PL108429B1 - Method of producing new n-2-/6-hydroxybenzothiazolylo/-n'-phenyloureas - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N,-fenylomoczników o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, grupe alkoksylowa o l—3 atomach'wegla lub atom chlorowca. 5 Zwiazki o wzorze 1 wykazuja czynnosc regulowania reakcji immunologicznych.Podstawione w polozeniu 2 benzimidazole, benzo- tiazole i benzoksazole proponowano ostatnio stosowac w wielu dziedzinach, glównie w rolnictwie. Przykladowo, 10 2-trójfluorometylobenzimidazole przedstawiono w brytyj¬ skim opisie patentowym nr 1097 561 jako wybitnie .aktywne srodki chwastobójcze. Zwiazkom tym przepisuje sie równiez dzialanie mieczako-, owado- i grzybobójcze.Inne podstawione w polozeniu 2 benzimidazole wykazuja 15 -aktywnosc kokcydiostatyczna. 2-(4-tiazolilo)benzimidazol (tiabendazol) jest sprzedawany jako srodek przeciw ro¬ bakom. Ponadto pewne 2-hydroksybenzylobenzimidazole wykazuja wlasciwosci przeciwwirusowe (patrz opis pa¬ tentowy St. Zjedn. Ameryki nr 3 331 739). Zastosowanie 20 benzoksazoli i benzotiazoli w powyzszych dzialaniach nie jest tak dokladnie zbadane, jak benzimidazoli, jednak zwiazki te budza zainteresowanie, zwlaszcza jako srodki kokcydiostatyczne.Literatura dotyczaca pochodnych mocznika powyz- 25 : szych klas nie jest obszerna. N- (2-benzotiazolilo)-N'-fenylo- mocznik opisano w Chem. Abs., 29, 2660, 55, 8389 i 57, 801. Odpowiednia pochodna 4-metylowa opisano w Chem.Abs. 25, 104 i 50, 1776—1777, a pochodna 5-metoksylowa w Chem. Abs. 52, 20673. N- (2-benzimidazolilo)-N,-fenylo- 30 mocznik jest opisany w Bailstein 24 (II), 62 i Chem, Abs. 15, 3077. Ponadto, w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3 299 085 przedstawiono N-(2-benzotiazolilo) lub N- (2-benzoksazolilo)-N'-alkilomoczniki, w których grupa alkilowa jest rodnik alifatyczny o 1^5 atomach wegla, jako zwiazki przejsciowe w procesie wytwarzania pewnych zwiazków chwastobójczych, a w opisie patentowym St.Zjedn. Ameryki nr 3 162 644 2-benzoksazolilomoczniki wykazujace czynnosc regulacji wzrostu roslin i odprezania miesni.W opisach patentowych St. Zjedn. Ameryki nr 3 399 212, 3 336191 i 3 401 171 przedstawiono benzimidazolilo- moczniki stanowiace srodki przeciw robakom.W opisie patentowym Republiki Poludniowej Afryki (Derwent Pharmdoc numer podstawowy 36565) ujawniono benzotiazolilomoczniki stosowane jako antyseptyczne dodatki do detergentów.Ostatnio nabraly znaczenia zwiazki immunosupresyjne, znajdujace zastosowanie przy transplantacjach organów takich jak serce, a zwlaszcza nerki. Mechanizm obronny czlowieka dazy do usuniecia obcych antygenów (w tym przypadku przeszczepionego organu) w drodze reakcji immunologicznej. Tak wiec przy wszystkich operacjach przeszczepiania organów konieczne jest uprzednie podanie duzych dawek czynnika imtnunosupresyjnego, aby zapo¬ biec odrzuceniu przeszczepu. Czynnikiem immunosupre- syjnym z wyboru jest azatiopryna (nazwa handlowa IMURANR opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr. 3 056 785).W belgijskim opisie patentowym 744 970 z 27 lipca 1970 r. 108 429108 429 3 (patrz równiez brytyjski opis patentowy nr 1296 561 z 15 listopada 1972) omówiono zastosowanie podstawionych w polozeniu 6 benzotiazolilofenylomoczników, takich jak N-2-(ó-metoksybenzotiazoloiloJ-N^fenylomoczniki, sta¬ nowiace czynniki inmunosupresyjne i regulujace reakcje immunologiczna.Stwierdzono jednak, ze te znane zwiazki o budowie najbardziej zblizonej do struktury zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku posiadaja dzialanie muta¬ genne w stosunku do pewnych szczepów bakterii. W od¬ róznieniu, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku nowe N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N,-fenylomoczniki nie po¬ siadaja zadnych wlasciwosci mutagennych na co wskazuja zamieszczone dalej wyniki testów. Jest to nieoczekiwana i korzystna wlasciwosc, poniewaz nie znajduje sie praktycz¬ nie zwiazku nie posiadajacego mutagennej aktywnosci, a przy wprowadzaniu zwiazków do organizmów zywych korzystne fest jesli zwiazek nie wykazuje zadnego muta- i^ennj^cjizialania^^j Przypuszcza sie, ze aktywnosc mutagenna znanych N-2- (6-metoksybenzotiazolilo)-N,-fenylomoczników jest spo¬ wodowana obecnoscia 2-amino-6-metoksybenzotiazolu. Nie stwierdzono metabolizmu pochodnych 6-metoksylowych w organizmach zwierzat, jednakze nalezy wziac pod uwage, ze zachodzace procesy moga spowodowac hydrolize w wy¬ niku której otrzymuje sie mutagenne 2-amino-6-metoksy- benzotiazóle. Jesli hydrolizie ulegalyby zwiazki o wzorze ogólnym 1, produkt rozkladu tj. 2-amino-6-hydroksy- benzotiazol nie bedzie wykazywal wlasciwosci mutagennych, co równiez potwierdzaja zamieszczone dalej wyniki testów.Nalezy równiez podkreslic, ze immunosupresyjna czynnosc nowych N-2-(ó-hydroksybenzotiazoliloJ-N^fe- nylomoczników jest nieoczekiwana wobec stwierdzonego braku podobienstwa farmakologicznych wlasciwosci zwiaz¬ ków hydroksylowych i ich pochodnych eterowych np. metoksylowych. Dla przykladu, mofrina posiadajaca wolne grupy hydroksylowe jest bardzo silnym srodkiem znieczulajacym, podczas gdy jej metoksylowa pochodna taka jak kodeina posiada jedynie 1/20 aktywnosci znieczula¬ jacej. Taka odmienna aktywnosc wystepuje takze w przy¬ padku hormonalnej czynnosci epinefryny i norepinefryny oraz ich pochodnych dwumetoksylowych a takze w przy¬ padku przeciwbakteryjnego dzialania zwiazków zawieraja¬ cych wolne grupy hydroksylowe, które charakteryzuja sie wysoka aktywnoscia podczas gdy ich pochodne eterowe wykazuja wzgledny brak aktywnosci.Reakcja immunologiczna sklada sie z sekwencji przek- ksztalcen komórkowych i zjawisk biochemicznych, prowa¬ dzonych do bimodalnej reakcji na obca substancje (anty¬ gen). Komórki biorace w niej udzial rozwijaja sie z komórek macierzystych powstajacych w szpiku kostnym i rozpro¬ wadzanych do obwodowych organów limfatycznych. Stad, na bodziec antygenowy, wychodzi odpowiedz organizmu, w postaci komórek osocza (wytwarzajacych przeciwciala) i specyficznych limfocytów odpornosciowych. Do ukladu krazenia wprowadzane jest przeciwcialo, które w ten sposób moze dzialac w oddaleniu od wytwarzajacej je komórki (odpornosc humorama). Specyficzne limfocyty odpornos¬ ciowe równiez dostaja sie do ukladu krazenia i dzialaja w miejscu uszkodzenia (odpornosc komórkowa). Reakqa przeciwciala z antygenem powoduje wydzielanie histaminy z zasadochlonnych leukocytów. Histamina zmienia przepusz¬ czalnosc naczyn krwionosnych, przyspieszajac doplyw zarówno przeciwcial jak i specyficznych limfocytów od¬ pornosciowych do miejsca uszkodzenia. Takwiec odpowiedz 4 immunologiczny sklada sie z kolejno po sobie nastepujacych zjawisk biochemicznych, zachodzacych w róznych miejscach ciala. Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku posiadaja wlasciwosci zmieniania jej, w sensie osla- 5 bienia, na rózny;h etapach zjawisk biochemicznych lub rozwoju komórkowego.Zwiazki przeciwhistaminowe maja wplyw jedynie na reakcje wtórne w odpowiedzi immunologicznej, nie maja natomiast bezposredniego wplywu na komórki wytwarzaja- 10 ce przeciwciala lub specyficzne limfocyty odpornosciowe* Niektóre zwiazki z obecnie stosowanych jako leki immuno- supresyjne maja wplyw na wczesniejsze ogniwa lancucha zjawisk zwanych odpowiedzia immunologiczna. Pewne ste¬ roidy przeciwzapalne, np. kortizon, ograniczaja wytwa- 15 rzanie przeciwcial i specyficznych limfocytów odpornos¬ ciowych, lecz równiez niszcza normalna tkanke limfatyczna i wykazuja inne niepozadane dzialania uboczne.Niektóre leki przeciwnowotworowe, np. azatiopryna, cyklofosfamid i metotreksat, stosowane jako czynniki 20 immunosupresyjne, równiez niszcza normalna tkanke limfatyczna i znacznie ograniczaja wytwarzanie innych komórek przez szpik kostny. Poniewaz leki te wybrano na podstawie ich toksycznosci w stosunku do spektrum typów komórki, nalezy oczekiwac ich ogólnie cytotoksycz- 25 nego dzialania.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku nowe N-2- (ó-hydroksybenzotiazoliloJ-N^fenylomoczniki nie posia¬ daja glównych wad wyzej przedstawionych, stosowanych obecnie srodków immunosupresyjnych, poniewaz nie 30 niszcza normalnej tkanki limfatycznej oraz nie dzialaja depresyjnie na szpik kostny.Ponadto, stosowane obecnie srodki immunosupresyjne takie jak azatiopryna i cyklofosfamid wykazuja wlasciwosci mutogenne, których pozbawione sa zwiazki wytwarzane 35 sposobem wedlug wynalazku.Sposób wytwarzania nowych N-2-(6-hydtroksybenzo- tiazolilo)-N'-fenylomoczników o ogólnym wzorze 1, w którym R ma wyzej podane znaczenie polega wedlug wynalazku na tym, ze sililuje sie 2-fenoksykarbonyloamino- 40 -6-hydroksy-benzotiazol o ogólnym wzorze 2, w którym R1 oznacza atom wodoru, grupe nitrowa lub grupe metylowa, w temperaturze —20 °C do 111 °C w organicznym rozpusz¬ czalniku, ogrzewa sie mieszanine reakcyjna do wytworzenia trójmetylosililoksy-2-benzotiazoliloizocyjanianu, który na- 45 stepnie poddaje sie reakcji z anilina o wzorze 3, w którym R ma wyzej podane znaczenie a otrzymany zwiazek poddaje sie hydrolizie.Alternatywny sposób prowadzenia procesu wedlug wy¬ nalazku, w którym wytwarza sie zwiazki i ogólnym wzorze 1, 50 w którym R ma wyzej podane znaczenie polega na tym, ze N-2-(6-fenylokarbamyloksybenzotiazolilo)-N'-fenylo- mocznik o ogólnym wzorze 4, w którym R ma wyzej podane znaczenie poddaje sie hydrolizie za pomoca zasady z grupy obejmujacej wodorotlenki i weglany metalu alkalicznego, 55 wodorotlenek amonu, alkoholany oraz wodorotlenki alkiloamoniowe o 1—2 atomach wegla w grupie alkilowej, w obojetnym rozpuszczalniku, w temperaturze nie wyzszej niz okolo I00°C.Stosowane przy omawianiu wzoru 1 okreslenie „grupa 60 alkilowa o 1—3 atomach wegla", oznacza rodnik metylowy, etylowy, n-propylowy, i izopropylowy. Okreslenie „grupa alkoksylowa o 1—3 atomach wegla oznacza grupe metoksy¬ lowa, etoksylowa, n-propoksylowa i izopropoksylowa, a termin „atom chlorowca" atom fluoru, chloru, bromu 65 lub jodu.108 429 5 Zwiazki o wzorze 1 sa krystalicznymi cialami stalymi barwy bialej o wysokiej temperaturze topnienia. Mozna je otrzymywac jednym z dwóch ponizej opisanych wariantów sposobu. W obu tych sposobach substratem jest 2-amino-6- -hydroksybenzotiazol, otrzymany na drodze kondensacji 5 chinonu z tiomocznikiem, sposobem opisanym w J. Org.Chem. 35, 4103(1970) lub na drodze demetylowania 2-amino-6-metoksybenzotiazolu, sposobem opisanym w J.Hetero. Chem. 10, 769 (1973).W pierwszej syntezie grupe aminowa w polozeniu 2 10 benzotiazolu przeksztalca sie najpierw w grupe karbami- nianowa w reakcji z chloromrówczanem fenylu, przyklado¬ wo z chloromrówczanem p-nitrofenylu. Otrzymany karba- minian poddaje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu, sposobem opisanym przez Grebera i Kircheldorfa, Angew. 15 Chem. Internat. Edit., 7, 941 (1968).Grupa trójmetylosililowa spelnia podwójna role. Po pierwsze przeksztalca grupe karbaminianu p-nitrofenylu w grupe izocyjanianowa zgodnie z metoda Grebera i Kri- cheldorfa, podana w cytowanej literaturze, a ponadto 20 ochrania wolna grupe wodorotlenowa, znajdujaca sie przy ugrupowaniu benzotiazolu, zapobiegajac reakcji tej grapy z grupa izocyjanianowa utworzona przy pierscieniu tiazolu.Otrzymany 6-hydroksybenzotiazolilo-2-izocyjanian latwo reaguje z anilina lub odpowiednio podstawiona anilina, 25 przechodzac w pochodna mocznika. Dodanie do mieszaniny reakcyjnej wody powoduje hydrolityczne odszczepianie grupy trójmetylosililowej, w wyniku czego powstaje zwiazek o wzorze 1. Powyzsza synteza jest przedstawiona schematem1. 30 W sekwencji reakcji przedstawionej schematem 1 mozna w miejsce chloromrówczanu p-nitrofenylu zastosowac inne chloromrówczany fenylu, otrzymujac w wyniku reakcji tych zwiazków z aminohydroksybenzotiazolem odpowiednie karbaminiany. Przykladami odpowiednich 35 chloromrówczanów sa chloromrówczan nie podstawionego fenylu i chloromrówczan tolilu.Odszczepienie grupy trójmetylosililowej z karbaminianów otrzymanych z powyzszych chloromrówczanów wymaga jednak wyzszej temperatury i/lub dluzszego czasu reakcji. 40 W sekwencji reakcji przedstawionej schematem 1 jako czynnik sililujacy zastosowano chlorek trójmetylosililu.Jak podaja Greber i Kricheldorf w cytowanej literaturze, do otrzymywania zwiazków dwusililowych mozna zastoso¬ wac równiez mono- lub dwu(trójmetylosililo)acetamid. 45 W alternatywnym rozwiazaniu 2-amino-6-hydroksyben- zotiazol poddaje sie reakcji z 1—2 molami (nadmiar molowy do 100%) fenyloizocyjanianu o wzorze R-C6H4-NCO.W reakcji tej powstaje mieszanina zawierajaca pochodna 6-karbamyloksylowa o wzorze ogólnym 4 i ewentualnie 50 zwiazek o wzorze 1. N-2-(6-fenylokarbamyloksybenzotia- zolilo)-N,-fenylomoczaik o wzorze ogMnym 4 poddaje sie zasadowej hydrolizie w obojetnym rozpuszczalniku w tem¬ peraturze ponizsj okolo 100 °C do calkowitego rozszcze¬ pienia grupy fenylokarbamyloksylowej w polozeniu 6 benzo- 55 tiazolilomocznika, w wyniku czego otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1.Hydrolize zwiazku 6-fenylokarbamyloksylowego do odpo¬ wiedniej pochodnej 6-hydroksylowej mozna przeprowadzic w mieszaninie reakcyjnej lub w trakcie poczatkowego 60 etapu rozdzielania, w którym wykorzystuje sie fenolowy charakter grupy hydroksylowej w polozeniu 6 i rozpuszcza sie zwiazek o wzorze 1 w zasadzie. Nierozpuszczalny w zasadzie zwiazek oddziela sie i poddaje hydrolizie w wyzej opisanysposób. 65 6 Korzystnie jest oczywiscie przeprowadzenie hydrolizy w mieszaninie reakcyjnej. 6-hydroksybenzotiazolilomocznik o wzorze 1 obecny lub powstajacy w reakcji hydrolizy, w warunkach tej reakcji jest trwaly.W reakcji 2-amino-6-hydroksybenzotiazolu z fenylo- izocyjanianem o wzorze R-C6H4-NCO podstawienie grupy 2-aminowej zachodzi znacznie szybciej niz podstawienie grupy 6-hydroksylowej. Tak wiec, przy stosowaniu jed¬ nego mola fenyloizocyjanianów glównym produktem re¬ akcji jest N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N,-fenylomocz- nik. Reakcja grupy hydroksylowej z fenyloizocyjanianem zachodzi jednak równiez z mierzalna szybkoscia, co powodu¬ je, ze koncowa mieszanina reakcyjna zawiera obok produktu glównego, mocznika o wzorze 1, równiez pewne ilosci 2-amino-6-fenylokarbomyloksybenzotiazolu, N-2- (6-fe- nylokarbamyloksybenzotiazoliloJ-N^fenylomocznika i nie przereagowanego wyjsciowego 2-amino-6-hydroksybenzo- tiazolu.W celu zapewnienia calkowitego przeksztalcenia grupy 2-aminowej benzotiazolu nalezy do mieszminy reakcyjnej wprowadzic wystarczajaca ilosc fenyloizocyjanianu lub podstawionego fenyloizocyjanianu, korzystnie 25—100% powyzej ilosci stechiometrycznej. Nadmiar przekraczajacy 100% ilosci stechiometrycznej (2 mole na mol aminoben- zotiazolu) nie jest oczywiscie konieczny, poniewaz przy 2 molach fenyloizocyjanianiu lub podstawionego fenylo¬ izocyjanianu cala ilosc benzotiazolu ulega przeksztalceniu w 6-fenylokarbamyloksybenzotiazolilomocznik o wzorze 4.Jezeli izocyjanian stosowany jest w ilosci mniejszej niz 2 lecz wiekszej niz 1 mol na mol benzotiazolu, to mieszanina reakcyjna bedzie zawierac zarówno pochodna 6-hydroksy- lowa jak i pochodna 6-karbamyloksylowa. W kazdym przypadku dla otrzymania pozadanego zwiazku 6-hydroksy- lowego z wydajnoscia ilosciowa konieczna jest hydroliza calej ilosci powstalej w reakcji pochodnej 6-karbamyloksy- lowej.Jak wspomniano, hydrolizente przeprowadza sie za po¬ moca zasady w obojetnym rozpuszczalniku, w temperaturze ponizej okolo 100 °C, az do praktycznie calkowitego zhydro- lizowania pochodnej 6-karbamyloksylowej do pochodnej 6-hydroksylowej o wzorze 1. Odpowiednim obojetnym rozpuszczalnikiem jest woda i nizsze alkanole, takie jak metanol lub etanol. Odpowiednimi zasadami sa wodorotlen¬ ki metali alkalicznych, jak wodorotlenek sodu lub potasu, alkoholany metali alkalicznych, jak etanolan potasu, metanolan sodu itp., weglany metali alkalicznych, jak weglan sodu lub potasu, wodorotlenek amonu i wodorotlenki amoniowe, jak wodorodenek trójmetyloamoniowy, trójme- tyloamoniowy itp. Reakcje przeprowadza sie zwykle w tem¬ peraturze wrzenia rozpuszczalnika, tj. od 65 °C, w przypadku stosowania metanolu, do 100°C w przypadku stosowania wody itp. Oczywiscie, im wyzsza temperatura tym krótszy jest czas pelnej hydrolizy zwiazku.Waznym czynnikiem jest równiez rozpuszczalnosc zasady w obojetnym rozpuszczalniku; przykladowo wodo¬ rotlenki metali alkalicznych sa lepiej rozpuszczalne niz weglany, skutkiem czego czas reakcji przyv stosowaniu wodorotlenków jest krótszy niz przy stosowaniu weglanów.Pelna hydroliza zwiazku 6-fenylokarbamyloksylowego za¬ chodzi w ciagu 1—18 godzin, w zaleznosci od rozpuszczal¬ nika, zasady i temperatury oraz natury ewentualnie pod¬ stawionej grupy 6-fenylokarbamyloksylowej.Charakter izocyjanianu o wzorze R-C6H4-NCO ma wplyw nie tylko na szybkosc hydrolizy grupy 6-fenylo/lub podstawionej fenylo/karbamyloksylowej lecz równiez na108 429 7 ilosciowy stosunek produktów reakcji danego izocyjanianu z 2-amino-6-hydroksybenzotiazolem, a zwlaszcza na sto¬ sunek szybkosci reakcji z grupa aminowa do szybkosci reakcji z grupa hydroksylowa.N-2-(6-hydroksybenzotiazolilo)-N,-fenylomocznik i inne zwiazki o wzorze 1 sa uzyteczne jako czynniki o dzialaniu przeciwwirusowym i immunosupresyjnym.Otrzymywanie zwiazków o wzorze 1 na drodze demetylo- wania odpowiedniego 6-metoksyeteru, np. za pomoca 48% kwasu bromowodorowego, okazalo sie nieskuteczne. Spo¬ sób ten nie moze byc stosowany szczególnie do otrzymy¬ wania zwiazków, w których R oznacza grupe metoksylowa, poniewaz demetylowanie prowadziloby do uwalniania grup wodorotlenowych w obu pierscieniach. Mozliwe jest jednak demetylowanie w drodze enzymatycznej, poniewaz zwiazki o wzorze 1 sa produktami metabolizmu odpowiednich pochodnych 6-metyloksylowych w organizmie szczura.Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku sa uzyteczne jako czynniki modyfikujace reakcje immuno¬ logiczna ssaków. Tak wiec zwiazki te mozna zaklasyfikowac jako „czynniki regulujace odpornosc", który to termin oznacza czynnik zmniejszajacy szybkosc wytwarzania prze¬ ciwcial w stosunku do obcego bialka. Czynnosc te mozna równiez scharakteryzowac jako czynnosc przeciwalergiczna, poniewaz reakcja alergiczna jest czescia mechanizmu obrony ciala (mechanizm odpornosciowy) wobec obcych antygenów (aktywnosc ta jest rózna od aktywnosci przeciw- histarninowej, która oddzialywuje tylko na wydzielanie histaminy w wyniku reakcji przeciwcialo-antygen). Czyn¬ nosc regulacji odpornosci oznaczono na myszach, stosujac jako antygen erytrocyty owcy, nalezy jednak oczekiwac, ze ten sam tym aktywnosci bedzie sie przejawiac w stosunku do kazdego obcego bialka u ssaków kazdego gatunku.Czynnosc zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku zmieniania mechanizmu odpornosciowego zwie¬ rzat oznaczono nastepujacym sposobem: Szwajcarskim myszom o wadze 20 g w grupach po 5 zwierzat, wprowadzono dootrzewnowo standaryzowana zawiesine antygenu-komórek krwi owcy. Aktywne zwiazki wprowadzono równiez dootrzewnowo, w róznym czasie przed i po wprowadzeniu czerwonych komórek krwi.W 8 dni po wprowadzeniu antygenu myszy wykrwawiono i polaczono uzyskane w grupie osocze. Sposobem agluty¬ nacji krwi oznaczono przeciwciala i przeprowadzono po¬ równanie wyników z uzyskanymi w kontrolnej grupie zwierzat.W tablicy 1 przedstawiono aktywnosc zwiazków, wyra¬ zona jako dawka konieczna do zmniejszenia miana agluty¬ nacji krwi zwierzat poddanych dzialaniu antygenu do wartosci charakteryzujacej zwierzeta kontrolne. W tablicy 1 w kolumnie 1 podano nazwe zwiazku, w kolumnie 2 sposób wprowadzenia, w kolumnie 3 wielkosc dawki, w kolumnie 4 sposób supresji.Jako znaczaca aktywnosc regulowania odpornosci przy¬ jeto co najmniej czterokrotna supresje miana aglutynacji krwi.Czynnosc immunosupresyjna innych zwiazków oznaczo¬ no sposobem zmodyfikowanym, poddajac badaniu osobno osocze kazdego zwierzecia. W sposobie tym dziesieciu szwajcarskim myszom o wadzie 20 gramów wprowadzono dootrzewnowo czerwone komórki krwi w ilosci po 5 x 107 Przed wprowadzeniem antygenu w ciagu trzech dni z kazdej w mys2y podawano badany zwiazek, w róznych dawkach.Grupie kontrolnej podano jedynie nosnik i komórki krwi owcy. W 7 dni po wprowadzeniu antygenu myszy wykrwa- 8 Tablica 1 Czynnosc reagulacji reakcji odpornosciowej Nazwa zwiazku N-2-(6-hydroksy- benzotiazolilo) -N'-fenylomo- cznik Sposób wprowa¬ dzenia doustnie doustnie doustnie pod¬ skórnie pod¬ skórnie Dawka mg/kg/ X dni 50x10 25x10 12,5 x 10 3,1 x 10 1,6x10 0,8 x 10 Stopien 1 supresji [ 8x 8x 4x calko¬ wita 16 x brak efektu [ wiono indywidualnie i oznaczono zawartosc przeciwcial w osoczu.W podobnym doswiadczeniu grupie 10 myszy wprowa¬ dzono dozylnie czerwone komórki krwi owcy w ilosci po 5 x 107, a badany zwiazek podano w okreslonych dawkach doustnie w ciagu trzech kolejnych dni poprzedzajacych wprowadzenie antygenu.Wyniki przedstawiono w tablicy 2. W tablicy tej w ko¬ lumnie 1 podano nazwe zwiazku, kolumnie 2 dawke w mili¬ gramach na kg, a w kolumnie 3 logarytm o podstawie 2 hemaglutyniny + lub — blad standardowy.Tablica 2 Czynnosc regulacji reakcji odpornosciowej Nazwa zwiazku Dawka (mg/kg) Log2 1 hemaglutyniny (wartosc srednia ±blad standardowy)* wprowadzenie dootrzewnowe N-2-(6-hydroksybenzo- 1 tiazoliloJ-N'- (p-meto- ksyfenylo)mocznik N-2- (6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'- (o-f luoro- fenylo)mocznik N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'- (o-tolilo) mocznik kontrola wprowac N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'- (p-meto- 1 ksyfenylo)mocznik N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'-(o-f luoro- fenylo)mocznik N-2-(6~hydsoksybenzo- | tiazolilo)-N'- (o-tolilo) mocznik | kontrola 50 25 12,5 50 25 12,5 50 25 12,5 lzenie dou 25 12,5 6,2 25 12,5 6,2 25 12,5 6,2 — <3,9O±0,53** <3,11±0,11** <3,60±0,34** <3,30±0,15** <3,35±0,24** <3,22±0,15** <3,22±0,22** <3,00±0,00** <3,70±0,15** 6,60 ±0,48 stne 7,00±0,26 7,62 ±0,18 6,78 ±0,22 <4,22±0,32** <4,40 ±0,43** <6,00±0,44** <5,78±0,49** 6,60 ±0,30** 7,40±0,22 7,50±0,17 x„ „ oznacza, ze jedno osocze w grupie lub "wiek¬ sza ich liczba nie zawieraja hemaglutyniny w ilosci wykrywalnej w próbie z najmniejszym roz¬ cienczeniem. 85 xxp 0,01 — poziom ufnosci.108 429 Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku sa uzyteczne w operacjach przeszczepiania narzadów, zapobie¬ gajac odrzuceniu przeszczepu przez organizm. Znajduja one równiez zastosowanie w leczeniu róznych schorzen o slabo poznanej etiologii, znanych ogólnie chorobami 5 autoimmunologicznymi. Do chorób tych naleza; auto- immunologiczna anemia chemolityczna, samoistna plamica trabocytopeniczna, toczen rumieniowaty, toczeniowe za¬ palenie watroby, toczeniowe zapalenie nerek i klebuszków nerkowych, zespól nerczycowy, zespól Goodpasture'a, 10 ziarnica Wegenera, schleroderma, choroba Sezarye'go, luszczyca, zapalenie jagodówki, reumatyczne zapalenie stawów, zapalenie tarczycy i zapaknie jadra przy swince.W leczeniu powyzszych chorób czynniki immunosupre- syjne sa skuteczne w zaleznosci od stopnia w jakim choroby 15 te zaleza, od mechanizmu autoimmunologicznego.Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazków mozna podawac doustnie, dootrzewnowo, miejscowo lub podskórnie. Dla podania doustnego zwiazki immunosu- presyjne mozna rozpuscic lub zawiesic w glikolu polietyle- 20 nowym i zmieszac z olejem kukurydzianym, w stosunku 1—200 mg na ml preparatu. Szczególnie korzystnym nos¬ nikiem preparatów doustnych jest mieszanina 50% glikolu polietylenowego 200, 50% oleju kukurydzianego i 10% monostearynianu polioksyetylenosorbitolu. 25 Uzyteczne sa równiez nosniki wodne, do których mozna dodac srodka powierzchniowo czynnego. Do zastosowan miejscowych nadaja sie roztwory zwiazków w etanolu lub w mieszaninie glikolu etylenowego z olejem kukurydza- nym z dodatkiem sredka powierzchniowo czynnego. 30 Stezenie czynnika immunosupresyjnego w nosniku moze wynosic 1—200 mg/ml.Heterocykliczne pochodne mocznika modyfikujace od¬ powiedz immunologiczna organizmu róznia sie od wiekszo¬ sci znanych czynników immunoregulacyjnych i immuno- 35 supresyjnych mechanizmem dzialania. W przeciwienstwie do leków przeciwhistaminowych nie dzialaja one bezpo¬ srednio antagonizujace) w stosunku do czynnosci histarriny.Nie dzialaja depresyjnie na czynnosc szpiku kostnego, jak to czynia leki przeciwnowotworewe stosowane czesto <0 przy przeszczepach tkanek. Heterocykliczne pochodne mocznika swoim wplywem na odpowiedz immunologiczra bardziej przypominaja kortikoidy lecz w przeciwienstwie do nich nie niszcza normalnej tkaniki liirfatycznej. Zwiazki te nie dzialaja takze depresyjnie na szpik kostny, a wiec nie 45 posiadaja glównych wad wykazawanych przez obecnie stosowane kortikosteroidowe i przeciwnowotworowe leki immunosupresyjne.Ponizej przedstawiono badania mutsgennctci wykazu¬ jace, ze zwiazki wytwarzana sposobem wedlug wynalazku 50 maja lepsze wlasciwosci niz znane benzotiazolilomoczniki, poniewaz nie posiadaja mutagennego dzialania. Dane badania mutagennosci.Aktywnosc mutagenna wielu pochodnych N-benzotia- zolilo-hT-fenylomocznika i wielu znanych czynników 55 mutagennych bada sie za pomoca zmodyfikowanego testu Amesa.Materialy, a. Dr Bruce Ames i jego wspólpracownicy uzyskali ze szczepu Salmonella typhimurium LT-2 naste¬ pujace auksotrofy bakteryjne: 60 G 46 histydyna — mutacja missens TA 1535 G 46 z delecja gal-bio-uvrB oraz delecja LPS TA 100 G 46 z delecja gal-bio-uvrB oraz z delecja LPS z dodatkiem czynnika ER PKM 101 C 3076 histydyna-, ( + ) mutacja fazy odczytu 65 10 TA 1537 C 3076 z delecja gal-bio-uvrB i z delecja LPS D 3052 histydyna-, (+ ) mutacja fazy odczytu TA 1538 D 3052 z delecja gal-bio-uvrB i z delecja LPS TA98 D 3052 z delecja gal-bio-uvrB oraz z delecja LPS z dodatkiem czynnika R PKM 101 b. Dr B.A. Bridges i jego wspólpracownicy uzyskali ze szczepu Escherichia coli nastepujace hodowle: WP 2 Escherichia coli tryptofan- WP 2 uvrA- Escherichia coli tryptofan- z delecja uvrA Pozy^ ki. a. Pozywka wegetatywna. Hodowle utrzymuje sie na tryptozowej pozywce sojowej (BBL) do której dodaje sie jeden procent wyciagu z drozdzy (Difco). b. Agar podstawowy. Jako pozywke podstawowa sto¬ suje sie minimalna pozywke Spizena ze sladowymi ilosciami biotyny, histydyny i tryptofanu. c. Górny agar. Selekcje szczepów histydyno* i trypto- fano* przeprowadza sie przy uzyciu górnego agaru aklada- jacego sie z 1% agaru, 0,5% chlorku sodowego, sladowych ilosci histydyny i tryptofanu oraz nadmiaru biotyny.Metody, a. Bakteryjne badanie mutagennego czynnika na plytkach gradientowych.Agarowe plytki zawierajace badany zwiazek w gradiencie stezenia przygotowuje sie nastepujacym sposobem. Przy¬ gotowuje sie mieszanine badanego zwiazku i agaru o ste¬ zeniu 100 mikrogramów zwiazku na jeden mililitr agaru, dodajac badany zwiazek w postaci roztworu w 0,1 ml dwumetylosulfotlenku do minimalnego agaru Spizizena. 10 ml uzyskanej mieszaniny agarowej umieszcza sie na kwadratowej plytce Petriego, która nastepnie ustawia sie pod nieznacznym katem. Agar pozostawia sie w tempera¬ turze pokojowej do zestalenia w postaci klina. Nastepnie plytki ustawia sie poziomo i pozostale miejsca wypelnia druga równa objetoscia minimalnego agaru Spizizena (nie zawierajacego badanego zwiazku) i po zestaleniu drugiej porcji agaru uzyskuje sie górny klin ulozony w pozycji odwrotnej do pierwszego.Gradient stezenia badanego zwiazku uzyskuje sie za pomoca dyfuzji zwiazku z dolnego klina do górnego, która zachodzi w ciagu dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Stezenie zwiazku na plytce zmienia sie w przy¬ blizeniu od 100 mikrogramów na ml do 1000 mikrogramów na ml. Dodatkowo przygotowuje sie trzy plytki ze steze¬ niami badanego zwiazku w zakresie 10 mikrogramów/ml do 100 mikrogramów/ml., 1,0 mikrograma/ml do 10 mikro¬ gramów/ml craz 0,1 irifcrograma/ml do 1,0 mikrograma/ml.Pipety o pojemnosci 50 mikrolitrów zanurza sie w zawie¬ szonych w pozywce A wyselekcjonowanych auksot^ofach (szczepów testowych) i czesciowo wypelnia je za pomoca przyciagania kapilarnego. Pipety przyklada sie do górnej krawedzi gradientu i zarysowuje nimi powierzchnie wzdluz plytki. Obserwuje sie wilgotny slad inokulacji. Nastepnie plytki inkubuje sie w ciagu 48 godzin w temperaturze 37 CC.Minimalna pozywka Spizizena stosowana w tych bada¬ niach zawiera tylko nieznaczne ilosci tryptofanu, histydyny i biotyny, które pozwlaja na wzrost okolo 6—10 generacji suksotrofów. Taki wzrost jest dostateczny dla okreslenia czy wystepuje dzialanie mutagenne. Jesli dzialanie to wyste¬ puje, wzdluz pasków inokulacji obserwuje sie bardzo blade paski hodowli bakteryjnej.Jesli obserwuje sie nieusmiercajace dzialanie mutagenne, to w tym bladym pasku podstawowym wystepuja niezna¬ czne kolonie drobnoustrojów. Czestotliwosc wystepowania108 429 11 kolonii wzrasta wzdluz wzrastajacego gradientu stezenia w kierunku stezenia, przy którym zachodzi maksymalne dzialanie mutagenne. Odwrotnie, czestotliwosc zmniejssza sie w kierunku zmniejszajacego sie gradientu stezenia i ponizej stezenia minimalnego obserwuje sie jedynie 5 pasek podstawowy. Tegranice stezen górna i dolna przyj¬ muj e sie jako zakres stezenia przy którym zwiazek wykazuje mutagenne dzialanie w warunkach testowych. b. Bakteryjne dzialanie mutagennego czynnika na plyt¬ kach gradientowych przy zastosowaniu metabolicznej 10 aktywacji badanego zwiazku.Enzym stosowany w celu aktywacji wytwarza sie naste¬ pujacym sposobem. Wszystkie etapy przeprowadza sie w temperaturze 0—4°C w wyjalowionych naczyniach szklanych i stosujac wyjalowione roztwory. Preparuje sie watroby z doroslych samców szczurów (rasy Wistar) którym piec dni wczesniej dootrzewnowo podano w poje¬ dynczej dawce 500 mg/kg Arocloru 1254. Watroby umiesz¬ cza sie w wyjalowionych cylindrach o pojemnosci 100 ml 20 zawierajacych w przyblizeniu 50 ml wyjalowionego 1,15 m roztworu KO. Objetosci watrób okresla sie poprzez zmiane objetosci. W przyblizeniu 1,0 ml watroby miesza sie z 3,0 ml 1,15 m roztworu KC1 i rozdrabnia. Rozdrobniona mieszanine homogenizuje sie w aparatach Pottera, Elvehjema przy uzyciu teflonowego tluczka. Homogenizat wiruje sie w ciagu 10 minut przy 9000xg warstwe wierz¬ chnia dekantuje, chowa i oznacza jako frakcje S-9. Jeden mililitr frakcji S-9 zawiera okolo 250 mg cieklej watroby.Swieza frakcje oznaczona S-9 dzieli sie na porcje o objetosci 2,0 ml (równowazne 500 mg cieklej watroby), które umiesz¬ cza sie w plastykowych probówkach do przechowywania w cieklym azocie, (probówki NUNC do surowicy, o wymiarach 38 x 12,5 mm, z zakrecanymi nasadkami), szybko zamraza i przechowuje w temperaturze cieklego azotu. W razie potrzeby, próbke frakcji S-9 rozmraza sie i utrzymuje w lodzie do czasu uzycia w ciagu dnia testo¬ wania, próbke nieuzyta odrzuca sie przy koncu tego dnia.Nastepnie przygotowuje sie roztwór, który zawiera 0,2 ml roztworu mikrosomalnego (frakcja S-9 przygoto- 4Q wana sposobem opisanym powyzej), 4 mikromole TPN*, 5 mikromoli 6-fosforanu glikozy, 5 mikromoli MgCl2, 32 mikromole KC1, 50 mikromoli fosforanu sodowego o wartosci pH=7,4, w jednym mililitrze. Koncowa mieszani¬ ne agarowa stosowana do wytworzenia wierzchniego klina przygotowuje sie nastepujacym sposobem: 10 ml 1,0% agaru zawierajacego sladowe ilosci histydyny, tryptofanu i nadmiar biotyny w temperaturze 45 °C miesza sie w probó¬ wce z 2,0 ml mieszaniny zawierajacej enzym i natychmiast rozdziela na cztery plytki za pomoca pipety. W tych warun¬ kach, w temperaturze 37°C mikrosomy istnieja w czasie krótszym niz jedna minuta. Proces ten powtarza sie kolejno dla kazdej z czterech plytek, az wszystkie plytki pokryje sie górna warstwa. Plytki pokrywa sie paskami, zwykle stosowanym sposobem i inkubuje w ciagu 48 godzin w temperaturze 37°C. Plytki odczytuje sie tak samo jak opisano powyzej w tescie bez aktywacji. c. Próby kontrolne Poza plytkami zawierajacymi badane zwiazki, w kazdej badanej serii stosuje sie dwie grupy plytek, z których 60 jedna sklada sie z plytek zawierajacych streptazocyne, zas druga 2-acetyloaminofluoren, bedace znanymi czynni¬ kami mutagennymi. Jako dodatkowe czynniki kontrolne stosuje sie równiez immunosupresanty takie jak cyklo- fosfamid i azatiopryne. 65 12 Przebadano nastepujace zwiazki: N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocznik, który jest zwiazkiem wytwarzanym sposobem wedlug wynalazku; N-2- (6-metoksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocznik i N-2- - (6-metoksybenzotiazolilo)-N,- (4-hydroksyfenylo)mocznik stanowiace zwiazki znane o budowie zblizonej do zwiazków o wzorze 1; 2-amino-6-metoksybenzotiazol i 2-amino-6-hydroksybenzo- tiazol; cyklofosfamid i azatiopryne, które sa zwiazkami znanymi o dzialaniu immunosupresyjnym; oraz znane czynniki mutagenne takie jak streptozotocyna i 2-cetyloaminofluoren.Wyniki przedstawiono w tablicy 3. Z danych przedsta¬ wionych w tablicy 3 widac, ze sposród badanych zwiazków jedynie N-2- (6-hydroksybenzotiaz3lilo)-N,-fenylomocznik i 2-amino-6-hydroksybenzotiazol nie wykazuja wlasciwosci mutagennych w stosunku do zadnych bakterii.Testy mutagenne wykazuja, ze N-2-(6-metoksybenzo- tiazolilo)-N'-fenylomocznik i N-2-(6-m2toksybenzotia- V zolilo)-N,-(4-hydroksyfenylo)mDcznik posiadaja aktyw¬ nosc mutagenna, podczas gdy N-2-(6-hydroksybenzotiazo- lilo)-N,-fenylomocznik nie posiada zadnej mutagennej zdolnosci.Chromatograficzne badania pochodnych 6-metoksy- lowych wskazuja na obecnosc 2-amino-6-m2toksybenzo- tiazolu. Przypuszcza sie, ze aktywnosc pochodnych 6-me- toksylowych jest spowodowana obecnoscia 2-amino-6- metoksybenzotiazolu. Zródlem tego zwiazku moze byc zwiazek wyjsciowy jak równiez produkt hydrolizy. 2-amino- -6-hydroksybenzotiazol nie posiada zadnej mutagennej aktywnosci.Wynalazek jest zilustrowany nastepujacymi przykladami.Podane w nich wartosci pKa oznaczono w 66% uwodnio¬ nym dwumetaloformamidzie.Przyklad I. Wytwarzanie N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'-fenylomocznika.Do zawiesiny 16,7 g chlorowodorku 2-amino-6-hydróksy- benzotiazolu, otrzymanego sposobem opisanym w J. Org.Chem., 35,4103 (1970) i 11 g kwasnego weglanu potasu w 300 ml acetonu wkrapla sie mieszajac, roztwór 22,4 g chloromróoczami p-nitrofenylu w 300 ml acetonu. Calosc miesza sie w ciagu okolo 18 godzin, a nastepnie wylewa do 3 litrów wody. Wytracony osad, zawierajacy utworzony w reakcji ó-hydroksybenzotiazolilokarbaminian p-nitro¬ fenylu odsacza sie i przemywa eterem. Zwiazek krystali¬ zuje w postaci pólwodzianu.Analiza elementarna: wartosci obliczone dla C14H19N304S 1/2 H20: C 51,85%, H 2,88%, N 13,33%, wartosci znale¬ zione: C 51,7%, H3,40%, N 12,74%.Do zawiesiny 600 mg powyzszego karbaminianu w 25 ml acetonu wkrapla sie 0,5 ml aniliny. Mieszajac w tempera¬ turze pokojowej dodaje sie za pomoca strzykawki 0,3 ml chlorku trójmetylosililu, a nastepnie calosc ogrzewa w ciagu okolo 18 godzin do wrzenia pod chlodnica zwrotna, otrzy¬ mujac zólto zabarwiony roztwór, który oziebia sie i miesza¬ jac wylewa do wody. Wytracony osad odsacza sie, przemywa i suszy. W osadzie zawarty jest utworzony w reakcji N-2-(6- hydroksybenzotiazolilo)-Nl-fenylomocznik o temperaturze topnienia powyzej 260 °C. Wydajnosc 60%.Charakterystyczne jony fragmentacyjne w spektrografii masowej 285, 212, 192 i 166 m/e. pka=10,9 Analiza elementarna: wartosci obliczone dla C14HUN3O2S C 58,93, H3,89, N 14,73, wartosci znalezione: C 58,34, H 3,76, N 13,76108 429 13 14 £ o fi ' M fi S bO CO 4* O 117 1 I o Ol 117 1 I O O li I o X Os CS in o o o o I111 Ol I I o o o o o I o o o o 7111 I 9 2 ii 1 III I O o eS l o O I I I I I I I I I I I £ < o o o 7 o o o 000 o o i-h o m I T I T j, 11 I i i °« o o o o 00 o I I III I I I I o I I I o o o I I 7 I I NI ied H n ft 0 £ 0 a cd F cd u 0 a rH cl 0 0 T3 cd W) XI CJ cd M fM cd fi 0 fi cd 0) rH 44 O fi CD -4-» xn W < NI osc fi fi 0) W) cd fi F 0 azuj 4* » £ pM CU N f* 0 F cd $H W) 0 u fi 0 0 0 '—' N Tj ar F 0 a fi •¦-i fi 0 •N N a '0 O fi ri ci; ftn cd -4-» fi fi 0 ci 0 NI Tl U OJ % +j Ul cdJ cu £ N B u *o M N Jh fi OJ •N m N c; cd fi N O c/J 3 ft fi ^ B ~--» A CJ cd Fi rrt Sh m 0 S cd B cd W) 0 u M N fi PQ 44 'fi fi l-H fi 1 O) 44 0 (-1 -(6-hyd 0 :otiazoli M ri N n enylom r 4*5 U - (6-met o ^otiazoli M ri N n enylom r 44 u - (6-met 03 S s js 5 z 3 *, s jj ¦3 a tf ¦? ! 8 1 3 w t* y r' •* L « C3 A ej w cd Ol o fi fi o, o ^ T3 —, 43 CM vó u 6 a fi al II cd fi S &-S fi E 4p 000 tf *i u ri ^ ^ ni OOO b ^ 4^ rTiooSi^ l^'otC'4= Vi_i McN^coCNtM M (N ^ « CN Lh fi fi) •N cy ISl res 4^ cd N £ -O fi cd u W) O *^3 a108 429 15 16 W powyzszy sposób otrzymano nastepujace zwiazki: N-2- (ó-hydroksybenzotiazolilo)-N'- (4-metoksyfenylo) mocznik.Charakterystyczne jony fragmentacyjne w spektro¬ grafii masowej 315, 192 i 166 m/e. pKa = 11,1. Tempe- 5 ratura topnienia powyzej 250 °C, wydajnosc 34% wago¬ wych.Analiza elementarna: wartosci obliczone dla C15H13N303S C 57,13%, H4,16%, N 13,33%, wartosci znalezione: C 56,90%, H4,40%, N13,37% ie N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N,- (2-fluorofenylo)mo- cznik.Jednorodny w chromatografii cienkowarstwowej, tempe¬ ratura topnienia powyzej 250 °C, pKa =10,3. 15 Charakterystyczne jony fragmentacyjne w spektografii masowej: 303, 192 i 166 m/e; wydajnosc 65% wagowych.Analiza elementarna, wartosci obliczone dla C14H10FN1 02S: C 55,44%, H 3,32, N 13,85%, wartosci znalezione: C 55,28%, H 3,47,% N13,31%. 20 N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N'- (2-tolilo)mocznik.Jednorodny w chromatografii cienkowarstwowej, temperatura topnienia powyzej 250 °C, pKa =10,6, 25 wydajnosc 68% wagowych.Analiza elementarna, wartosci obliczone dla C15H13N302S 3/4 H20: C 57,88%, H 4,82%, N 13,50%, wartosci znale¬ zione: C 57,42%, H 4,27%, N 13,18%.Przyklad II. Alternatywny sposób wytwarzania 30 N-2-(6-hydroksybenzotiazolilo)-N,-fenylomocznika.Do zawiesiny 152 g 2-amino-6-hydroksybenzotiazolu w 3 litrach acetonu wkrapla sie roztwór 109 g fenyloizocyja- nianu w 150 ml acetonu. Po zakonczeniu wkraplania mie¬ szanine reakcyjna ogrzewa sie w ciagu nocy do wrzenia 35 pod chlodnica zwrotna. Po oziebieniu do okolo 50 °C dodaje sie wegla odbarwiajacego. Mieszanine przesacza sie a do przesaczu dodaje druga porcje 109 g fenyloizocyja- nianu w acetonie. Mieszanine reakcyjna ponownie ogrzewa sie w ciagu 2 godzin do wrzenia pod chlodnica zwrotna. 40 Po oziebieniu wytraca sie osad barwy bialej, zawierajacy N-2-(6-fenylokarbamyloksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocz- nik. Osad odsacza sie i przemywa acetonem. Wydajnosc 74%.Analiza elementarna, wartosci obliczone dla C21H16N403S 45 C 62,38%, H3,96%, N 13,86%, S 7,95%, wartosci znale¬ zione: C 62,30%, H3,97%, N 13,69%, S 7,76%.Temperaturatopnienia powyzej 250 °C. 4 g powyzszego N-2-(s-fenylokarbamyloksybenzotiazo- lilo)-N'-fenylomocznika rozpuszcza sie w 150 ml bezwodne- 50 go metanolu. Do roztworu dodaje sie, mieszajac, 10% zawiesine 0,5 g metanolu sodu w metanolu. Calosc miesza sie w ciagu nocy w temperaturze pokojowej. Chromato¬ grafia cienkowarstwowa wykazuje 50% hydrolitycznie odszczepienie grupy karbamyloksylowej. Nastepnie 55 mieszanine reakcyjna powoli podgrzewa sie, sledzac za- pomoca chromatografii cienkowarstwowej postep hydro¬ lizy. Po dwóch godzinach ogrzewania w 45 °C hydroliza zachodzi w 100%. Wówczas mieszanine reakcyjna oziebia sie i ostroznie zakwasza do pH 4 za pomoca 10% wpdnego 60 roztworu kwasu solnego. Wytracony N-2- (hydroksybenzo- tiazolilo)-N'-fenylomocznik odsacza sie i przemywa kolejno metanolem i eterem. Widmo NMR produktu wykazuje nieobecnosc grupy fenylokarbamyloksylowej, potwierdzona przesunieciem absorbcji w nadfiolecie zwiazku w roztwo- 65 rach kwasnych i zasadowych. Wytworzony N-2-(6-hydro- ksybenzotiazolilo)-N,-fenylomocznik ma nastepujaca charak¬ terystyke: temperatura topnienia powyzej 250 °C, jony fragmentacyjne w spektografii masowej 285, 212, 192 i 166 m/e, pKa = 10,9 (662 DMF).Analiza elementarna: wartosci obliczone dla C^H^N^S: C 58,93%, H3,89%, N 14,73%, wartosci znalezione: C 58,34—%, H3,76%, N 13,76%.Przyklad III. Mieszanine zawierajaca 100 mg N-2- (6-fenylokarbamyloksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocznik, 100 mg metanolanu sodu i 25 ml metanolu ogrzewa sie w ciagu 1/2 godziny do wrzenia pod chlodnica zwrotna.Po uplywie tego czasu chromatografia cienkowarstwowa wykazuje brak w mieszaninie reakcyjnej produktu wyjscio¬ wego i to, ze produktem reakcji jest odpowiedni zwiazek 6-hydroksy. Dalsze ogrzewanie w ciagu 18 godzin mieszaniny reakcyjnej do wrzenia pod chlodnica zwrotna nie powoduje rozkladu powstalego w reakcji N-2-(6-hydroksybenzotia- zolilo)-N,-fenylomocznika.Przyklad IV. Stosuje sie sposób analogiczny do opisanego w przykladzie III, z tym, ze metanolan sodu zastepuje sie 20 mg wodorotlenku potasu. Po 6 godzinach reakcji chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze hydroliza grupy 6-fenylogkarbamyloksylowej nie jest pelna. Ogrzewanie do wrzenia pod chlodnica zwrotna kon¬ tynuuje sie w ciagu dalszych 12 godzin. Po uplywie tego czasu stwierdza sie pelna hydrolize i pelna konwersje mate¬ rialu wyjsciowego do odpowiedniego zwiazku 6-hydroksy.Przyklad V. Stosuj mc sposób analogiczny do opi¬ sanego w przykladzie III, z tym, ze zamiast metanolanu sodu stosuje sie okolo 35 mg weglanu potasu. Okresowe badanie mieszaniny reakcyjnej wykazuje, ze pelna hydroliza grupy 6-fenylokarbamyloksylowej zachodzie w ciagu 18 godzin.Przyklad VI. Stosuje sie sposób analogiczny do opisanego w przykladzie III, z tym, ze zamiast metanolu stosuje sie 25 ml wody. Mieszanine reakcyjna podgrzewa sie powoli. Material wyjsciowy przechodzi do roztworu przy okolo 80°C. Ogrzewanie mieszaniny do wrzenia pod chlodnica zwrotna powoduje pelna hydrolize grupy 6-feny¬ lokarbamyloksylowej w ciagu godziny.Przyklad VII. Stosuje sie sposób analogiczny do opisanego w przykladzie III, z tym, ze w miejsce metanolanu sodu stosuje sie 0,35 ml trójetyloaminy. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze ogrzewanie do wrzenia pod chlodnica zwrotna powoduje pelna hydrolize w ciagu 6 godzin.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N,-fenylomoczników o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, grupe alkoksylowa o 1—3 atomach wegla lub atom chlorowca, znamienny tym, ze 2-fenoksykarbonyloami- no-6-hydroksybenzotiazol o ogólnym wzorze 2 sililuje sie w temperaturze —20 do 111 °C w organicznym rozpuszczal¬ niku, ogrzewa sie mieszanine reakcyjna do wytworzenia trójmetylosililoksy-2-benzotiazoliloizocyjanianu, który na¬ stepnie poddaje sie reakcji z anilina o wzorze 3, w którym R ma wyzej podane znaczenie, po czym zwiazek poddaje sie hydrolizie. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2- (4-ni- trofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol poddaje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i anilina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzi sie mieszanine108 429 17 raeakcyjna za pomoca wody i otrzymuje sie N-2- (6-hydro- ksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocznik. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2-(4- nitrofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol pod¬ daje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i z 4-metoksy- 5 anilina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzi sie mieszanine reakcyjna za pomoca wody i otrzymu¬ je sie N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N'- (4-metoksyfeny- lo)mocznik. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2-(4- 10 nitrofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol pod¬ daje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i 2-fluoroanilina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzi sie mieszanine reakcyjna za pomoca wody i otrzymuje sie N-2- (ó-hydroksybenzotiazolilo^N'- (2-fluorofenylo)mocz- 15 nik. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2- (4- nitrofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol pod¬ daje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i 2-mctyloaniIina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzie sie 20 mieszanine reakcyjna za pomoca wody i otrzymuje sie N-2- (6-hyd^oksybenzotiazolilo)-N,-(2-toMlo)mocznik. 6. Sposób wytwarzania nowych N-2- (6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'-fenylomoczników o ogólnym wzorze 1, w któ¬ rym R oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—3 ato- 25 18 mach wegla, grupe alkoksylowa o 1—3 atomach wegla lub atom chlorowca, znamienny tym, ze N-2-(6-fenylokar- bamyloksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocznik o ogólnym wzorze 4, w którym R ma wyzej podane znaczenie poddaje sie hydrolizie za pomoca zasady takiej jak wodorotlenki i weglany metalu alkalicznego, alkoholany, wodorotlenek amonu i wodorotlenki alkiloamoniowe o 1—2 atomach wegla w grupie alkilowej, w obojetnym rozpuszczalniku, w temperaturze nie wyzszej niz 100 °C. 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze N-2- (6-fenylokarbamyloksyberizotiazoHlo)-N'-fenylomocznik poddaje sie reakcji z metanolanem sodu w metanolu i otrzy¬ muje sie N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocz- nik. 8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze N-2- [6- (4-metoksyfenylo)karbamyloksybenzotiazolilo] -N'-4- metoksyfenylomocznik poddaje sie reakqi z metanolanem sodu w metanolu i otrzymuje sie N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'-4-metoksyfenylomocznik. 9. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze N-2- [6- (2-fluorofenylo) karbamyloksybenzotiazolilo [-N'-(2-fluoro- fenylo)mocznik poddaje sie reakcji z metanolanem sodu w metanolu i otrzymuje sie N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)- N'- (2-fluorofenylo)mocznik.HO h0^0$c-nh-Lh-^R WzOr 1 5 ° r1 Wzór 2 ^Ghmh-CO-O^S^ nh_co_nh j^ Wzór 3 R Wzór 4108 429 — 9 N02-^C"yO-C-CL /VN HO \ V^S' C-NH, HO/V^S- ^1 o C-NH-C-O- (CH3)3SiCl O NO, y lP \ CIGptO (CH3,3S,-oU^-N=C7CH^0^ss^OpN02 k^3-NH; H20 - HOA^s 0 „/R C-NH-C-NH^^ Schemat 1 LZG Z-d 3, z. 769/1400/80, n. 95+20 egz.Cena 45 zl PL PL

Claims (9)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N,-fenylomoczników o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, grupe alkoksylowa o 1—3 atomach wegla lub atom chlorowca, znamienny tym, ze 2-fenoksykarbonyloami- no-6-hydroksybenzotiazol o ogólnym wzorze 2 sililuje sie w temperaturze —20 do 111 °C w organicznym rozpuszczal¬ niku, ogrzewa sie mieszanine reakcyjna do wytworzenia trójmetylosililoksy-2-benzotiazoliloizocyjanianu, który na¬ stepnie poddaje sie reakcji z anilina o wzorze 3, w którym R ma wyzej podane znaczenie, po czym zwiazek poddaje sie hydrolizie.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2- (4-ni- trofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol poddaje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i anilina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzi sie mieszanine108 429 17 raeakcyjna za pomoca wody i otrzymuje sie N-2- (6-hydro- ksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocznik.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2-(4- nitrofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol pod¬ daje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i z 4-metoksy- 5 anilina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzi sie mieszanine reakcyjna za pomoca wody i otrzymu¬ je sie N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N'- (4-metoksyfeny- lo)mocznik.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2-(4- 10 nitrofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol pod¬ daje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i 2-fluoroanilina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzi sie mieszanine reakcyjna za pomoca wody i otrzymuje sie N-2- (ó-hydroksybenzotiazolilo^N'- (2-fluorofenylo)mocz- 15 nik.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 2- (4- nitrofenoksykarbonyloamino)-6-hydroksybenzotiazol pod¬ daje sie reakcji z chlorkiem trójmetylosililu i 2-mctyloaniIina w acetonie i w temperaturze wrzenia, po czym chlodzie sie 20 mieszanine reakcyjna za pomoca wody i otrzymuje sie N-2- (6-hyd^oksybenzotiazolilo)-N,-(2-toMlo)mocznik.

6. Sposób wytwarzania nowych N-2- (6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'-fenylomoczników o ogólnym wzorze 1, w któ¬ rym R oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—3 ato- 25 18 mach wegla, grupe alkoksylowa o 1—3 atomach wegla lub atom chlorowca, znamienny tym, ze N-2-(6-fenylokar- bamyloksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocznik o ogólnym wzorze 4, w którym R ma wyzej podane znaczenie poddaje sie hydrolizie za pomoca zasady takiej jak wodorotlenki i weglany metalu alkalicznego, alkoholany, wodorotlenek amonu i wodorotlenki alkiloamoniowe o 1—2 atomach wegla w grupie alkilowej, w obojetnym rozpuszczalniku, w temperaturze nie wyzszej niz 100 °C.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze N-2- (6-fenylokarbamyloksyberizotiazoHlo)-N'-fenylomocznik poddaje sie reakcji z metanolanem sodu w metanolu i otrzy¬ muje sie N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)-N'-fenylomocz- nik.

8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze N-2- [6- (4-metoksyfenylo)karbamyloksybenzotiazolilo] -N'-4- metoksyfenylomocznik poddaje sie reakqi z metanolanem sodu w metanolu i otrzymuje sie N-2-(6-hydroksybenzo- tiazolilo)-N'-4-metoksyfenylomocznik.

9. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze N-2- [6- (2-fluorofenylo) karbamyloksybenzotiazolilo [-N'-(2-fluoro- fenylo)mocznik poddaje sie reakcji z metanolanem sodu w metanolu i otrzymuje sie N-2- (6-hydroksybenzotiazolilo)- N'- (2-fluorofenylo)mocznik. HO h0^0$c-nh-Lh-^R WzOr 1 5 ° r1 Wzór 2 ^Ghmh-CO-O^S^ nh_co_nh j^ Wzór 3 R Wzór 4108 429 — 9 N02-^C"yO-C-CL /VN HO \ V^S' C-NH, HO/V^S- ^1 o C-NH-C-O- (CH3)3SiCl O NO, y lP \ CIGptO (CH3,3S,-oU^-N=C7CH^0^ss^OpN02 k^3-NH; H20 - HOA^s 0 „/R C-NH-C-NH^^ Schemat 1 LZG Z-d 3, z. 769/1400/80, n. 95+20 egz. Cena 45 zl PL PL