PL114694B1 - Method for detection of enzyme inhibitors from cholinesterase group on abosrbing bases - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywa¬ nia inhibitorów enzymów z grupy cholinoesteraz na podlozach chlonnych za pomoca reakcji enzy¬ matycznej.Inhibitory enzymów z grupy cholinoesteraz sta¬ nowia glówny skladnik czynny na przyklad wielu srodków ochrony roslin zwlaszcza fosforoorganicz¬ nych i takze innych jak chloroorganicznych, kar- baminowych. Zwiazki te charakteryzuja sie wyso¬ ka toksycznoscia spowodowana inhibicyjnym w stosunku do cholinoesteraz dzialaniem skladnika czynnego. W zwiazku z powszechnym i masowym stosowaniem pestycydów wynika koniecznosc szy¬ bkiej detekcji inhibitorów enzymów z grupy cho¬ linoesteraz zarówno w miejscu ich stosowania jak i w wodach, sciekach oraz na stanowiskach prar cy w zakladach produkujacych te srodki.W dotychczas znanych sposobach wykrywania inhibitorów enzymów z grupy cholinoesteraz z wykorzystaniem reakcji enzymatycznej stosuje sie preparaty enzymatyczne w postaci homogeniza- tów z tkanek zwierzecych bogatych w cholino- esterazy np. mózg, watroba, krew i jej skladniki.Preparaty takie jako nietrwale, niepowtarzalne pod wzgledem skladu, klopotliwe w otrzymywa¬ niu stanowia powazne ograniczenie zastosowania ich w metodach enzymatycznych, a staja sie bar¬ dzo klopotliwe w przypadku koniecznosci natych¬ miastowego przeprowadzenia analizy. Jako drugi odczynnik w reakcji enzymatycznej stosuje sie 15 20 25 30 ester ulegajacy hydrolizie pod wplywem enzymu.Poniewaz podstawa wizualizacji substancji na podlozu chlonnym jest wystepowanie barwy lub fluorescencji wiec w enzymatycznej metodzie de¬ tekcji substancja chromto- lub luiminogenna musi byc ester badz jeden z produktów jego hydrolizy.Warunek ten ograniczal dotychczas stosowanie estrów specyficznych dla cholinoesteraz i jej po¬ chodnych — estrów choliny. W znanej metodzie z uzyciem substratów cholinowych otrzymuje sie badz detekcje „negatywowa" badz spozytywowa", ale w celu uzyskania „pozytywowej" uzywa sie wskazniki acydymetryczne, wykrywa wydzielony w reakcji kwas, co z powodu mozliwosci przy¬ padkowego wystepowania zwiazków o charakte¬ rze kwasnym lub zasadowym moze powodowac bledy w oznaczeniu.Powszechnie stosowanymi substratami niecho- linowymi sa estry naftoli, azonaftoli i pochod¬ nych indolu. Stosowanie substratów niespecyficz¬ nych powoduje nie tylko obnizenie czulosci i wy¬ dluzenie czasu reakcji, ale takze powstawanie nieczytelnych „negatywowych" obrazów.Celem rozwiazania wedlug wynalazku jest zna¬ lezienie sposobu, który by zapewnil przeprowadze¬ nie analizy szybko z uzyskaniem jednoznacznego wyniku badania z kontrastowym ^pozytywowym" obrazem takze w prymitywnych warunkach polo¬ wych. Wedlug wynalazku sposób polega na tym. ze1 stosuje sie preparaty enzymatyczne zawierajace 114 694114 694 3 cholinoesterazy szczególnie preparaty fabryczne, tioestry a zwlaszcza estry tiocholiny i substancje barwne dajace w reakcji z tiolem bezbarwne produkty.Wskutek hydrolizy tioestru powstaje tioalkohol.Grupy — SH tioalkoholu reaguja z substancja barwna w wyniku czego substancja barwna prze¬ ksztalca sie w produkt bezbarwny. Sposób detek¬ cji jest czuly, szybki i* uzyskuje sie „pozytywo¬ wy" obraz z wyrazna kontrastowa zmiana barwy; na bialym tle powierzchni podloza wytworzonym wskutek przereagowania substancji barwnej z tio- alkoholem pozostaja barwne plamy stanowiace miejsca inhibitorów cholinoesteraz.Jako zródlo cholinoesteraz stosuje sie szczegól¬ nie preparaty fabryczne produkowane wedlug us¬ talonych przepisów otrzymywania i testowania trwale w czasie o znanej aktywnosci i pozbawio¬ ne balastu bialkowego.Jako podloze chlonne mozna stosowac rózne materialy na przyklad plytki do chromatografii cienkowarstwowej, bibule, wlóknine, tasmy tek¬ stylne.Jednym z warunków prawidlowego przebiegu reakcji enzymatycznej jest okreslone pH srodo¬ wiska. Poniewaz stosowane w sposobie wedlug wynalazku podloza maja bardzo zróznicowany odczyn, w zwiazku z tym do przeprowadzenia re¬ akcji uzywa sie odczynniki w postaci odpowied¬ nich roztworów na przyklad wodnych lub bufo¬ rowych. N Sposób wedlug wynalazku mozna stosowac do kolorymetrycznych oznaczen inhibitorów w roz¬ tworach, z tym, ze pomiar jest klopotliwy, ponie¬ waz kolorymetrowanie przebiega nie wprost.Jako tioestry stosuje sie na przyklad chlorki, bromki i jodki acetylo-propionylo-, butyrylo-, benzoilo-, tiocholiny i jej alkilo pochodnych.Jako substancje barwne stosuje sie na przyklad zwiazki o wzorze: (R), N-CH^CCRi) (OHJ-CelL-NfRa), w którym R oznacza alkil, a Rt oznacza wodór lub aKkil.Sposób detekcji wedlug wynalazku wykonuje sie w ten sposób, ze podloze spryskuje sie wod¬ nym lub buforowym roztworem preparatu choli¬ noesterazy o okreslonej aktywnosci. Nastepnie spryskuje sie roztworem wodnym lub buforowym estru tiocholiny i substancji barwnej. Wkrótce ukazuja sie na bialym tle powierzchni podloza barwne plamy inhibitorów cholinoesteraz.Sposób wedlug wynalazku ilustruja przyklady wykonania.Przyklad' I. Rozwiniety i wysuszony chro- matogram na plytce gotowej (Art. 5553 f-my 10 Merck) spryskuje sie roztworem cholinoesterazy z surowicy krwi konskiej (prod. Biowet' Pulawy) w buforze boranowym o pH 8,5 którego aktyw¬ nosc wynosi 2Q j, a/cm*. Nastepnie chromatografii spryskuje sie roztworem wodnym zawierajacym 0,5 g jodku butyrylotiocholiny i 0,012 g 4,4' dwu- metyloaminodwufenylokarbinolu w 100 ml roz¬ tworu. Po niedlugim czasie ukazuja sie na bialym tle niebieskie plamy inhilbitorów cholinoesteraz.Przyklad II. Plytka chromatograficzna f-my Merck (Art. 5737); preparat fabryczny cholinoes¬ terazy 10 j. a/cm* w buforze boranowym pH 9; substrat — 50 mg chlorku acetylotiocholiny i 2 mg 4,4'-bis-dwuetyloaminodwufenylokartoinolu w 25 cm-1 Hfi. Wystepuja kontrastowe barwne 15 plamy inhibitorów cholinoesteraz.Przyklad III. Plytka chromatograficzna f-my Merck (Art. 5551); enzym — 15 j. a/cm* w bufo¬ rze octanowym pH 4,2; substrat — 150 mg jodku butyrylotiocholiny i 40 mg 4,4'-tois-dwumetyloami- nodwufenylokarbinolu w 25 cm* buforu octanowe¬ go o pH 4,2 wystepuja kontrastowe plamy.Przyklad IV. Podloze — celuloza mikro¬ krystaliczna; enzym —- 10 j. a/cm* w H^O; sub¬ strat -^ 70 mg jodku butyrylotiocholiny i 3 mg 4,4'-bis-dwumetyloaminodwiufenylokarbinolu w 25 cm* H^O. Wystepuja barwne plamy.Przyklad V. Podloze — bibula zawierajaca 30% silikazelu; enzym 5 j. a/cm* w H/D; sufostrat — 50 mg jodku acetylotiocholiny i 2 mg 4,4'-bis- -dwuetyloaiminodwufenylokarbinolu w 25 cm? H2(X Wystepuja barwne plamy.Przyklad VI. Podloze — tlenek glinu; en¬ zym — 20 j. a/cm* w H^O; substrat — 100 mg jodku butyrylotiocholiny i 4 mg 4,4'-bis-dwumety- loarninodwufenylokarbinolu w 25 cm* HjO. 5 mi¬ nut po spryskaniu roztworem substratu wklada sie plytke na pare minut w pary kwasu octo¬ wego. Wystepuja barwne plamy.Za strzezenie patentowe Sposób wykrywania inhibitorów enzymów z grupy cholinoesteraz na podlozach chlonnych za pomoca reakcji enzymatycznej polegajacej na traktowaniu podloza chlonnego preparatem enzy¬ matycznym powodujacym hydrolize estrów* sub- stratem bedacym estrem i wskaznikiem stopnia hy¬ drolizy substratu, znamienny tym, ze stosuje sie preparaty enzymatyczne zawierajace cholinoeste¬ razy tioestry, zwlaszcza estry tiocholiny i substan¬ cje barwne dajace w reakcji z powstajacym tio- lemt bezbarwne produkty. 20 25 30 PZGraf. Koszalin D-453 105 A-4 Cena 100 xl PL

Claims (1)

1. Za strzezenie patentowe Sposób wykrywania inhibitorów enzymów z grupy cholinoesteraz na podlozach chlonnych za pomoca reakcji enzymatycznej polegajacej na traktowaniu podloza chlonnego preparatem enzy¬ matycznym powodujacym hydrolize estrów* sub- stratem bedacym estrem i wskaznikiem stopnia hy¬ drolizy substratu, znamienny tym, ze stosuje sie preparaty enzymatyczne zawierajace cholinoeste¬ razy tioestry, zwlaszcza estry tiocholiny i substan¬ cje barwne dajace w reakcji z powstajacym tio- lemt bezbarwne produkty. 20 25 30 PZGraf. Koszalin D-453 105 A-4 Cena 100 xl PL