Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania glukagonu, bedacego cennym srodkiem biologicznie czynnym, zwlaszcza powodujacym zwiekszanie ste¬ zenia glikozy we krwi.Wkrótce po odkryciu insuliny w r. 1921 przez Bantinga i Basta, Miku badaczy [Murlim i wspól¬ pracownicy, J. Biol. Chem., 56, 252 (1923) i Kimball i Murlin, J. Biol. Chem., 58, 337 (1924)] stwierdzi¬ lo, ze niektóre trzustkowe wyciagi insuliny powo¬ duja przecukrzenie krwi. Substancje wywolujaca ten skutek nazwano glukagonem. Wynikiem dal¬ szych badan bylo oczyszczenie i krystalizacja glu¬ kagonu [patrz Staub i wspólpracownicy, Science, 117, 628 (1953) i J. Biol. Chem., 214, 619 (1955)].Strukturalnie glukagon jest pojedynczym lancu¬ chem polipeptydowym 29 aminokwasów. Kolejnosc aminokwasów w swinskim glukagonie ustalil Bro- mer z wspólpracownikami [J. Am. Chem. Soc, 79, 2807 (1957)].Glukagon jako s-uibstaincja powodujaca zwieksza¬ nie stezenia glikozy we krwi jest przeciwienstwem dynamicznym insuliny, która powoduje niedocu¬ krzenie krwi. Z tego wzgledu glukagon ma wazne znaczenie przy traktowaniu niedocukrzenia krwi spowodowanego przez insuline, jezeli nie dysponu¬ je sie hipertonicznym roztworem glikozy.Glukagon wykazuje równiez dodatnie dzialanie inotropowe [patrz Farach i Tuttle, J. Pharmacol, Exptl. Therap., 29, 49 (1960)]. Mianowicie, badania wykazaly, ze glukagon powoduje zwiekszanie sily 10 25 30 skurczania serca, to tez zaczeto szeroko stosowac ten zwiazek w stanach, w których konieczne jest zwiekszanie tej sily [Van der Ark i wspólpracow¬ nicy, Amer. Heart J., 79, 481 (1970)].Poza tym stwierdzono, ze glukagon przejawia i inne dzialania biologiczne, np. powoduje rozluz¬ nienie dwunastnicy przy jej rentgenowskim uwi¬ docznianiu hipotonicznym [Miller i wspólpracowni¬ cy, Radiology, 108, 35 (1973)]. Glukagon dziala tez moczopednie, rozszerza oskrzela, zmniejsza wy¬ dzielanie soków zoladkowych i zmniejsza stezenie lipidów i cholesteryny we krwi. Stosowano tez glukagon w leczeniu trzustki [Stremmel, Pharma- kotherapie In Kurze, 116, 69 (1974)].Do wszystkich wyzej wymienionych celów nie¬ zbedny jest glukagon dobrze oczyszczony. Wiado¬ mo, ze zarówno insulina jak i glukagon sa wytwa¬ rzane w trzustce, ale podczas gdy insuline mozna wyosobniac i oczyszczac nalezycie znanymi spo¬ sobami, to wyosobnianie glukagonu, a zwlaszcza je¬ go oczyszczanie, unikanie rozkladu i otrzymywanie produktu z dostateczna wydajnoscia, stwarza nadal powazne trudnosci. Przyczyna tego jest bliskie po¬ krewienstwo pomiedzy insulina i glukagonem acz¬ kolwiek przy wyosobnianiu insuliny trudnosci te przezwyciezono, to nie rozwiazano tego problemu w odniesieniu do glukagonu.Znane sposoby oczyszczania glukagonu polegaja na tym, ze wlókienka wytwarza sie przy malej wartosci pH, zwykle okolo 2,0, a wiec w srodowi- 114153114153 3 sku, które sprzyja hydrolizie glukagonu. Produk¬ ty hydrolizy z reguly przejawiaja zmniejszona ak¬ tywnosc i np. dezamidoglukagon ma tylko okolo 60§/t hormonalnej aktywnosci glukagonu. Poza tym, wytwarzanie wlókienek zalezy od czystosci gluka- s gonu i gdy czystosc ta maleje, wówczas tworzenie wlókienek staje sie trudniejsze, a nawet niemozli¬ we.Glukagon ma tendencje do tworzenia zelu i wy¬ twarzania wlókienek w roztworach kwasnych, to i« tez przy oczyszczaniu glukagonu metodami chro¬ matograficznymi w kwasnych roztworach nastepuja straty glukagonu na skutek jego zelowania i stra¬ cania sie w kolumnie. Poza tym, w kwasnych roz- 15 tworach glukagon latwo tworzy skupienia, co znacznie ogranicza selektywnosc i skutecznosc od¬ saczania zelu (usuwanie zelu na drodze chromato¬ graficznej) w srodowiskach kwasnych.Wynalazek umozliwia oczyszczanie glukagonu przy uniknieciu opisanych wyzej wad znanych spo- ^ sobów, w warunkach lagodniejszych i selektywniej oraz z wysoka wydajnoscia.Zgodnie z wynalazkiem glukagon oczyszcza sie w ten sposób, ze specznia sie zel, który w stanie suchym moze pobierac co najmniej okolo 4°/o wa- 2I gowych wody i którego czastki maja srednice mniejsza niz okolo 100 mikronów i specznionym zelem upakowuje sie kolumne. Do upakowanej ko¬ lumny wprowadza sie wodny roztwór glukagonu o czystosci co najmniej okolo 0,lf/#, majacy war¬ tosc pH od okolo 9 do okolo 11 i eluuje glukagon z kolumny w temperaturze okolo 4—40°C wodnym eluentem o wartosci pH tego samego rzedu co war¬ tosc pH roztworu glukagonu podawany na kolum¬ ne. Roztwór glukagonu zawiera w 1 ml co naj¬ mniej okolo 0,01 mg glukagonu i mniej niz okolo 10f/o wagowo/objetosciowych wszystkich stalych protein. Calkowita ilosc glukagonu podawanego na kolumne jest taka, aby na i litr zloza w kolumnie przypadalo okolo 0,01—5 g glukagonu.Stosowane tu okreslenie „oczyszczanie" oznacza, ze zanieczyszczony glukagon, niezaleznie od jego postaci to jest staly lub w wodnym roztworze, w wyniku oczyszczania wystepuje w stosunku do 45 calkowitej ilosci stalych protein w ilosci wiekszej niz przed oczyszczaindem. Tak wiec czystosc glu- kagomii, okreslana jako stosunek ilosci glukagonu do calkowitej ilosci stalych protein, zwykle wy¬ razana w procentach,rosnie. so Nalezy podkreslic, ze przy stosowaniu procesu wedlug wynalazku hydroliza glukagonu do mono- dezamidoglukagonu nie stanowi problemu, aczkol¬ wiek hydroliza glukagonu w srodowisku alkalicz¬ nym jest znana np. z publikacji Annable, Acta En- 55 docrinologica 77, 706 (1974).Wykres na rysunku przedstawia zaleznosc optycz¬ nej gestosci eluatu i zawartosci glukagonu od ob¬ jetosci eluatu w procesie wedlug wynalazku, przed¬ stawionym w przykladzieI. eo Filtrowanie przez zel jest zabiegiem stosowanym w chromatografii do oddzielania substancji, np. * protein, na podstawie wielkosci czasteczek. W pro¬ cesie tym substancje rozdziela sie na kolumnie za¬ wierajacej zel usieciowany w taki sposób, ze w r- 4 kazdej czastce zelu tworza sie pory. Pory te maja okreslona i dajaca sie mierzyc objetosc, która jest wprost proporcjonalna do stopnia specznienia zelu i odwrotnie proporcjonalna do stopnia usieciowa- nia. Poniewaz dostep mniejszych czasteczek do tych porów jest latwiejszy niz czasteczek wiek¬ szych, przeto przechodzenie mniejszych czasteczek przez kolumne jest szybsze niz czasteczek wiek¬ szych.Ogólnie biorac, w procesie wedlug wynalazku mozna stosowac kazdy zel peczniejacy pod wply¬ wem wody i odpowiedni przy przerobie roztwo¬ rów protein. Jednakze w stanie suchym, przed specznieniem, powinien on miec zdolnosc ponow¬ nego pobierania co najmniej okolo 4°/o wagowych wody w stosunku do wagi zelu w stanie suchym i jego czastki powinny miec srednice mniejsze niz okolo 100 mikronów. Korzystnie, zdolnosc pobiera¬ nia wody przez zel wynosi od okolo 4 do okolo 98, a zwlaszcza od okolo 5 do okolo 20§/t wagowych.Srednice czastek suchego zelu powinny byc ko¬ rzystnie mniejsze niz 80 mikronów, a zwlaszcza powinny wynosic od okolo 20 do okolo 80 mikro¬ nów.Przykladami odpowiednich zelów sa: skrobia, w tym tez skrobia kukurydziana, usieciowany galak- tomannan, usieciowany dekstran, agar, poliakryloa- midy, kopolimery amidu kwasu akrylowego z me- tyleno-bis (akryloamidem), kopolimery metyleno- -bis (akryloamidu) z eterem winylowoetylowym gli¬ kolu dwuetylenowego i z winylopirolidonem. Ko¬ rzystnie stosuje sie usieciowane dekstrany, takie jak preparaty szeregu Sephadex firmy Pharmacia Fine Chemicals, Inc. Piscataway, St. Zj. Am.Typ kolumny nie ma istotnego znaczenia w pro¬ cesie wedlug wynalazku i wysokosc, srednica i ksztalt kolumny zaleza od zadanych parametrów procesu. W miare zwiekszania wysokosci kolum¬ ny maleje oczywiscie szybkosc przeplywu, gdyz o- pór kolumny jest wprost proporcjonalny do jej wy¬ sokosci. Z tych tez wzgledów korzystnie stosuje sie upakowana kolumne taka, jak np. Pharmacia Se- ctional Column KS-370. Do normalnej produkcji odpowiednia jest kolumna o 4—6 sekcjach.Glukagon oczyszcza sie korzystnie zwlaszcza po¬ dajac na kolumne od okolo 0,08 do okolo 3,1 g glu¬ kagonu na 1 litr zloza, ale ogólnie biorac mozna stosowac okolo 0,01—5 g na 1 litr objetosci zloza.Warunki najodpowiedniejsze dla danej kolumny mozna latwo ustalic.Zel mozna speczniac i upakowywac kolumne specznionym zelem w dowolny, znany sposób, ale przewaznie specznia sie zel w eluencie. Mozna tez jednak speczniac zel w 30% roztworze wodnym eta¬ nolu, dekantowac drobne czastki i nastepnie za¬ stepowac roztwór etanolu eluentem.W zasadzie sposobem wedlug wynalazku mozna oczyszczac zanieczyszczony glukagon dowolnego po¬ chodzenia, pod warunkiem, ze zawartosc glukago¬ nu wynosi co najmniej okolo 0,l*/o, a korzystnie co najmniej okolo !•/• w stosunku wagowym. Tak np. mozna jako zródlo glukagonu stosowac nawet surowe frakcje proteinowe z trzustki, jak tez i czesciowo oczyszczony glukagon krystaliczny.114 153 6 Zanieczyszczony glukagon mozna rozpuszczac w zakwaszonej wodzie, zwykle o wartosci pH 3. War¬ tosc pH doprowadza sie nastepnie stosownie do potrzeby do 9—11 za pomoca rozcienczonego roz¬ tworu wodnego zasady lub organicznej substancji 5 buforowej. Mozna tez, co jest korzystne, rozpusz¬ czac zanieczyszczony glukagon w wodnym srodowi¬ sku alkalicznym przy wartosci. pH 9—11. Odpowied¬ nie sa np. takie zasady jak wodorotlenek sodo- • wy, potasowy ,litowy lub amonowy, a najkorzyst- io niej stosuje sie wodorotlenek sodowy. Przyklada¬ mi organicznych substancji buforowych sa: glicy¬ na z wodorotlenkiem sodowym i trój/hydroksyme- tylo/-aminometan. W razie potrzeby substancje nie¬ rozpuszczalne oddziela sie znanymi sposobami. Jak 15 wyzej wspomniano, roztwór zawierajacy glukagon wprowadza sie na kolumne przy wartosci pH od okolo 9,0 do okolo 11, a korzystnie od okolo 9,0 do okolo 10,5. Wprawdzie nie jest konieczne, aby wartosc pH roztworu glukagonu podawanego na 2P kolumne i wartosc pH eluentu byly identyczne, ale duzych róznic nalezy korzystnie unikac.Roztwór glukagonu podawany na kolumne po¬ winien zawierac co najmniej 0,01 img, korzystnie co najmniej okolo 0,05 mg, a najkorzystniej o 25 najmniej okolo 0,5 mg glukagonu w 1 ml. Powi¬ nien on tez zawierac mniej niz okolo 10°/o, ko¬ rzystnie mniej niz 8Vo, a najkorzystniej mniej niz okolo 6% wagowo/objetosciowych wszystkich pro¬ tein stalych. W razie potrzeby roztwór glukagonu 30 podawany na kolumne moze byc buforowany, ale nie jest to konieczne. Korzystnie jest równiez, je¬ zeli podawany na kolumne roztwór glukagonu za¬ wiera srodek chelatujacy jon metalu dwuwartoscio- wego i substancje stabilizujaca, jak to opisano 35 szczególowo nizej.W celu uzyskania zadowalajacych wyników, za¬ nieczyszczony glukagon powinien byc rozpuszczo¬ ny w rozpuszczalniku o objetosci mniejszej od ob¬ jetosci podczas rozdzielania, jak to wyjasniono ni- 40 zej.W chromatografii, wspólczynnik rozdzielania Kd okresla sie jako stosunek stezenia substancji roz¬ puszczonej w fazie ruchomej do stezenia substan¬ cji rozpuszczonej w fazie nieruchomej. Podczas fil- 45 trowania przez zel faza ruchoma jest rozpuszczal¬ nik przeplywajacy przez wolna przestrzen pomie¬ dzy czastkami zelu, a faza nieruchoma jest rozpusz¬ czalnik wchloniety przez czastki zelu, to jest za¬ trzymany w porach w kazdej z czastek zelu. Tak wiec Kd wyraza czesc ropuszczalnika zatrzymanego w porach, która moze byc przenikana przez sub¬ stancje rozpuszczona.Objetosc eluowania Ve substancji rozpuszczonej mozna wyrazic równaniem: Ve=V0+Kd.V1 w którym V0 oznacza objetosc wolnej przestrzeni w kolumnie, a Vi oznacza objetosc zatrzymanego rozpuszczalnika. Z powyzszego równania wspól¬ czynnik Kd wyraza sie równaniem: 50 55 wówczas Vi=aWr przy czym a oznacza ciezar su¬ chego zelu i Wr oznacza ilosc wody ponownie po¬ chlanianej przez zel. Zgodnie z tym: K.d—- Ve-V0 aWr K =-—— Jezeli ciezar wlasciwy wody przyjmie sie jako=l, 65 i wspólczynnik Kd mozna w znany sposób okre¬ slic doswiadczalnie.Zakladajac, ze roztwór zawiera 2 rozpuszczone substancje objetosc eluowania dla kazdej z tych substancji wyraza sie wzorami: V'e=V0-fK,dVi V"e=V0+K"dVi Objetosc rozdzielania Vs jest róznica: Vs=V"e-V'e czyli Vs^(K"d-K'd)Vi Z powyzszego wynika, ze stopien rozdzielania dwócjbt lub wiekszej liczby rozpuszczonych substan¬ cji, jest czesciowo zalezny od obciazenia kolumny.Gdy iloac substancji rozpuszczonej majacej mniej¬ szy ciezar.czasteczkowy zbliza sie do ilosci gra¬ nicznej, która moze byc przyjeta przez pory, roz¬ dzielanie dwóch substancji rozpuszczonych z ko¬ niecznosci maleje. W granicach- obciazenia stoso¬ wanego zgodnie z wynalazkiem stopien rozdziela¬ nia moze byc rózny i w niektórych przypadkach mozna stosowac wyzsze obciazenie kolumny, aby utrzymac w równowadze rozdzielanie w stosunku do wydajnosci.Jak wspomniano wyzej, eluent powinien miec wartosc pH okolo 9—11, korzystnie 9—10,5^ a zwla¬ szcza 9,5. Zwykle jako eluent stosuje sie wodny roztwór zasady lub organicznej substancji buforo¬ wej, jaka stosuje sie przy wytwarzaniu roztworu glukagonu podawanego na kolumne, przy czym ko¬ rzystnie jest stosowac wodny roztwór wodorotlen¬ ku amonowego. Ewentualnie, a nawet korzystnie, eluent zawiera w 1 litrze do okolo 0,01 mola srod¬ ka chelatujacego jon metalu dwuwartosciowego i/albo do okolo 0,5e/t objetosciowych butanolu jako stabilizatora. Korzystnie zawartosc butanolu wy¬ nosi 0,l#/a w stosunku objetosciowym.Jako srodek chelatujacy mozna stosowac kwas etylenodwuamino-N,N,N',N'-czterooctowy, kwas l,2-dwuaminopropylo-N,N,N',N'-czterooctowy [ED- TA].Srodek chelatujacy mozna stosowac w postaci wolnego kwasu lub jego soli z metalem alkalicznym albo soli amonowej. Korzystnie stosuje sie 0,001 m stezenie srodka chelatyzujacego.Kolumne eluuje sie w temperaturze okolo 4— 40°C, korzystnie w temperaturze pokojowej lub nizszej. Proces eluowania prowadzi sie w znany sposób, korzystnie jednak mierzac absorpcje swia¬ tla nadfioletowego o dlugosci fali 280 milimikro- nów. Frakcje zawierajace oczyszczony' glukagon la¬ czy sie i przerabia w znany sposób, otrzymujac krystaliczny glukagon o wysokim stopniu czy¬ stosci.Dalsza przeróbka zalezy od czystosci i stezenia glukagonu w eluencie •prowadzi sie ja znanymi spo-7 114153 8 sobami. Jezeli eluent zawiera wiecej niz okolo 10% wagowych glukagonu w stosunku do ^wszystkich substancji stalych zawartych w roztworze i zawar¬ tosc glukagonu w eluencie jest wieksza niz okolo 3000 |ig/ml, to zwykle krystalizuje sie glukagon bez- 5 posrednio z roztworu, przewaznie przy wartosci pH 4,8—5,2, korzystnie 5,0. Mozna tez krystalizo¬ wac glukagon w obecnosci cynku przy wartosci pH 7,5. Jezeli czystosc glukagonu w eluencie jest mniejsza niz okolo 10%, to znaczy, gdy glukagon 10 stanowi mniej niz 10% substancji stalych rozpusz¬ czonych w eluencie, wówczas wytraca sie gluka¬ gon w postaci 20% soli i przekrystalizowuje ja w kwasnym srodowisku, ewentualnie po uprzednim przefiltrowaniu przez zel. We wszystkich tych 15 przypadkach otrzymuje sie glukagon o posrednim stopniu czystosci, wymagajacy dalszego oczyszcza¬ nia. Takie dodatkowe oczyszczania prowadzi sie przez przekrystalizowywanie z slabo alkalicznego srodowiska, to jest przy wartosci pH 7—8, albo 20 chromatograficznie w obecnosci wymieniacza jonów, lub tez stosujac oba te zabiegi. Korzystnie jest zwlaszcza rozpuszczac czesciowo oczyszczony glu¬ kagon ponownie i podawac go drugiej filtracji przez zel sposobem wedlug wynalazku i nastepnie kry- 25 stalizowac z eluentu w srodowisku kwasnym lub slabo zasadowym. W ten sposób otrzymuje sie glu¬ kagon o czystosci powyzej 90%. Sposób ten jest opisany nizej szczególowo. i*rzewaznie przy oczyszczaniu glukagonu sposo- 30 bem wedlug wynalazku na skale techniczna stosuje sie glukagon o czystosci okolo 2—5% wagowych.Zwykle stanowi on frakcje proteinowe z trzustki, otrayanane przy wyosobnianiu i oczyszczaniu insu¬ liny z gruczolów trzustkowych swini. Taki zanie- 35 czysaczony glukagon rozpuszcza sie. w zakwaszonej wodzie o wartosci pH okolo 3, przy czym stosuje sie ilosc wo4y stanowiaca w przyblizeniu objetosci zloza kolumny, która ma byc stosowana.Otrzymani roztwór, przewidziany do podawania 40 na kolumne, zawiera na 1 litr objetosci zloza 3—4g stalych substancji, w tym 0,00—0,2 g glukagonu.Kolumne zrównowaza sie w temperaturze 25°C roz¬ cienczonym wodorotlenkiem amonu o wartosci pH od okolo 9,0 do okolo !ft,5 zawierajacym 0,001 m « roztworu EDTA i 0,1% objetosciowych butanolu.Najkorzystniej jako zel stosuje sie Sephadex G-50F.Wartosc pH roztworu glukagonu podawanego na kolumne doprowadza sie nastepnie do 9—11 za po¬ moca rozcienczonego roztworu wodnego zasady lub 5* organicznego roztworu buforowego i przed poda¬ niem roztworu na kolumne mozna go w razie po¬ trzeby przesaczyc w zwykly sposób, w celu usu¬ niecia stalych czesci. Nastepnie roztwór glukagonu podaje sie na kolumne i eluuje opisanym wyzej 55 roztworem wodorotlenku amonowego o wartosci pH 9,5, zawierajacym EDTA i butanol. Wartosc wspólczynnika rozdzielania Kd wynosi, 0,7&M),82 w eluencie, którego objetosc wynqsi okolo 20—25% objetosci zloza. Stezenie glukagonu w eluencie wy- 60 nosi korzystnie okolo 400—700 ug/ml i czystosc je¬ go wynosi powyzej okolo 10%. Jezeli roztworu te¬ go nie podaje sie zaraz dalszemu oczyszczaniu, to przed magazynowaniem trzeba go zakwasic roz¬ cienczonym kwasem solnym do wartosci pH oko- es lo 3. Frakcje zebrane przed i po wlasciwych frak¬ cjach eluentu zawierajacego glukagon zachowuje sie i wykorzystuje przy dodatkowym oczyszczaniu glukagonu.Przed dalsza przeróbka wartosc pH eluentu za¬ wierajacego glukagon doprowadza sie do okolo 5 za pomoca rozcienczonego roztworu kwasu fosfo¬ rowego lub rozcienczonego roztworu wodnego wo¬ dorotlenku potasowego, po czym ogrzewa do tem¬ peratury 60°C, przesacza, chlodzi do temperatury okolo 5°C i pozostawia do krystalizacji. Krystalicz¬ ny glukagon oddziela siew dowolny, znamy sposób, np. przez odwirowywanie i przemywa zimnym, roz¬ tworem wodnym chlorku sodowego o stezeniu 0,001% wagowego. Wszystkie lugi macierzyste zachowuje sie do dalszego wykorzystania.Krystaliczny glukagon rozpuszcza sie w roztwo¬ rze wodorotlenku amonowego o wartosci,-pH 9,5, zawierajacym EDTA i butanol, przygotowujac roz¬ twór zawierajacy okolo 2—6% wagowo/objetoscio¬ wych glukagonu, okolo 0,265—0,75 g substancji sta¬ lych na 1 litr objetosci zloza i okolo 0,1—1,875 g glukagonu na 1 litr objetosci zloza. Calkowita ob¬ jetosc roztworu wynosi okolo 2,5—7,5% objetosci zloza. Otrzymany roztwór, przeznaczony do poda¬ wania na druga kolumne* podaje sie na kolumne wypelniona preparatem Sephadex G-50F, która ma objetosc zloza o okolo 20% wieksza od objetosci zloza pierwszej kolumny., Eluuje sie w sposób wy¬ zej opisany, przy czym zawartosc glukagonu w eluencie wynosi zwykle okolo 500-t3500 ^g/ml. War¬ tosc pH roztworu doprowadza sie do okolo 7—8 i poddaje krystalizacji w temperaturze okolo 5— 10°C. Po oddzieleniu krystalicznego glukagonu wszy¬ stkie lugi macierzyste i popluczyny wykorzystuje sie ponownie w procesie.Sposób wedlug wynalazku zilustrowano w przy¬ kladach. Przyklad I przedstawia proces oczyszcza nia glukagonu z dwoma zabiegami filtrowania przez zel. Przyklady II i III sa podane w celach porów-: nawczych i stosuje sie w nich znany sposób oczy¬ szczania glukagonu z filtrowaniem przez zel i bez tego zabiegu. We wszystkich przykladach stosuje sie taki sam zanieczyszczony glukagon, pochodzacy z dwóch zródel, a mianowicie: 1) bezpostaciowa frakcje proteinowa wyosobniona przy wytwarzaniu krystalicznej insuliny cynkowej i 2) proteiny pozo¬ stale w buforowanym za pomoca cytrynianu lugu macierzystym po krystalizacji insuliny cynkowej, wytracanej za pomoca cynku. Obie frakcje protei¬ nowe lacza sie i prowadzi frakcjonowane wytra¬ canie przy wartosci pH okolo 6,2, w obecnosci 0,75% chlorku sodowego i 0,5% fenolu (procenty wagowo-objetosciowe). Szereg takich partii frak¬ cjonowanie stracanych protein laczy sie, oznacza¬ jac w nich zawartosc glukagonu, aby otrzymac pro¬ dukt wyjsciowy zawierajacy 3,60% wagowych glu¬ kagonu.Zawartosc glukagonu oznacza sie zmieniona nie¬ co metoda oznaczania insuliny [Herbert i wspól¬ pracownicy, J. Clin. Endocr., 25, 1375 (1965)], sto¬ sujac rozcienczanie radioaktywne i powlekany we¬ giel drzewny. Czystosc glukagonu okresla sie w procentach wagowych w stosunku do calkowitej zawartosci substancji stalych, która oznacza sie9 114153 10 znanymi sposobami. Wydajnosc procesu oznacza sie w procentach glukagonu uzyskanego, w stosunku do calkowitej zawartosci glukagonu w produkcie wyjsciowym.Przyklad I. A. Przygotowywanie roztworu glukagonu podawanego na kolumne. 200 g wyjscio¬ wej proteiny zawierajacej glukagon rozpuszcza sie w 5 litrach wodnego roztworu kwasu solnego o wartosci pH 3,0 i w celu ulatwienia rozpuszczania doprowadza wartosc pH roztworu do 11, dodajac wodny roztwór wodorotlenku sodowego. Nastepnie za pomoca 3n kwasu solnego doprowadza sie war^ tosc pH roztworu do 9,5 i przesacza roztwór, otrzy¬ mujac 5,675 litra przesaczu.B. Pierwsze filtrowanie przez zel. Chromatogra¬ ficzna kolumne zlozona z 4 jednostek Pharmacia KS-370/15 (Pharmacia Ftine Chemicals. Inc.) upa- kowuje sie preparatem* Sephadex G-50F (Pharma¬ cia Fine Chemicals, Inc.) i równowazy w tempe¬ raturze 25°C wodnym roztworem wodorotlenku amonowego o wartosci pH 9,5, zawierajacym 0,001 m EDTA i 0,1% butanolu. Kolumne te .zasila* sie przy¬ gotowanym w sposób wyzej opisany roztworem glukagonu i eluuje roztworem wodnym wodoro¬ tlenku amonowego o wartosci pH 9,5, zawieraja¬ cym EDTA i butanol. Eluent wprowadza sie w ilo¬ sci 300—400 ml/minute. W odcieku oznacza sie za¬ wartosc protein mierzac w procentach przepusz¬ czalnosc promieniowania o dlugosci fali 280 nm za pomoca absorpcjomierza /LKB Uvicord II firmy LKB Produkter AB, Sztokholm, Szwecja/. Po ze¬ braniu 19,6 litra odcieku (objetosc równa objetosci pustych przestrzeni w kolumnie), zbiera sie 22,4 litra . frakcji zawierajacej proteiny o wiekszym ciezarze czasteczkowym, po czym zbiera sie trzy frakcje, a mianowicie: 1/2 filtry frakcji wstepnej, 2/11 litrów frakcji wlasciwej, zawierajacej glu¬ kagon i 3/4 litry frakcji dodatkowej. Wartosc pil frakcji zawierajacej glukagon doprowadza sie za pomoca 3n wodnego roztworu kwasu solnego do 5,5 i pozostawia na noc w temperaturze 25°C. Ob¬ jetosc tego roztworu wynosi 11 litrów, zawiera on 56 g lacznie substancji stalych, co odpowiada 4,6 mg/ml, a zawartosc glukagonu wynosi 6,058 g, co odpowiada 551 iig/ml. Czystosc glukagonu wynosi 11,97%, a wydajnosc 84,14%, w przeliczeniu na za¬ wartosc glukagonu w produkcie wyjsciowym, która wynosi 7,20 g.C. Posrednia krystalizacja. Roztwór glukagonu w eluencie miesza sie i ogrzewa do temperatury 60°C, doprowadza wartosc pH roztworu do 5,0 za pomoca 3n wodnego roztworu kwasu solnego, prze¬ sacza goracy roztwór, chlodzi przesacz do tempe¬ ratury okolo 5°C i pozostawia w tej temperaturze do krystalizacji glukagonu. Lug macierzysty naj¬ pierw dekantuje sie, a nastepnie odwirowuje kry¬ sztaly, zachowujac lugi macierzyste. Krystaliczny glukagon rozpuszcza sie w wodnym roztworze wo¬ dorotlenku amonowego o wartosci pH 9,5, zawie¬ rajacym EDTA i butanol, po czym przesacza, otrzy¬ mujac 1,65 litra roztworu zawierajacego 6,27 sta¬ lych substancji, co odpowiada 3,8 mg/ml, a zawar¬ tosc glukagonu wynosi 3,82 g, co odpowiada 2,322 mg/ml. Czystosc glukagonu wynosi 61,1%, a wy¬ dajnosc 53,1%.D. Drugie filtrowanie przez zel. Przygotowuje sie kolumne chromatograficzna podobna do opisanej 5 w ustepie A, lecz skladajaca sie z 5 sekcji. Roz¬ twór otrzymany w wyniku posredniej krystalizacji podaje sie na te kolumne i eluuje roztworem wo¬ dorotlenku amonowego o wartosci pH 9,5, zawie¬ rajacym EDTA i butanol. Eluent doprowadza sie 10 w ilosci 500 ml/minute i eluuje w sposób opisany w ustepie B, otrzymujac 14,0 litrów frakcji zawieT • rajacej glukagon. Roztwór ten zawiera 5,6 g .sub¬ stancji stalych, to jest 0,40 mg/ml. Zawartosc glu¬ kagonu wynosi 3,40 g, to jest 243 |*g/ml. Czystosc lf glukagonu wynosi 60,7% i wydajnosc 47,22%. Na¬ lezy zaznaczyc, ze ze wzgledu na wspomniane wy¬ zej dostosowywanie wartosci pH$ zawartosc soli nieorganicznych w eluencie znacznie wzrasta. Po¬ niewaz zas te sole maja wspólczynnik Kd w przy- 20 blizeniu/ równy wspólczynnikowi glukagonu, przeto sole te nie sa usuwane podczas filtrowania przez zel, a poniewaz czystosc glukagonu okresla sie w odniesieniu do calkowitej zawartosci substancji sta¬ lych wobec tego to drugie oczyszczanie pozornie 31 nie powoduje oczyszczania. Jednakze w pewnej mierze zachodzi tu oczyszczanie glukagonu od in¬ nych protein. Innymi slowy, kazdy z zabiegów po¬ woduje zwiekszanie czystosci glukagonu, jezeli czy¬ stosc te okresla sie w stosunku do calkowitej za- * wartosci protein^ a nie wszystkich substancji sta¬ lych.E. Koncowa krystalizacja glukagonu. Wartosc pH; roztworu otrzymanego po drugim filtrowaniu dopiowadza sie do 7,5 dodajac 26 ml 10% wodne- 35 go ioztworu kwasu fosforowego,, miesza roztwór w temperaturze 5°C w ciagu 18 godzin, w celu o- siagniocia mozliwie dobrej krystalizacji, po czym pozostawia do odstania w ciagu oftelo 72 godzin.Lug macierzysty oddziela sie przez-dekantacje, po 40 czym odwirowuje krysztaly i lugi pozostawia do wykorzystania. Krysztaly glukagonu przemywa sie kolejno raz roztworem 0,001% chlorku sodowego, dwukrotnie woda i raz bezwodnym eterem. Kry¬ sztaly suszy sie. pod zmniejszonym cisnieniem w ciagu nocy. Otrzymuje sie 3,455 g krystalicznego glukagonu, którego czystosc oznaczana przez ana¬ lizowanie aminokwasów i metoda chromatograficz¬ nej wymiany jonów wynosi 91,1%. Otrzymany pro¬ dukt zawiera 3,13 g czystego glukagonu, co ozna¬ cza 43,5% wydajnosci teoretycznej.Przyklad II. A. Przygotowywanie roztworu glukagonu. 4000 g wyjsciowej proteiny zawieraja¬ cej 144 g glukagonu rozpuszcza sie w 250 litrach wodnego roztworu kwasu solnego o wartosci pH 2,8 mieszajac w temperaturze 25°C w ciagu 1 go¬ dziny, po czyift przesacza. Do przesaczu dodaje sie 550 litrów wody i tyle 3n roztworu wodafcego kwa¬ su solnego, aby uzyskac wartosc pH roztworu 2,1. w Calkowita objetosc roztworu wynosi 800 litrów.B. Wytwarzanie wlókienek. Do otrzymanego roz¬ tworu dodaje sie 3,2 litra 0,1 m roztworu EDTA i 4;8 litra wodnego roztworu siarczanu amonowego o stezeniu 50% wagowych. Otrzymany roztwór o f| wartosci pH 2,3 miesza sie W ciagu 48 godzin w114153 11 12 temperaturze 27°C, w celu spowodowania fibryla- cji. Wytworzone wlókienka odwirowuje sie i mie¬ sza z 120 litrami wodnego roztworu kwasu solne¬ go o wartosci pH 2,0, zawierajacego 0,2°/o wago¬ wo/objetosciowych fenolu, po czym za pomoca 10% roztworu wodnego wodorotlenku potasowego dopro¬ wadza sie wartosc pH zawiesiny do 10, otrzymujac 122 litry roztworu zawierajacego 683,2 g wszyst¬ kich substancji stalych, co odpowiada 5,6 mg/ml.Roztwór zawiera 98,088 g glukagonu, to jest 804 jig/ml. Czystosc glukagonu Wynosi 14,36% i wy¬ dajnosc 68,12%.C. Posrednia krystalizacja. Wartosc pH otrzyma¬ nego roztworu wlókienek glukagonu doprowadza sie do 7,0 za pomoca 10% wodnego roztworu kwa¬ su fosforowego; i ogrzewa do temperatury 60°C, dodajac równoczesnie tyle wody, aby uzyskac 137 litrów roztworu, w którym zawartosc stalych sub¬ stancji wynosi 5,0 mg/ml. Do roztworu dodaje sie jeszcze tyle 10% wodnego roztworu kwasu fosfo¬ rowego, aby uzyskac wartosc pH roztworu 5,0, po czym goracy roztwór przesacza sie i utrzymuje w temperaturze 5°C w ciagu 72 godzin. Krystaliczny glukagon oddziela sie przez dekantacje i odwiro¬ wywanie, zachowujac lugi macierzyste do dalszego wykorzystania, a produkt rozpuszcza sie w 9,0 li¬ trach wodnego roztworu wodorotlenku amonowe¬ go o wartosci pH 9^5 i przesacza. Przesacz zawie¬ ra 99,0 g wszystkich substancji stalych, co odpo¬ wiada stezeniu 11,0 mg/ml. Roztwór ten zawiera 42,11 g glukagonu, to jest 4,679 iig/ml. Czystosc glukagonu wynosi 42,54% i wydajnosc 29,24%. Z otrzymanego roztworu oddziela sie 1 litr, to jest 11,1% objetosci roztwoifti i przeznacza te czesc do próby 'opisanej w przykladzie III, a 8 litrów pod¬ daje sie filtracji przez zel.D. Filtrowanie przez zel. 8 litrów glukagonu po¬ daje sie na kolumne o pieciu sekcjach, opisana w przykladzie I D i eluuje w sposób opisany rów¬ niez w przykladzie I D, z predkoscia przeplywu 350—500 ml/minute. Frakcja zawierajaca glukagon ma objetosc 30 litrów i zawiera 66,0 g wszyst¬ kich substancji stalych, to jest 2,2 mg/ml. Zawar¬ tosc glukagonu wynosi 36,84 g, to jest 1228 \ig/m\, czystosc glukagonu 55,8% i wydajnosc po uwzgled¬ nieniu odjetej czesci roztworu wynosi 28,78%.E. Koncowa krystalizacja glukagonu. Do frakcji zawierajacej glukagon dodaje sie 0,1 litra 10% •roztworu kwasu fosforowego, w celu uzyskania wartosci pH 7,5, po czym miesza sie roztwór w temperaturze 5°C w ciagu 16 godzin, powodujac krystalizacje glukagonu i nastepnie pozostawia na okres 72 godzin. Osadzony produkt krystaliczny od¬ dziela sie przez dekantacje i odwirowuje, zacho7 wujac lugi macierzyste do dalszego wykorzystania, a osad przemywa sie kolejno 0,001% roztworem wodnym chlorku sodowego, bezwodnym etanolem i eterem, po czyim suszy pod zmniejszonym niem. Otrzymuje sie 33,654 g glukagonu o czysto¬ sci, okreslonej droga analizy aminokwasów i dro¬ ga chromatograficzna, wynoszacej 84,35%. Pro¬ dukt zawiera wiec 28,39' g czystego glukagonu, co stanowi 22,17% wydajnosci teoretycznej.Przyklad* III. Do litra roztworu wlókienek glukagonu, otrzymanego w sposób opisany w przy- 10 15 20 35 kladzie II C, dodaje sie okolo 300 ml 10% roztwo¬ ru wodnego kwasu fosforowego, az do uzyskania slabego zmetnienia i wartosci pH 7,8, po czym miesza sie roztwór w ciagu 2 godzin w temperatu¬ rze 25°C i nastepnie w ciagu 16 godzin w tempe¬ raturze 5°C i pozostawia do odstania na okres 72 godzin. Krystaliczny produkt odwirowuje sie, lug macierzysty pozostawia do wykorzystania i osad przemywa kolejno wodnym roztworem chlorku so¬ dowego, bezwodnego etanolu i eteru, po czym su¬ szy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 3,897 g glukagonu. Jego czystosc oznaczona meto¬ da analizy aminokwasów i metoda chromatogra¬ ficznej wymiany jonów wynosi 81,5%, to znaczy, ze produkt zawiera 3,341 g czystego glukagonu, co stanowi 21,09% wydajnosci teoretycznej.Podane wyzej przyklady swiadcza o tym, ze spo¬ sobem wedlug wynalazku otrzymuje sie glukagon czysciejszy i z wyzsza wydajnoscia niz przy sto¬ sowaniu znanego sposobu, nawet jezeli ten zna¬ ny sposób polaczy sie z zabiegiem filtrowania przez zel.Rysunek ilustruje sposób opisany w przykladzie I, podajac wykres przebiegu procesu eluowania w obu 'stadiach filtrowania przez zel. Wykres ten przedstawia zaleznosc optycznej gestosci róznych frakcji eluatu przy dlugosci fali 280 nm od obje¬ tosci eluatu w litrach oraz zaleznosc zawartosci glukagonu w niektórych frakcjach od objetosci eluatu w litrach. Tak wiec wykres ten podaje za¬ równo zawartosc protein i zawartosc glukagonu w odcieku otrzymanym podczas eluowania. Z wy¬ kresu tego wynika, ze glukagon jest eluowany w stosunkowo waskim odcinku tego procesu, na¬ wet jezeli inne proteiny przeplywaja przez kolum¬ ne w sposób ciagly. 45 55 60 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oczyszczania glukagonu, znamienny tym, ze wodny roztwór glukagonu o czystosci co najmniej okolo 0,1*/©, majacy wartosc pH od oko¬ lo 9 do okolo 11 i zawierajacy w 1 ml co naj¬ mniej okolo 0,01 mg glukagonu oraz mniej niz o- kolo 10% wagowo/objetosciowych wszystkich sta¬ lych protein, podaje sie na kolumne napelniona specznionym zelem, który w suchym stanie moze ponownie pochlaniac co najmniej 4% wagowe wo¬ dy i którego czastki maja srednice mniejsza niz okolo 100 mikronów, przy czym calkowita ilosc glukagonu podawana na kolumne jest taka, aby na 1 litr objetosci zloza w kolumnie przypadalo od okolo 0,01 do okolo 5 g glukagonu, po czym eluuje sie glukagon z kolumny w temperaturze od okolo 4°C do okolo 40°C wodnym eluentem o wartosci pH tego samego rzedu co wartosc pH roztworu glukagonu. ' 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zel, który ma zdolnosc pochlaniania wo¬ dy w ilosci od okolo 4% do okolo 98% w stosunku wagowym. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie zel, który ma zdolnosc pochlaniania wo-114 153 13 dy w ilosci od okolo 4% do okolo 20% w stosun¬ ku wagowym. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze jako zel stosuje sie usieciowany dekstran. 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze stosuje sie zel majacy zdolnosc pochlaniania okolo 5*/o wagowych wody. 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze stosuje sie zel majacy czastki o srednicy od okolo 20 do okolo 80 mikronów. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze obciazenie kolumny glukagonem wynosi od okolo 0,08 d.o okolo 3,1 g ma 1 litr objetosci zloza. 14 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie eluent zawierajacy w 1 litrze do okolo 0,01 mola kwasu etylenodwuamino-N,N,N',N'-czte- rooctowego jako srodka chelatujacego jon dwuwar- tosciowego metalu. 9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie eluent, który zawiera do okolo 0,Wr objetosciowych butanolu jako stabilizatora. 10. Sposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze stosuje sie korzystnie eluent zawierajacy 0,l§/# ob¬ jetosciowych butanolu. 11. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze Droces eluowania prowadzi sie w temperaturze po¬ kojowej. r. . ^ ^ } \ r 1 i i— p A M -D— l ' ' { \ T—1 V -o— T—' <*oo. oc^\ =k+— r^^^ J-^ °o_ *\ ' y T A 0 T™^ X } / I—* rk \ \j \r ^"^ \ \ p / p W L \ l\ W \ 1 \ l T- \ N H ^ T-* r^ «* i—* *jf *** W f 1 \ T^ \ T^ C/O "n 70 45 50 38 «0 PL