PL114282B1 - Process for preparing novel derivative of leucino-enkephaline - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 30.09.1983 114282 Int. Cl.* C07C 103/52 CZYTELNIA Urzedu Patentowego Pilniej Izeczypg ^;e) iU!iB„j Twórcy wynalazku: Wieslaw Adam Klis, Eleonora Nawrocka, Ignacy Zenon Siemion Uprawniony z patentu: Uniwersytet Wroclawski im. Boleslawa Bieruta, Wroclaw (Polska) Sposób otrzymywania nowej pochodnej leucyno-enkefaliny Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania nowej pochodmiej leucyno-enkefaliny takiej' jak [L-3-arni- no-ityrozyino^Titleiuicyno^-enkefaliina, analogu leucy- no-enkefalino oi wzorze Tyr-Gly-Gly-Phe-Lreu mo¬ dyfikowanego w pierscieniu aromatycznym tyrozy¬ ny. Zastosowanie takiej imodyfdlkacji powoduije dwu¬ krotne przedluzenie czasu dzialania peptynu w po¬ równaniu -z leucyno-enkefalina, przy tej samej dawce na 1 kg ciezaru ciala.Dotychczasowe poszukiwania nowych analogów enkefalin, biegly w kierunku zamian poszczególnych aminokwasów na inne, wydluzenia lub skrócenia, lancucha i badania podobnych sekwencji z innych naturalnych peptydów. W badaniach tych stwier¬ dzono, ze zamiana glicyny w pozycji 2 na amino¬ kwas L-prowadzii do znacznego obnizenia aktyw¬ nosci oraz ze wprowadzenie na C-koniec, grupy amidowej nie zmienia aktywnosci. Kolejno stwier¬ dzono, ze wstawianie w pozycje 2 aminokwasu D^podnosi aktywnosc biologiczna. Dalsze badania doprowadzily do odkrycia analogów z D-amtino- kwasaimi w pozycji 2, oraz z amidem proMmy badz tiazolidyno-4-kariboiksylowego kwasu w pozycji 5, które byly bardziej a'ktywne niz beta-endorfina, a nadto byly aktywne przy podawaniu dozylnym.Istota wynalazku polega na powiazaniu struktu¬ ry enlkefaliny z morfina i jej pochodna — amino- -morfina. Na podstawie porównania struktur do¬ chodzi sie do wniosku, ze wstawienie do pierscie¬ nia aromatycznego tyrozyny w pozycji 3 grupy aminowej upodobni N-koncowy fragment leucyno- -enkefaliny do struktury amino-morfiny.Zgodnie zatem z wynalazkiem sposób otrzymy¬ wania i[L-3-amino-tyrozyno*]i[leucyno5]-enkefaliny 5 w roztworze polega na tym, ze modyfikuje sie pierscien aromatyczny tyrozyny w pozycji 3 grupa nitrowa za pomoca kwasu azotowego i otrzymana L-3-niiitro-tyrozyne sprzega sie kolejno z odpo¬ wiednimi aminokwasami w -znany sposób metoda io azydowa, przy czym do zablokowania N-koncowej grupy aminowej tyrozyny stosuje sie jako oslone grupa benzyloksykiaribonylowa a do zablokowania C-lkoncowej grupy karlbdksylowej leucyny stosuje sie ester benzylowy, redukuje sie grupe nitrowa 15 w pierscieniu tyrozyny do grupy aminowej oraz usuwa sie obie grupy zabezpieczajace za pomoca katalitycznego uwodornienia a oczyszczenie otrzy¬ manej [L-3-aimino-tyrozynoliOleucyno*]-enkefaliny prowadzi sie przez krystalizacje z alkoholu etylo- ao wego.Schemat syntezy sposobem wedlug wynalazku jest przedstawiony na zalaczonym rysunku, na którym zastosowane symbole odpowiednio ozna¬ czaja: 25 Z ~- C6H*CH2-hO^CO— BOC — /OHa/aC^-O^CO— Bzl — CjjHs-^CH^ Et — QHg— M Me — CHa 114 282114 282 3 Synteze prowadzi sie tradycyjnymi metodami w roztworze.N-koncowy trójipeptyd, uzyslkano przez polacze¬ nie hydrazydu NHbenzyloksykarbonylo-L-3-nitro- -tyrozyny z chlorowodorkiem estnu etylowego glicylo-glicyny metoda azydowa w modyfikacji Rudiingera. Nastepnie 'przeprowadzono ten produkt w hydrazyt i polaczono z uprzednio uzyskanym trójfluorccctaneim estru bemzylowego-LL-fenyloana- lyno-L-leucyny. Otrzymany chroniony pieciioipep- tyd odblokowano przez katalityczne uwodornienie, w trakcie którego grupa, nitrowa ulega równoczes¬ nej redukcji, do gnupy aminowej. Produkt oczy¬ szczano przez krystalizacje.Przyklad. Etap pierwszy: otrzymywanie 3- -nitro-L-tyrozyiny (I) 10 g L-tyrozyny zawieszono w 37 ml wody i przy chlodzeniu oraz mieszaniu dodano poregami 26,5 g stezonego kwasu azotowe¬ go. . Mieszanie prowadzono do calkowitego rozpu¬ szczenia sie tyrozyny. Mieszanine pozostawiono na 4 godziny w temperaturze pokojowej. Zólty kry¬ staliczny material odsaczono, rozpuszczono w ma¬ lej ilosci goracej wody i zadano stezonym roz¬ tworem amoniaku w wodzie do pH 5—6, przy czym zaczyna: wypadac osad wolnej 3-nitro-L- -tyrozyny. Osad odsaczono i rekrystalizowano z wody, a do odbarwienia uzyto wegla aktywnego.Otrzymano 9,^8 g produktu; wydajnosc 78%.Etap drugi: otrzymanie chlorowodorku estru metylowego L-3-miitro-tyrozyny (II). t 28 g (I) zawieszono w alkoholu metylowym, oziebiono do temperatury —5°C i przy silnym mieszaniu wkroplono 14 ml chlorku tionylu. Na¬ stepnie calosc ogrzano pod chlodnica zwrotna do wrzenia i pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej. Czesc rozpulszczalniików odparowano pod próznia. Uzyskany krystaliczny osad odsaczono i rekrystalizowano z ukladu matanol-eter etylowy.Otrzymano 27,7 g produktu; wydajnosc 50%; tem¬ peratura topnienia 1i87^190°C; [ta]546 = +1,12 (c = 3, metanol).Dla wzoru: C^H^N^ObOI olbliczono 4^,41 i% C; 4,73% H; 10,12% N; znaleziono 43y39% C; 4^15% H; 10,51% N; Etap trzeci: otrzymanie estru metylowego^ N- -oenzylóksyikarbonylo-L-3-nitro-tyrozyny (III). 27 g (II), 50 g weglanu sodu, 100 ml wody i 150 ml chloroformu zmieszano i wkroplono 17,6 g chloromrówczanu benzylu przy mieszaniu i chlo¬ dzeniu woda z lodem. Mieszanie kontynuowano przez 1,5 godziny. Substancje stale odsaczono, prze¬ myto woda i chloroformem. Warstwe chloroformo¬ wa oddzielono i suszono chlorkiem wapnia. Na¬ stepnie po odsaczeniu srodka suszacego chloroform odparowano w prózni, a pozostalosc rozpuszczono w octanie etylu. Warstwe octanowa 2 M kwasem solnym, woda i suszono bezwodnym siarczanem magnezu. Nastepnie octan etylu odparowano pod próznia, a pozostalosc rekrystalizowano z ukladu octan etylu — benzyna. Otrzymano 22 g "zwiazku wydajnosc okolo 60%; temperatura: topnienia 100—ll01°C; [a]546 ——1,05 (c = 2^netanol).Dla wzoru: C^H^N^Cy obliczono 57,75% C; 4,85% H; 7,48% N; znaleziono 57,90% C; 4,87% H; 7,36% N; "4 Etap czwarty: otrzymanie hydrazytu N-toenzylo- ksykarbonylo-L-3-nitro-tyarozyny (IV). 20 g (III) rozpuszczono na goraco w 40 ml me¬ tanolu i dodano 8 ml wodzianu hydrazyny. Po- 5 zostawiono na 48 godzin. Wydzielony osad odsa¬ czono i oczyszczono przez dwukrotne odgotowanie z alkoholem metylowym i odsaczanie na goraco.Uzyskano 15,2 g osadu; wydajnosc 76% temperatu¬ ra topnienia 188—il9il°C. 10 Dla wzoru: C17HieN406 obliczono 54,54% C; 4,8i5% H; 14,97% N; znaleziono 54,79% C; 4,68% H; 14,87% N; Etap piaty: otrzymanie chlorowodorku estru etylowego glicylo-glicyny (V). 15 20 g glicylo-glicyny zawieszono w 100 ml eta¬ nolu i wkroplono 12 ml chlorku tionylu przy mie¬ szaniu i chlodzeniu do temperatury 0°C przez 1 godzine. Naistejpnie mieszanine ogrzano pod chlod- .nica zwrotna i pozostawiono na noc w temperatu- 20 rze pokojowej. Wytracony osad odsaczono i kry¬ stalizowano z etanolu. Otrzymano 15,8 g produktu, wydajnosc 53%; temperatura topnienia 182—183°C.Etap szósty: otrzymanie estru etylowego N-ben- zyloksykanbonylo-L-2-nitro-tyrozolo-glicylo- 25 -glicyny (VI). 10 g mamidzie (DMF) z dodatkiem 1,95 g chlorowodoru rozpuszczonego w dioksanie. Oziebiono do tempe¬ ratury —20°C i wkroplono 3,127 g azotynu azylu. 30 Pozostawiono 20 minut, temperatura wzrosla do —5°C. Ponownie oziejbiono do temperatury —30°C i dodano 6,74 ml N-etylo-morfoliny i roztwór (V) w DMF z dodatkiem 3,37 ml N-etylo-morfoliny, pH roztworu wynioslo 7,5. Pozostawiono w tempe- 35 raturze 0°C na 20 godzin i jeszcze na 5 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalniki, odpa¬ rowano w prózni, a pozostalosc przemyto przez roztarcie w mozdzierzu 2M kwasem solnym * woda, nasyconym roztworem kwasnego weglanu 40 sodu, woda i po wysuszeniu rekrystalizowano •z ukladu metanol — woda.Otrzymano 10,4 g produktu; wydajnosc 77%; tem¬ peratura topnienia 116—119°C; [a]546 = ^0,40 (c = 2, metanol) 45 Dla wzonu: C25H2dNiOg obliczono 54,98% C; 5,22 H; 1145% N; znaleziono 55,110% C; 5,35 H; 11,34% N; Etap siódmy: otrzymanie hydrazytu N-benzylo- k!sy!kaxibonylo-Ij-3-nitro-ty[rozylo-gIicylo-glicyny 50 (VII), przez reakcje 9 g (VI) z 2,7 ml wodzianu hydrazyny w 70 ml etanolu zgodnie z etapem (IV).Otrzymano 5,5 g proditiktu; wydajnosc 6,1%; tempe¬ ratura topnienia 189—194°C.Dla wzoru: C2iH24N^08 55 obliczono 17,21% N; znaleziono 17,32% N; Etap ósmy: otrzymanie estru benzylowego N-t- butyloksykaitoonylo-iL-fenyloalanylo L-leucyny (VIII). 60 5,3 g N^t-ibutyloklsykanbonylo-L-fenyloalaniny, 7,9 g paratolaunosiulfonianiu estru benzylowego L- -leucyny rozpuszczono w chloroformie z dodatkiem 3,1 ml trójetyloaminy (TEA) i dodano 4 g dwucy- klo heksylokarbodwiuamidu. Mieszanine pozostawio- 65 no w temperaturze pokojowej na 20 godzin. Po114 282 odsaczeniu osadu dwucykloheksylomocznika, chlo¬ roform odparowano pod próznia, a pozostalosc za¬ lano octanem etylu. Wytracony osad chlorowodorku TEA odsaczono, a warstwe octanowa przemyto 1 M roztworem kwasu solnego-, woda, nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodu i woda i wy¬ suszono bezwodnym siarczanem magnezu. Octan etylu odparowano w prózni, a pozostalosc krysta¬ lizowano z ukladu eter etylowy — eter naftowy.Otrzymano 5,3 g produktu; wydajnosc okolo 57%; temperatura topnienia 82—84°C {a] 546 = —25,0 (c = 2, metanol).Dla wzoru: C2|H3ffN205 doliczono 69,19% C; 7,69% H; 5,95% N; znaleziono 69,11% C; 7,73% H; 6^0% N; Etap dziewiaty: otrzymanie trójfiluorooctanu estru benizylowego-L-fenyloalanylo-L-leuicyny (IX).Na 4,6 g (VIII) dzialano 18 ml kwasu trójfluoro- ootowego w 20 ml chloriktu metylu. Reakcje pro¬ wadzono przez 30 minut w temperalturze pokojowej.Rozpuszczalniki odparowano w prózni, a pozosta¬ losc krystalizowano przez zadanie eterem nafto¬ wym. Uzyskany osad odsaczono i suszono nad wo¬ dorotlenkiem potasowym. Otrzymano 4,1 g produk¬ tu; wydajnosc 88%.Etap dziesiaty: otrzymanie estru benzylowego N- Hbenzyloksykarbonylo-L-S-niitroHtyrozylo-iglicylo- iglicylo-L-fenyloalanylo-Li-leucyny (X).Polaczono 4,9 g (VII) z 4,88 g (IX) wedlug pro¬ cedury opisanej w (V). Ilosci innych reagentów 0,72 g chlorowodoru w dioksanie 1,172 g azotynu- amylu 2,58 ml i 1,26 ml N-etylo-morfoliny. Produkt rekrystalizowano z ukladu kwas octowy — woda.Uzyskano 4 g produktu, wydajnosc 49%; tempera¬ tura topnienia 168—174°C.Dla wzoru C43H4eN^011 10 15 30 35 obliczono: 62,61% C; 5,86% N; 10,19% N; znaleziono: 6^07% C; 5,60% N; 10,41% N; Etap jedenasty: otrzymanie L-3-amino-tyrozylo- -iglicylOHglacylo-L-fenyloalanylo-L-leucyny (XI). 2 g (X) katalitycznie uwodorniono na palladzie na siarczanie banu w 5% roztworze kwasu octowe¬ go w metanolu. Po odwirowaniu katalizatora i od¬ parowaniu rozpuszczalników produkt rekrystalizo¬ wano z alkoholu etylowego.Uzyskano 1,50 g produktu; wydajnosc 90%; tem¬ peratura topnienia 162—166°C.Dla wzoru: CsoH^OgNe obliczono: 13,3%; znaleziono: 12,9% N; Analiza aminokwasowa: 3-amino-tyrozyna 0,90; glicyna 1,98; fenyloalanina 1,10; leucyna 1,01. « PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania nowej pochodnej leucyno- -enkefaliny, znamienny tym, ze modyfikuje sie pierscien aromaityczny tyrozyny w pozycji 3 grupa nitrowa za pomoca kwasu azotowego i otrzymana L-3-mitro tyrozyne sprzega sie kolejno z odpowied¬ nimi aminokwasami w znany sposób metoda azy- dowa, przy czym do zablokowania N-koncowej grupy aminowej tyrozyny stosusje sie jako oslone grupe benzyloksykairbonylotwa a do zablokowania C-koncowej grupy karboksylowej leucyny stosuje sie ester benzylowy, rediukuje sie grujpe nitrowa w pierscieniu tyrozyny do grupy aminowej oraz usuwa sie obie grupy zabezpieczajace za. pomoca katalitycznego uwodornienia a; oczyszczenie otrzy¬ manej [iL-3-amino-tyrozyno] [leucyno5] — enkefali- ny prowadzi sie przez krystalizacje z alkoholu etylowego. Tyr N02 Ni/ N02 ^ NO2 N02[ 2 Y N2H3 N02 ^V- £*L z% „^ (Gly)z •ow# Phe Leu -0£f BOC -ÓEt BOC- -N} M3 H- H- OBzi OBzl OBzl OBzl •OH PL