NO970054L

NO970054L - Implantert anordning inneholdende tumorceller for behandling av cancer

Info

Publication number: NO970054L
Application number: NO970054A
Authority: NO
Inventors: Robin Lee Geller; James H Brauker; William D Johnston; Steven A Levon; David A Maryanov
Original assignee: Baxter Int
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1997-01-07
Publication date: 1997-03-10
Also published as: CN1157560A; ATE172099T1; IL114482A0; EP0769932A1; DE69505391T2; DE69505391D1; NO970054D0; DK0769932T3; EP0769932B1; JPH10502638A; KR970704410A; AU699405B2; AU2912895A; WO1996001611A1; ES2125630T3; CA2194555A1; CA2194555C

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår cancerforebyggelse og behandling gjennom implantasjon av tumorceller i pasienten, idet tumorcellene er inneholdt i et kammer som atskiller tumorcellene fra pasientens vev.

Oppfinnelsens bakgrunn

Vanlig aksepterte terapier for de fleste tumorer er kirurgi, kjemoterapi, strålingsterapi, benmargstransplanta-sjoner eller forskjellige kombinasjoner av disse terapier. Vanligvis er disse behandlinger målrettet mot ødeleggelse av tumorcellene ved mekanismer uavhengige av aktivering av pasientens immunsystem. I løpet av strålings- og kjemoterapi er betydelig skade på immunsystemet en uheldig bivirkning. Langtidseffektiviteten av disse behandlinger er dessuten tvil-som for en del tumorer.

a. Aktivering av immunsystemet

I løpet av det siste tiår er det blitt utviklet terapeutiske metoder basert på aktivering av immunsystemet for å formidle antitumoraktivitet. En vanlig vertsrespons mot tumorceller starter vanligvis med at T-celler gjenkjenner tumorassosierte antigener på tumorceller, eller via antigenfremvisende celler. Gjenkjennelse via T-celleantigenreseptor utløser signaltranskripsjonsreaksjonsveier som formidler aktiveringen av T-cellene. Dette fører til utskillelse av interleukin-2 (IL-2), y-interferon, tumornekrosefaktor-a og andre cytokiner, fra T-cellene og hjelperceller. Vertens immunsystem mobiliseres således til å drepe tumorcellene. Av dårlig forståtte årsaker inntreffer imidlertid ikke denne vertsrespons, eller den er utilstrekkelig til å drepe tumorceller.

Én terapi som er utformet for å aktivere immunsystemet er den systemiske administrering av IL-2. De fordrede doser av IL-2 for å oppnå tilstrekkelig forsterkning viste seg imidlertid å være toksiske for pasienten. Cellulære immun-terapimetoder for å aktivere immunsystemet har fokusert på to typer av celler: LAK-celler og TIL-celler. LAK ("lymphokine

activated killer")celler er celler fra immunsystemet som er blitt uspesifikt aktivert ved anvendelse av cytokin, slik som IL-2 (Lotze et al., Cancer Res. 41, s. 4420-4425 (1981); Grimm et al., J. Exp. Med. 155, s. 1823-1844 (1982)) og/eller ved anvendelse av monoklonale antistoffer, slik som anti-CD3 (Ochoa et al., Cancer Res. 49, s. 693-700 (1989)). Disse celler kan formidle betydelig antitumoraktivitet uten de hovedhistokompatibilitetskompleks(MHC)-beslektede restrik-sjoner karakteristiske for T-cellereseptoren i klassiske cyto-lytiske T-celler (CTL). I én nylig undersøkelse resulterte infusjon av IL-2 og LAK-celler for fremskredne tumorer, i responser hos 12 % pasienter med melanom og 3 % av pasienter med renal cellekarsinom (Lotze, Cell Transplantation 2, s. 33-47 (1993)). Selv om de fleste LAK-celler som hittil erkarakterisertbestår av aktiverte, naturlige dreper(NK)celler (Ortaldo et al., J. Exp. Med. 164, s. 1193-1205 (1986); Ferrini et al., J. Immunol. 138, s. 1297-1302 (1987); Phillips og Lanier, J. Exp. Med. 164, s. 814-825 (1986)), kan LAK-celler også dannes fra en undergruppe av T-celler kjent som yå-T-celler (T-celler som mangler de klassiske a(3-subenheter av T-cellereseptoren, og i stedet uttrykker y6-subenhetene (Ochoa et al., Cancer Res. 49, s. 693-700 (1989)). LAK-celler kan også dannes fra isolerte CD4+- eller CD8+-T-celler som er blitt dyrket i nærvær av IL-2 og anti-CD3-monoklonale antistoffer (Geiler et al., J. Immunol. 146, s. 3280-3288 (1991)). TIL(tumorinfUtrerende lymfocytter)celler er lymfocytter som er blitt isolert in vttro fra tumorer. På samme måte som LAK-celler kan disse celler ekspanderes ved dyrking i nærvær av cytokiner, slik som IL-2 eller IL-4, men i motsetning til LAK-celler er disse celler tumorspesifikke. Ved anvendelse av TIL-celler er det blitt observert en 20-50 % responsverdi hos

pasienter med melanom (Lotze, Cell Transplantation 2, s. 33-47

(1993)).

b. Forhøyelse av immunogenitet av tumorer

Andre metoder for tumorimmunterapi involverer økning av immunogeniteten av tumorceller, i stedet for forhøyelse av aktiviteten av responderende lymfocytter. Det er antatt at mange tumorceller mangler en grad av immunogenitet som fordres for å indusere en tilstrekkelig immunrespons (Houghton og Lewis, "Cytokine Induced Tumor Immunogenicity", ed. Forni et al., Academic Press, s. 35-54 (1994)).

Vanligvis aktiverer stimulatorceller (slik som tumorceller) T-celler ved å engasjere T-cellereseptorer med peptid forbundet med enten klasse I eller klasse II MHC-molekyler på stimulatorceller. Disse peptider kan enten opptas fra det eksterne miljø av stimulatorceller, i hvilket tilfelle de bearbeides og fremvises sammen med MHC klasse II-molekyler, eller de kan være peptider produsert endogent av stimulatorceller og deretter fremvist med MHC klasse I-molekyler. Fremvisning av eksogent avledede peptider ved hjelp av stimulator-cellen refereres til som indirekte fremvisning, fordi peptidene ikke fremvises på cellen fra hvilken de ble avledet. I tilfellet med direkte fremvisning fremvises peptider på overflaten av cellene fra hvilke peptidene ble avledet. Figur 1 er et skjematisk diagram som viser direkte, hhv. indirekte, fremvisning.

I tillegg til T-cellereseptoren og MHC-antigener, er det blitt identifisert et stort antall celleoverflateantigener som kan spille en rolle ved formidling av interaksjoner mellom antigenfremvisende celler og de reagerende T-celler. Disse kostimulerende molekyler inkluderer intercellulære adhesjons-molekyler (ICAM), vaskulært celleadhesjonsmolekyl 1 (VCAM-1), lymfocyttfunksjonassosiert antigen 3 (LFA-3), varmestabilt antigen (HSA) og CD28 på lymfocytter, og liganden B7 som må være til stede på den antigenfremvisende celle (Pardi et al., Immunol. Today 13, s. 224-230 (1992); Chen et al., Immunol. Today 14, s. 483-486 (1993)). Engasjement av T-cellereseptoren med den antigenfremvisende celle i fravær av kostimulerende molekyler, kan føre til T-celleanergi og svikt i immunresponsen mot tumoren (Gimmi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 90, s. 6586-6590 (1993)).

Entydige tumorantigener er blitt definert for flere tumorer, inkludert MAGE (van derBruggen et al., Science 254, s. 1643-1650 (1991)) og MART (Kawakami, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91, s. 3515-3519 (1994); Boon et al., Ann. Rev. Immunol. 12, s. 337-365 (1994)) mot melanomer og muciner mot bryst- og pankreastumorer (Finn, J. Cellular Biochem. 17D, s. 92 (1993); Domenech et al., J. Cellular Biochem 17D, s. 108 (1993); Fontenot et al., J. Cellular Biochem. 17D, s. 125 (1993)). Se også Brown, J. P. et al., US patent nr. 5 141 742 (melanom-assosiert antigen). Det er blitt observert at tumorceller ikke fremviser selvpeptider effektivt (direkte fremvisning) selv når cellene uttrykker MHC-antigener, hvilket antyder at det kan være en defekt/svikt i et annet molekyl som er nødvendig for effektiv direkte fremvisning av antigen av tumorceller. Mange tumorceller er blitt demonstrert å uttrykke lave nivåer av B7. En terapeutisk metode er således å gjenopprette immunogeniteten av tumorcellene ved innføring av genet for B7 hos pasientens tumorceller, for således å fremme direkte tumor-antigenfremvisning (Chen et al., Cell 71, s. 1093-1102 (1993) og EPO 600591; Chen et al., J. Exp. Med. 179, s. 523-532

(1994); Townsend og Alison, Science 259, s. 368-370 (1993); Baskar et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90, s. 5687-5690

(1993)). Innføringen av CD28 ligand-B7 mot immunogen lymfom, mastocytom, melanom eller sarkom, resulterte i økt CTL-aktivitet mot villtypetumor og beskyttelse mot etterfølgende injeksjon med villtypetumoren (Chen et al., Cell 71, s. 1093-1102 (1993) (melanom); Chen et al., J. Exp. Med. 179, s. 523-532 (1994) (mastocytom, fibrosarkom, lymfom, melanom, karsinom); Townsend og Alison, Science 259, s. 368-370 (1993); Baskar et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90, s. 5687-5690

(1993) (sarkom)). Injeksjon av EL4-lymfomceller som uttrykker B7- førte dessuten til en 60 % helbredelsesgrad hos mus med etablerte EL4-avledede tumorer (Chen et al., J. Exp. Med. 179, s. 523-532 (1994)). Transfeksjon av muse-tykktarmsadenosarkom eller fibrosarkom med gener for muse-klasse I-molekyler, kunne likeledes formidle regresjon av umodifisert tumor, selv om tumorer ikke ble fullstendig eliminert (Plautz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90, s. 4645-4649 (1993) (fibrosarkom, tykktarmskarsinom)). Denne metode festes for tiden i kliniske forsøk på mennesker (Nabel, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90, s. 94-97 (1993) (melanom)). I begge disse eksempler økte innfør-ingen av de fremmede gener direkte klasse I-formidlet gjenkjennelse av tumorcellene av vertens effektorceller. Responsen er tumorspesifikk. Behandling med den genetisk modifiserte tumor hadde ingen effekt på veksten av en urelatert tumor. Denne respons antas å kreve direkte celle-cellekontakt. Se også Hock et al., Gene Therapy Weekly, s. 22 (9. januar 1995)

(museneuroblastomceller som uttrykker klasse II-MHC).

En litt annerledes metode ble benyttet av Trojan et al. for behandling av glioblastom. Gliomceller uttrykker høye nivåer av insulinlignende vekstfaktor I (IGF-1). Behandling av gliomceller med et antisensegen for IGF-1 synes å reversere den tumorogene fenotype og gjør cellene immunogene. I disse undersøkelser resulterte injeksjon av gliomceller som uttrykker IGF-1 antisenssekvensen i eliminering av forhåndseksisterende tumor i alle behandlede dyr (Trojan et al., Science 259, s. 94-97 (1993)). Selv om denne respons ble vist å bli formidlet av CD8+ T-celler er det ikke klart hvorvidt de aktiveres direkte av de modifiserte tumorceller, eller indirekte via antigener opptatt av antigenfremvisende celler, eller begge.

Ytterligere metoder for forhøyelse av immunogeniteten av tumorer involverer utforming av tumorcellene til å uttrykke cytokingener slik som IL-2, IL-4, IL-6, tumornekrosefaktor, interferon-y eller granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) (Dranoff et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90, s. 3539-3543 (1993); Golumbek et al., Science 254, s. 713-716 (1991) (renal cellekarsinom); Gansbacher et al., Cancer Res. 50, s. 7820-7825 (1990); Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172, s. 1217-1224 (1990); Bannerji et al., J. Immunol. 152, s. 2324-2332 (1994) (fibrosarkom); Fearon et al., Cell 60, s. 397-403 (1990) (tykktarmskarsinom); Columbo et al., J. Exp. Med. 173, s. 889-897 (1991) (adenokarsinom); Haddada et al., Hum. Gene Therapy 4, s. 703-711 (1993) (mastocytom); Lollini et al., Int. J. Cancer 55, s. 320-329 (1993) (brystadeno-karsinom); Watanabe et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86, s. 9456-9460 (1989) (neuroblastom); Pardoll, Curr. Opin. Oncol. 4, s. 1124-1129 (1992); Tepper og Mule, Hum. Gene Therapy 5, s. 153-164 (1994); Porgador et al., Cancer Res. 52, s. 3679-3686 (1992) (Lewis lungekarsinom); se også WO 92/05262 Hopkins/University of Texas. Her er også de genetisk modifiserte tumorceller i stand til å stimulere en immunrespons i situasjoner hvori stamtumorlinjene er ikke-immunogene. Forskere på dette område har observert at immunresponsen omfatter destruksjon av immunmodifiserte tumorceller, så vel som de konstruerte tumorceller, og kan i noen tilfeller føre til fullstendig regresjon av forhåndseksisterende tumor hos eksperimentdyr (Dranoff et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90, s. 3539-3543 (1993); Golumbek et al., Science 254, s. 713-716

(1991); Gansbacher et al., Cancer Res. 50, s. 7820-7825

(1990); Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172, s. 1217-1224

(1990); Bannerji et al., J. Immunol. 152, s. 2324-2332 (1994)

(fibrosarkom); Fearon et al., Cell 60, s. 397-403 (1990); Columbo et al., J. Exp. Med. 173, s. 889-897 (1991); Haddada et al., Hum. Gene Therapy 4, s. 703-711 (1993); Lollini et al., Int. J. Cancer 55, s. 320-329 (1993); Watanabe et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86, s. 9456-9460 (1989); Pardoll, Curr. Opin. Oncol. 4, s. 1124-1129 (1992); Tepper og Mule, Hum. Gene Therapy 5, s. 153-164 (1994); Porgador et al., Cancer Res. 52, s. 3679-3686 (1992); Vieweg et al., Gene Therapy Weekly, s. 20 (21. november 1994) (prostatacancer)).

Disse eksperimentprotokoller involverer generelt immunisering av dyr én eller flere ganger med bestrålede tumorceller som er blitt genetisk konstruert til å uttrykke det eksogene gen. Bestråling forhindrer cellene fra å dele seg, men reduserer ikke deres antigenitet. Antitumorresponser testes deretter på én av tre måter: (i) dyrene utfordres med umodifiserte tumorceller etter at immuniseringsprosessen er fullført; (ii) dyrene utfordres med umodifiserte tumorceller under vaksinasjonsprosessen; eller (iii) små tumorer etableres før immunisering med modifiserte tumorceller.

Hovedmengden av undersøkelsene med benyttelse av genetisk modifiserte tumorceller har involvert innføringen av cytokingener i forskjellige tumorer (se Pardoll, Curr. Opin. Oncol. 4, s. 1124-1129 (1992); Tepper og Mule, Hum. Gene Therapy 5, s. 153-164 (1994) for oversikt. Ett av de mest effektive molekyler er GM-CSF (granulocytt-makrofag-koloni-stimulerende faktor) som forsterker spesifikk immunitet overfor atskillige tumortyper (Dranoff et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90, s. 3539-3543 (1993) (B16-melanom, tykktarmskarsinom, lungekarsinom, fibrosarkom, renal karsinom)). GM-CSF er unikt ved at den kan formidle dens antitumoreffekt ved å stimulere proliferasjonen av differensieringen av de dendrittiske celler som er ytterst potente antigenfremvisende celler som er i stand til å fremvise antigener mot både CD4+- og CD8+-T-celler (Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9, s. 271-296

(1991)). Metzinger har nylig antydet at den eneste måte som immunsystemet kan aktiveres for å reagere på tumorer, er via utspredte antigener som opptas og fremvises av profesjonelle antigenfremvisende celler, slik som dendrittiske celler (Metzinger, Ann. Reg. Immunol. 12, s. 991-1045 (1994)). Bannerji et al., har nylig antydet at avvisningen av IL-2-ut-skillende fibrosarkomceller ikke er T-celleformidlet, selv om den etterfølgende systemiske immunitet er avhengig av til-stedeværelsen av både CD4+- og CD8+-T-celler (Bannerji et al., J. Immunol. 152, s. 2324-2332 (1994)). Deres hypotese er at ødeleggelse av de modifiserte celler formidles av NK-celler og fører til frigivelse av tumorantigener som kan opptas av antigenfremvisende celler som uttrykker både klasse I- og klasse II-molekyler på deres celleoverflate. Disse celler vil deretter være i stand til å aktivere både CD4+- og CD8+-T-celler. En lignende modell er diskutert av Shoskes og Wood (Shoskes og Wood, Immunol. today 15, s. 32-38 (1994)).

I nylige eksperimenter har Cohen og medarbeidere vært i stand til å forlenge overlevelse av mus med forhåndseksisterende melanom, ved å injisere dyrene med allogene fibroblaster som er blitt transfektert med genet for IL-2 og DNA isolert fra melanomceller (Kim og Cohen, Cancer Res. 54, s.- 2531-2535 (1994)). Ved anvendelse av allogene celler er det intet behov for å bestråle cellene, hvilket kunne påvirke cytokinekspresjon. Fordi de transfekterte celler er fibroblaster danner de ikke tumorer, og fordi de er allogene aktiverer de lett immunsystemet. Fordi de allerede er avvist foreligger det imidlertid ingen langtidsstimulering av immunsystemet. Andre har blandet cytokinuttrykkende fibroblaster med bestrålede tumorceller og deretter administrert blandingen som en vaksine (WO 93/07906, PCT US92/08999). Ytterligere andre har koblet ikke-tumorøse fibroblastceller til et adjuvans og administrert cellene som en tumorvaksine (Eggers, US patent nr. 5 208 022).

En ytterligere terapi for forebyggelse og behandling av tumorer er immunisering med tumorantigener (WO 93/06867 Pardoll, Mulligan). En annen vaksineprotokoll er administrering av bestrålede tumorceller sammen med et bakterielt adjuvans (Pardoll, 5 Cur. Opin. Immunology, s. 719-725

(1993)). Andre har bestrålet umodifiserte tumorceller og administrert dem alene som en vaksine (Dranoff et al., 90 PNAS, s. 3539-3543, figur 4A (1993)).

c. Tumorevolus i on

De fleste cancere antas å være klonale i opprinnelse, og det antas at nye subpopulasjoner oppstår kontinuerlig under evolusjon av en cancer på grunn av Darwins utvelgelse av genetiske varianter som har en vekstfordel. Noen av de genetiske varianter er karakteristiske for en spesiell tumortype, og kan faktisk tjene som basis for klassifikasjon av alvorlig-heten av tumor, i andre tilfeller er endringene idiotypiske, dvs. spesifikke for individets egen tumor. Mutasjoner som forårsaker vekstfordel inkluderer mutasjoner i vekstregulerende gener, endringer i morfologi, hormonavhengighet, enzymmønstre og overflateantigener. Noen av disse endringer kan tillate at de unormale celler unnslipper enten homøostatisk kontroll hos pasienten, eller ødeleggelse ved behandling. Konvensjonelle kjemoterapier er ofte innledningsvis effektive ved å forsinke utviklingen av sykdom. Med tiden blir imidlertid gjentatte behandlinger mindre effektive, kanskje gjennom evolusjon av suksessivt mindre sensitive kloner (G. Klein og E. Klein, PNAS USA 74, s. 2121 (1977)). Se også Schreiber, H., "Tumor Immunology", kap. 32 i Fundamental Immunology W. Paul, ed.

(1993).

d. Diffusionskammere

Diffusjonskammere som forhindrer celle-til-celle-kontakt er blitt anvendt i mange år for å undersøke immunologiske mekanismer. Klein et al. har anvendt tumorceller i et diffusjonskammer som en modell for å undersøke vertens immunrespons overfor tumorceller. De konkluderer med at tumorceller produserer oppløselige faktorer som fremmer forsinket type-hypersensitivitet, og stimulerer også angiogenese som fremmer tumorvekst (Tumor Biol., 15, s. 160-165 (1994)).

Stillstrøm nar implantert tumorceller i dirrusjons-kammere for å indusere immunitet hos gnagere, og funnet at etter 10 uker var immunitetsnivået indusert av tumorceller i et diffusjonskammer deponert subkutant i 7 dager, 10-100 ganger lavere enn nivået oppnådd med direkte inokulerte celler. I andre eksperimenter fant han ingen vesentlig for-skjell i immuntilstanden hos dyr inokulert direkte og dyr gitt diffusjonskammere inneholdende tumorceller. De fant også at kammere ble avvist hvis de ble etterlatt subkutant i flere uker (Acta Path. Microbiol. Scand., Sect. B 82, s. 676-686

(1974)).

Biggs og Eiselein anvendte diffusjonskammere for å vise at en bestemt tumorcelletype frigir en viruspartikkel som diffunderer ut av kammeret og tilveiebringer immunitet overfor etterfølgende utfordring med tumorcellene. De viste også at meget lav porøsitet av kammere kan forhindre immunisering (Cancer Research, vol. 25, s. 1888-1893 (1965)).

Cochrum et al., US patent nr. 5 015 476 beskriver anvendelse av lymfokiner eller cytokiner som et adjuvans ved mikroinnkapsling av parasitter, og implantering av disse for å oppnå immunisering mot parasittinfeksjon.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den nye cancerterapi ifølge foreliggende oppfinnelse helbredet 60 % av dyrene med eksperimentell tumor. Når anvendt ved forebyggelse av cancer var metoden 100 % effektiv. Ingen eksperimentdyr utviklet tumorer, til tross for utfordring med en injeksjon av 10<6>tumorceller.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for forebyggelse eller behandling av cancer hos en pasient, omfattende: Administrering av et første sett av tumorceller hvori minst noen av de første tumorceller er minst ett tumorantigen som tilsvarer antigen funnet på pasientens tumorceller, hvori tumorcellene er inneholdt i et implanterbart kammer som er definert ved hjelp av vegger som inkluderer en porøs grense mellom pasientens immunceller og de inneholdte celler, hvilken grense er mottakelig for subcellulært antigenmateriale, hvorved grensen forhindrer kontakt mellom pasientens immunceller og de inneholdte tumorceller, og hvor ved grensen tillater at subcellulært antigenmateriale trenger ut i kammeret. De administrerte tumorceller kan være umodifiserte, eller tumorcellene kan være modifisert til å uttrykke og utskille et immunpotenserende molekyl (f.eks. lymfokiner).

Alternativt, i stedet for tumorceller, kan de administrerte celler være utransformerte, somatiske celler konstruert til å uttrykke tumorassosierte antigener eller andre antigener; og de kan ytterligere være konstruert til å uttrykke cytokiner. Tumorcellene kan være levende eller bestrålede. Tumorcellene kan administreres profylaktisk for å forebygge utvikling av tumorer, eller terapeutisk for å behandle eksisterende tumorer eller metastaser. Tumorcellene kan være autologe tumorceller administrert etter kirurgisk fjerning av en tumor. De kan være allogene, eller de kan være fra en tumorcellelinje utviklet fra en allogen donor. Tumorcellene kan administreres før, under eller etter andre cancer-terapier, slik som kjemoterapi eller strålingsterapi. De kan administreres sammen med lokal administrering av cytokiner ved anvendelse av f.eks. liposomer.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse

holdes administrerte tumorceller atskilt fra pasientens celler ved anvendelse av ethvert egnet, implanterbart celleinneholdende kammer som kan tilbakeholde tumorcellene og tillate subcellulært materiale å passere til og fra kammeret. Kammeret forhindrer celle-til-celle-kontakt mellom de administrerte celler og pasientens immunceller. Tumorcellene kan implanteres på. stedet for en eksisterende tumor, eller på et sted fjernt fra en tumor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et kammer inneholdende tumorceller.

I en alternativ utførelsesform administreres bestrålede tumorceller i kammeret med eller uten levende tumorceller også i kammeret. Fortrinnsvis er kammeret slik at det tillater levende tumorceller å overleve etter implantasjon i en lengre tidsperiode enn de ville overleve dersom de var i kontakt med celler fra pasientens immunsystem.

I en annen alternativ utførelsesform er kammeret slik at det tillater bestrålede tumorceller inneholdt i kammeret å overleve etterfølgende implantasjon i en tidsperiode lengre enn de ville overleve dersom de var i kontakt med celler fra pasientens immunsystem. Med andre ord forsinker eller forhindrer kammeret fortrinnsvis avvisning av de inneholdte celler. I en foretrukket utførelsesform er kammeret av en type som forårsaker en kronisk sårhelingsinflammasjon på dets overflate, som virker som et adjuvans for å forhøye pasientens immunrespons overfor de implanterte tumorceller.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten en ny cancerterapi omfattende (i) administrering av tumorceller i et implanterbart, celleinneholdende kammer, i kombinasjon med (ii) administrering av tumorceller som er blitt gjort ikke-tumorigene. Tumorcellene som er blitt gjort ikke-tumorigene administreres utenfor kammeret som en inokulering av "frie" celler. De gjøres fortrinnsvis ikke-tumorigene ved bestråling. Alternativt kan det anvendes enhver metode som gjør cellene ikke-tumorigene. Det er f.eks. rapportert at administrering av ubestrålede tumorceller i kombinasjon med IL-2 gjør cellene ikke-tumorigene. I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan tumorceller administrert utenfor kammeret være umodifiserte, eller de kan være modifiserte for å uttrykke et immunpotenserende polypeptid. Alternativt, i stedet for tumorceller, kan cellene administrert utenfor kammeret være utransformerte celler konstruert for ekspresjon av tumorassosierte antigener eller andre antigener med eller uten cytokiner. De kan være autologe eller allogene, eller de kan være fra en cellelinje utviklet fra autologe eller allogene celler.

Tumorcellene implantert i kammeret, eller utenfor kammeret, kan være autologe, dvs. at de er tatt fra en eksisterende tumor hos pasienten. Alternativt kan de være allogene: Tatt fra et annet individ med tumorceller med tumorantigener som tilsvarer antigenene funnet hos pasientens tumorceller, eller de kan være fra en tumorcellelinje som tilsvarer den type tumor som skal behandles eller forebygges hos pasienten. De kan også være ikke-tumorceller konstruert til å uttrykke tumorassosierte antigener eller andre antigener, med eller uten samtidig ekspresjon av cytokiner.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er en skjematisk tegning som illustrerer

direkte, hhv. indirekte, antigenfremvisning.

Figur 2 er en tegning av kammeret anvendt i en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse. Figur 3 er en tabell som viser responsen fra mus overfor tumorutfordring etter behandling i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, som beskrevet i eksempel 1. Dyr ble implantert med to anordninger som hver inneholdt IO<5>

celler. Ett dyr mottok kun én anordning. Alle dyr ble gitt den første utfordring med IO<6>frie MCA-38-celler tre uker etter implanteringen. I eksperiment I var en andre utfordring 8 uker etter implanteringen; i eksperiment 2 ble en andre utfordring gitt 11 uker etter implanteringen.

Figur 4 viser antallet dager for påvisning av tumor

på utfordringsstedet hos dyr utfordret med IO<3>MCA-38-celler på tidspunktet for implantasjon av anordning, som beskrevet i eksempel 1. Kontrolldyr mottok ikke anordninger.

Figur 5 viser størrelsen av gjenværende subkutane

masser hos hund 142-3 etter implantasjon av anordninger inneholdende vev fra en utskåret masse som beskrevet i eksempel 2.

Figur 6 illustrerer størrelsen av den gjenværende tumormasse hos hund 4008 etter kirurgisk fjerning av > 95 % av tumoren. Fjernet tumor ble anvendt som kilde for vev for å

fylle anordninger som ble implantert subkutant, som beskrevet i eksempel 2.

Figur 7 (fra eksempel 3) viser overlevelsesgraden for C57/B6-mus hvori forhåndseksisterende MCA-38-tumor ble be-

handlet ved administrering av bestrålede MCA-38-tumorceller,

både i og utenfor kammeret. Den viser også overlevelsesgraden for behandling ved administrering av ubestrålede celler i kammeret i kombinasjon med ubestrålede celler utenfor kammeret.

Figur 8 (fra eksempel 3) viser overlevelsesgraden for C57/B6-mus hvori forhåndseksisterende MCA-38-tumor ble behandlet ved administrering av bestrålede og ubestrålede MCA-38-tumorceller både i og utenfor kammeret. Figur 9 (fra eksempel 3) viser overlevelsesgraden for C57/B6-mus hvori forhåndseksisterende MCA-38-tumor i det dorsale subkutane rom ble behandlet ved administrering av bestrålede tumorceller både i og utenfor kammeret. Figur 10 viser protokollen for et eksperiment ifølge eksempel 4. Figur 11 (fra eksempel 4) viser overlevelsesgraden for C57/B6-mus hvori forhåndseksisterende MCA-38-tumor ble skåret bort og deretter behandlet ved administrering av kammere inneholdende ubestrålede MCA-38-tumorceller, og ingen celler utenfor kammeret. Figur 12 viser protokollen for eksperimentet ifølge eksempel 5. Figur 13 (fra eksempel 5) viser overlevelsesgraden for C57/B6-mus utfordret med B16-melanom etter først å ha blitt immunisert med B16-melanom utviklet i, og overført fra, syngene dyr. Figur 14 (fra eksempel 6) viser overlevelsesgraden for C57/B6-mus utfordret med C57-ovarietumor 4 uker etter at de først var immunisert med både frie, bestrålede V57-overie-tumorceller og anordninger inneholdende bestrålet C57-ovarie-tumor.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

En ny fremgangsmåte for tumorterapi er beskrevet som omfatter administrering av tumorceller til en pasient under forhindring av celle-til-celle-kontakt mellom minst noen av de administrerte tumorceller og pasientens immunceller. Som anvendt heri skal "tumor" inkludere faste tumorer, metastat-iske tumorceller og ikke-faste cancere i blodet, margen og de lymfatiske systemer. "Tumor" skal inkluderer: karsinomer (cancere avledet fra epitelceller), sarkomer (avledet fra mesenkymalt vev), lymfomer (faste tumorer av lymfoidvev) og leukemier (tumorer fra marg eller blod av lymfocytter eller andre hematopoetiske celler).

Som anvendt heri skal "behandling" av, eller "terapi" mot cancer, inkluderer fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse som eliminerer eksisterende tumor, forsinker syk-domsutvikling, reduserer størrelsen av eksisterende tumor, forhindrer tumorforstørrelse som ville forekomme uten behandling eller terapi, forsinke inntreden av tumordannelse, forsinke tumorforstørrelse og fremgangsmåter som forhindrer, reduserer eller forsinker metastaser. Som anvendt heri skal "metastaser" bety tumorceller lokalisert på steder uten for-bindelse med den opprinnelige tumor, vanligvis ved lymfatisk og/eller hematogen spredning av tumorceller.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse implanteres tumorcellene hos pasienten ved anvendelse av kammere som forhindrer celle-til-celle-kontakt mellom tumorcellene og pasientens immunceller. Fortrinnsvis oppnås denne atskillelse ved anvendelse av en anordning som beskrevet i PCT-patentsøknad WO 92/07525, som herved er inkorporert i sin helhet heri ved referanse, eller anordningen beskrevet i US patentsøknad nr. 8/179 860, som også er inkorporert heri ved referanse i sin helhet. Anvendelse av en anordning av denne type forhindrer celle-til-celle-kontakt, tillater subcellulært materiale å passere gjennom kammeret og tilveiebringer blod-karsirkulasjon hos pasienten på implantasjonsstedet. Den unn-går dessuten dannelse av en klassisk fremmed kroppskapsel og den tilveiebringer en kronisk sårhelingsinflammasjon på dens overflate som virker som et adjuvans.

Enhver anordning for cellulær atskillelse som tillater de implanterte tumorceller å reagere med pasientens

immunsystem på enhver måte unntatt gjennom direkte celle-til-celle-kontakt vil være egnet. Alternative midler vil inkludere hule fibrer, platemembraner eller innkapsling av enkle tumorceller eller grupper av tumorceller i, f.eks., alginat-makro-eller mikrokapsler eller i liposomer. Anvendelse av et kammer som kan uttas intakt fra pasienten er foretrukket, spesielt dersom levedyktige tumorceller administreres i kammeret. Dette gir fordelen ved å være i stand til å fjerne de inneholdte tumorceller fra pasienten. Anvendelse av det foretrukne kammer har også den fordel at det tillater administrering av levende autologe tumorceller, levende allogene tumorceller eller levende ikke-tumorøse allogene eller autologe celler konstruert for å uttrykke tumorantigener.

Tumurcellevaksiner ifølge kjent teknikk administrert til pasienter, anvender generelt bestrålede tumorceller eller allogene celler uten kammere eller innkapslingsteknikker. I overensstemmelse med en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir ubestrålede, levende celler inneholdt i kammeret ikke avvist eller ødelagt av vertens immunrespons, og antas å ha en kontinuerlig immunstimulerende effekt så lenge de over-lever. I motsetning til dette tilveiebringer de ikke-levedyktige tumorceller ifølge kjent teknikk kun forbigående stimulering, fordi de hurtig fjernes fra verten. Kammeret kan implanteres hos pasienten og senere fylles med celler, eller kammeret kan fylles før implantasjon.

Tumorceller administrert i kammeret i kombinasjon med administrering av frie, ubestrålede celler kan overraskende tilveiebringe en terapi som er overlegen hver teknikk anvendt separat. Selv om søkerne ikke kjenner mekanismen for dette resultat er det antatt at anvendelse av frie celler tillater tidlig celle-til-celle-kontakt for å initiere en forhøyet immunrespons, og anvendelsen av celler i et kammer tillater en etterfølgende forlenget, forhøyet immunrespons.

I tilfellet med behandling av en eksisterende tumor er de administrerte celler fortrinnsvis autologe celler og omfatter fortrinnsvis en blanding av alle de forskjellige celler som kan være til stede i en heterolog tumor. Fortrinnsvis gjenspeiler de administrerte tumorceller heterogeniteten av pasientens egen tumor. Hovedmengden av tumoren (tumorer) til stede hos pasienten fjernes ved anvendelse av konvensjonelle, kirurgiske teknikker. Fjernede tumorceller oppsamles, blandes i et egnet medium og fylles i et kammer, eller flere kammere, avhengig av den ønskede dose av celler. Cellene i kammeret kan være bestrålet eller ikke. Kammere kan implanteres subkutant, intraperitonealt, på eller i stedet for tumoren uansett vevstype, eller på ethvert annet egnet sted. Det fylte kammer kan administreres i kombinasjon (eller ikke i kombinasjon) med administreringen av frie, ikke-levedyktige (bestrålede) tumorceller på kammerimplanteringsstedet, eller fjernt fra kammerimplanteringsstedet. Flere kammere og flere steder kan anvendes.

Dersom allogene tumorceller anvendes er de fortrinnsvis fra en tumorcellelinje som uttrykker minst ett av antigenene uttrykt av pasientens tumor, som bestemt ved tumorbiopsi. De allogene celler administreres i kammeret som beskrevet heri. De inneholdte celler kan være bestrålet eller ikke. De allogene celler kan dessuten være bestrålet og kan også administreres som frie celler.

Alternativt, i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, kan kammeret inneholdende tumorceller administreres med en dose av immunpotenserende molekyler (f.eks. lymfokiner). Dosen kan administreres ved anvendelse av ikke-tumorøse celler (f.eks. fibroblaster) konstruert for å uttrykke og utskille immunpotenserende molekyler (f.eks. lymfokiner). De fylte kammere kan administreres med eller uten frie, bestrålede tumorceller, med eller uten immunpotenserende molekyler. De konstruerte celler kan uttrykke flere en ett cytokin eller immunpotenserende molekyl. Andre kilder for direkte lokal administrering av immunpotenserende molekyler kan anvendes, slik som liposomer, mikrokapsler, tidsfrigiv-elseskapsler eller mikropumper, hvilke alle er kjent i lege-middelutleveringsteknikken.

Som anvendt heri inkluderer "immunpotenserende molekyl" ethvert molekyl som stimulerer eller forhøyer

aktiviteten av immunsystemet ved anvendelse i kombinasjon med kammeret og tumorcellene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fagfolk vil erkjenne at dette kan inkludere cytokiner, så vel som antigene lipider som inkluderer fosfolipider, hormoner, karbo-hydrater, nukleinsyrer, viruspartikkelkomponenter, bakterielle celleantigener og proteiner. Fagfolk vil erkjenne at, for å

kunne anvendes ved foreliggende oppfinnelse, må det immunpotenserende molekyl være til stede i tilstrekkelig høye mengder og en grad av antigenitet som er tilstrekkelig til å forhøye, stimulere eller utløse en immunrespons. Det immunpotenserende molekyl kan være utskilt eller utspredt fra levende eller bestrålede celler, eller kan være et nedbryt-ningsprodukt fra døde celler; eller det kan være et syntetisk eller renset legemiddel. Noen immunpotenserende molekyler er beskrevet i Frost et al., WO 92/05262. Anvendelsen av cytokiner som sofistikerte immunadjuvanser er kjent i teknikken og beskrevet av Houghton og Lewis i "Active Specific Immuno-therpay in Humans" kap. 5 i "Cytokine Induced Tumor Immunogenity", red. Forni, G. et al. (1994). Golumbek, P. T. et al., beskriver koinjeksjon av bestrålede tumorceller pluss GMC-SF inneholdt i mikrokapsler, som en cancervaksine i en musemodell (Cancer Research, 53, s. 5841-5844 (15. desember 1993) ).

Ved bestemmelse av protokoller som inkluderer egnede doser kan en fagperson referere til de mange publiserte protokoller godkjent av National Institutes of Health Recombinant DNA Advisory Committee for cancervaksiner som benytter bestrålede, modifiserte eller umodifiserte tumorceller. Se f.eks. Human Gene Therapy April 1994 vol. 5, s. 553-563 og referanser deri til publiserte protokoller. Disse publiserte protokoller inkluderer: (i) Immunization of Cancer Patients Using Autologous Cancer Cells Modified by Insertion of the Gene for Tumor Necrosis Factor, hovedforsker: S. A. Rosenberg, Human Gene Therapy 3, s. 57-73 (1992); (ii) Immunization of Cancer Patients Using Autologous Cancer Cells Modified by Insertion of the Gene for Interleukin-2, hovedforsker: S. A. Rosenberg, Human Gene Therapy 3, s. 75-90 (1992); (iii) A Pilot Study of Immunization with Interleukin-2 Secreting Allogeneic HLA-A2 Matched Renal Cell Carcinoma, hovedforsker: B. Gansbacher, Human Gene Therapy 3, s. 691-703 (1992); (iv) Immunization with Interleukin-2 Transfected Melanoma Cells. A Phase I-II Study in Patients with Metastatic Melanoma, Human Gene Therapy 4, s. 323-330 (1993); (v) Gene Therapy of Cancer: A Pilot Study of IL-4 Gene Modified Fibroblasts Admixed with Autologous Tumor to Elicit an Immune Response, hovedforsker: M. T. Lotze og I. Rubin, Human Gene Therapy 5, s. 41-55 (1994)

(melanom, renal cellekarsinom, bryst, tykktarm); (vi) en protokoll ble godkjent 17. februar 1995 for tykktarmscancer, som kombinerer tumorceller pluss fibroblaster konstruert til å uttrykke IL-2 (San Diego Regional Cancer); (vii) Phase I Study of Cytokine-Gene Modified Autologous Neuroblastoma Cells for Treatment of Relapsed/Refactory Neuroblastoma; hovedforsker: M. K. Brenner; RAC godkj. nr. 9206-018; (viii) Phase I Study of Non-replicating Autologous Tumor Cell Injections Using Cells Prepared with or without Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor Gene Transducing in Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma; hovedforsker: J. Simons; RAC godkj. nr. 9303-040; (ix) Phase I Trial of Human Gamma Interferon-Transduced Autologous Tumor Cells in Patients with Disseminated Maligant Melanoma; hovedforsker: H. F. Seigler; RAC-søknad nr. 9306-043; (x) Phase I Study of Transfected Cancer Cells Expressing the Interleukin-2 Gene Product in

Limited Stage Small Cell Lung Cancer; (xi) Immunization of Malignant Melanoma Patients with Interleukin-2 Secreting

Melanoma Cells Expressing Defined Allgeneic Histocompatibility Antigens; hovedforsker: T. K. Das Gupta; RAC-søknad nr. 9309-056; og (xii) Genetically Engineered Autologous Tumor Vaccines Producing Interleukin-2 for the Treatment of Metastatic Melanomas; hovedforsker: J. S. Economon; RAC-søknad nr. 9309-058. Disse protokoller er herved inkorporert heri ved referanse i sin helhet. Se også PCT-søknad WO 93/07906 for en cancerterapiprotokoll er beskrevet for celler som uttrykker IL-2 og PCT-søknad WO 94/18995 hvor en protokoll for administrering av allogene melanomceller som utskiller IL-2 (RAC godkjennelse nr. 9206-021) er beskrevet. En fagperson vil erkjenne at delene deri som angår pasientutvelgelse, dose, forhåndsbehandlingsevaluering, samtidig terapi og behandling av potensiell toksisitet, alle er anvendelige ved foreliggende oppfinnelse. Den ønskede dose er generelt det antall celler som vil være effektiv for å utløse en beskyttende immunrespons fra pasienten mot tumorcellene. For å behandle en pasient på 70 kg som har en tumor som veier ca. 150 g, ville det f.eks. administreres ca. 5 x IO<7>til 5 x 10<8>autologe, bestrålede eller ubestrålede, tumorceller inneholdt i totalt 5 til 10 anordninger som rommer 40 ul og som er beskrevet i US patent-søknad nr. 8/179 860, innsendt 11. januar 1994, eller det nød-vendige antall slike anordninger for å inneholde det ønskede antall tumorceller. Inntil et lignende antall frie, bestrålede celler kan administreres samtidig. En reduksjon av størrelsen av tumorer til stede hos pasienten burde komme til syne innen ca. 3 uker og opp til noen få måneder. Elimineringen av metastaser kan være vanskeligere å påvise.

Implantatet kan etterlates hos pasienten i flere uker for en forbigående virkning. For behandling av eksisterende tumorer bør implantatet fortrinnsvis forbli hos pasienten så lenge som det er en mulighet for at det foreligger tumorer. For forebyggelse av tumorer bør implantatet forbli hos pasienten så lenge som pasienten fortsatt risikerer å utvikle tumorer. Ett eller flere av implantatene kan fjernes en gang i blant for å bestemme levedyktigheten av de implanterte tumorceller. Frie, bestrålede celler kan administreres ved tids punktet for implanteringen, og readministreres på nytt etter en viss tid, slik at de opprinnelige, frie, bestrålede celler sannsynligvis er ødelagt av pasientens immunsystem, ca. 2 til 6 uker. Dersom, slik som i en utførelsesform, fortsatt leve-dyktighet av tumorceller er ønsket, kan om ønskelig implantat-anordningene fjernes og erstattes med nye anordninger som inneholder friske tumorceller. Alternativt kan implantatet tømmes og fylles på nytt på stedet uten at det fjernes. Erstatningstumorcellene kan være celler innhøstet på tidspunktet for den opprinnelige tumorreseksjon, og nedfrosset for senere bruk, dersom autologe tumorceller ble administrert.

I tilfellet med administrering av allogene tumorceller vil lignende retningslinjer følges. Minst noen av antigenene eller de oppløselige faktorer i donortumorcellene tilsvarer fortrinnsvis de som finnes i pasientens tumorceller, som bestemt ved tumorbiopsi.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan, når ønskelig, tumorceller gjøres ikke-tumorfremkallende ved bestråling, ved mitomycin C-behandling eller andre behandlinger kjent i teknikken.

Humane cellelinjer konstruert til å uttrykke kjente, humane tumorspesifikke antigener kan dannes og deretter administreres i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse. Eksempler på slike kjente tumorantigener inkluderer MAGE, MART og muciner. US patent nr. 5 141 742, Brown et al., beskriver melanomassosierte antigener. Antigenet (antigenene) i de administrerte celler tilsvarer også her, i det minste delvis, antigenene i pasientens tumorceller, som bestemt ved tumorbiopsi. Fremstillingen av humane cellelinjer, og konstruk-sjonen av slike celler til å uttrykkeønskede antigener, involverer teknikker kjent for fagfolk. Cellene er fortrinnsvis av en type som effektivt uttrykker det ønskede antigen, eller oppløselige faktorer. Den genetiske modifikasjon av cellene kan utføres ved hjelp av én eller flere velkjente teknikker på genterapiområdet (Human Gene Therapy April 1994, vol. 5, s. 543-563). En vanlig anvendt teknikk for levering av ekstern DNA til celler involverer anvendelse av retrovirus-vektorer. Disse vektorer kan infisere store prosentmengder av målcellene og kan integrere i cellegenomet. Retrovirus- vektorene konstrueres til å være replikasjonsdefekter i ut-valgte cellelinjer, og er derfor ikke i stand til å infisere utransduserte celler. Andre virusvektorer som er foreslått eller anvendt for levering av DNA i celler, inkluderer adeno-virus, adenoassosiert virus, herpesvirus og poliovirus. Retrovirus- og adenoassosierte virusvektorer er oftest foreslått eller anvendt for ex vivo-genterapi, dvs. DNA-levering i celler fjernet fra pasientens kropp.

Ikke-retrovirus-utleveringsteknikker som er blitt anvendt eller foreslått for genterapi, inkluderer DNA-ligand-komplekser, gengeværteknikker og elektroporering, og lipofek-sjon. Under de fleste betingelser vil disse utleveringsteknikker, så vel som bestemte virusvektorer som adenovirus-vektorer, ikke føre til signifikant integrasjon av DNA i cellegenomet. Dette betyr at stabile transformasjoner av mot-takercellene med det eksterne DNA forekommer med meget lav frekvens. Avhengig av de spesielle betingelser vil enten virus- eller ikke-virusmetoder være egnede for innføring av gener i celler som deretter implanteres i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse. Genetisk manipulering av primære tumorceller er beskrevet tidligere (Patel et al., Human Gene Therapy 5, s. 577-584 (1994)).

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for forebyggelse av cancer er spesielt egnet for pasienter med høy risiko for utvikling av tumorer; f.eks. de individer som ved genetisk screening er identifisert til å ha høy risiko for utvikling av tumorer. Som en terapi for pasienter diagnostisert med cancer er terapien ifølge foreliggende oppfinnelse spesielt egnet for pasienter som har gjennomgått vellykket tumorreseksjon og pasienter som har en høy risiko for tilstedeværelse for mikrometastaser.

Kammeret anvendt ved foreliggende oppfinnelse forhindrer direkte celle-til-celle-kontakt mellom cellene hos pasientens immunsystem og cellene i kammeret. Det foretrukne kammer ifølge foreliggende oppfinnelse (figur 2) er en anordning som omfatter to dobbeltlagede membraner (1) omgitt av en polyesternetting (2) som er støpt sammen ved hjelp av ultra-lyd, med en åpning (3) for tilgang til hulrommet (4). Hvert dobbeltlag omfatter en 5 um PTFE-membran produsert av Gore, Flagstaff, Arizona, produkt nr. L31324 og en 0,45 ym PTFE-membran produsert av Millipore, Bedford, Massachusetts, produkt nr. SF1R848E1. I én ende er det en polyester (PE 90 ID 0,034 "ved OD 0,050") åpning for å tillate tilgang til det indre av anordningen for celler som skal tilføres. Anordningen har et indre hulrom. Denne anordning er beskrevet i patent-søknad nr. 8/179 860, innsendt 11. januar 1994, og patent-søknad nr. 8/210 068, innsendt 17. mars 1994. Tidligere under-søkelser har vist at denne foretrukne anordning har den fordel (selv om den ikke er nødvendig for alle utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse) at den er i stand til å beskytte allotransplantatvev mot immunawisning i forlengede perioder (Carr-Brendel et al., J. Cellular Biochem. 18A, s. 223 (1994) og Johnson et al., Cell Transplantation 3, s. 220 (1994)).

Andre celleinneholdende kammere som fagfolk kan finne anvendelige ved foreliggende oppfinnelse inkluderer: Agarose-mikrokapsler (Iwata et al., J. Biomed. Mater. Res. 26, s. 967-977 (1992); J. Bioact. og Comp. Polymers 3, s. 356-369 (1988) og Depuy et al., J. Biomed. Mater. Res. 22, s. 1061-1070

(1988) ); hule fibrer av XM50 (Winn et al., J. Biochem. Mater. Res. 23, s. 31-44 (1989) og Altman et al., Proe. of Third Meeting of ISAO, Supp. 5, s. 776-779 (1981); Diabetes, 35, s. 625-633 (1986)); alginatpolylysin (Wong et al., Biomat., Art. Cells and Immob. Biotech. 19, s. 675-686 (1991)); mikrokapsler av alginatpolylysin (0'Shea et al., Biochim. et Biophy. Acta 804, s. 133-136 (1984), Sun et al., App. Biochem. og Biotech. 10, s. 87-99 (1984), Chicheportiche et al., Diabetologia 31, s. 54-57 (1988) og Goosen et al., US patent nr. 4 689 293, 25. august 1987; US patent nr. 4 487 758, 11. desember 1984; US patent nr. 4 806 355, 21. februar 1989 og US patent nr. 4 673 566, 16. juni 1987); Kitosanalginat (McKnight et al., J. of Bioact. og Comp. Poly. 3, s. 334-355 (1988)); polyakrylonitril eller andre ultrafiltreringsmembraner i en U-formet anordning (Moussy et al., Artif. Org. 13, s. 109-115

(1989) , Lepeintre et al., Artif. Org. 14, s. 20-27 (1990) og Jaffrin og Reach, US patent nr. 4 578 191, 25. mars 1986); hule fibrer av polyakrylonitril (Aebischer et al., Biomat.

12., s. 50-56 (1991) og Lacy et al., Science 254, s. 1782-1784

(1991)); sporetsede polykarbonatmembran-diffusjonskammere

(Gates og Lazarus, Lancet, 17. desember, s. 1257-1259 (1977)); polymerisert 2-hydroksyetylmetakrylat-pHEMA-membrananordninger (Ronel et al., J. Biomed., Mater., Res, 17, s. 855-864

(1983)); mikrokapsler av polyakrylater (Douglas og Sefton, Biotech og Bioeng. 36, s. 653-664 (1990); Trans Am. Soc. Artif. Inter. Org. 35, s. 791-799 (1989)); hule fibrer av akrylkopolymer (Lanza et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. 88, s. 11100-11104 (1991)); polyolkopolymerfilm WO 93/22427; intra-vaskulære anordninger (Berguer, US patent nr. 4 309 776, 12. januar 1982) og Gaskill, US patent nr. 4 911 717, 27. mars 1990); kationisk-anionisk-tverrbundne membraner, f.eks. kitosan og polyasparaginsyre eller polyglutaminsyre (Jarvis, US Patent nr. 4 803 168, 7. februar 1989); overflatekonforma-sjonsbindende brolag av et multifunksjonelt materiale og et semipermeabelt polymerlag for celleinnkapsling (Cochrum, US patent nr. 4 696 286, 29. september 1987); vaskulære perfu-sjonsanordninger (Chick et al., US patent nr. 5 002 661,

26. mars 1991); makromer polymerinnkapsling, Desai et al.

WO 93/16687; bariumalginat-kryssbundne mikrokapsler (Zekorn et al., Acta. Diabetol. 29, s. 99-106 (1992)), andre membrananordninger (Ward et al., Fourth World Biomat. Con., Berlin, s. 152, 24.-28. april 1992)); andre innkapslingsanordninger (Aebischer, WO 94/07999; US patent nr. 5 283 187; WO 93/00128; WO 93/00127; WO 93/00063; WO 92/19195; WO 91/10470;

WO 91/10425; WO 90/15637; WO 90/02580) og cellulære implantat-anordninger: US patent nr. 4 241 187; 4 892 538 og 4 391 909. "Islet Transplantation with Immunoisolation", Lanza, R. P. et al., 41 Diabetes, s. 1503 (1992) gjennomgår forskjellige kammere anvendt for å inneholde celler; på samme måte som Langer og Vacanti i "Tissue Engineering", 260 Science, s. 920

(1993). I det tilfelle at de spesielle kammere beskrevet ovenfor ikke er tilstrekkelig permeable til å tillate inntrenging og uttrenging av det subcellulære materiale til og fra implanterte tumorceller, vil en fagperson forstå at permeabiliteten av slike kammere kan endres uten å endre den grunnleggende utforming av slike kammere.

Søkerne antar dessuten at andre anordninger som ikke er nevnt her kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse dersom de har den egenskap at de kan inneholde implanterte celler på en slik måte at direkte kontakt mellom transplantatceller og vertsimmunceller forhindres, og tillate frigivelse av det subcellulære antigene materiale som stimulerer pasientens immunrespons. Selv om det subcellulære materiale som forårsaker pasientens immunrespons ikke er isolert ellerkarakterisertved foreliggende oppfinnelse, antas det at det inkluderer immunogene molekyler (antigener) inneholdt i eller utskilt fra, de inneholdte tumorceller. Tumorcellene inneholder mange antigener, ikke kun tumorassosierte antigener. Dette antas å rekruttere et høyt antall makrofager og antigenfremvisende celler til det sted som i sin tur tilveiebringer en økt immunrespons. Administreringen av et immunpotenserende molekyl, slik som et cytokin, forhøyer ytterligere immunresponsen på stedet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et stort antall fordeler i forhold til de nåværende cancerimmun-terapier. Mange av de hittil publiserte undersøkelser fordrer kun administrering av "frie" bestrålede celler; dvs. celler som ikke er inneholdt i et kammer. Cellene blir bestrålt som en sikkerhetsforholdsregel for å forhindre dem fra å proli-ferere og forårsake ytterligere tumorer. De blir imidlertid fjernet fra kroppen innen 1 til 2 uker og tilveiebringer kun en forbigående dose, og i noen tilfeller kan bestrålingen for-styrre produksjonen av eventuelle cytokiner konstruert i cellene. Ved foreliggende oppfinnelse er det ikke bestandig nødvendig å bestråle de inneholdte celler. Selv når bestrålte celler anvendes forblir de allikevel sannsynligvis til stede som immunogener i kammeret i tidsperioder lengre enn de frie, bestrålte celler ifølge kjent teknikk. Anvendelse av et kammer ifølge foreliggende oppfinnelse gir tryggheten med isolering av tumorcellene, slik at, i motsetning til kjent teknikk, frie tumorceller ikke behøver å innføres hos pasienter. I en foretrukket utførelsesform ved anvendelse av det foretrukne kammer, virker dessuten selve kammeret som en adjuvans for de subcellulære, antigene materialer. Makrofager tiltrekkes til den ytre overflate av anordningen og er således i en posisjon til å oppta antigene materialer når de utspres fra tumorene i anordningen.

Eksempler på konstruerte celler som kan anvendes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse inkluderer tumorceller konstruert for å utskille cytokiner (Sobol et al., WO 95/07105; Addision et al., Gene Therapy Weekly, s. 19 (november 1994)); celler konstruert for å uttrykke fremmede antigener for å øke den cellulære og/eller humorale antitumoraktivitet (Plantz et al., PNAS 90, s. 4645 (1993) (allogent histokompatibilitetsgen); Gansbacher WO 94/18995 (allogen tumorcelle konstruert for å uttrykke cytokiner, adhesjons-molekyler, kostimulerende faktorer eller tumorassosierte antigener); Allione et al., Gene Therapy Weekly, s. 20 (januar 1995) (brystadenokarsinomceller konstruert for å uttrykke IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, TNF«, CMCSF); Hock et al., Gene Therapy Weekly, s. 22 (januar 1995) (museneuroblastom som uttrykker klasse II MHC) (selv om denne metode antas å fordre direkte celle-celle-kontakt, ville utspredt MHC være et immunpotenserende molekyl i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse)); og koekspresjon i tumoravledete celler av både immunpotenserende molekyl og et selvmordsgen (Frost et al., WO 92/05262).

De følgende eksempler og data vist i figurene demonstrerer samlet effektivitet av foreliggende oppfinnelse i et antall forskjellige eksperimentelle situasjoner. Når et kammer inneholdende tumorceller anvendes som en vaksine (dvs. før tumordannelse) kan det være effektivt ved å forhindre tumordannelse i så mye som 100 % av eksperimentdyr. Ved implantasjon i nærvær av mikrotumor er det ved foreliggende oppfinnelse demonstrert effektivitet i mer enn 75 % i de testede dyr. Til sist, når de ble kombinert med kirurgisk reseksjon av store tumorer, forhindret implantasjon av anordninger gjenvekst av tumor i 60 % av de implanterte dyr.

Sett i sammenheng kan flere konklusjoner trekkes fra disse data. For det første, ved gjennomgang av alle eksemplene, kan det konkluderes med, selv om det ikke oppnås helbredelse hos 100 % av dyrene, er det allikevel bedre å ha et kammer enn ikke. I verste fall utvikles tumorene mer lang-somt, i beste fall utvikler dyrene aldri tumor; ikke i noe tilfelle utvikler dyr tumorer hurtigere, eller har større tumorer, i nærvær av et kammer enn kontrolldyrene. Dataene demonstrerer at, ved anvendelse av kammeret, kan tumorceller uten genetisk modifikasjon anvendes effektivt for å danne en antitumorimmunrespons. Tumorceller i et kammer er mye mer effektive enn frie tumorceller når det gjelder dannelse av denne immunrespons, og bestrålte celler i kammeret synes å være mer effektive enn levende celler. Det antas at dette skyldes en forhøyelse av immunogeniteten av cellene på grunn av bestrålingsinduserte endringer i cellene.

De følgene eksempler tilveiebringes for illustrasjon av flere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, og skal ikke fortolkes som begrensning av rammen for foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Gnaqeradenokars inommodel1

Anvendte cellelinjer

MCA-38 (en generøs gave fra Dr. Augusto Ochoa, NCI) er et musetykktarmskarsinom som kan opprettholdes in vivo eller in vitro. For opprettholdelse in vitro ble cellene dyrket i RPMI (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) supplert med 1 mM HEPES, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % L-glutamin, 1 % natriumpyruvat, 1 % penicillin/streptomycin (Sigma), 0,1 % p-merkaptoetanol og 10 % kalvefosterserum (Irvine Scientific, Irvine CA). Celler ble rutinemessig passert ved behandling med trypsin to ganger pr. uke.

Anvendte dyr

I de fleste eksperimenter ble det anvendt C57/B6-hunnmus (Harlan Sprague Dawley). Når det er angitt ble atymiske mus (Harlan Sprague Dawley) anvendt. Alle dyr ble oppbevart i overensstemmelse med standard prosedyrer for pleie og anvendelse av laboratoriedyr.

Anordning

Disse undersøkelser anvendte ultralydforseglede

4,5 ul eller 20 ul anordninger utstyrt med åpninger, ved benyttelse av laminerte membraner beskrevet ovenfor og i US patentsøknad nr. 8/179 860. Anordningene ble sterilisert over

natten i 70 % etanol, og deretter ble etanolen fjernet ved tre vaskinger i steril saltløsning (Baxter Scientific Products, Waukegan IL).

Implantasjon av anordninger

For påfylling ble MCA-38-celler behandlet med trypsin, vasket og pelletert ved sentrifugering. Dersom ikke annet er angitt ble MCA-38-celler innkapslet i 4,5 ul anordninger med åpninger ved å fylle 3 pl med IO<6>celler i det sentrale hulrom i anordningen ved anvendelse av en Hamilton-sprøyte. Den større anordning ble fylt med 10<7>celler i 20 pl. Anordninger ble forseglet i liggende stilling med en silikonplugg ved anvendelse av en dimensjon 23 nål og sprøyte. Anordningsåpningen ble fullstendig fylt med silikon og åpningsdelen ble delt i to. Den resterende åpningsdel ble vippet i kort tid i 70 % etanol. De fylte anordninger ble vasket tre ganger med saltløsning. Anordningene ble plassert i RPMI 1640 supplert som beskrevet ovenfor og inkubert ved 37 °C inntil de ble implantert.

Dyrene som mottok implantater ble bedøvet ved intra-peritoneal injeksjon av 0,2-0,3 ml av blandingen av 1 ml ketamin (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa) og 0,75 ml xylazin (Rugby Laboratories, Rockville Center, New York) fortynnet i 1 ml steril saltløsning. Bukområdet ble penslet med betadin og det ble utført et ventralt midtlinjeinnsnitt. Ved anvendelse av en hemostat ble det laget en liten subkutan lomme på hver side av midtlinjeinnsnittet, og én 4,5 pl anordning ble innsatt i hver lomme. Når anordningene var innsatt ble snittet lukket ved anvendelse av sterile heftestifter og bukområdet ble penslet på nytt med betadin. Ved anvendelse av 20 pl anordningen ble kun én av disse innsatt.

Tumorutfordring

På de angitte tidspunkter ble dyrene utfordret med en injeksjon av uinnkapslede MCA-38-celler. For utfordringer etter implantasjon ble IO<6>nylig trypsinbehandlede MCA-38-celler fortynnet i 50 pl steril saltløsning og injisert i muskelen på høyre bakben. I tilfellet med ny utfordring ble den andre injeksjon på IO<6>celler utført i det venstre bakben, og, hvis passende, ble den tredje injeksjon på IO<6>celler ut-ført i det høyre ben. For utfordring på tidspunktet for implantasjon ble dyrene utfordret med IO<3>frie MCA-38-celler. Tidligere undersøkelser har vist at så få som 500 frie MCA-38-celler er tilstrekkelig for tumordannelse.

Histologi

Ved fullførelse av hvert eksperiment ble implantert anordning fjernet, fiksert i glutaraldehyd, oppdelt og analysert ved hjelp av hematoksylin- og eosinfarging for tilstedeværelse av overlevende tumorceller i anordningen ved anvendelse av lysmikroskopi.

Overlevelse av MCA- 38- celler i immunisoleringsanordninger

For å bestemme evnen for MCA-38 til å overleve i anordningen i fravær av immunangrep, ble IO<4>eller IO<6>celler innkapslet i 4,5 ul anordninger og implantert i atymiske mus. Ved slutten av implanteringsperioden på 3 uker ble anordningene fjernet, bearbeidet histologisk og analysert for tilstedeværelse av levende vev. MCA-38-celler overlevde i anordningen. I alle tilfeller var det et betydelig nekrotisk område i midten av anordningen, men celler som virket friske var til stede langs periferien. Bredden av det nekrotiske område var avhengig av det innledende antall celler fylt i anordningen (dvs. større nekrose i anordninger inneholdende IO<6>enn de inneholdende 10<4>celler).

Anvendelse av anordninger inneholdende MCA- 38- celler som en tumorvaksine

Syngene C57/B6-mus ble implantert med to anordninger som hver inneholdt 10<6>MCA-38-celler i tre eller fire uker. Disse dyr ble deretter utfordret med en injeksjon av IO<5>frie MCA-38-celler, som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 3 utviklet 0/8 dyr de to eksperimenter tumorer på utfordringsstedet, mens alle kontrolldyr utviklet tumorer innen 10 dager fra injeksjonen. Tomme anordninger implantert i mus beskyttet ikke musene mot en etterfølgende utfordring med frie MCA-38-celler.

Fem av disse dyr mottok en andre utfordring med IO<6>celler 8-11 uker etter den innledende implantasjon. I dette tilfelle forble 4/5 av de implanterte dyr tumorfrie på begge implantasjonssteder; på nytt utviklet alle kontrolldyr tumorer på injeksjonsstedet. Ett eksperimentdyr utviklet en tumor på stedet for den andre injeksjon, dette dyr ble implantert med kun én anordning.

Tre av dyrene som forble tumorfrie ble gitt en tredje utfordring 7 måneder etter at anordningene var implantert. For to av dyrene ble de subkutane anordninger fjernet før tumor-utfordringen ble gitt, det tredje dyr ble utfordret mens anordningene var på plass. Dyret med anordningene forble tumorfritt etter den tredje utfordring, mens begge dyrene som anordningene var fjernet fra utviklet tumor, hvilket også var tilfelle for alle kontrolldyr som aldri hadde mottatt en anordning. Selv om dyrene som fikk fjernet anordningene utviklet tumorer, var imidlertid denne utvikling mye langsommere enn hos kontrolldyrene. Kontrolldyr utviklet tumorer 10 dager etter utfordringen. Ett av eksperimentdyrene utviklet tumor 25 dager etter utfordringen og det andre utviklet tumor 36 dager etter utfordringen. Histologi av de fjernede anordninger avslørte at > 90 % av cellen var døde, og at det var omfattende forkalkning av materialet i anordningen. Det forelå imidlertid bevis på noen få resterende, levende celler. Disse resultater antyder at selve anordningen ikke formidler antitumorvirkningen, fordi dyrene som fikk fjernet anordningene ikke utviklet tumorer i samme grad dom kontrolldyr som aldri var implantert med anordninger. Samtidig synes anordningen å være nødvendig for å opprettholde den immunologiske beskyttelse mot tumoren; selv om tumorer kommer til syne mye langsommere hos dyr hvor anordningene er fjernet, synes det ikke å foreligge noen langtidsimmunitet hos dyr som er blitt implantert med anordning i fravær av disse anordninger.

Anvendelse av anordninger inneholdende MCA- 38- celler som en tumorterapi

I en annen serie eksperimenter ble dyr utfordret med frie MCA-38-celler på tidspunktet for implantasjon av anordninger inneholdende MCA-38-celler. I dette tilfelle ble dyrene utfordret med IO<3>frie tumorceller. I ett eksperiment var søkerne i stand til signifikant å forsinke tiden for tumordannelse (figur 4) p = 0,036. I dette eksperiment var et dyr tumorfritt ved tiden for avlivning på dag 32. I et andre eksperiment hadde alle dyrene uten anordninger utviklet tumor innen dag 16, ved hvilket tidspunkt kun 1/10 av de implanterte dyr hadde utviklet en tumor på utfordringsstedet. Disse resultater antyder at implantasjonen av en anordning inneholdende tumorceller kan forsinke eller forhindre veksten av tumorer innført på tidspunktet for implantasjon.

Eksempel 2

Hundemodell

Anvendte dyr

En hund i Baxters hundefarm (142-3) ble identifisert med flere subkutane masser som varierte i størrelse fra et knappenålshode til en 50-øring. Histologisk analyse diagnosti-serte disse masser som epitelinklusjonscyster. En andre hund

(4008) ble innkjøpt fra en utenforstående leverandør. Denne hund hadde en brysttumor med diameter på ca. 10 cm som ble biopsert og diagnostisert som et intrakanal-brystkarsinom.

Anordning

Disse undersøkelser anvendte den ultralydforseglede 40 ul anordning med åpning ved benyttelse av laminerte membraner beskrevet ovenfor og i US patentsøknad nr.

8/179 860. Anordninger ble sterilisert over natten i 70 % etanol og deretter ble etanolen fjernet ved tre vaskinger i steril saltløsning (Baxter Scientific Products, Waukegan Illinois).

Implantasjon av anordninger

Hunder ble bedøvet ved hjelp av standard metoder. Området rundt tumorene ble barbert. I tilfellet med hund 142-3, ble den største masse fjernet kirurgisk og plassert i steril saltløsning. Massen ble kuttet i små biter ved anvendelse av to par kirurgiske sakser. De opphakkede biter ble fylt i immunisoleringsanordningen som følger: 80 ul gravitasjons-bunnfalt vev ble opptatt i en Hamilton-sprøyte. Sprøytenålen ble innsatt i åpningen i anordningen og innholdet ble fylt i anordningens hulrom. Anordningene ble forseglet i liggende tilstand med en silikonplugg ved anvendelse av en dimensjon 23 nål og sprøyte. Anordningsåpningen ble fullstendig fylt med silikon og åpningslengden ble delt i to. Ved anvendelse av en hemostat ble det laget en liten lomme på hver side av stedet hvor tumoren var fjernet, og en anordning ble innføyet i hver lomme (totalt to anordninger ble implantert). Når anordningene var innsatt ble snittet lukket og suturert og bukområdet ble på nytt penslet med betadin.

I tilfellet med hund 4008 ble -95 % av tumormassen fjernet kirurgisk med kauterisasjon av involverte blodkar. Snittet ble deretter suturert og en basislinjemåling av den gjenværende tumor ble utført. Den fjernede tumor ble skåret åpen og flere biter med diameter 0,5 cm ble fjernet på forskjellige dybder. Disse biter ble ytterligere oppkuttet ved anvendelse av to par kirurgiske sakser. De opphakkede biter ble fylt i 8 anordninger som beskrevet ovenfor. 4 små, sentrale, subkutane innsnitt ble utført dorsalt for det sted hvor tumoren var fjernet fra, og 2 anordninger ble innsatt i hvert innsnitt. Snittene ble deretter suturert og bukområdet ble penslet med betadin.

Kontroll av dyr

De gjenværende masser i hund 142-3 ble målt 2 til 3 ganger pr. uke. Målinger ble utført i to dimensjoner og anvendt for å kalkulere totalt overflateareale av hver masse. To målinger ble utført av to forskjellige teknikere og gjennomsnitt av verdiene ble beregnet for hvert tidspunkt. Den gjenværende tumor hos hund 4008 ble likeledes målt 3 ganger pr. uke i to dimensjoner.

Etter utskjæring av den største masse fra hund 142-3 og innsettelse av anordningene inneholdende vev fra den ut-skårede masse, viste 2 av de 4 gjenværende svulster en dramat-isk reduksjon i størrelse (figur 5), som bestemt ved hjelp av to uavhengige målinger. De andre to, som var morfologisk atskilte, viste ingen endringer i størrelse. Denne størrelses-reduksjon i de gjenværende masser forekom uten noen ytterligere manipulering av dyret.

Størrelsen av den gjenværende tumor i hund 4008 syntes å øke innledningsvis, men dette skyldes antakeligvis ødem som et resultat av kirurgisk skade (bemerk økningen på dag 7, figur 6). Deretter har det vært en jevn reduksjon av størrelsen av den gjenværende tumor, som bestemt ved hjelp av to sett av uavhengige målinger, med noe utjevning etter

>30 dager etter kirurgi.

Eksempel 3

Små forhåndseksisterende tumorer

Anvendte cellelinjer

MCA-38 er et musetykktarmskarsinom som kan opprettholdes in vivo eller in vitro. For opprettholdelse in vitro ble cellene dyrket i RPMI (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) supplert med 1 mM HEPES, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % L-glutamin, 1 % natriumpyruvat, 1 % penicillin/strepto-mycin (Sigma), 0,1 % P-merkaptoetanol og 10 % kalvefosterserum (Irvine Scientific, Irvine CA). Celler ble rutinemessig passert ved behandling med trypsin to ganger pr. uke.

Anvendte dyr

C57/B6 hunnmus (Harlan Sprague Dawley) ble anvendt. Alle dyr ble oppbevart i overensstemmelse med standard prosedyre for pleie og anvendelse av laboratoriedyr.

Immunisoleringsanordning

Disse undersøkelser anvendte ultralydforseglede

4,5 pl anordninger med åpning ved benyttelse av laminerte membraner som beskrevet i US patentsøknad nr. 7/735 401 og 7/861 512. Utstyr ble sterilisert over natten i 70 % etanol og etanolen ble deretter fjernet ved tre vaskinger i steril salt-løsning (Baxter Scientific Products, Waukegan IL).

Implantasjon av anordninger

For påfylling ble MCA-38-celler behandlet med trypsin, vasket og pelletert ved sentrifugering. Hvis ikke annet er angitt ble 10<6>MCA-38-celler innkapslet i 4,5 pl anordninger med åpning, ved å fylle 3 pl av de pelleterte celler i det sentrale hulrom i immunisoleringsanordningen ved anvendelse av en Hamilton-sprøyte.

Der det er angitt ble celler utsatt for 3 500 Rad før påfylling. Anordninger ble forseglet i liggende tilstand med en silikonplugg ved anvendelse av en dimensjon 23 nål og sprøyte. Anordningsåpningen ble fullstendig fylt med silikon og åpningslengden ble delt i to. Den resterende åpningsdel ble kort dyppet i 70 % etanol. De fylte anordninger ble vasket tre ganger med saltløsning. Anordningene ble plassert i RPMI 1640 supplert som beskrevet ovenfor og inkubert ved 37 °C inntil implantasj on.

Dyrene som mottok implantater ble bedøvet ved intra-peritoneal injeksjon av 0,2-0,3 ml av blandingen av 1 ml ketamin og 0,75 ml rompum fortynnet med 1 ml steril salt-løsning. Bukområdet ble penslet med betadin og det ble utført et ventralt midtlinjeinnsnitt. Ved anvendelse av en hemostat ble det laget en liten lomme på hver side av midtlinjeinnsnittet, og én anordning ble satt i hver lomme. Når anordningene var innsatt ble snittet lukket ved anvendelse av sterile heftestifter, og bukområdet ble på nytt penslet med betadin.

Injeksjon av frie, bestrålte celler

Ved tidspunktet for implantasjon ble noen eksperimentdyr også gitt en injeksjon av frie, bestrålte tumorceller. For bestråling ble cellene preparert som beskrevet ovenfor for påfylling. Cellene ble suspendert ved en konsentrasjon på IO<6>celler i 50 ml. Cellene mottok 3 500-4 000 Rad fra en kobolt-60-kilde. IO<6>celler ble injisert.

Tumorutfordring

Initiering av tumorer før implantasjon ble dyr injisert med 10<3>frie MCA-38-celler 3-7 dager før implantasjon. Injeksjoner ble utført enten ved intramuskulær injeksjon i det høyre bakben, eller i det dorsale, subkutane rom. Foreløpige undersøkelser har vist at så få som 500 frie MCA-38-celler er tilstrekkelig for tumordannelse. I tilfellet med en andre utfordring etter implantasjon ble den andre injeksjon utført i det venstre bakben.

Behandling av forhåndseksisterende tumorer

Dyr ble injisert med IO<3>frie tumorceller tre dager før implantasjon. Ved tidspunktet for implantasjon mottok dyrene to anordninger inneholdende bestrålte MCA-38-celler, og ble også gitt en injeksjon på IO<6>frie, bestrålte tumorceller utenfor anordningene. Som vist i figur 7 utviklet ingen av de fem dyr som ble behandlet med bestrålte celler, både inne i og utenfor anordningen, tumor i løpet av de første 90 dager. På dag 90 ble to av disse dyr utfordret med IO<6>tumorceller, ett av disse to dyr utviklet en tumor fra denne utfordring. Alle de andre dyr har forblitt tumorfrie i >150 dager. Som illu-strert i figur 8 virker denne behandling best med kombina-sjonen av bestrålede celler i anordningen og en injeksjon av frie, bestrålte celler utenfor anordningen. Selv om noe beskyttelse oppnås ved administrering av ubestrålte tumorceller i anordningen i kombinasjon med frie, bestrålte celler, er den mindre effektiv enn administrering av bestrålte celler i anordningen i kombinasjon med frie, bestrålte celler. Injeksjon av frie, bestrålte celler har ingen virkning på tumorut-vikling.

Når tumorer ble initiert i det dorsale, subkutane rom, var implantasjon av anordninger inneholdende bestrålte celler sammen med en injeksjon av frie, bestrålte celler, i stand til å redde 60 % av de behandlede dyr (alle de ubehandlede dyr utviklet tumor på stedet hvor de opprinnelige tumorer ble initiert) (figur 9).

Eksempel 4

Anordningsterapi etter tumorreseksion

Anvendte cellelinjer

Anvendte dyr

Immunisolasionsanordninq

Disse undersøkelser anvendte de ultralydforseglede 4,5 ul anordninger med åpning ved benyttelse av laminerte membraner som beskrevet i US patentsøknad nr. 7/735 401 og 7/861 512. Anordninger ble sterilisert over natten i 70 % etanol, og deretter ble etanolen fjernet ved tre vaskinger i steril saltløsning (Baxter Scientific Products, Waukegan IL).

Implantas i onsanordinqer

For påfylling ble MCA-38-celler behandlet med trypsin, vasket og pelletert ved sentrifugering. Dersom ikke annet er angitt ble 10<6>MCA-38-celler innkapslet i 4,5 ul anordninger med åpning ved påfylling 3 ul av de pelleterte celler i det sentrale hulrom i immunisoleringsanordningen ved anvendelse av en Hamilton-sprøyte.

Anordninger ble forseglet i liggende tilstand med en silikonplugg ved anvendelse av en dimensjon 23 nål og sprøyte. Anordningsåpningen ble fullstendig fylt med silikon og åpningslengden ble delt i to. Den gjenværende åpningslengde ble kort dyppet i 70 % etanol. De fylte anordninger ble vasket tre ganger i saltløsning. Anordninger ble plassert i RPMI 1640 supplert som beskrevet ovenfor og inkubert ved 37 "C inntil implantasjon.

Dyrene som mottok implantater ble bedøvet ved intra-peritoneal injeksjon av 0,2-0,3 ml av blandingen av 1 ml ketamin og 0,75 ml rompum fortynnet i 1 ml steril saltløsning. Bukområdet ble penslet med betadin og et ventralt midtlinjeinnsnitt ble utført. Ved anvendelse av en hemostat ble det laget en liten lomme på hver side av midtlinjeinnsnittet, og én anordning ble innsatt i hver lomme. Når anordningene var innsatt ble snittet lukket ved anvendelse av sterile heftestifter, og bukområdet ble på nytt penslet med betadin.

Tumorutfordrinq

For å initiere tumorer ble dyr injisert med IO<5>frie MCA-38-celler 3-7 dager før implantasjon. Injeksjoner ble ut-ført i det dorsale, subkutane rom. Foreløpige undersøkelser har vist at så få som 500 frie MCA-38-celler er tilstrekkelig for tumordannelse.

Anvendelse av immunisolerinqsanordninqer inneholdende MCA- 38-celler som en tumorterapi for behandling etter tumorreseksion

Protokollen for dette eksperiment er skissert i figur 10. Kort beskrevet ble dyr injisert med 10<5>celler i det

dorsale, subkutane rom og overvåket inntil merkbare tumorer ble observert. På dag 10 ble tumorene fjernet kirurgisk fra alle dyrene. Halvparten av dyrene (n = 5) mottok ingen ytterligere behandling. Den andre halvpart (n = 5) ble implantert med to anordninger som hver inneholdt IO<6>ubestrålte MCA-38-celler. Anordningene ble implantert subkutant på den ventrale side. Begge grupper av dyr ble overvåket for gjenutvikling av tumor på det opprinnelige tumorsted. Som vist i figur 11 gjenutviklet alle kontrolldyrene (uten implantater) tumor på det

opprinnelige tumorsted innen 30 dager fra operasjonen. Selv om to av dyrene med implantater også gjenutviklet tumor var dette ikke til stede for tre av dyrene, og de har forblitt tumorfrie i >180 dager. Forskjellene mellom disse grupper er ytterst

signifikant (p < 0,05).

Eksempel 5

Gnaqermelanommodell

Anvendte cellelinjer

Bl6 er et musemelanom som kan opprettholdes in vivo eller in vitro. For opprettholdelse in vitro ble cellene dyrket i RPMI (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) supplert med 1 mM HEPES, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % L-glutamin, 1 % natriumpyruvat, 1 % penicillin/streptomycin (Sigma), 0,1 % P-merkaptoetanol og 10 % kalvefosterserum (Irvine Scientific, Irvine CA). Cellene ble rutinemessig passert ved behandling med trypsin to ganger pr. uke.

Anvendte dyr

C57/B6 hunndyr ble anvendt. Alle dyr ble oppbevart i overensstemmelse med standard prosedyre for pleie og anvendelse av laboratoriedyr.

Immunisolas i onsanordninq

Disse undersøkelser anvendte de ultralydforseglede 4,5 ul anordninger ved benyttelse av laminerte membraner beskrevet i US patentsøknad nr. 7/735 401 og 7/861 512. Anordninger ble sterilisert over natten i 70 % etanol, og etanolen ble deretter fjernet ved tre vaskinger i steril salt-løsning (Baxter Scientific Products, Waukegan IL).

Implantasjon av anordninger

For påfylling ble B16-celler behandlet med trypsin, vasket og pelletert ved sentrifugering. Dersom ikke annet er angitt ble 10<6>B16-celler innkapslet i 4,5 ul anordninger med åpning ved å fylle 3 ul av de pelleterte celler i det sentrale hulrom i immunisoleringsanordningen ved anvendelse av en Hamilton-sprøyte. Anordningene ble forseglet i liggende tilstand med en silikonplugg ved anvendelse av en dimensjon 23 nål og sprøyte. Anordningsåpningen ble fullstendig fylt med silikon og åpningslengden ble delt i to. Den gjenværende åpningsdel ble kort dyppet i 70 % etanol. De fylte anordninger ble vasket tre ganger med saltløsning. Anordningene ble plassert i RPMI 1640 supplert som beskrevet ovenfor og inkubert ved 37 °C inntil implantasjon.

Dyrene som mottok implantater ble bedøvet ved intra-peritoneal injeksjon av 0,2-0,3 ml av blandingen av 1 ml ketamin og 0,75 ml rompum fortynnet i 1 ml steril saltløsning. Bukområdet ble penslet med betadin og det ble utført et ventralt midtlinjeinnsnitt. Ved anvendelse av en hemostat ble det laget en liten lomme på hver side av midtlinjeinnsnittet, og én anordning ble innsatt i hver lomme. Når anordningene var innsatt ble snittet lukket ved anvendelse av sterile heftestifter, og bukområdet ble på nytt penslet med betadin.

Injeksjon av frie, bestrålte celler

Ved implantasjonstidspunktet ble alle dyr med implanterte anordninger også gitt en injeksjon på IO<6>frie, bestrålte, dyrkede B16-celler på utfordringsstedet. For bestråling ble cellene preparert som beskrevet ovenfor for påfylling. Cellene ble suspendert ved en konsentrasjon på 10s celler i 50 ml. Cellene mottok 3 500-4 000 Rad fra en kobolt-60-kilde.

Tumorutfordring

4 uker etter implantasjon av anordninger ble dyrene utfordret med en injeksjon av ubestrålede B16-celler. For utfordring ble 5 x 10<5>nylig trypsinbehandlede B16-celler fortynnet i 50 ul steril saltløsning og injisert i muskelen i det høyre bakben. Foreløpige undersøkelser har vist at IO<4>frie B16-celler er tilstrekkelig for tumordannelse.

Anvendelse av immunisoleringsanordninger inneholdende in vivo - avledet tumorvev som en tumorvaksine

Protokollen for dette eksperiment er skissert i figur 12. Kort beskrevet ble dyr behandlet i en første runde, enten med anordninger inneholdende ubestrålede Bl6, eller ved injeksjon av frie, bestrålte B16-celler. Alle disse dyr utviklet tumor etter utfordring med 5 x IO<4>B16-celler. Tumorene fra begge grupper av dyr ble fjernet kirurgisk, opphakkede biter på ca. 1 mm<2>og fylt i 4,5 pl anordninger. Et tredje sett av anordninger ble også preparert inneholdende dyrkede, ubestrålede B16-celler. Disse tre sett av anordninger ble implantert i et andre sett av friske dyr, og alle tre grupper mottok også en injeksjon av frie, ubestrålte, dyrkede B16-celler; kontrolldyr mottok ingen behandling. Dyrene ble utfordret med dyrkede B16-celler 4 uker senere. Som vist i figur 13 forble ett av tre dyr immunisert med anordninger inneholdende tumorer utviklet hos dyr som kun ble behandlet ved injeksjon av frie, bestrålte celler, tumorfrie for >140 dager etter utfordring. Tumorcellene anvendt for å immunisere de friske dyr var således ikke dyrkede celler, men de var i stedet celler som ble utviklet under vekst i den første runde av dyr. Disse data indikerer at kammere inneholdende tumorceller som er blitt underkastet evolusjon, slik som autologe, humane tumorceller, sannsynligvis er anvendelige ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 6

Gnaqerovarietumor

Anvendte cellelinjer

C57ov er en musetumor som kan opprettholdes in vivo eller in vitro. Den ble identifisert i laboratoriet hos et dyr som var gitt en i.v.-injeksjon av B16-celler (5 x IO<5>). Histologisk undersøkelse antyder at den ikke var B16-avledet. For in vitro-opprettholdelse ble cellene dyrket i RPMI (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) supplert med 1 mM HEPES, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % L-glutamin, 1 % natriumpyruvat, 1 % penicillin/streptomycin (Sigma), 0,1 % P-merkaptoetanol og 10 % kalvefosterserum (Irvine Scientific, Irvine CA). Celler ble rutinemessig passert ved behandling med trypsin to ganger pr. uke.

Anvendte dyr

C57/B6 hunndyr ble anvendt. Alle dyr ble oppbevart i overensstemmelse med standard prosedyrer for pleie og anvendelse av laboratoriedyr.

Immunisolerinqsanordninq

Disse undersøkelser anvendte de ultralydforseglede 4,5 ul anordninger ved benyttelse av laminerte membraner beskrevet i US patentsøknad nr. 7/735 401 og 7/861 512. Anordninger ble sterilisert over natten i 70 % etanol, og deretter ble etanolen fjernet ved tre vaskinger i steril salt-løsning (Baxter Scientific Products, Waukegan IL).

Implantasjon av anordninger

For påfylling ble C570v-celler behandlet med trypsin, vasket og pelletert ved sentrifugering. Der ikke annet er angitt ble 10<6>C57ov-celler innkapslet i 4,5 ul anordninger med åpning, ved å fylle 3 ul av de pelleterte celler i det sentrale hulrom i immunisoleringsanordningen ved anvendelse av en Hamilton-sprøyte. Anordningene ble forseglet i liggende tilstand med en silikonplugg ved anvendelse av en dimensjon 23 nål og sprøyte. Anordningsåpningen ble fullstendig fylt med silikon og åpningslengden ble delt i to. Den gjenværende åpningsdel ble kort dyppet i 70 % etanol. De fylte anordninger ble vasket tre ganger med saltløsning. Anordningene ble plassert i RPMI 1640 supplert som beskrevet ovenfor og inkubert ved 37 "C inntil implantasjon.

Injeksjon av frie, bestrålte celler

Ved tidspunktet for implantasjon ble alle dyr med implanterte anordninger også gitt en injeksjon på 10<6>frie, bestrålte, dyrkede C57ov-celler på utfordringsstedet. For bestråling ble cellene preparert som beskrevet ovenfor for påfylling. Cellene ble suspendert ved en konsentrasjon på 10<6>celler i 50 ml. Cellene mottok 3 500-4 000 Rad fra en kobolt-60-kilde.

Tumorutfordring

4 uker etter implanteringen av anordninger ble dyrene utfordret med en injeksjon av ubestrålte C57ov-celler. For utfordring ble 5 x 10<4>nylig trypsinbehandlede C57ov-celler fortynnet i 50 ul steril saltløsning og injisert i muskelen i det høyre bakben. Foreløpige undersøkelser har vist at IO<3>frie C57ov-celler er tilstrekkelig for tumordannelse.

Anvendelse av immunisoleringsanordninger inneholdende C57ov som en tumorvaksine

Dyr ble implantert med to anordninger som er inne holdt IO<6>bestrålte C57ov-celler. På tidspunktet for implantasjon mottok dyrene også en injeksjon på IO<6>C57ov-celler. Dyrene ble utfordret med C57ov 4 uker senere. Resultatene er vist i figur 4, 60 % av dyrene har forblitt tumorfrie i

>30 dager.

Selv om foreliggende oppfinnelse er beskrevet uttrykt ved spesifikke fremgangsmåte og anordninger, er det under-forstått at variasjoner og modifikasjoner vil fremgå for fagfolk ved betraktning av foreliggende oppfinnelse.

Et stort antall modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse, som beskrevet i de illustrerende eksempler ovenfor, forventes å forekomme for fagfolk og således skal foreliggende oppfinnelse kun begrenses av de med-følgende krav. Det er således ment at de medfølgende krav skal dekke alle slike ekvivalente variasjoner som faller innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Claims

1. Implanterbar anordning for forebyggelse eller behandling av cancer, karakterisert ved at den omfatter: (a) et implanterbart kammer inneholdende tumorceller, eller somatiske celler konstruert for å uttrykke minst ett antigen som tilsvarer antigener hos en pasients tumor; (b) en porøs vegg i kammeret som ved bruk tilveiebringer en porøs grense mellom pasientens immunceller og de inneholdte celler; idet, (c) porøsiteten av grenseveggen er tilstrekkelig til å tillate subcellulært, antigent materiale å passere gjennom grensen, mens de inneholdte celler og pasientens immunceller forhindres fra å passere gjennom grensen.

2. Anordning ifølge krav 1, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en kilde for immunpotenserende molekyler, enten atskilt fra eller inneholdt i kammeret.

3. Anordning ifølge krav 2, karakterisert ved at de immunpotenserende molekyler er lymfotoksin, makrofagmigrasjonsinhiberende faktor (MIF), GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFNy, TNF, TGF-p eller et tumorantigen.

4. Anordning ifølge krav 2, karakterisert ved at kilden er liposomer inneholdende immunpotenserende molekyler.

5. Anordning ifølge krav 2, karakterisert ved at kilden er mikrokapsler inneholdende immunpotenserende molekyler.

6. Anordning ifølge krav 2, karakterisert ved at kilden er somatiske celler, også inneholdt i kammeret og som er blitt konstruert til å uttrykke og utskille immunpotenserende molekyler.

7. Anordning ifølge krav 1, karakterisert ved at tumorcellene er blitt konstruert til å uttrykke og utskille immunpotenserende molekyler.

8. Anordning ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at tumorcellene er levedyktige.

9. Anordning ifølge ethvert av kravene 1 til 7, karakterisert ved at tumorcellene er ikke-tumorigene .

10. Anordning ifølge ethvert av kravene 1 til 7, karakterisert ved at tumorcellene er blitt bestrålet.

11. Anordning ifølge krav 1, karakterisert ved at tumorcellene er autologe.

12. Anordning ifølge krav 1, karakterisert ved at tumorcellene er allogene.

13. Anordning ifølge krav 1, karakterisert ved at tumorcellene er fra en allogen tumorcellelinje.

14. Implanterbar anordning ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at den foreligger i kombinasjon med administrerbare, andre tumorceller som er ikke-tumorigene og ikke inneholdt i kammeret.

15. Anordning ifølge krav 14, karakterisert ved at de andre tumorceller er autologe.

16. Anordning ifølge krav 14, karakterisert ved at de andre tumorceller er allogene.

17. Anordning ifølge krav 14, karakterisert ved at de andre tumorceller er fra en allogen tumorcellelinje.

18. Anordning ifølge krav 14, karakterisert ved at minst noen av de andre tumorceller er konstruert til å uttrykke og utskille immunpotenserende molekyler.

19. Anordning ifølge krav 14, karakterisert ved at de andre tumorceller er ikke-tumorø se, humane celler konstruert til å uttrykket minst ett antigen som tilsvarer antigener hos pasientens tumorceller.

20. Anordning ifølge ethvert av kravene 1 til 18, karakterisert ved at tumorcellene anvendes ved en metode for å forebygge eller behandle en cancer hos en pasient, omfattende ikke-tumorøse, humane celler konstruert til å uttrykke minst ett antigen som tilsvarer et antigen hos en- pasients tumorceller.

21. Anordning ifølge krav 20, karakterisert ved at de ikke-tumorøse, humane celler er mesotelceller, epitelceller, endotelceller, hepatocytter, myoblaster eller fibroblaster.

22. Anordning ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at kammeret omfatter mikrokapsler, hule fibere, ultrafiltreringsmembrankammer, membrandiffusjonskammer eller en vaskulær perfusjonsanordning.

23. Anordning ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at kammeret inkluderer en åpning for å tilveiebringe tilgang til kammeret.

24. Anvendelse ved fremstilling av en implanterbar anordning, omfattende et kammer med en porøs vegg for å tilveiebringe, i bruk, en porøs grense som forhindrer pasientens immunceller fra å passere gjennom grensen, mens subcellulært, antigent materiale tillates å passere gjennom grensen; celler inneholdt i kammeret og ute av stand til å passere gjennom grensen, for formålet å behandle eller forebygge cancer hos en pasient, idet cellene er tumorceller med minst ett antigen som tilsvarer antigener hos pasientens tumorceller, ikke-tumorøse, humane celler konstruert for å uttrykke minst ett antigen som tilsvarer antigener hos en pasients tumorceller, eller andre somatiske celler konstruert for å uttrykke minst ett antigen som tilsvarer antigener hos en pasients tumorceller.

25. Anvendelse ifølge krav 24 for det formål å behandle eller forebygge en fast tumor, en metastatisk tumor eller leukemisk cancer.

26. Anvendelse ifølge krav 24 for det formål å behandle eller forebygge lymfom, melanom, tykktarmskarsinom, brystkarsinom, lungekarsinom, fibrosarkom, renal karsinom eller neuroblastom.