnen-3,20-dioin o temperaturze topnienia 1Q 226—8°C, ^max242 nm, e 16100, [a] 2D5 +59° (1% metanol) z 16 a-metylo-17 a,21-dihydroksy-4-preg- men-3,20-dionu; 6 a-metylo-11 a,17 a,21-trihydroksy- -4-pregnen-3,20-dioro 0 temperaturze topnienia 196—8°C, [a] g + 68° (1%, dioksan), X max 242 nm, 15 s 14500, z 6 a-metylo-21-acetok:sy-17 a-hydroksy-4- -pregnen-3,20-dionu; 6 a-fluoro-16a,17 a-izopropyli- denodwuoksy-11 a,21- dihydrokisy - 4 - pregnem - 3,20- -dion o temperaturze topnienia 262—4°C, lmax 236 nm, E }Jm 347, KBrmax980, 1010, 1060, 1655, 1680, 20 3400 cm-1, z 6 a-fluoro-16 a, 17 a-izopropylidenodwu- oksy-21-hydraksy-4-pregnen-3,20-dionu; 16 ^me- tylo-11 a,17 a,21-trihydG:oiksy-4-preg,nen-3,20-dion o temperaturze topnienia 204—206°C, Xmax 242 nm, E JJm 400, [a]£3 + 103° (12%, aceton), z 16 fme- 25 tylo-17 a,21-dihydroksy-4-preginen-3,20-dionu; 6 a- -fluoro-16 a,17 a - izopropylidenodwuoksy-11 a, 21-di- hydroksy-l,4-pregnadien-20-diion o temperaturze topnienia 227—9°C, EJjm 415, ^max 244 nm, [a]g + + 65° (1%, chloroform), z 6 a-fluoro-16 a,17 a-izo- propylidenodwuoksy-21- hydroksy - 1,4 - pregnadien- -3,20-diomu. 30 36 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania 11 a-hydroksysteroidów serii pregnainu o wzorze ogólnym 1, w którym Ri ozna¬ cza atom wodoru, grupe hydroksylowa, ewentual¬ nie zestryfikowana reszte kwasu organicznego o 2—5 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru, grupe hydroksylowa albo grupe a- lub ^-metylo¬ wa lub razem z Ri — grupe izopropylidenodwu- oksylowa, X oznacza atom wodoru alfeo chlorowca lub grupe a- lub /7-metylowa, a Z jest pojedyn¬ czym lub podwójnym wiazaniem miedzy weglami li 2, na drodze mikrobiologicznej hydroksylacji, znamienny tym, ze zwiazki o wzorze ogólnym 2, w których Ri, R2, Xi Z maja wyzej podane zna¬ czenie, R3 oznacza wodór lub reszte kwasu, orga¬ nicznego jedno- lufo dwiuikarboksylowego, poddaje sie 11 a-hydroksylacji przy uzyciu drobnoustroju *° Cylindrocladium simplex-Meyer nr 2358 w postaci jego grzybni- wegetatywnej, lub zarodników w ho¬ dowli tlenowej na pozywkach zawierajacych przys¬ wajalne zródla wegla, azotu, fosforu, a takze czyn¬ niki wzrostowe, takie jak witaminy i jony metali 53 w postaci odpowiednich soli. 45123 535 CHoOH IU,0J?3 OZGraf. Z.P. Dz-wo, z. 409 (90+15) 11.84 Cena 100 zl PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania 11 a-hydroksysteroidów serii pregnainu o wzorze ogólnym 1, w którym Ri ozna¬ cza atom wodoru, grupe hydroksylowa, ewentual¬ nie zestryfikowana reszte kwasu organicznego o 2—5 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru, grupe hydroksylowa albo grupe a- lub ^-metylo¬ wa lub razem z Ri — grupe izopropylidenodwu- oksylowa, X oznacza atom wodoru alfeo chlorowca lub grupe a- lub /7-metylowa, a Z jest pojedyn¬ czym lub podwójnym wiazaniem miedzy weglami li 2, na drodze mikrobiologicznej hydroksylacji, znamienny tym, ze zwiazki o wzorze ogólnym 2, w których Ri, R2, Xi Z maja wyzej podane zna¬ czenie, R3 oznacza wodór lub reszte kwasu, orga¬ nicznego jedno- lufo dwiuikarboksylowego, poddaje sie 11 a-hydroksylacji przy uzyciu drobnoustroju *° Cylindrocladium simplex-Meyer nr 2358 w postaci jego grzybni- wegetatywnej, lub zarodników w ho¬ dowli tlenowej na pozywkach zawierajacych przys¬ wajalne zródla wegla, azotu, fosforu, a takze czyn¬ niki wzrostowe, takie jak witaminy i jony metali 53 w postaci odpowiednich soli. 45123 535 CHoOH IU,0J?3 OZGraf. Z.P. Dz-wo, z. 409 (90+15) 11.84 Cena 100 zl PL