Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych aminoglikozydów 2-dezoksystreptami- nowych, bedacych srodkami przeciwbakteryjnymi.Aminoglikozydy 2-dezoksystreptaminowe sa dobrze znanymi srodkami przeciwbakteryjnymi, otrzymy- 5 wanymi na drodze fermentacji lub metoda pól- syntetyczna. Do srodków tych naleza wartosciowe preparaty chemoterapeutyczne, takie jak kanamy- cyna, gentamycyna, tobramycyna, rybostamycyna i neomycyna. 10 Nowe srodki przeciwbakteryjne wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku stanowia serie aminogli¬ kozydów 2-dezoksystreptaminowych, w których we wzorze, w polozeniu 1 grupa aminowa podsta¬ wiona jest grupa alkilowa, która z kolei przy ato¬ mie wegla innym niz zwiazany z grupa aminowa podstawiona jest jedna lub wieksza liczba grup hydroksylowych. Zwiazki te charakteryzuja sie aktywnoscia przeciwko zakazeniom wywolanym 2Q przez rózne drobnoustroje Gram-dodatnie i Gram- -ujemne, w tym równiez przeciw zakazeniom dróg moczowych u ludzi i zwierzat.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku wykazuja korzystniejsze cechy w porównaniu 25 z aminoglikozydami 2-dezoksystreptaminowymi za¬ wierajacymi niepodstawiona grupe aminowa w po¬ lozeniu 1 pierscienia 2-dezoksystreptaminowego.Stwierdzono, ze korzystniejszym cechom towarzy¬ szy jednoczesnie zmniejszona toksycznosc nowych 30 pochodnych w porównaniu z toksycznoscia wielu znanych aminoglikozydów.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych aminoglikozydów 2-dezoksystreptami¬ nowych o wzorze ogólnym 1, w którym Ri ozna¬ cza pierwszorzedowa grupe alkilowa o 3—7 ato¬ mach wegla, z których przynajmniej dwa inne niz atom wegla polaczony z grupa aminowa podsta¬ wione sa grupa hydroksylowa lub R1 oznacza dru- gorzedowa grupe alkilowa o 3—7 atomach wegla, z których przynajmniej jeden inny niz atom wegla polaczony z grupa aminowa, podstawiony jest gru¬ pa hydroksylowa, R2 oznacza grupe aminowa lub hydroksylowa, kazdy z podstawników R3 oznacza grupe hydroksylowa, R4 i R5 oznaczaja atomy wo¬ doru, a R6 oznacza grupe 3-amino-3-dezoksy-a-D- -glikopiranozylowa, a R7 oznacza atom wodoru lub nizsza grupe alkilowa, zawierajaca do 4 atomów wegla oraz dopuszczalnych do stosowania w far¬ macji addycyjnych soli tych zwiazków z kwasami.Okreslenie „pierwszorzedowa grupa alkilowa" oznacza grupe alkilowa przylaczona niepodstawiona grupa metylenowa do grupy aminowej, która je¬ zeli sklada sie z wiecej niz 3 atomów wegla to moze byc grupa alkilowa o lancuchu prostym lub rozgalezionym, okreslenie „drugorzedowa grupa alkilowa" oznacza grupe alkilowa, w której atom wegla przylaczony do grupy aminowej,' laczy sie jednoczesnie z dwoma atomami wegla lub z dwo¬ ma lancuchami alkilowymi. 108 094108 094 3 4 Korzystna grupe zwiazków wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku stanowia zwiazki, w któ¬ rych we wzorze 1, R7 oznaczaja atomy wodoru, a kazdy z podstawników, R1 oznacza grupe alkilo¬ wa o 3—5 atomach wegla, korzystnie podstawiona grupa hydroksylowa, a zwlaszcza grupe propylo¬ wa. Szczególnie korzystnym podstawnikiem grupy 1-aminowej jest grupa dwuhydroksypropylowa, na przyklad, grupa 2,3-dwuhydroksypropylowa, lub 1,3-dwuhydroksypropylowa-2.Szczególnie korzystnymi zwiazkami, które wy¬ twarza sie sposobem wedlug wynalazku sa 1-N- -(2,3-dwuhydroksypropylo -kanamycyna A i B oraz l-N-(l,3-dwuhydroksypropylo-2-) kanamy¬ cyna A i B.Sole addycyjne z kwasami zwiazków wytwarza¬ nych sposobem wedlug wynalazku, dopuszczone do stosowania w farmacji, otrzymuje sie przy uzyciu kwasów, które daja takie sole addycyjne, zawie¬ rajace anion dopuszczony do stosowania w far¬ macji. Przyklady takich soli to chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, kwasny siarczan, fosfo¬ ran, kwasny fosforan, octan, maleinian, funaron, bursztynian, mleczan, winian, cytrynian, glikonian, cukrzan, p-toluenosulfonian oraz weglany.Nowe zwiazki o wzorze ogólnym 1, wytwarza sie sposobem wedlug wynalazku przez alkilowanie zwiazku o wzorze ogólnym 2, w którym R2, R3, R4, R5, R6 i R7 maja wyzej podane znaczenie, oraz w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych, innych niz grupa aminowa w poloze¬ niu 1, moze byc ewentualnie ochroniona. Po prze¬ prowadzeniu alkilowania usuwa sie ewentualne grupy ochraniajace i izoluje sie zwiazek o wzorze ogólnym 1.Ewentualne grupy ochraniajace wolne grupy aminowe w zwiazku o wzorze ogólnym 2 mozna wprowadzic za pomoca reakcji selektywnie dzia¬ lajacego w odniesieniu do wolnych grup amino¬ wych reagenta, i nastepnie latwo dajacych sie usunac za pomoca zwykle stosowanych sposobów, na przyklad za pomoca hydrolizy i wodorolizy.Przyklady odpowiednich grup ochraniajacych sa grupa formylowa, acetylowa, trójfluoroacetylowa, metoksykarbonylowa, III-rzed- butyloksykarbony- lowa i benzyloksykarbonyIowa.Alkilowanie mozna przeprowadzic zwykle stoso¬ wanymi sposobami , na przyklad na drodze redu¬ kujacego alkilowania przy uzyciu odpowiedniego hydroksypodstawionego aldehydu lub ketonu lub, jesli we wzorze ogólnym 1 podstawnik R1 oznacza pierwszorzedowa grupe alkilowa, przy uzyciu od¬ powiedniego hydroksypodstawionego kwasu prze¬ prowadza sie acylowanie, a nastepnie uzyskana po¬ chodna acylowana poddaje sie redukcji (na przy¬ klad przy uzyciu boroetanu).Oczywiscie, w przypadku wystepowania w zwiazku o wzorze ogólnym 2 innych wolnych grup aminowych poza grupa aminowa w polozeniu 1, reakcja zachodzi równiez z tymi pozostalymi gru¬ pami aminowymi i niezbedrie staje sie oddzielenie pozadanej 1-N-podstawionej pochodnej z miesza¬ niny produktów. Zabieg ten mozna przeprowadzic znanymi sposobami, na przyklad za pomoca chro¬ matografii jonowymiennej. Jednak korzystnie sto¬ suje sie ochrone pewnych lub najkorzystniej wszy¬ stkich grup aminowych, innych niz grupa w polo¬ zeniu 1, w czasie przeprowadzania reakcji alkilo¬ wania, w celu uproszczenia procesu koncowej izo- 5 lacji produktu. W takim przypadku niezbedne jest wprowadzenie dodatkowego etapu usuwania grup ochraniajacych.Tak wiec, jednym ze sposobów wytwarzania zwiazków o wzorze ogólnym 1, jest poddanie selek¬ tywnie ochranianej pochodnej aminoglikozydowej o wzorze ogólnym 2, posiadajacej wolna grupe aminowa w polozeniu 1, reakcji z aldehydem lub ketonem korzystnie z ketonem uzytym w nadmia¬ rze. Powstajaca w poczatkowym etapie zasade Schiffa, jednoczesnie lub w nastepnym etapie, pod¬ daje sie reakcji i otrzymuje produkt 1-N-pod- stawiony.Reakcje mozna przeprowadzac przy uzyciu bo¬ rowodorku sodowego lub cyjanoborowodorku so¬ dowego jako czynnika redukujacego. Czynnik re¬ dukujacy dodaje sie do mieszaniny reakcyjnej zwykle przy wartosci pH pomiedzy 4 i 7 i tym samym umozliwia sie przeprowadzenie reakcji w jednym etapie. Sposobem alternatywnym mie¬ szanine aminoglikozydu o wzorze ogólnym 2 i al¬ dehydu lub ketonu poddaje sie reakcji katalitycz¬ nego wodorowania przeprowadzanej zwykle stoso¬ wanymi metodami.Reakcje przeprowadza sie zwykle przy uzyciu odczynników rozpuszczonych w rozpuszczalniku obojetnym w warunkach reakcji, na przyklad, w wodzie, uwodnionym dioksanie lub uwodnio¬ nym metanolu, w temperaturze pomiedzy 0°C i w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Okres czasu konieczny do zakonczenia reakcji zalezy od wlasciwosci odczynników, rozpuszczalnika i stoso¬ wanej temperatury. Stwierdzono jednak, ze re¬ akcja pomiedzy aminoglikozydem o wzorze ogól¬ nym 2 i hydroksypodstawionym aldehydem lub ketonem (na przyklad, glicerynoaldehydem lub dwuhydroksyacetonem), w obecnosci nadmiaru cy¬ janoborowodorku sodowego, przy wartosci pH po¬ miedzy 4 i 7, zwykle zachodzi calkowicie w ciagu 2 dni, jesli przeprowadza sie ja w uwodnionym acetonie w temperaturze 60°C.W drugim etapie usuwa sie ewentualnie grupy ochraniajace grupe aminowa, jesli wystepuja one w czasteczce aminoglikozydu. Dobór warunków za¬ pewniajacych calkowite usuniecie grup ochrania¬ jacych grupy aminowe zalezy od wlasciwosci gru¬ py ochraniajacej oraz od otoczonej ochraniajacej grupy aminowej. Reakcje usuwania grup ochra¬ niajacych przeprowadza sie w róznych srodowis¬ kach zarówno bezwodnych jak i uwodnionych, oraz w szczególnosci w przypadkach w srodowis¬ kach kwasnych lub zasadowych o róznych ste¬ zeniach.Szczególnie korzystna grupa ochraniajaca dla zwiazków o wzorze ogólnym 2 jest grupa formylowa.Grupe te latwo usuwa sie za pomoca lagodnej hydrolizy zasadowej, na przyklad, za pomoca dzia¬ lania rozcienczonym roztworem wodorotlenku so¬ dowego, w temperaturze pokojowej w ciagu kilku godzin lub przez ogrzewanie z octanem hydrazyny albo w warunkach lagodnej hydrolizy kwasnej na 15 20 25 30 35 40 4b 50 55 €0108 094 5 przyklad, przy uzyciu 5 n roztworu kwasu solne¬ go w temperaturze pokojowej w ciagu kilku godzin.Odpowiednia grupa jest równiez grupa III rzed.- -butyloksykarbonyIowa, która usuwa sie w warun¬ kach kwasowych, na przyklad za pomoca dzialania kwasem trójfluorooctowym, w warunkach bezwod¬ nych, w temperaturze pokojowej w czasie krótszym niz 45 minut, jak równiez grupa benzyloksykarbo- nylowa, która usuwa sie za pomoca katalitycznej wodorolizy, na przyklad za pomoca wodorolizy w wodnym roztworze kwasu octowego, w obecnosci palladu osadzonego na weglu jako katalizatora, w temperaturze 30°C, pod cisnieniem 3,4 atmosfery w ciagu kilku godzin, oraz grupa acetylowa, która usuwa sie przez ogrzewanie z 3 n roztworem wodo¬ rotlenku sodowego w temperaturze 80—90°C w cia¬ gu kilku godzin. Po- usunieciu grup ochraniajacych produkt wydziela sie zwykle stosowanymi sposo¬ bami, na przyklad przez odsaczenie lub oddestylo¬ wanie rozpuszczalnika, po czym surowy produkt oczyszcza sie na drodze krystalizacji lub za pomoca chromatografii.Szczególnie korzystna ochroniona aminoglikozy- dylowa pochodna o wzorze ogólnym 2, stosowana w sposobie wedlug wynalazku do wytwarzania po¬ chodnych kanamycyny A o wzorze ogólnym 1, w którym R7 oznacza atom wodoru, a R2 oznacza gru¬ pe hydroksylowa jest 3, 3", 6' -trój-N-formylokana- mycyna A.Odpowiednia pochodna 2, 3, 3" 6'-cztero-N-formy- lokanamycyna B korzystnie stosuje sie do wytwa¬ rzania 1-N-podstawionych pochodnych kanamycy¬ ny B o wzorze ogólnym 1, w którym R2 oznacza grupe aminowa, a R3, R4, R5, R6 i R? maja wyzej podane znaczenie. Do tych celów odpowiednie sa znane równiez selektywnie ochronione pochodne kanamycyny A i B na przyklad 3", 6'-N-acetyloka- namycyna A, 2', 3", 6'-trój-N-fluoroacetylokanamycy- na B i 3", 6-dwu-N-trójfluoroacetylokanamycyna A.Aminoglikozydy i ochronione pochodne amino- glikozydów o wzorze ogólnym 2 sa zwiazkami zna¬ nymi i uprzednio opisanymi w literaturze. Na przyklad, rózne N-formylowane na wszystkich grupach aminowych aminoglikozydy, w tym 3,3", 6* -trój-N-formylokanamycyne A i 2', 3,3", 6* -cztero- -N-formylokanamycyne B, opisano w belgijskim opisie patentowym nr 817546.Podobne pochodne innych aminoglikozydów moz¬ na wytwarzac sposobem analogicznym. Pochodne, w których ochroniona jest grupa 6'-aminowa sa dobrze znane i sposoby ich wytwarzania przedsta¬ wiono w brytyjskim opisie patentowym nr 1401220 i opisach patentowych RFN nr 2311524, 2350169 i 2512587.Hydroksypodstawione aldehydy i ketony odpo¬ wiednie do stosowania w sposobie wedlug wyna¬ lazku do wytwarzania zwiazków o wzorze ogól¬ nym 1, sa zwiazkami latwo dostepnymi. Na przy¬ klad, jesli stosuje sie D-glicerynoaldehyd, to otrzymuje sie produkt o wzorze ogólnym 1, w któ¬ rym R1 oznacza grupe (S) 2,3-dwuhydroksypropy- lowa. W reakcji mozna stosowac równiez Inne latwo dostepne aldozy i dezoksyaldozy, na przy¬ klad, D-erytroze, D-ryboze i 2-dezoksy-D-ryboze. 6 Podobnie mozna stosowac dwuhydroksyaceton w celu wytwarzania pochodnej 1-N- 1,3-dwuhydro- ksypropylowej-2) oraz hydroksyaceton (acetol) do wytwarzania odpowiedniej pochodnej 1-hydroksy- s propylowej-2.Zwiazki o wzorze ogólnym 1, jak równiez zwiaz- . ki o wzorze ogólnym 2, moga wystepowac w róz¬ nych postaciach konformacyjnych i zakres sposo¬ bu wedlug wynalazku nie ogranicza sie do której¬ kolwiek z tych postaci. Ogólnie, kazdy z pierscieni wystepuje w postaci krzeselkowej i kazdy z pod¬ stawników przyjmuje polozenie ekwatorialne w odniesieniu do pierscienia. Ponadto, lancuch gliko- zydowy pomiedzy pierscieniem heksopiranozylo- wym i pierscieniem 2-dezoksystreptaminowym zwykle przylaczony jest w polozeniu a w odnie¬ sieniu do grupy wzorcowej. Ponadto podstawnik hydroksyalkilowy grupy 1-aminowej posiada jeden lub wieksza liczbe asymetrycznych atomów wegla, 20 przy czym kazdy z nich moze wystapic w konfi¬ guracji R lub S albo w postaci mieszaniny izome¬ rów optycznych.Badania in vitro przeciwbakteryjnej aktywnosci 25 zwiazków otrzymywanych sposobem wedlug wy¬ nalazku przeprowadza sie przez okreslenie naj¬ mniejszego stezenia badanego zwiazku hamujace¬ go wzrost drobnoustrojów. Badanie to przeprowa¬ dza sie w odpowiednim srodowisku, w którym wzrastaja poszczególne drobnoustroje. W praktyce stosuje sie plytki agarowe, z których kazda zawie¬ ra badany zwiazek w danym stezeniu. Plytki te szczepi si^ standardowa iloscia komórek testowa¬ nego drobnoustroju, po czym plytki inkubuje sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 37°C. Nastepnie 35 plytki ocenia sie, obserwujac obecnosc lub brak wzrostu drobnoustroju i oznaczajac odpowiednia wartosc najmniejszego stezenia hamujacego(M.LC).Jako testowe drobnoustroje stosuje sie nastepu¬ jace szczepy: Escherichia coli, Klabsiella pneumo- 40 niae, Prateus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aurea i Streptococcus faecalis.Badanie in vivo przeprowadza sie podajac pod¬ skórnie badane zwiazki myszom zakazonym szcze¬ pem Escherichia coli. 45 Kazdy zwiazek podaje sie w seriach dawek gru¬ pom myszy i jego aktywnosc okresla sie jako dawke, przy której chroni sie przed choroba 50% myszy zakazonych szczepem Escherichia coli w ciagu 72 godzin. 50 Dane porównawcze zwiazków otrzymanych spo¬ sobem wedlug wynalazku ze zwiazkami znanymi o podobnej budowie przedstawiaja wyniki trzech oddzielnych badan. 55 W badaniu A in vitro aktywnosc przeciwbakte- ryjna dwóch zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku, porównano z aktywnoscia ka¬ namycyny A i B przeciwko pieciu opornym szcze¬ pom Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeru- eo ginosa jest glównym patogenem, przeciwko które¬ mu, w leczeniu chorób ludzi stosuje sie zwykle antybiotyki aminoglikozydowe, przy czym coraz powazniejszym problemem jest pojawienie sie wsród nich szczepów opornych na stosowanie ami- 65 noglikozydów.108 094 Jednak glówna zaleta zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku polega na ich mniej¬ szej toksycznosci, w porównaniu z dotychczas sto¬ sowanymi aminoglikozydami. Objawami toksycz¬ nego dzialania aminoglikozydów, które najczesciej zaobserwowano, sa utrata sluchu lub uszkodzenia nerek.W badaniu B przedstawiono wyniki testu okres¬ lajacego stopien dzialania zwiazku na tkanke ner¬ kowa. Wyniki odnosza sie do jedenastu badanych zwiazków i do szesciu zwiazków otrzymanych spo¬ sobem wedlug wynalazku. Nalezy zaznaczyc, ze netylmycyna czyli 1-N-etylosysomycyna uwazana jest za najlepszy sposród zwiazków ujawnionych.Amikacyna jest zwiazkiem znanym z opisu paten¬ towego St. Zjedn. Ameryki nr 3 781 268, zas wszys¬ tkie pozostale zwiazki mozna uwazac za „antybioty¬ ki macierzyste".W badaniu C zwiazek z przykladu XIX byl ba¬ dany bezposrednio w porównaniu z amikacyna, ka- nomycyna i kanamycyna B. Mozliwosc uszkodzenia sluchu przy stosowaniu zwiazku z przykladu XIX jest wyraznie mniejsza w porównaniu z innymi zwiazkami uzytymi w badaniach.A. Najmniejsze stezenie zwiazków hamujace oper¬ ne szczepy Pseudomonas aeruginosa.Tablica 1 8 Tablica 2 Numer n szczepu 48 52 53 54 56 Najmniejsze stezenie zwiazków hamuja¬ ce wzrost drobnoustrojów mcg/ml i Zwiazek z przykladu XVIII 3,1 3,1 3,1 6,25 6,25 Kanamy¬ cyna A 50 50 100 100 50 Zwiazek z przykladu XIX 1,56 1,56 3,1 3,1 1,56 Kanamy-| cyna ! 12,5 12,5 25 25 . 12,5 25 30 50 B. Oslona wiazaca tkanka nerkowa.Sposób postepowania jest zasadniczo taki sam jak opisany przez Kunin'a w Journal of Infections Di- seases, 121, 55 (1970). Nerke królika homogenizuje sie w stezeniu 12,5% w buforowym roztworze fos¬ foranu o wartosci pH=8. Roztwór badanego zwiaz¬ ku o stezeniu 20 mcg/ml przygotowuje sie w homo- genacie tkanki i jego dzialanie przeciwbakteryjne w stosunku do Bacillus subtilis, mierzy sie stosujac standardowa technike plytkowa i okresla aktywnosc przeciwbakteryjna na podstawie rozmiarów obszaru hamowania. Nastepnie mierzy sie aktywnosc prze- 55 ciwbakteryjna badanego zwiazku, w tych samych warunkach, lecz w nieobecnosci tkanki nerkowej.Na podstawie otrzymanych dwóch cyfr, mozna obliczyc procent hamowania aktywnosci przeciw- bakteryjnej, spowodowanego tkanka nerkowa.Stwierdzono, ie im bardziej toksyczny jest anty¬ biotyk amirioglikozydowy* tym silniej wiaze sie on z tkanka nerkowa i wskutek tego zwieksza sie pro¬ cent hamowania aktywnosci przeciwbakteryjnej. 65 Badany zwiazek ribostamycyna streptomycyna kanamycyna A butyrosyna amikacyna kanamycyna B tobramycyna i netylmycyna 3', 4'-dwudezoksykana- mycyna B gentamycyna ! neomycyna zwiazek z przykladu I | zwiazek z przykladu II zwiazek z przykladu III zwiazek z przykladu IV zwiazek z przykladu V zwiazek z przykladu XI i zwiazek z przykladu XVII zwiazek z przykladu XVIII zwiazek z przykladu XIX Procent hamowania dzialania przeciw- bakteryjnego 55 57 .58 58 61 69 • 73 ¦ 76 77 81 81 38 33 32 34 37.' 48 52 42 46 C. Oslona przeciw uszkodzeniu sluchu u swinek morskich.Wybiera sie grupe skladajaca sie z 4—7 bialych swinek morskich w 48 godzin po urodzeniu. W ka¬ zdym z eksperymentów jedna grupa jest grupa kon¬ trolna, zas zwierzetom z innych grup wstrzykuje sie podskórnie badany zwiazek. Kazdego dnia pod¬ czas eksperymentu i tuz przed zastrzykiem kazde zwierze jest wystawione na impulsy dzwiekowe o czestotliwosci 12 kHz. Odnotowuje sie najmniejsze natezenie dzwieków mierzone w decybelach odle¬ glosci 30,5 cm, przy którym zwierze wykazuje od¬ ruch Preyersa (drganie uszu). Bardziej toksyczne zwiazki powoduja utrate sluchu, która prowadzi do odpowiedniego zwiekszenia dawki az do progu na¬ tezenia odruchu Preyersa. Na ogól wynik jest wi¬ doczny w ciagu 20 dni. Amikacyna zwieksza znacz¬ nie utrate sluchu po 15—17 dniach, w dawkach 150 mg/kg dziennie, podczas gdy zwiazek z przykladu XIX stosowany w takiej samej dawce nie wska¬ zuje na utrate sluchu. Kanamycyna A stosowana w dawce 200 mg/kg dziennie powodowala calkowita gluchote, po 14—16 dniach, zas kanamycyna B sto¬ sowana w dawce 100 mg/kg dziennie powodowala calkowita gluchote po 14—15 dniach.Wykres na rysunku przedstawia bezposrednie po¬ równani© amikacyny ze zwiazkiem z przykladu XIX.Zwiazek z przykladu XIX jest oznaczony numerem kodowym UK-31 214.W celu stosowania u ludzi, przeciwbakteryjne zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku mozna poilawac w postaci czystej lub w mieszani-108 094 9 10 nie z farmaceutycznymi nosnikami dobranymi w zaleznosci od drogi podawania i zwykle stosowanej praktyki farmaceutycznej. Na przyklad, zwiazki te mozna podawac doustnie w postaci tabletek zawie¬ rajacych takie dodatki jak skrobia i laktoza w po- 5 staci kapsulek zawierajacych czysty zwiazek albo zwiazek w mieszaninie z dodatkami w postaci ply¬ nów albo zawiesin zawierajacych poza tym czynniki smakowe i barwiace. Zwiazki te mozna równiez sto¬ sowac w postaci iniekcji pozajelitowych, na przyk¬ lad dozylnie, domiesniowo lub podskórnie.W celu podawania pozajelitowego zwiazki otrzy¬ mane sposobem wedlug wynalazku, najlepiej sto¬ suje sie w postaci jalowego roztworu wodnego, któ¬ ry ponadto moze zawierac inne rozpuszczone sklad¬ niki, na przyklad sole lub glikoze, które powoduja, ze roztwór jest izotoniczny.Przy podawaniu ludziom nalezy uwzglednic to, aby wielkosc dziennej dawki przeciwbakteryjnego zwiazku otrzymanego sposobem wynalazku byla po¬ równywalna & dawkami arainoglikozydowych czyn¬ ników przeciwbakteryjnych stosowanych obecnie na przyklad 0,1-50 mg/kg (w dawkach podzielonych) przy podawaniu pozajelitowym lub 10-100 mg/kg (w dawkach podzielonych) przy podawaniu do¬ ustnym. Tak wiec tabletki lub kapsulki, które powinny zawierac 0,1—1 g zwiazku aktywnego pod¬ daje sie doustnie cztery razy dziennie, podczas gdy pozajelitowo podaje sie dziennie 10—500 mg zwiazku aktywnego. Wielkosc dawki najbardziej odpowiedniej dla danego pacjenta okresla sie bio¬ rac pod uwage wiek, wage i wrazliwosc pacjenta.Podane powyzej dawki stanowia przyklady sred¬ nich wielkosci. Oczywiscie, jesli zachodzi potrzeba, to w indywidualnych przypadkach stosuje wyzsze lub nizsze dawki. destylowuje sie rozpuszczalnik i pozostalosc chro- matografuje na kolumnie wypelnionej zywica jono¬ wymienna Amberlite CG-50 (postac NH4+), eluujac roztworem amoniaku o wzrastajacym stezeniu od 0 do 0,1 n i otrzymuje 66 mg (67%) 1-N- [(S)-2,3- -dwuhydroksypropylo] kanamycyny A. Wartosc Rf otrzymanego zwiazku w 1 m wodnym roztworze chlorku sodowego wynosi 0,27 (w tych warunkach wartosc Rf kanamycyny A wynosi 0,21). Wartosc Rf w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amo¬ niaku w stosunku 1 :2 wynosi 0,70 dla kanamy¬ cyny A wynosi 0,70.Analiza elementarna: dla wzoru C21H42N4O13. .2H2CO3 obliczono: C =40,5%, H=6,8%, N = 8,2% znaleziono: C=40,l%, H=7,0%, N=8,3%.Próbke otrzymanego produktu przeksztalca sie w lotna pochodna cztero-N-acetylo-dziewiecio-O-tr- ójmetylosililowa przez dzialanie bezwodnikiem octo¬ wym w metanolu, w temperaturze pokojowej w ciagu 24 godzin, po czym poddaje sie reakcji z mieszanina szesciometylodwusilazenu i trójmety- lochlorosilanu w stosunku 2:1 w temperaturze pokojowej w ciagu 24 godzin. Stwierdzono, ze war¬ tosc m/e wynosi 1285. Obliczono, ze dla wzoru C5eHi22N40i7Si9 pomniejszonego o jedna grupe CsHoOSi uzyskuje sie ciezar czasteczkowy 1285.Przykl ad II. Wytwarzanie r. l-N-[(S)-2, 3, 4- -trójhydroksybutyloi kamycyny A.Roztwór 100 mg (0,18 milimola 3,30,6' -trój-N- -formylokanamycyny A, 107 mg (0,90 milimola) D-erytrozy i 66 mg (1,04 milimola) cyjanoborowo- dorku sodowego w mieszaninie 10 ml metanolu i 2 ml wody przy wartosci pH=6,0 ogrzewa sie w ciagu 50 godzin w temperaturze 60°C. Nastepnie rozpuszczalnik oddestylowuje sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i pozostalosc rozpuszcza w 12 ml 10% wodzianu hydrozyny, pH mieszaniny dopro¬ wadza do wartosci 6,0 lodowatym kwasem octo¬ wym i otrzymany roztwór ogrzewa sie w tempe¬ raturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 6 godzin. Rozpuszczalnik oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc chromato¬ graf uje na zywicy jonowymiennej Amberlite CG-50 sposobem podanym w przykladzie I. Na¬ stepnie najwieksza frakcje zawierajaca produkt chromatografuje sie na Sephadex CM25 (postac NH4+) eluujac kolumne roztworem amoniaku o zmiennym stezeniu jak podano powyzej i otrzy¬ muje sie 37 mg (36%) 1-N-[(S) (R 2, 3,4-trójhydro- ksybutylo] kanamycyny A. Zwiazek ten w miesza¬ ninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w sto¬ sunku 2 :1 wykazuje wartosc Rf=0,29 (dla kana¬ mycyny A wartosc Rf=0,32).Analiza elementarna: dla wzoru Ci2H44N4Ol4 2H2CO: obliczono: C=40,5%, H=6,3%, N=7,9% znaleziono: C=41,6%, H=6,6%, N=7,9% Przyklad III. Wytwarzanie 1-N-[(S (S) (R)- -2,3,4, 5-czterohydroksypentylo] kanamycyny A Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie II, stosujac jako substrat D- ryboze. Otrzymuje sie produkt, który w mieszani¬ nie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosun¬ ku 1 : 2 wykazuje wartosc Rf=0,68 (kanamycyna A wykazuje wartosc Rf=0,70).Nastepujace przyklady przedstawiaja sposoby wytwarzania zwiazków sposobem wedlug wyna¬ lazku. Wartosci temperatury podane w stopniach Celsjusza. Nazwy „Amberlite,, i „Sephadex" ozna- 40 czaja zarejestrowane nazwy handlowe. Chromato¬ grafie cienkowarstwowa przeprowadza sie na plyt¬ kach pokrytych zelem krzemionkowym i podanej mieszaniny rozpuszczalników. Plamy poddaje sie ogledzinom po wysuszeniu plytek spryskanych 5% 45 roztworem podchlorynu III rzed.-butylu w cyklo¬ heksanie, wysuszeniu w temperaturze 100°C w cia¬ gu 10 minut w przedmuchiwanym piecu, oziebie¬ niu i spryskaniu roztworem skrobi i roztworem jodku potasowego.Przyklad I. Wytwarzanie l-N-[(S)-2,5-dwu- hydroksypropylo]-kanamycyny A. 100 mg (0,18 milimola) 3,3", 6' -trój-N-formyloka- namycyny A, 31,6 mg (0,35 milimola) D-gliceryno- aldehydu i 33 mg (0,52 milimola) cyjanoborowo- 55 dorku sodowego rozpuszcza sie w mieszaninie 10 ml metanolu i 2 ml wody, po czym wartosc pH roztworu doprowadza sie do 6,0 5 n roztworem kwasu solnego. Roztwór utrzymuje sie w tempe¬ raturze pokojowej w ciagu 40 godzin. Nastepnie 60 pod zmniejszonym cisnieniem, oddestylowuje sie rozpuszczalnik, pozostalosc poddaje dzialaniu 1 n roztworu wodorotlenku sodowego i pozostawia w temperaturze pokojowej w ciagu dalszych 20 go¬ dzin. Nastepnie pod zmniejszonym cisnieniem od- 65 15 20 25 30108 094 11 Przyklad IV. Wytwarzanie 1-N-[(S) (R)-3,4, 5-trójhydroksypentylo] kanamycyna A.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie II stosujac jako substrat 2-dezoksy-D-ryboze. Otrzymuje sie produkt, który w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 2 wykazuje wTartosc Rf=0,68 (war¬ tosc Rf dla kanamycyny A wynosi 0,70.Przyklad V. Wytwarzanie 1-N-[(S) (R) (R) (R)- -2, 3, 4, 5, 6-pieciohydroksyheksylo] kanamycyny A.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie II stosujac jako substrat D-glikoze. Otrzymany zwiazek w mieszaninie me¬ tanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 2 wykazuje wartosc Rf=0,55 (wartosc Rf dla kana¬ mycyny A wynosi 0,71).Przyklad VI. Wytwarzanie 1-N-[(R) (S) (R)- -2, 3, 4, 5-czterohydroksypentylo] kanamycyny A.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie II stosujac jako substrat D-arabinoze. Otrzymany zwiazek w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 1 wykazuje wartosc Rf=0,34 (dla kanamycyny A wartosc Rf wynosi 0,49).Przyklad VII. Wytwarzanie 1-N-[(S) (R) (R)- -2, 3, 4, 5-cztero-hydroksypentylo] kanamycyny A.Roztwór 100 mg (0,18 milimola) 3,3", 6'-trój-N- formylokanamycyny A, 79 mg (0,53 milimola) D-ksylozy i 44 mg (0,68 milimola) cyjanoborowo- dorku sodowego w 10 ml wody przy wartosci pH=4,6 ogrzewa sie w temperaturze 90°C w ciagu 3,5 godziny. Z roztworu pod zmniejszonym cisnie¬ niem oddestylowuje sie rozpuszczalnik i pozosta¬ losc rozpuszcza sie w 10 ml 5 n roztworu kwasu solnego i roztwór miesza sie w temperaturze 3G°C w ciagu 16 godzin. Nastepnie rozpuszczalnik oddes¬ tylowuje sie i pozostalosc chromatografuje sie na kolumnie wypelnionej zywica jonowymienna Am- berlite CG-50 (postac NH4+) i eluuje roztworem a- moniaku o stezeniu wzrastajacym od 0 do 0,2 n.Otrzymuje sie 56 mg (51%) 1-N-[(S) (R) (R)-2, 3, 4, 5-czterohydroksypentylo] kanamycyny A. Zwiazek ten w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amo¬ niaku w stosunku 1 : 2 wykazuje wartosc Rf=0,58 (kanamycyna A wykazuje wartosc Rf=0,66.Przyklad VIII. Wytwarzanie 1-N-[(R) (S) (S)- -2, 3, 4, 5-czterohydroksypentylo] kanamycyny A.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie VII stosujac jako substrat L-ksyloze. Produkt w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 2 wyka¬ zuje wartosc Rf=0,34 (kanamycyna A wykazuje wartosc Rf=0,50).Przyklad IX. Wytwarzanie 1-N-[(R) (R) (R)- -2, 3, 4, 5-czterohydroksypentylo] kanamycyny A.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie VII stosujac jako substrat L-ryboze. Produkt w mieszanie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 1 wykazuje wartosc Rf=0,38 (dla kanamycyny A wartosc Rf wynosi 0,51). Wartosc m/e dla N+l wynosi 619.Przyklad X. Wytwarzanie 1-N-[(R) (R) (R)- -2, 3, 4, 5-czterohydroksypentylo] kanamycyny A. 12 Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie VII stosujac jako substrat D-ksyloze. Produkt w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 1 wykazuje 5 wartosc Rf=0,37 (dla kanamycyny A wartosc Rf wynosi 0,48).Przyklad XI. Wytwarzanie l-N-[(S)-2,3-dwu- hydroksypropylo]-kanamycyny B.Roztwór 45 mg (0,5 milimola) D-glicerynialde- 10 hydu w 1 ml metanolu dodaje sie do roztworu 100 mg (0,17 milimola) 2', 3, 3", e^cztero-N-formy- lohanamycyny B w 5 ml metanolu i 1 ml wody.Nastepnie w czasie mieszania dodaje sie 20 mg (0,3 milimola) cyjanoborowodorku sodowego i war- 15 tosc pH mieszaniny doprowadza do 6,0 5n roztworem kwasu solnego. Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu nocy. Nastepnie z roztworu calkowicie oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem rozpuszczalnik, zas pozostalosc poddaje 20 dzialaniu 5n roztworu kwasu solnego i roztwór pozostawia w ciagu nocy. Nastepnie wartosc pH roztworu doprowadza sie do 6,0 roztworem wodo¬ rotlenku sodowego i roztwór ten chromatografuje na kolumnie wypelnionej zywica Amberlite CG-50, 25 sposobem opisanym w przykladzie I. Odpowiednie frakcje zbiera sie i poddaje liofilizacji otrzymujac 53 mg (56%) l-N-[(S)-2,3-dwuhydroksypropylo] ka¬ namycyny B. Wartosc Rf w 3 m wodnym roztwo¬ rze chlorku sodowego wynosi 0,51 (dla kanamycy- 30 ny B wartosc Rf= 0,42), w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 1 war¬ tosc Rf=0,54 (dla kanamycyny B wartosc Rf=0,58) W widmie spektroskopii masowej obserwuje sie sil¬ ny pik M+l przy m/e wynoszacym 558. Dla wzoru 35 C21H43N5O12, M+l=558.Przyklad XII. Wytwarzanie 1-N-[(S) (R)- -2, 3, 4-trójhydroksybutylo] kanamycyny B.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie XI, stosujac jako substrat 40 D-erytroze. Produkt w 3 m roztworze chlorku so¬ dowego wykazuje wartosc Rf= 0,60 (dla kanamy¬ cyny B wartosc Rf= 0,45).Przyklad XIII. Wytwarzanie 1-N-[(S) (S) (R)- -2, 3, 4, 5, -czterohydroksypentylo] kanamycyny B. 45 Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie XI, stosujac jako substrat D-ryboze. Produkt w 2 m roztworze chlorku so¬ dowego wykazuje wartosc Rf = 0,3 (dla kanamy¬ cyny B wartosc Rf= 0,2).Przyklad XIV. Wytwarzanie 1-N-[(S) (R)- 3, 4, 5-trójhydroksypentylo] kanamycyny B.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie XI, stosujac jako substrat 2-dezoksy-D-ryboze. Produkt w 2 m roztworze chlorku sodowego wykazuje wartosc Rf = 0,3 (dla kanamycyny B wartosc Rf wynosi 0.2).Przyklad XV. Wytwarzanie 1-N-[(S) (R) (R)- (R)-2, 3, 4, 5-pieciohydroksyheksylo] kanamycyny B. 60 Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie XI stosujac jako substrat D-glikoze. Produkt w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 :1 wykazuje wartosc Rf=0,25 (dla kanamycyny B wartosc 65 Rf=0,42).108 094 13 Przyklad XVI. Wytwarzanie l-N-(2,5-dwu- hydroksy-2-hydroksymetylopropylp) kanamycyny B.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie XI stosujac jako substrat BL-2-hydroksymetylo-2,3-p-izoprppylidenoglicery- noaldehyd. Otrzymuje sie produkt, którego Rf w 3 m roztworze chlorku sodowego wynosi 0,55 (dla kanamycyny B wartosc Rf=0,42). Stwierdzo¬ no, ze wartosc m/e dla M+l wynosi 588. Dla wzo¬ ru C22H45N5O13 wartosc M+l wynosi 588.Przyklad XVII. Wytwarzanie l-N-[(R)-2,3- -dwuhydrpksypropylo] kanamycyny B.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opisa¬ nym w przykladzie XI stosujac jako substrat gli- cerynoaldehyd. Otrzymuje sie produkt, który za pomoca chromatografii cienkowarstwowej identy¬ fikuje sie jako produkt uzyskany sposobem opisa¬ nym w przykladzie XI.Przyklad XVIII. Wytwarzanie l-N-(l,3-dwu- hydroksypropylo) kanamycyny A. 14 tanolu i 3 ml wody. Wartosc pH roztworu dopro¬ wadza sie do 4,5 2n roztworem kwasu solnego i calosc ogrzewa w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 20 godzin. Nastepnie pod zmniejszonym cisnieniem oddestylowuje sie rozpuszczalnik i pozostalosc rozpuszcza w 10 ml wody. Do roztworu dodaje sie 2 ml 60% hydratu hydrazyny i pH roztworu dqprowadza do wartosci 6 2 ml lodowatego kwasu spjnego, po czym calosc ogrzewa w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 6 godzin. Z mieszaniny oddesty¬ lowuje sie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cis¬ nieniem i otrzymuje produkt w postaci gumy. Pro¬ dukt ten rozpuszcza sie w 8 ml wody i pH roztwo¬ ru doprowadza do wartosci 5,5 0,2 m roztworem kwasu solnego, po czym chromatografuje na ko¬ lumnie wypelnionej zywica jonowymienna Amber- lite CG-50 (postac NH4+) eluujac na poczatku wo¬ da, zas nastepnie roztworem amoniaku o wzrasta¬ jacym stezeniu do 0,25 m. Frakcje zawierajace produkt (co stwierdza sie za pomoca chromato¬ grafii cienkowarstwowej) laczy sie i oddestylowuje z nich rozpuszczalnik, po czym pozostalosc ponow¬ nie poddaje chromatografii na kolumnie wypelnio¬ nej Sephadex CM-25 (postac NH4+) eluujac spo" sobem opisanym powyzej. Otrzymuje sie 59 mg (32%) l-N-(l,3-dwuhydroksy-2-propylo) kanamycy- cy B. Zwiazek ten w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amoniaku w stosunku 1 : 1 wykazuje wartosc Rf = 0,55 (dla kanamycyny B wartosc Rf = 0,47), oraz w 2 m roztworze chlorku sodowe¬ go wartosc Rf = 0,37 (dla kanamycyny B wartosc Rf = 0,26).Analiza elementarna: dla wzoru C21H43N5O12 • . 3 H2CO3 • H2O obliczono: C = 37,8%, H = 6,8%, N = 9,2% znaleziono: C = 37,6%, H = 6,3%, N = 9,2%.Przyklad XX. Wytwarzanie l-N-(l-hydro- ksy-2-propylo) kanamycyny B. 200 mg (0,36 milimola) 2',3,3",6'-cztero-N-formy- lo-kanamycyny B, 78 mg (1,05 milimola) hydroksy- acetonu i 88 mg (1,40 milimola) cyjanoborowodor- ku sodowego rozpuszcza sie w mieszaninie 20 ml metanolu i 4 ml wody, po czym pH roztworu do¬ prowadza do wartosci 6,0 5n roztworem kwasu solnego. Otrzymany roztwór ogrzewa sie w tempe¬ raturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 22 godzin. Nastepnie dodaje sie 23 mg hydroksyace- tonu i 30 mg cyjanoborowodorku sodowego, po czym ogrzewanie w temperaturze wrzenia konty¬ nuuje sie w ciagu 24 godzin. Z kolei oddestylowuje sie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc poddaje dzialaniu 10fy wodnego roz¬ tworu wodzianu hydrolizy i pH rpztworu dopro¬ wadza do wartosci 6 20 ml lodowatego kwasu oc- tpwego i calosc ogrzewa w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 6 godzin. Z miesza¬ niny reakcyjnej oddestylowuje sie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc chro¬ matografuje na kolumnie wypelnipnej zywica jo¬ nowymienna Amberlite CG-50 (postac NH4+), elu¬ ujac roztworem amoniaku o stezeniu wzrastajacym od 0 do 0,1 n. Frakcje zawierajace produkt (co stwierdza sie za pomoca chromatografii cienko¬ warstwowej) laczy sie, oddestylowuje z nich roz¬ puszczalnik i otrzymuje 0,11 g (50%) l-N-(l-hydro- 200 mg (0,36 milimola) 3,3", 6'-trój-N-formyloka- namycyny A, 95 mg (1,05 milimola dwu- hydroksyacetonu i 88 mg (1,40 milimola) cyja¬ noborowodorku sodowego rozpuszcza sie w mie- 25 szaninie 20 ml metanolu i 4 ml wody, po czym roztwór doprowadza sie do wartosci pH = 6,6 5n roztworem kwasu solnego. Otrzymany roztwór og¬ rzewa sie w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 22 godzin. Z kolei dodaje sie na¬ stepna porcje 95 mg dwuhydroksyacetonu i 88 mg cyjanoborowodorku sodowego i wartosc pH dopro" wadza do 5,5. Ogrzewanie w temperaturze wrzenia kontynuuje sie w ciagu dalszych 24 godzin, po czym rozpuszczalnik oddestylowuje sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, zas pozostalosc poddaje dziala¬ niu 20 ml mieszaniny 10% hydrozyny i kwasu octo¬ wego o wartosci pH=6,8 i ogrzewa w tempera¬ turze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 6 go¬ dzin. Z roztworu pod zmniejszonym cisnieniem od¬ destylowuje sie rozpuszczalnik i pozostalosc chro¬ matografuje na kolumnie wypelnionej zywica jo¬ nowymienna Amberlite CG-50 (postac NH4+) eluujac roztworem amoniaku w wzrastajacym ste¬ zeniu od 0 do 0,1 n. Frakcje zawierajace produkt (co stwierdza sie za pomoca chromatografii cienko- 45 warstwowej) laczy sie, oddestylowuje sie z nich rozpuszczalnik, po czym pozostalosc ponownie pod" daje sie chromatografii kolumnowej na Sephadex CM-25 (postac NH4+) eluujac sposobem opisanym poprzednio i otrzymuje sie 0,11 g (57%) 1-N-(1,3- 50 -dwuhydroksy-2-propylo) kanamycyny A. Produkt ten w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu amo¬ niaku w stosunku 2 : 1 wykazuje wartosc Rf = 0,40 (dla kanamycyny wartosc Rf wy¬ nosi 0,30).Analiza elementarna: dla wzoru C21H42N4O13 • •2H2CO3: policzono: C = 40,5%, H = 6,8%, N = 8,2%, znaleziono: C = 40,6%, H = 6,5%, N = 8,4%.Przyklad XIX. Wytwarzanie l-N-(l,3-dwu- 6o fiydroksy-2-propylo) kanamycyny B. 88 mg (1,40 milimoli) cyjanoborowodorku sodo¬ wego dodaje sie do roztworu 200 mg (0,33 milimo¬ la) 2,,3,3",6,-cztero-N-formylokanamycyny B i 95 mg (1,05 milimola) dwuhydroksyacetonu w 12 ml me- 65 10 15 ?,0 25 30 35 40 45 50 55 60108 094 20 15 ksy-2-propylo) ksanamycyny B. Zwiazek ten w 3m roztworze chlorku sodowego wykazuje wartosc Rf = 0,55 (kanamycyna B wykazuje war¬ tosc Rf=0,47).Analiza elementarna: dla wzoru C21H43N5O11 • 5 2V2H2COs.Obliczono: C = 40,5%, H = 6,9%, N = 10,0%.Znaleziono: C = 39,6%, H = 6,8%, N = 10,5%.Wartosc m/e (M+l) wynosi 542. Dla wzoru 10 C21H43N5O11 obliczono M+1=542.Przyklad XXI. Wytwarzanie l-N-(l-hydro- ksy-2-propylo) kanamycyny A.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie XX, stosujac 3,3",6'-trój-N- 15 -formylokanamycyne A. Otrzymany zwiazek wy¬ kazuje wartosc Rf = 0,30 w mieszaninie metanolu, chloroformu i 8% roztworu wodorotlenku amono¬ wego w stosunku 4:1:2 (wartosc Rf dla kanamy¬ cyny wynosi 0,20)^ Przyklad XXII. Wytwarzanie l-N-(l-hydro- ksy-2-propylo) tobramycyny. 2,0 g (3,5 milimola) 6'-N-IIIrz.-butyloksykarbo- nylotobramycyny, 0,78 g(10,6 milimola) hydroksy- 25 acetonu i 0,89 g (14,0 milimola) cyjanoborowodorku sodowego rozpuszcza sie w mieszaninie 150 ml metanolu i 30 ml wody, po czym pH roztworu do¬ prowadza do wartosci 6,0 5n roztworu kwasu sol¬ nego. Calosc ogrzewa sie w temperaturze wrzenia 30 pod chlodnica zwrotna w ciagu 72 godzin. Roz¬ puszczalnik oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc poddaje dzialaniu 20 ml kwasu trójfluorooctowego mieszajac w ciagu 45 minut w temperaturze pokojowej. Nastepnie roz- 35 puszczalnik ponownie oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpuszcza w niewielkiej ilosci wody, pH roztworu doprowa¬ dza do wartosci 6,0 3n roztworem wodorotlenku amonowego i roztwór chromatografuje na kolum- 40 nie wypelnionej zywica jonowymienna Amberlite CG-50 (postac NH4+) eluujac roztworem amoniaku o wzrastajacym stezeniu. Frakcje zawierajace pro¬ dukt laczy sie, oddestylowuje rozpuszczalnik i po¬ zostalosc chromatografuje na Sephadex CM-25 45 (postac NH4+) eluujac sposobem opisanym po¬ przednio i otrzymuje 8 mg (0,4%/ 1,N,) 1-hydro- ksy-2-propylo (tobramycyny). Wartosc Rf otrzy- 16 manego zwiazku w 3 m roztworze chlorku sodowe¬ go wynosi 0,68 (dla kanamycyny wartosc Rf = 0,60) Wartosc m/e dla M+l wynosi 526. Dla wzoru C21H43N5O10 M+l = 526.Przyklad XXIII. Wytwarzanie l-N-[(S)-2,3- -dwuhydroksypropylo] tobramycyny.Zwiazek tytulowy wytwarza sie sposobem opisa¬ nym w przykladzie XXII przy uzyciu D-gliceryno- aldehydu zamiast hydroksyacetonu. Zwiazek otrzy¬ many w 3 m roztworze chlorku sodowego wyka¬ zuje wartosc Rf = 0,55 (dla tobramycyny wartosc Rf = 0,45), zas w mieszaninie metanolu i 0,880 roztworu wodorotlenku amonowego w stosunku 2 : 1 wynosi 0,37 (dla tobramycyny wartosc Rf = 0,35).Przyklad XXIV. Wytwarzanie l-N-(l,3-dwu- hydroksy-2-propylo) kanamycyny A. 500 mg (0,80 milimola) 6',3"-dwu-N-acetylokana- mycyny A, 237 mg (2,64 milimola) 1,3-dwuhydro- ksyacetonu i 181 mg (2,64 milimola) cyjanoborowo¬ dorku sodowego rozpuszcza sie w 45 ml metanolu i 5 ml wody, po czym wartosc pH doprowadza do 6,0 2n roztworem kwasu solnego. Nastepnie roz¬ twór pozostawia sie w ciagu 3 dni w temperaturze pokojowej. Metoda chromatografii cienkowarstwo¬ wej stosujac mieszanine metanolu, chloroformu i n roztworu wodorotlenku amonowego w stosun¬ ku 4:2:1 stwierdza sie obecnosc dwóch plam o wartosciach Rf wynoszacych 0,17 i 0,22. Z roz¬ tworu oddestylowuje sie rozpuszczalnik i produkty rozdziela za pomoca chromatografii kolumnowej na Sephadex CM-25 (postac NH4+) eluujac roz¬ tworem amoniaku o wzrastajacym stezeniu. Sklad¬ nik o wartosci RF = 0,17, który eluuje sie jako drugi, ogrzewa sie w 3n roztworem wodorotlenku sodowego w temperaturze 89—90°C w ciagu 4 go¬ dzin. Po reakcji roztwór zobojetnia sie i oczyszcza za pomoca chromatografii kolumnowej na zywicy jonowymiennej Amberlite CG-50 (postac NH4+) eluujac sposobem opisanym poprzednio i otrzy¬ muje l-N-(l,3-dwuhydroksy-2-propylo)kanamycyne A, identyczna z produktem otrzymanym sposobem w przykladzie XVIII.Wyniki badania in vitro aktywnosci przeciwba- kteryjnej zwiazków, które otrzymuje sie sposoba¬ mi opisanymi w przykladach, przeprowadzonego spo¬ sobami poprzednio opisanymi, zamieszczone sa w tablicy 3.Tablica 3 Przeciwbakteryjna aktywnosc zwiazków w badaniach in vitro.Przyklad nr 1 * I II III IV V VI Najmniejsze stezenie zwiazków hamujacych wzrost drobnoustrojów jig/ml E. Coli 2 6,2 12,5 12,5 12,5 12,5 25 r Klebsiella pneumoniae 3 6,2 6,2 12,5 12,5 12,5 25 Proteus mirabilis 4 25 12,5 12,5 25 25 50 Pseudomonas aeruginosa 5 6,2 6,2 1 6,2 12,5 12,5 25 Staphylococcus aureus 6 6,2 6,2 6,2 12,5 12,5 25 i108094 17 i ! VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII 2 12,5 50 23 25 6,2 3,1 3,1 3,1 6,2 6,2 6,2 6,2 3,1 3,1 3,1 i 3,1 6,2 3 12,5 25 12,5 25 3,1 3,1 3,1 3,1 6,2 3,1 6,2 6,2 ' 1,6 3,1 3,1 6,5 3,1 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania aminoglikozydów 2-de- -zoksystreptaminowych o wzorze ogólnym 1, w któ¬ rym R1 oznacza pierwszorzedowa grupe alkilowa o 3—7 atomach wegla, z których przynajmniej dwa, inne niz atom wegla polaczony z grupa ami¬ nowa podstawione sa grupa hydroksylowa, R2 oznacza grupe aminowa lub hydroksylowa, kazdy z podstawników R* oznacza grupe hydroksylowa, R* i R5 oznaczaja atomy wodoru, Rf oznacza gru¬ pe 3-amino-3-dezoksy-a-D-glikopiranozylowa, a R? oznacza atom wodoru lub nizsza grupe alkilowa zawierajaca do 4 atomów wegla oraz dopuszczal¬ nych do stosowania w farmacji addycyjnych soli tych zwiazków z kwasami, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym R2, R3, R*, R5, R« i R7 maja wyzej podane znaczenie, oraz w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych, innych niz grupa aminowa w polo¬ zeniu 1, moze byc ewentualnie ochroniona, pod¬ daje sie redukcyjnemu alkilowaniu, usuwa sie ewentualnie wystepujace grupy ochraniajace, po czym izoluje zwiazek o wzorze ogólnym 1 i w ra¬ zie potrzeby, przeprowadza sie otrzymany zwia¬ zek w dopuszczalna do stosowania w farmacji addycyjna sól z kwasem. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogóljiym 2, w któ¬ rym jedna lub wieksza liczba wolnych grup ami¬ nowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wystepuje w postaci ochronionej grupa for- mylowa. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w któ¬ rym jedna lub wieksza liczba wolnych grup ami¬ nowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wystepuje w postaci ochronionej grupa ace- tylowa. 18 c.d. tablicy 3 5 • 1 12,5 25 12,5 25 3,1 1,6 3,1 3,1 6,2 3,1 6,2 3,1 1,6 3,1 6,2 3,1 3,1 6 6,2 25 25 25 1,6 1,6 1,6 1,6 6,2 3,1 3,1 6,2 1,6 1.6 3,1 0,8 1,6 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w któ¬ rym jedna lub wieksza liczba wolnych grup ami¬ nowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 30 1, wystepuje w postaci ochronionej grupa trój- fluóroacetylowa. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w któ¬ rym jedna lub wieksza liczba wolnych grup ami- 35 nowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wystepuje w postaci ochronionej grupa III- rzed.-butyloksykarbonyIowa. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze redukcyjne alkilowanie przeprowadza sie przy 40 uzyciu aldehydu. 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze re¬ dukcje prowadzi sie przy uzyciu borowodorku sodo¬ wego lub cyjanoborowodorku sodowego. &. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze re- 45 dukcje prowadzi sie na drodze katalitycznego wo- dorowania. 9. Sposób wedlug zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, ze redukcyjne alkilowanie przeprowadza sie przy uzyciu D-glicerynoaldehydu. 50 10. Sposób wytwarzania aminoglikozydów 2-dezo- ksystreptaminowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza drugorzedowa grupe alkilowa o 3—7 a- tomach wegla, z których przynajmniej dwa inne niz atom wegla polaczony z grupa aminowa podstawio- 55 ne sa grupa hydroksylowa, R2 oznacza grupe ami¬ nowa lub hydroksylowa, R? oznacza grupe hydro¬ ksylowa R4 i R5 oznaczaja atomy wodoru, a R6 oz¬ nacza grupe 3-amino-3-dezoksy-L-D-glikopirano- zylowa, a R7 oznacza atom wodoru lub nizsza grupe so alkilowa zawierajaca do 4 atomów wegla oraz do¬ puszczalnych do stosowania w farmacji addycyjnych soli tych zwiazków z kwasami, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym R*, Rs, R4 R5, Rfl i R7 maja wyzej podane znaczenie, oraz w któ- 65 rym jedna lub wieksza liczba wolnych grup ami-108 094 19 20 nowych, innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, moze byc ewentualnie ochroniona, poddaje sie redu¬ kcyjnemu alkilowaniu, usuwa sie ewentualnie wy¬ stepujace grupy ochraniajace, po czym izoluje zwia¬ zek o wzorze ogólnym 1 i w razie potrzeby, przepro¬ wadza sie otrzymany zwiazek w dopuszczalna do stosowania w farmacji addycyjna sól z kwasem. 11. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wystepuje w postaci ochronionej grupa formylowa. 12. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1 wyste¬ puje w postaci ochronionej grupa acetylowa. 13. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wyste¬ puje w postaci ochronionej grupa trójfluoroacety- lowa. 14. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wyste¬ puje w postaci ochronionej grupa III rzed.-butylok- sykarbonylowa. 15. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze redukcyjne alkilowanie przeprowadza sie przy uzy¬ ciu ketonu podstawionego grupa hydroksylowa. 16. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze redukcje prowadzi sie przy uzyciu borowodorku sodowego lub cyjanoborowodorku sodowego. 17. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze redukcje prowadzi sie na drodze katalitycznego wodorowania. 18. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze redukcyjne alkilowanie prowadzi sie przy uzyciu dwuhydroksyacetonu. 19. Sposób wytwarzania aminoglikozydów 2-dezo- ksystreptaminowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza drugorzedowa grupe alkilowa o 3—7 atomach wegla, z których jeden atom inny niz atom polaczony z grupa aminowa podstawiony jest grupa hydroksylowa, R2 oznacza grupe aminowa lub hy¬ droksylowa, R3 oznacza grupe hydroksylowa, R4 i R5 oznaczaja atomy wodoru, R6 oznacza grupe 3- amino-3-dezoksy-L-D-glikopiranozylowa, a K? oz¬ nacza atom wodoru lub niz jgrupe alkilowa zawie¬ rajaca do 4 atomów wegla oraz dopuszczalnych do stosowania w farmacji addycyjnych soli tych zwiaz¬ ków z kwasami, znamienny tym, ze zwiazek o wzo¬ rze ogólnym 2, w którym R2, R3, R4, R5, rs i R7 maja wyzej podane znaczenie, oraz w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych, in¬ nych niz grupa aminowa w polozeniu 1, moze byc ewentualnie ochroniona, podaje sie redukcyjnemu alkilowaniu, usuwa sie ewentualnie wystepujace grupy ochraniajace, po czym izoluje zwiazek o wzo¬ rze ogólnym 1, i w razie potrzeby, przeprowadza sie otrzymany zwiazek w dopuszczalna do stosowa¬ nia w farmacji addycyjna sól z kwasem. 20. Sposób wedlug zastrz. 14, znamienny tymr ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w poloze¬ niu 1, wystepuja w postaci ochronionej grupa for¬ mylowa. 21. Sposób wedlug zastrz. 19, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wystepuja w postaci ochronionej grupa acetylowa. 22. Sposób wedlug zastrz. 19, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wystepuja w postaci ochronionej grupa trójfluoroacetylowa. 23. Sposób wedlug zastrz. 19, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym jedna lub wieksza liczba wolnych grup aminowych innych niz grupa aminowa w polozeniu 1, wystepuje w postaci ochronionej grupa Illrzed.-butyloksykarbonylowa. 24. Sposób wedlug zastrz. 23, znamienny tym, ze jako zwiazek o wzorze ogólnym 2 stosuje sie 6 -N-IIIrzed.-butyloksykarbonylotobramycyne. 25. Sposób wedlug zastrz. 20 albo 24, znamien¬ ny tym, ze redukcyjne alkilowanie przeprowadza sie przy uzyciu ketonu. 26. Sposób wedlug zastrz. 25, znamienny tym, ze redukcje prowadzi sie przy uzyciu borowodor¬ ku sodowego lub cyjanoborowodorku sodowego. 27. Sposób wedlug zastrz. 25, znamienny tym, ze redukcje prowadzi sie na drodze katalityczne¬ go wodorowania. 28. Sposób wytwarzania aminoglikozydów 2-de- zoksystreptaminowych o wzorze ogólnym 3, w którym R1 oznacza pierwszorzedowa grupe al¬ kilowa o 3—7 atomach wegla, z których przynaj¬ mniej dwa, inne niz atom wegla polaczony z gru¬ pa aminowa podstawione sa grupa hydroksylowa lub R1 oznacza drugorzedowa grupe alkilowa o 3—7 atomach wegla, z których przynajmniej jeden atom inny niz atom polaczony z grupa ami¬ nowa podstawiony jest grupa hydroksylowa, a R2 oznacza grupe aminowa lub hydroksylowa oraz dopuszczalnych do stosowania w farmacji addy¬ cyjnych soli tych zwiazków z kwasami, znamien¬ ny tym, ze 2', 3", 6-trój-N-trójfluoroacetylokana- mycyne B, 3", 6-dwu-N-trójfluoroacetylokanamy- cyne A lub 3", ff-dwu-N-acetylokanamycyne A poddaje sie redukcyjnemu alkilowaniu, usuwa sie grupy acetylowe lub fluoroacetylowe, po czym izoluje sie zwiazek o wzorze 3, i w razie potrzeby przeprowadza sie otrzymany zwiazek w dopusz¬ czalna do stosowania w farmacji addycyjna sól z kwasem. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55108 094 tcs ssl 90A ssA 80\ 75A vo\ a - kontro/a. o - amikaa/na. 150mg/ty O - amikacuna WO mgMg.A - KK-31Z14. i i i Z 4 i i i 10 12 * ' io, ', n czosfdhij yn? RM NHa Vo -.R3' R2R50 X0RS wzór 1 ,NHR7 R< / NH, R3 R2 R5Ó OR6 Nzor 2 CH,NH2 NH2 ho^^o^Vnhr1 OH R2 HOVo H0^_VCH20H H2N OH wzór 3 PL PL PL PL PL PL PL PL