CS203157B2

CS203157B2 - Process for preparing aminoglycosides of 2-deoxystreptamine

Info

Publication number: CS203157B2
Application number: CS773790A
Authority: CS
Inventors: Kenneth Richardson; Rhona M Plews; James R Wright
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1976-06-16
Filing date: 1977-06-08
Publication date: 1981-02-27
Also published as: PL108094B1; NO772089L; FI771873A7; FR2355029B1; HU179054B; NZ184213A; PH14663A; JPS52153943A; GR66411B; IL52181A0; DE2726839B2; CH606079A5; NL7706514A; SE7706944L; DE2726839C3; MX4323E; PL198872A1; IE45389L; IL52181A; DK147942B

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových antibakteriálně účinných aminoglykosidů 2-deoxystreptaminu.

2-Deoxyrtreataminové aminoglykosidy jsou známými antibakteriálně účinnými látkami získávanými fermentačně nebo semisynteticky a zahrnují taková cenná chemoterapeutická činidla, jako jsou kanamyciny, gentamycin, tobramycin, ribostamycin a neomycin.

Nová antibakteriálně účinná činidla vyráběná způsobem podle vynálezu tvoří sérii aminoglykosidů 2-deoxystreptaminu, kde aminoskupina v poloze I je substituovaná alkylovou skupinou nesoucí na uhlíkových atomech, s výjimkou atomu uhlíku navázaného na aminoskupinu, jednu nebo několik hydroxylových skupin. Tyto sloučeniny jsou účinné při léčbě řady infekcí způsobených gram-positivními a gram-negativními bakteriemi, včetně infekcí močových cest, u zvířat a lidí, přičemž jsou výhodnější než 2-deoxystreptaminové aminoglykosidy s nesubstituovanou amínoskupinou v poloze 1 2-t^í^(^?^yrtPэamininO5^¢^Ьo kruhu. Zejména pak bylo zjištěno, že sloučeniny podle vynálezu se vyznačují nižší toxicitou než řada známých aminoglykosidů.

V souhlase s vynálezem se vyrábějí nové aminoglykosidy 2-deoxystrtptamínu, obecného vzorce I

HO

(I) ve kterém

R1 znamená primární alkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, z nichž alespoň dva, kromě uhlíkového atomu navázaného na atom dusíku, nesou hydroxylovou skupinu, nebo znamená sekundární alkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, z nichž alespoň jeden, kromě uhlíkového atomu navázaného na atom dusíku, nese hydroxylovou skupinu,

R2 představuje aminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu,

R³ znamená atom vodíku nebo hydroxylovou skupinu a

R7 představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, a jejich ' farmaceuticky upotřebitelné soli.

Výrazem „primární alkylová skupina“ se míní alkylová skupina s nesubstituovanou methylenovou skupinou navázanou na aminoskupinu, přičemž v případě, že tato skupina obsahuje více než 3 atomy uhlíku, může být přímá nebo rozvětvená. Výrazem „sekundární alkylová skupina“ se míní alkylová skupina, v níž uhlíkový atom napojený na aminoskupinu je navázán na další dva uhlíkové atomy nebo uhlíkaté řetězce.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou látky shora - uvedeného obecného vzorce I, ve kterém R7 znamená atom vodíku a R3 představuje hydroxylovou skupinu. Symbol R1 představuje s výhodou hydroxysubstituovanou alkylovou skupinu se 3 až 5 atomy uhlíku, zejména hydroxysubstituovanou propylovou skupinu. Zvlášť výhodným substituentem aminoskupiny v poloze 1 je dihydroxypropylová skupina, tj. 2,3-dihydroxypropylová nebo l,3-dihydroxy-2-propylová skupina. Mezi zvlášť výhodné individuální sloučeniny vyráběné způsobem podle vynálezu náležejí - 1-N- (2,3-dihydroxypropyl)kanamyciny A a B, a l-N-(l,3-dihydroxy-2-propyljkianamyciny A a B.

Farmaceuticky upotřebitelnými solemi sloučenin podle vynálezu s kyselinami jsou soli odvozené od kyselin tvořících netoxické adiční soli obsahující farmaceuticky upotřebitelné anionty, jako hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty či bisulfáty, fosfáty nebo kyselé · fosfáty, acetáty, maleáty, fumaráty, sukcináty, laktáty, tartráty, citráty, glukonáty, sacharáty, p-toluensulfonáty a karbonáty.

Nové sloučeniny shora uvedeného- obecného vzorce I - je možno podle vynálezu vyrobit tak, že se aíkyluje sloučenina obecného vzorce II

becného vzorce I se izoluje a/nebo se popřípadě převede - na farmaceuticky upotřebitelnou sůl.

Případné chránění volných aminoskupin ve výchozích látkách obecného vzorce II je možno uskutečnit reakcí s činidlem selektivně reagujícím s volnými aminoskupinamí a zavádějícím takovou chránící skupinu, kterou je možno - snadno odštěpit běžným způsobem, například hydrolýzou nebo hydrogenolýzou. Jako příklady vhodných chránících skupin je možno uvést skupinu formylovou, acetylovou, trifluoracetylovou, methoxykarbonylovou, terc.butoxykarbonylovou a benzyloxykarbonylovou.

Alkylací podle vynálezu je možno uskutečnit běžným způsobem, například reduktivní alkylací za použití odpovídajícího hydroxysubstituovaného aldehydu nebo ketonu, nebo v případě, že R1 znamená shora definovanou primární alkylovou skupinu, acylací odpovídající hydroxysubstituovanou kyselinou a redukcí vzniklého acylovaného derivátu (například diboranem). V případě, že ve výchozí látce jsou kromě aminoskupiny v poloze 1 přítomny ještě další volné aminoskupiny, proběhne shora uvedená reakce pochopitelně i na těchto -amiinoskupinách a je pak nutno oddělit žádaný 1-N-substituovaný derivát ze směsi vzniklých produktů. Tuto separaci je možno uskutečnit obvyklým, způsobem, například chromatografií na iontoměničích. K usnadnění finální izolace žádaného produktu je ovšem žádoucí v - průběhu alkylační reakce chránit alespoň některé nebo výhodně všechny aminoskupiny přítomné ve výchozí - látce (pochopitelně kromě aminoskupiny v poloze - 1). V takovémto případě je pak třeba po provedené alkylací - chránící skupiny odstranit.

V souhlase s jedním provedením způsobu podle vynálezu se selektivně chráněný -aminoglykosldový derivát obecného vzorce II, obsahující volnou aminoskupinu v poloze 1, nechá reagovat s aldehydem nebo ketonem, přičemž keton ses výhodou používá v nadbytku, a primárně vzniklá Schiffova báze se současně nebo- v dalším stupni redukuje za vzniku 1-N-substituovaného produktu. Redukci je možno účelně uskutečnit za použití natriumborohydridu nebo natriumkyanborohydridu jako redukčního činidla a účelně se . provádí tak, že se toto- redukční činidlo přidá k reakční směsi při pH obecně mezi 4 a 7, čímž se umožní účelný průběh reakce v jediném pracovním stupni. Alternativně je možno směs aminoglykosidu obecného vzorce - II a aldehydu nebo- ketonu podrobit běžné katalytické hydrogenaci.

Reakci je možno účelně uskutečnit za použití reakčních složek rozpuštěných v inertním rozpouštědle, například ve vodě - nebo (II) ve kterém R2, R3 a R7 mají shora uvedený význam a kde jedna nebo několik volných aminoskupin, s výjimkou aminoskupiny v poloze 1, je popřípadě v chráněné formě, k zavedení zbytku ve významu symbolu R1, popřípadě přítomné chránící skupiny aminových funkcí -se odštěpí a získaný produkt o203157 vodném dioxanu či vodném methanolu, při teplotě mezi 0 °C a teplotou varu rozpouštědla pod zpětným chladičem. Reakční doba přirozeně závisí na použitých reakčních složkách, rozpouštědle a reakční teplotě, bylo však zjištěno, že provádí-li se reakce mezi aminoglykosidem obecného vzorce II a hydroxysubstituovaným aldehydem nebo ketonem (například glyceraldehydem nebo dihydroxyacetonem) v přítomnosti nadbytku natriumkyanborohydridu při pH mezi 4 a 7 ve vodném methanolu při teplotě 60 °C, je prakticky úplně ukončena během 2 dnů.

Jako další reakční stupeň je třeba provést odštěpení všech chránících skupin aminových funkcí, přítomných v molekule aminoglykosidu. Pro úplné odstranění chránících skupin aminových funkcí existují různé podmínky, které závisejí na charakteru použité chránící skupiny a na okolních skupinách. Používané reakční prostředí může být bezvodé nebo vodné a v konkrétních případech může být různě silně kyselé nebo zásadité. Zvlášť výhodnou chránící skupinou pro sloučeniny obecného vzorce II je skupina formylová. Tuto skupinu je možno·' snadno odstranit mírnou zásaditou hydrolýzou, například působením zředěného hydroxidu sodného při teplotě místnosti, trvajícím několik hodin, nebo záhřevem s hydrazin-acetátem, popřípadě několikahodinovou mírně kyselou hydrolýzou prováděnou například působením 5 N kyseliny chlorovodíkové při teplotě místnosti. Vhodnou chránící skupinou je rovněž terc.butyloxykarbonylová skupina, kterou je možno odštěpit za kyselých podmínek, například působením bezvodé trifluoroctové kyseliny při teplotě místnosti po dobu 45 minut. Další vhodnou chránící skupinou je benzyloxykarbonylová skupina, kterou je možno odštěpit katalytickou hydrogenolýzou, například několikahodinovou hydrogenací roztoku příslušné sloučeniny ve vodné kyselině octové v přítomnosti paládia na uhlí jako katalyzátoru, za tlaku 0,35 MPa. Ještě další vhodnou chránící skupinou je skupina acetylová, která se odstraňuje několikahodinovým zahříváním s 3 N hydroxidem sodným na teplotu 80 až 90 °C. Po odstranění chránících skupin se produkt zpracuje obvyklým způsobem, například filtrací a odpařením rozpouštědla, a popřípadě vyčištěním surového produktu krystalizaci nebo chro-matografíí.

Zvlášť výhodným chráněným aminoglykosidovým derivátem obecného vzorce II, použitelným při práci způsobem podle vynálezu pro výrobu derivátů kanamycinu A (sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém R7 znamená atom vodíku a R2 a R3 hydroxylovou skupinu), je 3,3“,6‘-tri-N-formylkanamycin A. Obdobně pak pro přípravu derivátů kanamycinu B (sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém R2 znamená aminoskupinu a · R3 a R7 mají shora uvedený význam) je výhodnou výchozí látkou odpovídající 2‘,3,3“,6‘-tetra-N-formylkan’amycin B. Vhodnými výchozí mi látkami jsou rovněž i jiné selektivně chráněné deriváty kanamycinu A a kanamycinu B, jako například 3“,6‘-di-N-acetylkanamycin A a 2‘,3“,6‘-tri-N-trifluoracetylkanamycin B.

Aminoglykosidové nebo chráněné aminoglykosidové deriváty obecného vzorce II jsou známými sloučeninami, které již byly popsány v literatuře. Tak například různé aminoglykosidy formylované na všech aminoskupinách s výjimkou aminoskupiny v poloze 1, včetně 3,3“,6‘-tri-N-iormylkanamycinu A a 2‘,3‘,3“,6‘-tetra-N-formylkanamycinu B, jsou popsány v belgickém patentu č. 817 546. Analogickým způsobem je možno připravit i další výchozí látky. Deriváty s chráněnou aminoskupinou v poloze 6‘ jsou dobře známé a jejich příprava je popsána například v britském patentu č. 1 401 220 a v německých patentech č. 2 311 524, 2 350 169 a 2 512 687.

Aldehydy a ketony, substituované hydroxylovými skupinami, použitelné pro přípravu sloučenin obecného vzorce I způsobem· podle vynálezu, jsou snadno dostupné. Tak například při použití D-glyceraldehydu se způsobem podle vynálezu získá produkt, · v němž R1 znamená (S)-2,3-dihydroxypropylovou skupinu. K reakci podle vynálezu je· možno použít i další snadno dostupné aldosy a deoxyaldosy, jako je například D-erythrosa, Dribosa a 2-deoxy-D-ribosa. Podobně se může použít dihydroxyaceton za vzniku 1-N-(1,3-dihydroxy-2-propyl) derivátu, jakož i hydroxyaceton (acetol) za vzniku odpovídajícího l-hydroxy-2-propylderivátu.

Sloučeniny obecného vzorce I, jakož i sloučeniny obecného vzorce II mohou existovat v různých konformačních formách a rozsah vynálezu není omezen na kteroukoli z nich. Obecně jsou všechny kruhy v židličkové formě a každý ze substituentů je situován ekvatoriálně se zřetelem ke kruhu. Dále pak glykosidická vazba mezi hexopyranosylovým kruhem a kruhem 2-deoxystreptaminu je obvykleji a-vazba, míněno na prvou z uvedených látek. Dále pak substituent s hydroxylovými skupinami na 1-aminoskupině má jedno či více opticky aktivních center, a každé z nich může být v konfiguraci R nebo S, nebo může jít o směs optických isomerů.

Vyhodnocení účinnosti sloučenin podle tohoto vynálezu in vitro jako antibakterielních látek ss provádí stanovením minimální inhibiční koncentrace (M.I.C.) testované sloučeniny ve vhodném prostředí, na kterém přestane růst ten či onen mikroorganismus. V praxi se používají agarové destičky, kam je přidána testovaná sloučenina za dané koncentrace, a očkují se standardisovaným počtem buněk testovaného mikroorganismu, načež se každá destička inkubuje po 24 hodin za teploty 37 °C. Potom se na destičkách vyhodnotí růst mikroorganicu, případně vymezení, a zaznamená se odpovídající hodnota M.I.C.

Mezi kmeny mikroorganismů, které byly použity při těchto testech, patří:

Escherichia coli,

Klebsíella pneumoniae, Próteus mírabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus a Streptococcus faecalis.

In vivo účinnost se vyhodnocuje subkutánním podáváním látek myším, postiženým infekcí kmenem Escherichia coli.

Každá sloučenina se podává v sérii různých hladin dávek skupinám myší a účinnost té které látky se stanoví jako hladina, za které se dosahuje 5Q% ochrana proti smrtelné infekci působením Escherichia coli během doby 72 hodin.

Při podávání lidem se mohou antibakterielní látky podle tohoto vynálezu podávat jako takové, ale obvykle se podávají ve směsi s farmaceutickým nosičem, zvoleným s ohledem na zamýšlenou cestu podávání a se zřetelem na standardisované postupy farmaceutické praxe. Například se mohou tyto látky podávat orálně ve formě tablet, obsahujících taková excipientia, jako je škrob nebo· laktosa, nebo se mohou podávat v kapslích a opět jako takové nebo ve směsi s excipientii, nebo se mohou podávat ve formě alkoholických nápojů nebo suspensi, obsahujících příchutě a barvivá. Mohou se injlkovat parenterálně, například intravenosně, intramuskulárně nebo subkutánně. Pro parenterální podávání se nejlépe používají ve formě sterilních vodných roztoků, které mohou obsahovat další rozpuštěné složky, například dostatečné množství solí nebo glukosy k vyrovnání osmotického tlaku.

Má se za to, že při podávání lidem jako pacientům, bude denní podávaná dávka podobná, jako je tomu v případě - běžně používaných aminoglykosidických antibakterielně účinných látek, například tedy v rozmezí 0,1 až 50 mg/kg (v rozdělených dávkách) při podávání parenterálními cestami, a od 10 až do 100 mg/kg (v rozdělených dávkách) při orálním podávání. Tablety nebo kapsle obsahují od 0,1 do 1 g účinné složky pro orální podávání čtyřikrát za den, zatím co dávky pro parenterální podávání obsahují od 10 až do 500 mg účinné složky. V každém případě určí ošetřující lékař s konečnou platností skutečnou dávku, jež bude nejvhodnější pro pacienta a bude kolísat s věkem, hmotností pacienta a odezvou v tom kterém případě. Výše uvedené dávky jsou příklady průměrů, mohou být pochopitelně případy, kdy budou vhodné vyšší nebo nižší dávky, a to- vše spadá do rozsahu tohoto vynálezu.

Další příklady popisují blíže přípravu předmětných sloučenin podle tohoto vynálezu. Teploty jsou uváděny ve stupních Celsia. „Amberlite“ a „Sephadex“ jsou chráněné obchodní známky. Ch^r^i^m^t^í^jgrafie na tenké vrstvě se provádí na destičkách ze silikagelu v uvedené soustavě rozpouštědel. Skvrny se ozřejmí sušením destiček, následujícím postřikem 5% roztokem terc.butylesteru chlorné kyseliny v cyklohexanu, dalším sušením destiček při 1ΰ0 °C po dobu 10 minut v odvzdušňované sušárně, ochlazením a postřikem roztoku škrobu s jodidem draselným.

„Amberlite“ je iontoměničová pryskyřice sestávající z polystyrénového základu zesítěného se 3 až 5 % divinylbenzenu a obsahující zbytky sulfonové kyseliny zavedené sulfonací.

„Sephadex“ je chemicky modifikovaný dextran získaný fermentací třtinového cukru, který se používá jako molekulární síto- k oddělování materiálů -s nízkou molekulovou hmotností od látek s vyšší molekulovou hmotností postupem známým jako filtrace na gelech.

Příklad 1 l-N-[ (S)-2,3-Dihydroxypropyljkanamycin A

Ve směsi 10 ml methanolu a 2 ml vody se rozpustí 100 mg (0,18 mmol) 3,3“,6‘-tri-N-formyl-kanamycinu A, 31,6 mg (0,35 mmol) D-glyceraldehydu a 33 mg (0,52 mmol) kyanborohydridu sodného, a hodnota pH roztoku se upraví přidáním 5 N roztoku chlorovodíkové kyseliny na 6,0. Roztok se uchovává za teploty místnosti po 40 hodin, potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku, a ke zbytku se přidá 1 N roztok hydroxidu sodného, načež se reakční směs ponechá stát dalších 20 hodin za teploty místnosti. Zbytek po zahuštění za sníženého tlaku se chromatografuje na koloně iontoměničové pryskyřice Amberlite GG-50 v amoniové formě, a eluování se provádí roztokem amoniaku o stoupající koncentraci od 0 do 0,1 N, čímž se získá 66 mg (67%) 1-N-[ (S)-2,3-dihydroxypropyl]kanamycinu A. V 1 M roztoku chloridu sodného má získaná látka Rf 0,27 (kanamycin A má hodnotu R_f0,21); další hodnoty Rf: v methanolu ve směsi roztokem amoniaku (0,660) 1:2 = 0,70 (kanamycin A 0,70).

Analysa:

pro C21H4řN4O13.2H2CO3 vypočteno:

40,5 % C, 6,6 % H, 6,2 % N, nalezeno:

40,1 % C, 7,0 % H, 6,3 % N.

Vzorek se převede na těkavý tetra-N-acetyl-nona-O-trimethylsilylderivát působením anhydridu kyseliny octové v methanolu 24 hodin za teploty místnosti s následující reakcí se směsí hexamethyldisilazanu a trimethyl203157 chlorsilanu (2:1) po 24 hodin za teploty místnosti. m/e nal. 1285; pro C56H122N4O17SÍ9 bez jedné skupiny C3H9OS1 vypočteno m/e 1285.

Příklad 2 l-N-[ (S) (R)-2,3,4-Trihydroxybutyl]kanamycin A

Roztok 100 mg (0,18 mmol) 3,3“,6‘-tri-N-formyl-kanamycinu A, 107 mg (0,90 mmol) D-erythrosy a 66 mg (1,04 mmol) kyanborohydridu sodného ve směsi 10 ml methanolu a 2 ml vody se zahřívá za hodnoty pH 6,0 50 hodin na 60 °C. Roztok se zahustí za sníženého tlaku, zbytek se rozpustí v 12 ml 10% hydrozinhydrátu, přidáním ledové kyseliny octové se pH roztoku upraví na 6,0, a roztok se zahřívá 6 hodin к varu pod zpětným chladičem. Za sníženého tlaku se oddestiluje rozpouštědlo, a zbytek se chromatografuje na Amberlite GG-50, jak je to popsáno v příkladu 1, a s následující chromatografií větší frakce, obsahující produkt, na Sephadexu CM25 v amoniové formě s eluováním roztokem amoniaku o stoupající koncentraci, jak bylo popsáno zde výše. Získá se tak 37 mg (36%) 1-N- [ (S) (R) -2,3,4-trihydroxybutyl ] kanamycinu A. Hodnota R_f: 0,29 v methanolu a roztoku amoniaku (0,880) v poměru 2:1 (kanamycin A: 0,32).

Analysa:

pro C212H44N4O14.2H2CO3 vypočteno:

40.5 % C, 6,8 % H, 7,9 % N, nalezeno:

41.6 % C, 6,6 % H, 7,9 % N.

Příklad 3

1-N[ (S) (S) (R )-2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl] kanamycin A se připraví za použití postupu z příkladu 2, ale s D-ribosou jako výchozí sloučeninou. Hodnota R_f ve směsi methanolu a amoniaku (0,880) 1:2 je 0,68 (kanamycin A: 0,70).

Příklad 4 l-N-[ (S) (R)-3,4,5-Trihydroxypentyl]kanamycin A se připraví za použití postupu z příkladu 2, ale s 2-deoxy-D-ribosou jako výchozí sloučeninou. Látka má R_f ve směsi methanolu a amoniaku (0,880) 1:2 je 0,68 (kanamycin A 0,70).

Příklad 5

1-N[ (S) (R) (R) (R)-2,3,4,5,6-Pentahydroxyhexyl] kanamycin A se připraví za použití postupu z příkladu 2, ale s D-glukosou jako výchozí látkou. Hodnota R_f ve směsi methanolu a amoniaku (0,880) 1:2 je 0,55 (kanamycin A: 0,71).

Příklad 6

1-N- [ (R) (S) (R) -2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl] kanamycin A se připraví za použití postupu z příkladu 2, ale za použití D-arabinosy jako výchozí látky. Hodnota R_f ve směsi methanolu a amoniaku (0,880) 1:1 je 0,34 (kanamycin A: 0,49).

Příklad 7 l-N-[ (S) (R) (R )-2,3,4,5-Tethahydroxypentyl] kanamycin A

Roztok 110 mg (0,18 mmol) 3,3“,6‘-tri-Nformylkanamycinu A, 79 mg (0,53 mmol) D-xylosy a 44 mg (0,68 mmol) kyanborohydridu sodného v 10 ml vody se za hodnoty pH

4,6 zahřívá 3,5 hodiny na 90 °C, rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku, a zbytek se rozpustí v 5 N roztoku chlorovodíkové kyseliny (10 ml) a roztok se míchá 16 hodin za teploty 30 °C. Rozpouštědlo se oddestiluje, a zbytek se chromatografuje na koloně iontoměničové pryskyřice Amberlite CG-50 v amoniové formě za eluování roztokem amoniaku o zvyšující se koncentraci od 0 až do 0,2 N. Získá se tak 56 mg (51%) 1-N-[ (S) (R) (R)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)kanamycinu A. Hodnota Rf ve směsi methanolu a roztoku amoniaku (0,880) v poměru 1:2 je 0,58 (kanamycin A má R_f 0,66).

Příklad 8 l-N-[ (R) (S) (S)-2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl] kanamycin A se připraví postupem podle příkladu 7, ale za použití L-xylosy jako výchozí sloučeniny. Látka má ve směsi methanolu a roztoku amoniaku (0,88) v poměru 1:2 hodnotu Rf 0,34 (kanamycin A: 0,50).

Příklad 9 l-N-[ (R) (R) (S )-2,3,4,5-Tetrahydroxypeintyl] kanamycin A se připraví postupem podle příkladu 7, ale s L-riibosou jako výchozí sloučeninou. Látka má hodnotu Rf 0,38 ve směsi methanolu a roztoku amoniaku (0,88) 1:1 (kanamycin A: 0,51). m/e pro M + l, nalezeno 619.

Příklad 10

1-N- [ (R) (R) (R) -2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl] kanamycin A se připraví za použití postupu z příkl. 7, ale ale s D-xylosou jako výchozí látkou. Látka má hodnotu Rf 0,37 ve směsi methanolu a roztoku amoniaku (0,88) (1:1) kanamycin A, 0,48).

Příklad 11 l-N-[ (S)-2,3-Dihydroxypropyl)-kanamycin B

i.oztok 45 mg (0,5 mmol) D-glyceraldehydu v 1 ml methanolu se přidá k roztoku 100 miligramů (0,17 mmol) 2‘,3,3“,6‘-totra-N-formyl-kanamycinu B v 5 ml methanolu a 1 ml vody, do míchaného roztoku se vnese 20 mg (0,3 mmol) kyanborohydridu sodného, hodnota pH se upraví na 6,0 přidáním 5 N roztoku chlorovodíkové kyseliny a roztok se míchá za teploty místnosti přes noc. Za sníženého tlaku se potom roztok zahustí do sucha, zbytek se rozpustí v 5 N roztoku · chlorovodíkové kyseliny, načež se roztok ponechá stát přes noc za teploty místnosti. Hodnota pH roztoku se upraví na 6,0 přidáním roztoku hydroxidu sodného, a roztok se chromatografuje ' na Amberlite CG-50, jak je to popsáno v příkladu 1. Lyofilizován odpovídajících frakcí se získá 53 mg (56%) 1-N-( (S)-2,3-dihydroxypropyl]kanamycinu B. Hodnota Rf je 0.51 v 3 M roztoku chloridu sodného (kanamycin B, 0,42).

Ve směsi methanolu a roztoku amoniaku (0,880) (1:1) má získaná látka hodnotu Rf 0,54 (kanamycin B: 0,58). V hmotovém spektru je silný pík pro M + l při m/e 558. C21H43N5O12, proi M -|- 1 = 558.

Příklad 12 l-N-[ (S) (R)-2,3,4-Trihy<droxybutyl]kanamycln B se připraví za použití postupu z příkladu 11, ale s D-erythrosou jako výchozí látkou. Rf v 3 M roztoku chloridu sodného je 0,60 (kanamycln B: 0,45).

Příklad 13

1-N- [ (S) (S) (R) -2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl] kanamycin B se připraví za použití postupu z příkladu 11, ale s D-ribosou jako výchozí látkou. Látka má v 2M roztoku chloridu sodného hodnotu Rf 0,3 (kanamycin B: 0,2).

Příklad 14 l-N-[ (S) (R)-3,4,5-Teihydroxypentyl)kanamycin B se připraví za použití postupu z příkladu 11, ale s D-ribosou jako výchozí sloučeninou.

Hodnota R_f v 2 M roztoku chloridu sodného činí 0,3 (kanamycin B: 0,2).

Příklad 15 l-N-[ (S) (R) (R) (R)-2,3,4,5,6-Pentahy droxyhexyl ] kanamycin · B se připraví za použití postupu z příkladu 11, ale s D-glukosou jako výchozí složkou. Látka má hodnotu Rf 0,25 ve směsi methanolu a amoniaku (0,88) (1:1) (kanamycin B:

0,42).

Příklad 16

1-N- (2,3-Dihy droxy-2-hydroxymethylpropyl) kanamycin B se připraví za použití postupu z příkladu 11, ale s DL-2-hydroxymethyl-2,3-O--soppopylidenglyceraldehydem. Látka má v 3 M roztoku chloridu sodného hodnotu Rf 0,55 (kanamycin B, 0,42). Hodnta m/e pro· M + l—nalezeno 588, pro C22H45N5O13, pro M·+l vypočteno 588.

Příklad· 17 l-N-[ (R)-2,3-Dihydroxypropyl)kanamycin B se připraví za použití postupu z příkladu 11, ale s L-glyctraldthydtm jako výchozí látkou. Produkt je totožný podle chromatografie na tenké vrstvě s produktem podle příkladu 11.

Příklad 18 l-N-[ l,3-Dihydroxy-2-propyl] kanamycin A

Ve směsi 20 ml methanolu a 4 ml vody se rozpustí 200 mg (0,36 mmol) 3,3“,6‘-tri-N-formyl-kanamycinu A a 88 mg (1,40 mmol) kyanborohydridu sodného, načež se pH roztoku upraví přidáním 5 N roztoku chlorovodíkové kyseliny na hodnotu 6,6. Roztok se zahřívá k varu pod zpětným chladičem· po dobu 22 hodin, přidá se další podíl 95 mg dihydroxyacetonu a 88 mg kyanborohydridu sodného, a hodnota pH se upraví na 5,5. V zahřívání k varu pod zpětným chladičem se pokračuje po dobu · dalších 24 hodin, načež se rozpouštědlo zahustí za sníženého tlaku, a ke zbytku se přidá . za hodnoty pH 6,0 20 mililitrů 10% roztoku soli hydra-zinhydrátu s kyselinou octovou. Reakční -směs se zahřívá 6 hodin do varu pod zpětným chladičem, a po zahuštění za sníženého tlaku se zbytek chromatografuje na koloně iontoměničové pryskyřice Amberlite CG-50 v amoniové formě za eluování roztokem amoniaku o zvyšující se koncentraci od 0 až do 0,1 N. , Frakce, obsahující produkt podle sledování chromatografováním na tenké vrstvě se spojí, za203157 hustí, a produkt se znovu chromatografuje na Sephadexu CM25 v amoniové formě, s eluováním, jak to zde bylo uvedeno dříve, se isoluje 0,11 g (57%) l-N-(l,3-dihydroxy-2-propyl jkanamicinu A. Látka má ve směsi methanolu a amoniaku (0,88) (2:1) hodnotu R_f 0,40 (kanamymin A, R_ř 0,30).

Analysa:

pro C21H42N4O13.2H2CO3 vypočteno:

40.5 % C, 6,8 % H, 8,2 % N, nalezeno:

40.6 % C, 6,5 % H, 8,4 % N.

Příklad 19

1-N- (l,3-Dihydroxy-2-propyl) kanamycin В

Ve směsi 12 ml methanolu a 3 ml vody se rozpustí 200 mg (0,33 mmol) ,2‘,3,'3“,6‘-tet!ra-N-formyl-kanamycinu В a 95 mg (1,05 mmol) dihydroxyacetonu, а к roztoku se přidá 88 mg (1,40 mmol) kyanborohydridu sodného; pH roztoku se upraví přidáním 2 N roztoku kyseliny chlorovodíkové na 4,5, a roztok se zahřívá 20 hodin к varu pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku, zbytek se rozpustí v 10 ml vody, к roztoku se přidají 2 ml 60% hydrozinhydrátu, pH roztoku se upraví přidáním 2 ml ledové kyseliny octové na hodnotu 6, a roztok se zahřívá 6 hodin к varu pod zpětným chladičem. Oddestilováním rozpouštědla za sníženého tlaku se získá pryskyřičný zbytek, který se rozpustí v 8 ml vody, přidáním 0,2 N roztoku kyseliny chlorovodíkové se pH upraví na hodnotu 5,5, a roztok se chromatografuje na koloně Amber lite CG-50 v amoniové formě za eluování nejprve vodou a potom roztokem amoniaku o stoupající koncentraci až к 0,25 N Frakce, obsahující produkt (podle sledování chromatografií na tenké vrstvě) se spojí, zahustí, a produkt se znovu chromatografuje na koloně Sephadexu CM 25 (v amoniové formě) za eluování, jak to bylo popsáno zde dříve. Získá se tak 59 mg (32%) l-N-(l,3-dihydroxy-2-propyl)kanamyclnu B. Ve směsi methanolu ia amoniaku (0,880) (1:1) má látka hodnotu Rf 0,55 (kanamycin B: 0,47). V 2 M roztoku chloridu sodného má získaná látka hodnotu Rf 0,37 (kanamycin B: 0,26).

Analysa:

pro C21H45N5O12. ЗН2СО3. H2O vypočteno:

37,8 % C, 6,8 % H, 9,2 % N, nalezeno:

37,6 % C, 6,3 % H, 9,2 % N.

Příklad 20

1-N- (l-Hydroxy-2-propyl) kanamycin В

Ve směsi 20 ml methanolu a 4 ml vody se rozpustí 200 mg (0,36 mmol) 2‘,3,3“,6‘-tetra-N-formyl-kanamycinu B, 78 mg (1,05 mmol) hydroxyacetonu a 88 mg (1,40 mmol) kyanborohydridu sodného, a přidáním 5 N roztoku kyseliny chlorovodíkové se pH roztoku upraví na 6,0. Roztok se zahřívá 22 hodin к varu pod zpětným chladičem, přidá se další podíl 23 mg hydroxyacetonu a 30 mg kyanborohydridu sodného, načež se v zahřívání к varu pod zpětným chladičem pokračuje 24 hodin. Po zahuštění rozpouštědla za sníženého tlaku se ke zbytku přidá 10% vodný roztok hydrazinhydrátu, přidáním 20 ml ledové kyseliny octové se upraví hodnota pH na 6, a reakční směs se zahřívá 6 hodin к varu pod zpětným chladičem. Zahuštěním za sníženého tlaku získaný zbytek se chromatografuje na koloně iontoměnlčové pryskyřice Amberlite CG-50 v amoniové formě za eluování .roztokem amoniaku o stoupající koncentraci od 0 až do 0,1 N. Frakce, obsahují podle vyhodnocení chromatografií na tenké vrstvě produkt, se spojí, a zahuštěním se získá 0,11 g (50%) l-N-(l-hydroxy-2-propyl) kanamycinu B. Hodnota R_f v 3 M roztoku chloridu sodného činí 0,55 (kanamycin B: 0,47).

Analysa:

pro C21H43N5O11.2,5Н2СОз vypočteno:

40.5 % C, 6,9 % H, 10,0 % N. nalezeno:

39.6 % C, 6,8 % H 10,5 % N.

Nalezená hodnota m/e pro M+ 1 = 542. Pro C21H43N5O11 vypočteno M + l = 542

Příklad 21

1-N- (l-Hydroxy-2-propyl) kanamycin A se připraví podobným způsobem, jak je to popsáno v příkladu 20, ale za použití 3,3“,6‘tri-N-formyl-kanamycinu A. Ve směsi methanolu, chloroformu a 8% amoniaku (4:1:2) má látka R_f 0,3 (kanamycin A: 0,2Q).

Příklad 22

1-N- (l-Hydroxy-2-propyl )tobramycin

1β

Ve směsi 150 ml methanolu a 30 ml vody se rozpustí 2,0 g (3,5 mmol) 6‘-N-terc.-butyloxykarbonyltobramycinu, 0,78 g (10,6 mmol) hydroxyacetonu a 0,89 g (14,0 mmol) kyanborohydridu sodného, a hodnota pH roztoku se upraví přidáním 5 N roztoku chlorovodíkové kyseliny na hodnotu 6,0. Reakční směs se zahřívá 72 hodin к varu pod zpětným chladičem, rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku, a ke zbytku se přidá 20 ml kyseliny trifluoroctové, načež se reakční směs míchá 45 minut za teploty místnosti. Roztok se znovu zahustí do sucha za sníženého tlaku, zbytek se rozpustí v malém množství vody, pH se upraví na 6,0 přidáním 3 N roztoku amoniaku a roztok se chromatografuje na iontoměničové pryskyřici Amberlite CG-50 v amoniové formě za eluování roztoku amoniaku s proměnnou koncentrací. Frakce, obsahující produkt, se spojí, odpaří, a produkt se znovu chromatografuje na Sephadexu CM25 v amoniové formě; eluováním, jak je to popsáno zde dříve, se získá 8 mg (0,4%) 1-N- (l-hydroxy-2-propyl) tobramycinu. V 3 M roztoku chloridu sodného má látka hodnotu R_f 0,68 (tobramycin 0,60). Hodnota m/ pro M + l nalezena 526.

Pro C21H45N5O10 vypočteno M+ 1 = 526.

Příklad 23 l-N-[ (S)-2,3-Dihydroxypropyljtobramycin se připraví podobným postupem, jak je to popsáno v příkladu 22, ale za použití D-glyceraldehydu místo hydroxyacetonu. V 3 M roztoku chloridu sodného má látka hodnotu R_f 0,37 (tobramycin 0,45), ve směsi metha nolu a amoniaku (0,880) (2:1) je hodnota R_f0,37 (tobramycin 0,35).

Příklad 24

1-N- (l,3-Dihydroxy-2-propyl) kanamycin A

Ve směsi 45 ml methanolu a 5 ml vody se rozpustí 500 mg (0,88 mmol) 6*,3“,-di-N-aQetylkanamycinu A, 237 mg (2,64 mmol) 1,3-dihydroxyacetonu a 181 mg (2,64 mmol) kyanborohydridu sodného, a přidáním 2 N roztoku chlorovodíkové kyseliny se pH roztoku upraví na 6,0. Potom se roztok nechá stát 3 dny za teploty místnosti, a chromatografováním na tenké vrstvě v soustavě methanol, chloroform a 1 N roztok amoniaku (4:2:1) lze zjistit 2 hlavní složky o hodnotách R_f0,17 a 0,22. Roztok se odpaří a produkty se dělí iontoměničovou chromatografií na Sephadexu CM25 v amoniové formě za eluování gradientem roztoku amoniaku o stoupající koncentraci. Pomaleji se pohybující složka o R_f 0,17, což byla druhá složka eluovaná z kolony, se zbaví krycích skupin čtyřhodinovým zahříváním v 3 N roztoku hydroxidu sodného na 80 až 90 °C. Neutralisováním, dále čištěním iontoměničovou chromatografií na Amberlite CG-50 v amoniové formě a eluováním jak to bylo popsáno zde dříve se získá 1-N- (l,3-dihydroxy-2-propyl) kanamycin A, totožný s produktem podle příkladu 18.

Výsledky testování sloučenin z uvedených příkladů na antibakterielní účinnost in vitro za použití popsaných způsobů jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka: Antibakteriální účinnost in vitro

Příklad č.	Minimální inhibiční koncentrace v ^g/ml	Staphylo coccus aureus
E. coli	Klebsiella pneumoniae	Próteus mirabilis	Pseudomonas aeruginosa
1	6,2	6,2	25	6,2	6,2
2	12,5	6,2	12,5	6,2	6,2
3	12,5	12,5	12,5	6,2	6,2
4	12,5	12,5	25	12,5	12,5
5	12,5	12,5	25	12,5	12,5
6	25	25	50	25	25
7	12,5	12,5	25	12,5	6,2
8	50	25	100	25	25
9	25	12,5	25	12,5	25
10	25	25	100	25	25
11	6,2	3,1	6,2	3,1	1,6
12	3,1	3,1	6,2	1,6	1,6
13	3,1	3,1	12,5	3,1	1,6
14	3,1	3,1	6,2	3,1	1,6
15	6,2	6,2	100	6,2	6,2
16	6,2	3,1	12,5	3,1	3,1
17	6,2	6,2	12,5	6,2	3,1
18	6,2	6,2	25	3,1	6,2
19	3,1	1,6	6,2	1,6	1,6
20	3,1	3,1	25	3,1	1,6
21	3,1	3,1	12,5	6,2	3,1
22	3,1	6,5	12,5	3,1	0,8
23	6,2	3,1	6,2	3,1	1,6

Claims

1. Způsob výroby aminoglykosidů 2-deoxystreptaminu, obecného vzorce Ί ve kterém

R² představuje aminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu,

R3 znamená atom vodíku nebo hydroxylovou skupinu a

R7 představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, a jejich farmaceuticky upotřebitelných solí, vyznačující se tím, že se alkyluje sloučenina obecného vzorce II

MO (ID ve kterém R2, R3 a R7 mají shora uvedený význam a kde jedna nebo několik volných aminoskupin, s výjimkou aminoskupiny v poloze 1, je popřípadě v chráněné formě k zavedení zbytku ve významu symbolu R1, případně přítomné chránící skupiny aminových funkcí se odštěpí a získaný produkt obecného vzorce I se izoluje atnebo se popřípadě převede na farmaceuticky upotřebitelnou sůl.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se zavádí zbytek R1 představující primární alkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, z nichž alespoň . dva, kromě uhlíkového atomu navázaného na atom dusíku, nesou hydroxylovou skupinu,

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se jako výchozí látka obecného vzorce iI použije S^^S^tri-N-formylkanainycin A nebo 2‘,3,3“,6‘-tetra-N-formylkana.myí:in B, do kterého se zavádí zbytek R1 definovaný v bodu 2.

4. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se jako zbytek R1 zavádí dihydroxypropylová skupina.

5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se zavádí zbytek R¹ představující sekundární alkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, z nichž alespoň dva, kromě uhlíkového atomu . navázaného na atom dusíku, nesou hydroxylovou skupinu.

6. Způsob podle bodu 5, vyznačující se tím, že se jako výchozí látka obecného vzorce II použije 3,3“,6‘-tri-N-formylkanamycin A nebo 2‘,3,3“,6‘-tetra-N-formylkanamycin A nebo 2‘,3,3“,6‘-tetra-N-formyIkanamycin B, do kterého se zavádí zbytek R¹ definovaný v bodu 5.

7. Způsob podle bodu 6, vyznačující se tím, že se jako zbytek R1 zavádí dihydroxypropylová skupina.

8. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se zavádí zbytek R¹ představující sekundární alkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, z nichž jeden, kromě uhlíkového atomu navázaného na atom dusíku, nese hydroxylovou skupinu.

9. Způsob podle bodu 8, vyznačující· se tím, že se jako výchozí látka obecného vzorce. II použije 2‘,3,3“,6‘-tetra-N-formylkanamycin B, do kterého se zavádí zbytek R¹definovaný v bodu 8.