PL100715B1 - Sposob otrzymywania aktywnych nierozpuszczalnych enzymow - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania aktywnych nierozpuszczalnych enzymów, nadajacych sie do wielokrotnego uzycia oraz do regenerowania ze srodowiska reakcji.

Enzymy sa nietrwalymi substancjami bialkowymi o charakterze koloidów. Istnieja trudnosci przy otrzy¬ mywaniu czystych preparatów enzymatycznych, zwiazane zarówno z wlasnosciami fizykochemicznymi enzy¬ mów^ jak równiez z utrata ich aktywnosci w procesie izolowania z materialu biologicznego. Wysokie koszty otrzymania oraz labilnosc chemiczna ograniczaja stosowanie enzymów w celach analitycznych, a zwlaszcza w procesach technologicznych. Istnieje wiec potrzeba modyfikowania naturalnych wlasnosci enzymów w kierun¬ ku wiazania ich ze stalym podlozem dla lepszego wykorzystania aktywnosci biologicznej zarówno w zastosowa¬ niach przemyslowych, Jak i laboratoryjnych.

Znane sa juz niektóre sposoby otrzymywania nierozpuszczalnych enzymów- Esteraza cholinowa jest inkludowana w zelu skrobiowym I laczona za pomoca wiazania kowalentnego z sefaroza, zas ureaza z zelem poliakryloamidowym, Wykorzystywane sa tez wstanie nierozpuszczalnym takie enzymy, jak amylaza lub fosfataza. Jednakie te znane nierozpuszczalne enzymy wykazuja znacznie obnizona aktywnosc biokatalityczna oraz znacznie skrócony okres trwalosci w stosunku do czystych preparatów naturalnych enzymów. Inkludowana inwertaza w zelu poliakryloamidowym zachowuje okolo 69,2%, glukoamylaza zaledwie 6,5%, obojetna proteaza ,5% aktywnosci enzymu, uzytego do Inkludowania. Nierozpuszczalne preparaty nierozpuszczalnych enzymów traca aktywnosc przy próbach wiazania ich ze stalym podlozem i w krótkim okresie czasu przestaja spelniac role biokatalizatorów. Uzywany najczesciej do wiazania zel poliakryloamidowy powoduje, w zaleznosci od rodzaju enzymu, Jego dezaktywacje, dochodzaca nawet do 100%, glównie w procesie polimeryzacji monomeru.

Wynalazek ma na celu opracowanie takiego sposobu otrzymywania nierozpuszczalnych enzymów,zwiaza¬ nych trwale z podlozem stalym, przy którym bylaby zachowana aktywnosc nuturalnego biokatalizatora, bez uwalniania wolnego enzymi w czasie prowadzenia procesów biochemicznych. Dalszym celem wynalazku jest umozliwienie wielokrotnego stosowania enzymów bez strat ich biologicznej aktywnosci z równoczesnym umozliwieniem wielokrotnej regeneracji ze srodowiska reakcji.2 100 715 Istota sposobu wedlug wynalazku polega na inkludowaniu w zelu krzemionkowym, otrzymywanym przez lagodna hydrolize wodnego roztworu odpowiedniego estru krzemoorganicznego, zmieszanego uprzednio z rozt¬ worem enzymu. Najlepsze efekty uzyskuje sie przy zastosowaniu lll-rzedowych lub IV-rzedowych chlorków aikilowanych aminoalkoksysilanów, jak równiez estrów kwasu krzemowego z glikolami. Wodne roztwory enzymu oraz zwiazku krzemoorganicznego miesza sie i doprowadza pH roztworu-do wartosci 7,0—7J5. Nastepnie do galaretowatego zelu dodaje sie obojetnego wypelniacza, takiego jak skrobia, sefadeks sproszkowane tworzywo sztuczne itp. Opisane substancje miesza sie dokladnie. Tak otrzymana mala" jest przesaczalna dla roztworu substratu i dla produktów reakcji. Sposób wiazania enzymów wedlug wynalazku nie wymaga zachowania ostrych warunków i umozliwia wiazanie nawet tak delikatnego enzymu, jak acetylocholinoesteraza.

Wynalazek jest dokladniej objasniony na przykladach.

Przyklad I. 10 mg enzymu acetylocholinoesterazy rozpuszcza sie w 0,5 cm3 wody redestylowanej, a nastepnie dodaje 0,5 g rozpuszczalnej soli estru krzemoorganicznego, korzystnie chlorowodorku dwuetyloami- noksysilanu. Po doprowadzeniu roztworu do wartosci pH * 7,5 otrzymuje sie zel, który rozdrabnia sie i miesza zOr5g sefadeksu. Uzyskana pólplynna mase przenosi sie do kolumienki szklanej o srednicy 3 cm, wysokosci cm. Po dokladnym wymyciu reszty organicznej zwiazku krzemoorganicznego, który inhibuje odwracalnie aktywnosc acetylocholinoesterazy, przez kolumne przepuszcza sie roztwór chlorku acetylocholiny. Aktywnosc enzymu w zaleznosci od stezenia substratu mozna mierzyc ilosciowo notujac przy pomocy wskaznika lub pehametru zmiane pH wycieku w funkcji czasu. Tak przygotowany nierozpuszczalny enzym zachowuja aktywnosc w ciagu tygodnia.

Przyklad II. 20 mg enzymu ureazy i 0,5 g soli estru krzemoorganicznego, korzystnie chlorku trójetyloaminopropylooksysilanu, rozpuszcza sie w 0,5 cm3 wody redestylowanej. Otrzymany roztwór zobojet* nia sie do pH = 7 i otrzymany zel miesza sie dokladnie z 3 do 5 g skrobi. Uzyskana jednorodna mase przenosi sie do kolumienki szklanej, jak w przykladzie I. W przypadku ureazy produkt hydrolizy estru krzemoorganicznego nie inhibuje aktywnosci enzymu. Po podaniu roztworu substratu, korzystnie mocznika, w wycieku obserwuje sie wskutek powstajacego amoniaku zmiane pH. Zmiana ta jest miara aktywnosci ureazy. Inkludowana na zelu krzemionkowym ureaza hydrolizuje w ciagu trzech tygodni.

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania aktywnych nierozpuszczalnych enzymów, znamienny ty m, ze wodny roztwór enzymu miesza sie z wodnym roztworem zwiazku krzemoorganicznego, stanowiacego estrowe pochodne glikoli lub aikilowanych aminoalkoholi i kwasu krzemowego, a otrzymana mieszanine poddaje sie lagodnej hydrolizie, po czym do otrzymanego zelu dodaje sie obojetny wypelniacz i dokladnie miesza, uzyskujac mase przepuszczal¬ na dla roztworów substratów. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl