NO900470L

NO900470L - Hybride proteiner.

Info

Publication number: NO900470L
Application number: NO90900470A
Authority: NO
Inventors: John Spencer Emtage; Timothy John Roy Harris
Original assignee: Celltech Ltd
Priority date: 1988-06-03
Filing date: 1990-02-01
Publication date: 1990-04-03
Also published as: NO900470D0

Description

HYBRIDE PROTEINER

Oppfinnelsesområdet

Den foreliggende oppfinnelse vedrører hybride proteiner og vedrører spesielt hybride plasminogene aktivatorer. Oppfinnelsen vedrører også fremstilling av slike hybride proteiner ved hjelp av rekombinant DNA teknologi og vedrører også vektorer og vertceller for bruk ved slik produksjon.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Det er velkjent at nærværet at blodpropper i blodkarene i pattedyr, særlig mennesker, kan være livstruende og føre til slike akutte kardiovaskulære sykdommer som infarkt (transmu-rale myokardiale infarkt), slag, pulmonær embolisme, dypvene trombose, perifer arteriell okklusjon og andre venøse tromboser. Ettersom mekanismen for dannelse og fjernelse av slike blodpropper er blitt belyst, er det blitt klart at det kan være en rekke forskjellige midler som kunne være nyttige ved å forhindre eller behandle slike sykdommer.

En spesiell klasse av slike midler er plaminogenaktivatorene. Disse midler virker ved å omdanne plasminogen til plasmin. Plasminet virker så på fibrinet i blodproppen og bevirker at dette nedbrytes og at proppen fjernes. Der er tre velkjente plasminogenaktivatorer, og disse er streptokinase, urokinase og vevs-plasminogenaktivator.

Streptokinase er noe forskjellig fra de andre'to midler ved

at den ikke virker enzymatisk på plasminogen, men bevirker en tilsvarende endring i plasminogenet slik at dette bli enzymatisk aktivt. Blant dets kliniske problemer er at den er sterkt antigenisk, idet den er avledet fra en bakterie, og at den ikke binder til fibrin. Dens bruk kan således føres til at pasienten immunsystem reagerer mot den og fjerner den fra blodet før den kan bevirke fjernelse av en propp. Dens anvendelse kan også føre til ikke-spesifikk plasminogenaktiver-

ing som fører til uønsket blødning. Bruken av streptokinase har derfor problemer ved at dens bivirkninger virker mot dens fornyede bruk i den i den samme pasient.

Urokinase, som nå generelt benevnes u-PA (urokinasetype plasminogenaktivator) ble opprinnelig isolert fra urin. Den er nå tilgjengelig som et produkt fra rekombinant DNA teknologi, u-PA virker enzymatisk på plasminogen for å bevirke det spaltning til plasmin. Ettersom den kan avledes fra pattedyr-kilder, f.eks. humane kilder, er den ikke antigenisk når den tilføres til en pasient. Den binder imidlertid ikke til fibrinet og dens bruk kan således føre til ikke-spesifikk plasminogenaktivering og bevirke uønsket blødning.

Vevs-plasminogenaktivator (t-PA) ble opprinnelig isolert fra forskjellige humane vev i små mengder. Deretter ble det opp-daget at visse melanornceller, særlig Bowes melanomceller, ut-skilte rimelige mengder av t-PA. Mer nylig er t-PA blitt, tilgjengelig som et produkt fra. rekombinant DNA teknologi. F.eks. ble kloning fra t-PA genet fra Bowes melanom-celle-linje rapportert av Pennica et al. [1] i 1983. t-PA har de fordeler at den ikke er antigenisk og at den har en forholds-vis høy affinitet for fibrin. Den har derfor en mindre ten-dens til å bevirke ikke-spesifikk plasminogenaktivering og reduserer således graden av uønsket blødning som kan fore-komme. Den er derfor potensielt et bedre trombolytisk middel enn urokinase.

In-vivo fjernes den imidlertid meget hurtig og kan derfor ikke tilføres ved bolus injeksjon og det er således nødvendig å tilføre store doser.

Aminosyresekvensen av både u-PA og t-PA er nå blitt oppklart. Disse og anordningen av disulfidbroene i molekylene er vist i fig. 1 henholdsvis 2 1 de vedføyde tegninger. u-PA (fig. 1) som translatert fra mRNA omfatter et N-terminalt signal pep-tid S, etterfulgt av et domene som ligner epidermal vekstfak-tor E, et Kringle domene K og ved C-enden et serin-protease-

domene P. Kringledomenet er et sterkt sammenbretted cystein-bisulfid sammenknyttet domene lignende domener i slike molekyler som plasminogen. Etter utskilling avspaltes signalpep-tidet S for å danne enkeltkjedet u-PA som deretter spaltes av plasmin for å frembringe en tokjedet form av u-PA med de to kjeder forbundet ved hjelp av cystein-disulfidbindinger. Den såkalte A-kjede av den tokjedede u-PA omfatter E- og K-domenene og den såkalte B-kjede omfatter P-domenet.

t-PA (fig. 2) som translatert fra mRNA omfatter et N-terminalt signalpeptid S, et lederdomene L, et domene tilsvarende en finger av fibronektin F, et epidermalt vekstfaktorlignende domene E, to Kringle-domener Kl og K2 og ved dens C-ende, et serin-protease domene P. Etter utskilling avspaltes S- og L-regionene for å danne enkeltkjedet t-PA. Denne blir deretter spaltet for å gi to kjeder t-PA hvor A-kjeden omfatter F, E, Kl og K2 domenene og B-kjeden omfatter P-domenet.

En mer'full beskrivelse av strukturene og funksjonene av u-PA og t-PA er gitt av Harris [2].

Selvom t-PA er blitt vist å ha potensial som et trombolytisk middel in-vivo vil det være ønskelig å forbedre både den halvlevetid og den spesifisitet, eller å fremstille et nytt molekyl med trombolytiske egenskaper, men som har forbedret halvlevetid og spesifisitet sammenlignet med t-PA. For å oppnå dette er det foreslått at nye plasminogenaktivatorer kunne fremstilles ved å anvende DNA teknologi.

Et forsøk på dette har vært det som vanlig kjennes som "do-meneskyfling". Det er foreslått at forbedrede plasminogenaktivatorer kan fremstilles ved å utelate domener fra eks-isterende plasminogenaktivatorer eller ved å kombinere domener fra en aktivator med andre domener fra en ytterligere aktivator. Noen av domene-skyflingsforsøkene som er blitt gjennomført er angitt av Harris [2]. Lignende forslag er også angitt i WO87/03906 (Upjohn).

Et annet forsøk, som har tatt sikte på å forbedre spesifisi-teten av plasminogenaktivatorer, er å knytte en plasminogenaktivator, eller et domene derav, til et molekyl med høy fib-ringbindende aktivitet. Det første rapporterte arbeide i dette område beskrev kryssbinding av serin proteasedomenet (B-kjeden) av u-PA til A-kjeden av plasminogen (Pin) ved delvis reduksjon og oksydasjon. Dette dannet et plasminogen A-kjede/u-PA-kjede hybrid (Plan A/u-PA B) med de fibrinbindende Kringle-domener av plasminogen og den enzymatiske aktivitet av u-PA. En 92.000 MW dimer som hadde en to ganger lavere enzymatisk aktivitet, men en høyere fibrinaffinitet enn u-PA ble avledet. Det var en fem ganger forbedring av plasminogenaktivering av hybridet i nærvær av oppløselig fibrin (se Robbins og Tanaka [3]).

Lignende undersøkelser ble gjennomført under anvendelse av serin protease domenet (B-kjeden) av t-PA. En disulfidsammen-knyttet dimer (Pin A/t-PA B) ble fremstilt (se Robbins og Boreisha [4]). Det rensede hybrid hadde omtrent 40% av den enzymatiske aktivitet av t-PA og redusert evne til å aktivere plasminogen. Det synes sannsynlig at hybridmolekylet ikke ville vise noen forbedret katalytisk mykningsgrad in-vivo i nærvær av fibrin og ville derfor ha redusert propp-lyseeffek-tiviteten.

Det er også blitt foreslått å knytte en plasminogenaktivator, eller domene derav, til i det minste den antigenbindende del av et antistoffmolekyl med spesifisitet for fibrin.

Det er f.eks. rapportert at u-PA og t-PA er blitt kjemisk

kryssbundet til et slikt monoklonalt antistoff spesifikt for P-kjeden av fibrin ved hjelp av unidireksjonelle linkere. Et lignende.konjugat omfattende et Fab fragment kryssbundet til u-PA ble også fremstilt (se Bode et al. (5, 6]).

De fibrinolytiske aktiviteter av disse konjugater u-PA og t-PA, ble sammenlignet under anvendelse av fjernelse av 125/1' fibrinmonomer knyttet til Sepharose<R>kuler som en bestemmelse av det fremstilte plasmin. Molekylene ble sammenligned ved ekvivalente enzymatiske aktiviteter. Ved dette kriterium ble antistoffkonjugatet øyensynlig mange ganger mer aktivt enn u-PA eller t-PA. Økningen i aktivitet var imidlertid inhibert ved det heptapeptid hvortil antistoffet var dannet. Ved in-vitro propplysebestemmelser var konjugatene 3 til 5 ganger mer effektive enn foreldreenzymene. I in-vivo kanin-trombe-modell var t-PA. konj ugatet 2 til 10 ganger mer effektivt enn t-PA, og dette antyder at mer potente og selektive fibrinolytiske midler kan fremstilles ved hjelp av denne teknikk (se Runge et al. [7, 8]). Disse konjugater har imidlertid de ulemper at de er vanskelige å fremstille og de er ustabile. De kan også lett fjernes fra en pasients blodstrøm for de kan virke in-vivo på en blodpropp.

Et ytterligere forslag for dette er angitt i EP-A-0 187 658 (General Hospital). Denne ansøkning foreslår også at de to komponenter kan sammenknyttes ved hjelp av en peptidtypebin-ding for å danne et hybrid hvori plasminogenaktivatordelen uttrykkes under anvendelse av .rekombinant DNA teknologi som et fusjonsprotein med antistoffdelen.

Enda et forsøk med rekombinant DNA teknikk for å fremstille antistoff/plasminogenaktivator-fusjonsproteiner er beskrevet av Schnee et al. [9]. Et monoklonalt antistoff med bindende spesifisitet for fibrin ble fremstilt. Genet for det variable domene og skjøtestykkeseksvensen av dette antistoff ble inn-ført i en SV-40 basert vektor hvori det ble forenet til en fraksjon av genomisk DNA som koder for det første og en del av det annet konstante domene av en museantistoff konstant region. 3' enden av antistoffgenfraksjonen ble knyttet til en cDNA sekvens som koder for B-kjeden av t-PA fra naturlige kuttesetet. Vektoren fremstilt på denne måte ble transfektert inn i en tung kjedetap variant av den myelomcellelinje hvorfra antifibrin-monoklonal antistoff var avledet. Transfek-terte cellelinjer fremstilte et hybrid molekyl omfattende en antifibrin variabel region, en muse-konstant region, inklu-sive hengslet og del av det annet konstante domene og, fusjonert til C-enden, B-kjeden av t-PA. Denne kjede har en molekylvekt på omtrent 65.000. Det er rapportert at denne kjeden øyensynlig riktig assosiert med den lette kjeden ut-skilt av tap-variant myelomcellelinjen vil produsere dimer med en molekylvekt på 170.000. Dimeren ble rapportert å være blitt isolert ved hjelp av affinitetskromatografering.

Dette hybride molekyl ble testet in-vitro for fibrinbinding og for plasminogenaktivering. Det ble funnet at det hybride molekyl hadde god fibrinbinding og detekterbare nivåer av plasminogenaktivering in-vitro.

Ved en symposiumpresentering gitt av Haber [10], som er en av ko-forfåtterne Schnee et al. [9] ble det gitt resultater av tester gjennomført in-vivo under anvendelse av det hybride molekyl. Det fremgår fra disse resultater at det hybride molekyl ikke er effektivt som en plasminogenaktivator in-vivo .

Presenteringen rapporterte også vedrørende produksjon av et annet hybridmolekyl som er tilsvarende det første molekyl, men hvori B-kjeden av t-PA er erstattet av B-kjeden av u-PA. Karakteriseringen av egenskapene av dette annet hybride molekyl var ikke fullstendig.

Ved presenteringen ble det angitt at grunnen til at det første hybride molekyl ikke var særlig aktivt in-vivo er at det ikke kan generere en fri N-terminal rest på t-PA-kjeden. Det ble angitt at intensjonen av taleren var å produsere ytterligere hybride molekyler som kunne spaltes til å frembringe en fri N-terminal rest på B-kjeden. Presentasjonen indikerte også at det ikke vil være nødvendig å ha noen andre domener av plasminogenaktivatoren enn serin proteasedomenet i det hybride molekyl.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det kan sees fra den foregående oversikt at selv om mye arbeid er gjennomført i et forsøk på å fremstille forbedrede plasminogenaktivatorer er det fremdeles ikke klart hvorledes slike forbedrede molekyler kan fremstilles.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveie-bringe en ny plasminogenaktivator med forbedret fibrinbindende og plasminogenaktiverende egenskaper.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en hybrid plasminogenaktivator omfattende:

1) et enkeltkjedet protein som:

ved sin N-ende har det variable domene av den tunge eller lette kjede av et fibrinspesifikt antistoff

et Kringleområde knyttet til C-enden av det variable domene, og

ved C-enden av proteinet har et serinproteasedomene fra en plasminogenaktivator knyttet til C-enden av Kringle-domenet,

og

2) et komplementært lett eller tungt kjedevariabelt domene av et antifibrin antistoff assosiert med det variable domene i det enkeltkjedede protein for å danne et anti-genbindingssete.

Det enkeltkjedede protein og det komplementære domene kan assosieres enten ikke-kovalent eller foretrukket kovalent, f.eks. ved hjelp av en eller flere cystein-disulfidbindinger.

Foretrukket er antistoffets tunge og lette kjededeler avledet fra det samme antistoff, som fordelaktig er et monoklonalt antistoff. Det monoklonale antistoff er passende et muse-. monoklonalt antistoff. Fordelaktig vil et slikt muse-monoklonalt antistoff være blitt "humanisert", f.eks. ved å pode de muse-hypervariable regioner på et humant antistoff-rammeverk som beskrevet av Reichmann et al. [11]. Alternativt kan det monoklonale antistoff være et humant monoklonalt antistoff.

Det foretrekkes at det variable domene i det enkeltkjedede protein er et tungkjededomene og at det komplementære domene er et lettkjede-variabelt domene.

Kringledomenet behøver ikke være knyttet direkte til det variable domene. Det kan derimellom være innsatt endel av eller samtlige av et eller flere antistoff-konstante domener. Foretrukket er der imidlertid ingen plasminogen aktivatordo-mener mellom Kringledomenet og det eller de antistoffavledede domener. Hvis f.eks. det variable domene er avledet fra anti-stof f--lettkj eden kan det enkeltkj edede protein inneholde det lettkjede-variable domene knyttet direkte til Kringeldomenet.

Ved en særlig foretrukket utførelsesform inneholder det enkeltkjedede protein et tungkjede variabelt domene, et tungkj ede første konstant domene og hengselregionen eller en modifisert hengselregion fra tungkjeden av et antistoff. Fordelaktig inkluderer enkeltkjedeproteinet ikke noe av eller mer enn en liten del av det annet konstante domene av tungkj eden. Nærværet av hengselregionen eller en modifisert hengselregion i enkeltkjedeproteinet tilveiebringer en anledning for den foretrukne plasminogene aktivator i henhold til den foreliggende oppfinnelse til å danne stabile dimere, difunksjonelle strukturer og vil medføre fleksibilitet til den hybride plasminogenaktivator.

Foretrukket fører hengselregionen direkte til Kringledomenet uten noen mellomliggende seksvenser.

Den modifiserte hengselregion kan f.eks. ha et redusert an-tall cysteinrester for å lette sammenføyningen av den hybride plasminogenaktivator til en dimer struktur.

Foretrukket,.hvor et eller flere konstante domener eller deler derav er til stede, er disse avledet fra et humananti-stoff. Således vil den hybride plasminogenaktivator være et chimerisk antistoff av den type som er beskrevet av Neuberger et al. [12, 13] .

Foretrukket er Kringeldomenet knyttet direkte til serinproteasedomenet slik at denne del av det enkeltkjedede protein nær ligner C-enden av u-PA eller t-PA. Mindre foretrukket kan det være en kort sammenknyttende sekvens mellom Kringle- og serinprotease-domenene slik at disse domener er indirekte sammenknyttet. Det bør imidlertid sikres at der ikke er noen lange sekvenser mellom Kringle- og serinprotease-domenene.

Kringle- og serinprotease-domenene kan ha sine native sekvenser. Alternativt kan imidlertid sekvensene varieres noe, f.eks. for å fjerne eventuelle labile sekvenser, som f.eks. den sekvens hvor spaltning foregår ved aktivering av plasminogenaktivatoren hvorfra domenet er avledet. Videre kan. serinproteasedomenet være et naturlig eller syntetisk mutantdo-mene med høyere katalytisk aktivitet enn for viil-typedome-net.

Foretrukket er Kringledomenet avledet fra en plasminogenaktivator (u-PA eller t-PA) og er fordelaktig K2-domenet av t-PA. •Foretrukket er serinproteasedomenet avledet fra t-PA.

Spesielle hybride plasminogeneaktivatorer i samsvar med den foreliggende oppfinnelse vil som det enkeltkjedede protein omfatte: (a) - det variable domenet, det første konstante domene og hengselregionen av en antifibrin monoklonal antistofftung kjede knyttet direkte til det annet Kringledomene og serinproteasedomenet av t-PA. (b) - som for (a), bortsett fra at hengselregionen er utelatt, (c) - som for (a), med unntakelse av at hengselregionen

er endret slik at bare en cysteinrest er til stede,

(d) , (e)

og (f) - som for (a), (b) og (c), men ved at t-Pa serinproteasedomenet er erstattet med u-PA serinprotease-domenet, eller (g) - som for (a), og inkluderende u-PA Kringledomenet

mellom hengselregionen og t-PA Kringledomenet.

I alle de ovennevnte tilfeller vil enkeltkjedeproteinet foretrukket være assosiert med en komplett komplementær lett kj ede.

Ved et annet•aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en hybrid plasminogenaktivator i samsvar med det første aspekt ved den foreliggende oppfinnelse hvori enkeltkjedeproteinet er blitt spaltet ved naturlige spaltningssete av plasminogenaktivatordelen av enkeltkjedeproteinet, idet serinproteasedomenet forblir bundet, foretrukket ved hjelp av disulfidbindinger, til resten av.proteinet. .Selv om det ville være mulig å produsere den hybride plasminogenaktivator i samsvar med den foreliggende oppfinnelse ved hjelp av konvensjonelle kjemiske metoder, f.eks. ved å forene forskjellige proteinfragmenter ved hjelp av peptidbindinger, foretrekkes det at den fremstilles ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi.

Følgelig, ved et tredje aspekt tilveiebringer oppfinnelsen også en ekspresjonsvektor som inkluderer et operon omfattende : en første DNA-sekvens som koder for det variable domene av den tunge eller lette kjede i et fibrinspesifikt antistoff,

en annen DNA-sekvens, som koder for et Kringledomene i en plasminogenaktivator, knyttet i en leseramme til 3'-enden av den første DNA-seksvens, og

en tredje DNA-sekvens som koder for et serinproteasedomene av en plasminogenaktivator, knyttet i leseramme til 3'-enden av den annen DNA-sekvens.

De tre DNA-sekvenser kan uavhengig være cDNA-sekvenser, genomiske DNA-seksvenser eller blandinger derav. Foretrukket er operonene bygget opp ved å ta hensyn til de naturlige intron/ exon-forbindelsessteder i det genomiske DNA som koder for domenene til stede i den hybride plasminogenaktivator. Fordelaktig blir de hybride plasminogenaktivatorer (a) til (g) ovenfor fremstilt ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi under anvendelse av overveiende cDNA.

Operonet i uttrykkingsvektoren kan inkludere ytterligere DNA-sekvenser mellom den første og annen DNA-sekvens, som f.eks. koder for et eller flere antistoff-konstante domener eller deler derav. Således kan uttrykkingsvektoren konstrueres slik at en vertcelle transformert dermed kan uttrykke det enkeltkj edede protein som definert i samsvar med det første aspekt av oppfinnelsen i hvilke som helst av de former som er refer-ert i det foregående.

Foretrukket, i uttrykkingsvektoren i samsvar med oppfinnelsen, koder den første DNA-sekvens for et tungt kjedevariabelt

■domene. I dette tilfelle vil det være mulig å transformere en vertcelle som utskiller en komplementær lett kjede med ut-

trykkingsvektoren og oppnå uttrykking av den hybride plasminogenaktivator i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.

I tilfeller hvor vertcellen ikke utskiller et komplementært domene, som f.eks. med en ikke-utskillende myelomlinje, vil det imidlertid være nødvendig å meddele vertcellen evnen til å utskille det komplementære domene. Dette kan gjøres ved ko-transfektering av vertcellen samtidig eller foretrukket sek-vensmessig med en annen uttrykkingsvektor som inkluderer et operon som omfatter en fjerde DNA-sekvens som koder for det komplementære variable domene. F.eks. kan en vertcellelinje som utskiller en lett kjedevariabel domene fremstilles ved passende transfeksjon. Denne kan således ytterligere trans-fekteres med en vektor som koder for et komplementært tungkj edebasert enkeltkjedet protein.

Alternativt inkluderer imidlertid uttrykkingsvektoren ved det tredje aspekt av oppfinnelsen ytterligere et annet operon omfattende en fjerde DNA-sekvens som koder for komplementære variable domener. Fordelaktig, hvor den fjerde DNA-sekvens koder for det variable domene av den tunge kjede koder den ■ også i det minste for det første konstante domene og hengselregionen av en tung kjede. Hvor den fjerde DNA-sekvens koder for det variable domene av den lette kjede, koder den fordelaktig også for det konstante område av en lett kjede.

Den foreliggende oppfinnelse inkluderer også en vertcelle transfektert med en uttrykkingsvektor i henhold til det tredje aspekt ved den foreliggende oppfinnelse eller, om nødvendig, kotransfektert med uttrykkingsvektoren av det tredje aspekt og den annen uttrykkingsvektor som definert i det foregående.

Vertcellen kan være en prokaryotisk eller eukaryotisk celle, som f.eks. en bakteriecelle, gjærcelle eller pattedyrcelle. Foretrukket er vertcellen en pattedyrcelle. Mest foretrukket er vertcellen en celle fra eggstokkene i kinesisk hamster (CHO) selv om en myeloid vertcelle, som f.eks. en myelomcelle eller hybridomcelle alternativt kan anvendes. Det vil også være mulig å anvende andre ikke-myeloide pattedyrceller som f.eks. BHK-celler, C127 eller L-celler. Pattedyrcellelinjer er fordelaktige ved at de har de nødvendige intracellulære mekanismer for behandling og sammensetning av slike hybride molekyler.

Hvor det variable domene er avledet fra den tunge kjede i et monoklonalt antistoff, kan vertcellen være en tung kjedetap-variant hybridomcelle avledet fra den monoklonale antistoff-produserende celle.

De rekombinante DNA-teknikker for fremstilling av uttrykk-ingsvektorer er f.eks. beskrevet av Maniatis et al. [14]. Prosesser anvendt for transfektering av cellelinjer er vist av Bebbington og Hentschel [28]. Prosesser anvendt for å dyrke vertceller og utvinne produkter derav er beskrevet av Rhodes og Birch [15].

Det forutsettes at de hybride plasminogenaktivatorer i samsvar med den foreliggende oppfinnelse vil ha fordelaktige egenskaper sammenlignet med t-PA eller antistoff-plasmino-genaktivatorene beskrevet av Schnee eller Haber [9 eller 10]. De foreliggende hybride plasminogenaktivatorer vil være meget'" spesifikke for fibrin og binde tett til dette. Videre vil-den plasminogenaktiverende virkning av den foreliggende hybride plasminogenaktivator være like så stor som eller bedre enn for t-PA, selv in-vivo. Det er overraskende at de foreliggende hybrid plasminogenaktivatorer er effektive på bakgrunn av Habers lære om at nærværet av Kringledomener ikke er nød-vendig.

Det antas at den forbedrede plasminogenaktivering skyldes

. nærværet av Kringleregionen som overfører en tilsvarende endring til serinproteasedomenet, idet dette letter aktiveringen av dette domene for å gjøre det i stand til å aktivere plasminogen mer effektivt. Søkeren ønsker imidlertid ikke å være

begrenset til denne forklaring på den overraskende effektive karakter av den foreliggende hybride plasminogenaktivator.

Kort beskrivelse av tegningene

En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse skal nå be-skrives som eksempel, med henvisning til de vedføyde tegninger, hvori: Fig. 1 viser strukturen og aminosyresekvensen av u-PA;

indikerer inter- og intra-kjede disulfidbindinger, indikerer N-tilknyttet oligosakkarid, S indikerer signalpeptid, E indikerer epidermalt vekstfaktorlignende domene, K indikerer Kringledomene, P indikerer serinproteasedomene,

indikerer spaltningssete for aktivering av u-PA, o indikerer katalytiske rester i serinproteasedomenet.

Fig. 2 viser strukturen og aminosyresekvensen av t-PA;

, , S, E, P, , og o i figuren har betydninger ekvivalente med de samme symboler i fig. I. L indikerer leder-peptidet, F indikerer fibronektin fingerlignende domene, K indikerer det første Kringledomene, og K2indikerer det annet Kringledomene.

Fig. 3 viser strukturen av plasmidet EE7.H3.

Fig. 4 viser strukturen av plasmidet EE7.HcmV.

Fig. 5a til 5c viser nukleotidsekvensen og avledet aminosyresekvens av Y22 lettkjeden anvendt i det hybride molekyl i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. De variable og konstante deler av sekvensen er indikert. Fig. 6a til 6c viser nukleotidsekvensen og avledet aminosyresekvens av den variable del av Y22 immunoglobulin tungkjeden. Grensene mellom signalpeptid, variabelt domene og CH1-regionen er indikert. Fig. 7 viser resultatene av et in-vitro propplyseforsøk. % propplyse er avsatt mot tiden for en enzymkonsentrasjon av 500 U/ml. Enzymer anvendt var — — kommersielt tilgjengelig tPA fra Genentech Inc.; Y22-K2~SP var konstruksjonen i henhold til den foreliggende oppfinnelse; og . _.. Kringle 2-serinprotease (K2SP) fragment av tPA.

Fig. 8 viser tilsvarende in-vitro propplyseresultater for Y22-K2SP konstruksjonen i henhold til den foreliggende oppfinnelse og Genentech tPA ved konsentrasjoner på 50 U/ml, 100 U/ml og 500 U/ml.

indikerer bakgrunn.

Metoder for gjennomføring av oppfinnelsen

Forutgående forsøk

Seks vektorer ble konstruert som beskrevet i det følgende. Den første og fjerde av disse (1 og 2 i tabell 1) inkluderer DNA-kodende hybride proteiner som eksemplifiserer proteinene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. De andre fire vektorer inkluderer sekvenser som koder for proteiner som mangler Kringledomener, men er inkludert for sammenlignings-formål.

pEE7.VCHIH.K2SP.HCMV

Plasmid EE6 er beskrevet i WO 89/01036. Plasmid EE7.H3 er vist i fig. 3. Det er avledet fra pEE6 ved innskudd av den sene SV40 promoter inn i det ene Hind III sete av pEE6. Denne promoter ble oppnådd som et 342 bp Pvu II-Hind III fragmen fra SV40, inneholdende opprinnelsen for replikasjon og Hind III linkere ble tilsatt for å lette innføringen. Plasmid EE7.H3 ble kuttet med Hind III og Sma I og deretter behandlet med alkalisk fosfatase.

pSV.VNp 72b A (CH2, CH3), et plasmid med et operon som koder for det tungkjedevariable domene, det første konstante domene og hengselregionen av et anti-NlP (nitrojodofenyl) antigen (se fig. 1) til Williams og Neuberger [13], ble behandlet med Xhol og inkubert med T4 DNA polymerase for å fylle Xhol-setet. Etter fjernelse av T4 DNA polymeraseaktivitet ble DNA kuttet med HindiII og det største fragment [Hindlll- Xhol (butt ende)] med omtrent 3,8 kb ble isolert. Dette fragment inneholdt kodesekvensen for det første konstante domene og hengselregionen av antistoffet ble innført mellom HindiII og Smal-setene av det kuttede og behandlede EE7.H3 plasmid. Dette fremstilte plasmidet EE7.CHIH og gjenskapte det ene Xhol-sete.

pSV.VNP"Y2b A (CH2, CH3) ble også behandlet med Ncol og det syntetiske oligonukleotid

5' CATGGTGGAAGCTTCCAC 3'

ble ligert dertil. Dette reformerte Ncol-setet med en Kozak konsensus-sekvens (CCACC) omkring initiatoren ATG og anbrakte et Hindlll-sete oppstrøms derfra. Behandling av ligeringspro-duktet med Hindlll tillot isolering av et HindIII-fragment inneholdende det variable domene av NP genet (omtrent 1100 bp). Dette HindIII-fragment ble klonet inn i Hindlll-setet av EE7.CHIH for å produsere plasmidet EE7.VCHIH.

Plasmidet EE7.tPA inneholder hele tPA cDNA genet (se Pennica etal. [1]) på et BamHI-fragment innskutt i Bcll-setet av plasmid EE7.H3. BamHI-fragmentet inneholder det meste av den 5' utranslaterte region av mRNA og forløper til Bcll-setet i den 3' utranslaterte region. Nukleotidsekvensen av tPA-genet i plasmid EE7.tPA ble endret ved setedirigert mutagenese for å innføre et Bglll-sete umiddelbart foran sekvensen som koder for.Asn-resten i posisjon 177 (se fig. 2). Sekvensene som koder for det annet Kringleområde og serinproteaseområdet av tPA ble så isolert på et XhoII-fragment med omtrent 1080 bp (fra Bglll (XhoII) setet ved restene 175, 176 til nukleotidet 1805 i den 3' utranslaterte region av tPA cDNA).

EE7.VCHIH ble behandlet med Xhol, ligert med Xhol-Bglll adap-toren

og deretter behandlet med Bglll. XhoII-fragmentet fra EE7.tPA inneholdende sekvensene som koder for det annet Kringledomene og serinproteasedomenet ble innført i dette Bglll sete for å produsere plasmidet EE7.VCHIH.K2SP. Et Pstl-fragment (Pstl m-segmentet) av det humane cytomegalo-virus (HCMV) dominant immediat tidlig (IE) gen mRNA ble isolert (se Boshart et al. [16]). Fragmentet spenner over pro-moterregionen av genet. Et HindIII-fragment ble generert ved å ligere syntetisk oligonukleotider til Pstl-endene for å danne følgende sekvens

Det således genererte HindIII-fragment ble så innført i Hindlll-setet av plasmid EE6 for å danne plasmid EE6.HCMV.

(Plasmid EE6 er hovedsakelig det samme som plasmid EE7.H3 med unntakelse av at SV40-regionen ikke er til stede.)

HCMV-promoteren ble isolert på et 2,1 kb HindIII-fragment fra EE6.HCMV og klonet inn i EE7.VCHIH.K2SP som var delvis behand-let med Hindlll. Et plasmid ble isolert inneholdende HCMV-fragmentet i den riktige orientering og oppstrøms fra V-regionen av anti-NIP genet. Dette plasmid er EE7.VCHIH.K2SP.-HCMV. Nukleotidsekvensen over forbindelsesstedet som forener CH2 domenet til det annet Kringledomene (K2) er:

pEE7.VCHI.SPtPA.HCMV

Sekvensen som koder for hoveddelen av serinproteasedomenet av t-PA ble isolert på et Ddel-fragment som begynner ved nukleo tid 1005 og inkluderer Bglll-setet ved nukleotid 2160 (se Harris et al. [17]). Til dette fragment ble ligert de to nu-kleotider:

Disse oligonukleotider rekonstruerer serinproteasedomenet til sekvensen T-C-G-L-R- som begynner serinproteasedomenet (se fig. 2) som definert ved intron-exon-forbindelsesstedene og anbringer et Apal-sete ved 5'-enden av fragmentet. Etter ligering og rekonstruksjon ble serinproteasedomenet isolert på et ApaI-BglII-fragment med omtrent 1190 bp.

EE7.VCHIH.K2SP ble behandlet med Apal og Bglll. Apal kutter anti-NIP-genet ut ved begynnelsen av hengselregionen. Således mangler vektoren som skriver seg fra de ovennevnte behand-linger cysteinrestene av72b hengselregionen. Apal-Bglll-fragmentet som koder for serinproteasedomenet ble innført i denne vektor for å danne EE7.VCHI.SPtPA.

EE7.VCHI.SPtPA ble behandlet delvis med Hindlll og HCMV-promoter (se det foregående) ble innskutt oppstrøms fra den anti-NIP variable region for å danne EE7.VCHI.SPtPA.HCMV.

Nukleotidsekvensen over forbindelsesstedet ved hengselregionen og serinproteasedomenet ble bestemt å være:

pEE7.VCHIH.SPtPA.HCMV

EE7.VCHIH.K2SP.HCMV ble behandlet med Xhol og de resulterende 5'-forlengelser fylt med T4 DNA polymerase. Dette fragment ble så inkubert med Sali og alkalisk fosfatase og det resulterende store vektorfragment isolert.

EE7.VCHI.SPtPA ble behandlet delvis med Apal og de resulterende 3'-forlengelser fjernet med T4 DNA polymerase. Ytterligere behandling med Sali tillot isolering av et fragment med omtrent 1800 bp med Apal (butt ende) og Sall-ender inneholdende serinproteasedomenet.

Fragmentet med omtrent 1800 bp ble ligert til det store vektorfragment av EE7.VCHIH.K2SP.HCMV for å frembringe

EE7.VCHIH.SPtPA.HCMV.

Nukleotidsekvensen over forbindelsesstedet som forener begynnelsen av CH2-domenet til serinproteasedomenet var:

pEE7.VCHI.K2SP.HCMV

EE7.VCHI.SPtPA.HCMV ble behandlet med Apal<p>g inkubert med T4 DNA polymerase for å fjerne 3'-forlengelsene frembrakt med Apal. Det resulterende plasmid ble behandlet med Sali og alkalisk fosfatase og det store vektorfragment isolert.

EE7.VCHIH.K2SP ble behandlet delvis med Xhol, inkubert med T4 DNA polymerase for å fylle utstående 5'-forlengelser og der-, etter med Sali. Et fragment med omtrent 1700 bp inneholdende det annet Kringledomene og serinproteasedomenet ble isolert. Fragmentet med omtrent 1700 bp ble ligert til det store vek-torf ragment for å frembringe EE7.VCHI.K2SP.HCMV.

Nukleotidsekvensen over forbindelsesstedet mellom hengsel-delen og begynnelsen av det annet Kringledomene ble bestemt å være:

pEE7.VCHIH.SPpUK.HCMV

Prourokinase cDNA oppnås på et fragment som løper fra et Hindlll-sete oppstrøms fra initiatoren og ATG til et Stul-sete i den 3'-utranslaterte region. Dette Hindlll-Stul-fragment ble innskutt med Hindlll og Smal-setene av plasmidet pSP65. (Plasmid pSP65 er beskrevet av Melton et al.

[18]) . Hoveddelen av sekvensen som koder for u-PA serinprotease domenet kan isoleres fra PSP65.pUK på et Ball - Sacl-fragment.

Derfor ble pSP65.pUK behandlet med Ball og deretter ligert

med oligonukleotidene:

Denne ligering gjendanner Ball-setet, gjenoppbygger serinproteasedomenet og anbringer et Xhol-sete umiddelbart 5' til dette. Serinproteasedomenet ble så isolert på et Xhol - Sacl-f ragment med omtrent. 950 bp. EE7 . VCHIH ble behandlet med SacI og Sali og 600 bp-fragmentet isolert. EE7.VCHIH.K2SP.HCMV ble behandlet med Xhol og Sali og behandlet med alkalisk fosfatase. Det store vektorfragment ble så isolert. De tre fragmenter beskrevet i det foregående ble så.ligert sammen for å danne EE7.VCHIH.SPpUK.HCMV.

Nukleotidsekvensen over CH2 - SPpUK forbindelsstedet ble bestemt å være:

pEE7.VCHI.SPpUK.HCMV

EE7.VCHIH.SPpUK.HCMV ble behandlet med Apal og Xhol og deretter inkubert 'med T4 DNA polymerase for å frembringe buttender. Disse ender ble forenet ved ligering for å frembring EE7.VCHI.SPpUK.HCMV.

Nukleotidsekvesen over forbindelsstedet mellom begynnelsen av hengselet og serinproteasedomenet ble bestemt å være:

Plasmidet EE7.preX.HCMV ble konstruert ved å isolere det komplette lambda lettkjedegen (se Wood et al. [19]) på et Clal-BglII-fragment og kloning av fragment inn i plasmidet EE7.H3 som var blitt behandlet med Clal og Bell. Dette frembrakte EE7 . preX.

EE7.preX ble behandlet med Hindlll og behandlet med alkalisk fosfatase. HCMV HindIII-fragmentet (se det foregående) ble så innført for å frembringe plasmidet EE7.preX.HCMV.

Hver av de ovennevnte seks tungkjedetype plasmider ble kotransfektert inn i COS celler med plasmidet EE7.preX.HCMV som koder for den komplette lambda lettkjede for anti-NlP antistoffet. COS-cellene ble dyrket i hver av tre media og proteinet fremstilt av cellene ble bestemt med hensyn på anti-NIP aktivitet og plasminogenaktivatoraktivitet. Resul-tatet er vist i tabell 1 som viser at molekylene bibeholder antigenbindende og enzymatisk aktivitet.

Y22 Antistoff

Balb/c mus ble immunisert med et human plasmin-generert fibrinogen nedbrytningsprodukt Y. Miltceller fra de immuni-serte mus ble fusjonert P3 x Ag 8653 myelomceller. Et klon (Y22) ble isolert som frembrakte monoklonalantistoffer av IgGl k-typen. Y22 antistoff synes å være rettet mot en dis-kontinuerlig, tredimensjonal epitope i det domenet av fibrin. Y22 antistoff innvirker sterkt på polymerisering av fibrin ved en trombin-tidstest. Ettersom et polymerisasjons-sete befinner seg i den distale ende av fibrinet, det vil si i D-domenet, kan dette sete være i eller nær epitopen av Y2 2. Forsøk med<99m>Tc-merket<y>22 in-vitro viser at Y22 binder hurtig for dannelse av propper.^9<m>Tc-Y22 binder også til for-dannede plasmapropper i et plasmamiljø, selv i nærvær av høye konsentrasjoner av heparin. Propplokaliseringsforsøk i kaniner- og rotter viser den høye fibrinspesifisitet og potensi-alet av<99m>Tc-Y22 f0r trombeavbilding in-vivo.

Polyadenylert RNA ble isolert fra Y22 hybridom-cellelinjen under anvendelse av guanidinium-isotiocyanate/litiumklorid-metoden (Cathala et al. [20]). Dobbelttrådet cDNA ble syntetisert (Gubler og Hoffman [21]), og et cDNA bibiliotek opp-bygget i plasmidvektoren CDM8 (Aruffo og Seed [22]) under anvendelse av BstXl adaptorer inneholdende et internt EcoRl-sete. En screeningprobe bie syntetisert, komplementær til museimmunoglobulin-lettkjede konstant region, idet denne var en 20 mer komplementær til restene 4658-4677 i den genomiske muse C^sekvens (Max et al. [23]). Proben ble radiomerket ved 5'-enden med [t32P] ATP under anvendelse av T4 polynukleotid kinase (Amersham International) og anvendt for screening av 40.000 kolonier fra cDNA biblioteket.

Plasmidsekvensanalyse (Chen og Seeburg [24], modifisert som beskrevet i Sequenase-håndboken) tillot identifisering av et klon som inneholdt den komplette leder, varible og konstante regioner av den lette kjede, betegnet pYL22.L12.

Sekvensen av leder- og variable-regioner ble bestemt. Under-søkelse av den utledede aminosyresekvens viste at Y22 har en k lettkjede av underklasse VII, som viser betraktelig homo-logi med andre karakteriserte immunoglobulingener, slik at det muliggjøres at grensene for lederdomenet, variable- og konstant-domener kan bestemmes. Nukleinsyresekvensen og ut-ledet aminosyresekvens for Y22 lettkjeden er vist i fig. 5a til 5c.

For uttrykking av Y22 lettkjedeprotein ble EcoRI-fragment isolert fra pY22-L12 og innført i det ene EcoRI-setet av plasmidet EE7.HCNV[28]. Plasmidet som uttrykte Y22 lett-kjede ble betegnet pEE7.HCMV.Y22-L1217.

Kloning av Y22 tungkjede

Polyadenylert RNA ble isolert og omdannet til dobbeltrådet cDNA som beskrevet for lettkjedekloningen. Etter addisjon av BstXl adaptorer til butt-ende molekylene ble et cDNA biblio-tek konstruert i pS064X. pSP64X ble avledet ved innføring av Xbal stuffer-fragment (pakningsfragment) fra CDM8 (Aruffo og Seed [22]) inn i Xbal-setet i polylinkeren av pSP64 (Melton

et al. [18]).

Det Y22 antifibrin monoklonalantistoff er av ^1 underklasse og således ble et DNA-fragment som koder for den konstante region i en klonet"Yl tungkj ede anvendt som en probe for kloningen av Y2 2-tungkjeden. Et lkb BamHI til EcoRl-restrik-sjonsfragment omfattende den tungkjede konstante region av B72.3 antistoffet (Whittle et al. [25]) ble isolert, a<32>P merket under anvendelse av den tilfeldige primingsmetode til Feinberg og Vogelstein [26] og anvendt for screening av cDNA-biblioteket. Under anvendelse av denne probe ble et plasmid isolert fra biblioteket og betegnet pSP64X.Y22H11.

Sekvensen av musegenet er blitt bestemt [27]. Denne viser et Bgll-sete nær enden av Chl og et Ndel-sete i hengselregionen. Analyse av tungkjeden inneholdt i cDNA pSP64X.Y22H11 bekreftet deres nærvær og viste at der var ingen andre Bgll eller Ndel-seter i Y22 tungkjede cDNA. Nukleinsyre- og avledet aminosyresekvenser for del av Y22 tungkjedeklonet er vist i fig. 6a og 6b.

Tungkjedene og lettkjedene av Y22 antistoffet er således blitt klonet. Under anvendelse av konvensjonelle metoder med rekombinant DNA-teknologi har det ved den foreliggende oppfinnelse vært mulig å erstatte de anti-NIP variable regioner av konstruksjonene omtalt i det .foregående med den antifi-brinvariable region fra Y22 tungkjede.

De følgende antifibrin-plasminogenaktivatorkodende vektorer har således blitt konstruert.

Vektor omfattende en konstruksjon med naturlig hengsel Preliminær konstruksjon

PSP64X.Y22H11 ble behandlet med Ndel for å fjerne CH2 og CH3 regionene. Kodonene for de siste tre aminosyrer i hengselet og de første fem aminosyrer i CH1 sammen med restriksjonsse-ter for Xhol og EcoRI ble erstattet ved ligering oligonukleotidene R1271 og R1272.

R1271: 5'-TATGTACGGTACCAGAAGTATCACTCGAG-3<1>

R1271: 5'-AATTCTCGAGTGATACTTCTGGTACCGTACA-3'

Plasmidet EE7.HCMV ble konstruert som vist i fig. 4. Plasmid EE7.H3 (beskrevet i det foregående og vist i fig. 3) ble behandlet med Hindlll og Hindlll.HCMV-fragmentet ble innført i det behandlede EE7.H3. Hindlll-setet mellom SV40-regionen og HCMV-regionen ble så ødelagt ved hjelp av delvis behandling, butt-ende dannelse og religering, etterfulgt av seleksjon for den ønskede delesjon.

Etter behandling med EcoRI ble et Y22 F(ab<1>) isolert og inn-ført i EE7.HCMV [28] som var blitt behandlet med EcoRI. Disse manipulasjoner produserer EE7.HCMV (V.CH1.H)Y22 med en ene-stående Xhol etter kodonene for de første fem aminosyrer av CH2

EE7.HCMV.(V.CH1.H)Y22ble behandlet med Xhol og behandlet med kalveintestinal alkalisk fosfatase. Xhol-fragmentet inneholdende K2SP-domenene av tPA ble så innført i' denne vektor og frembrakte EE7.HCMV.(V.CH1.H) Y22•K2SP• Nukleotidsekvensen over forbindelsesstedet av CH2-regionen og K2-domenet ble bestemt å være:

Vektorer omfattende konstruksjoner med muterte hengsler Preliminær konstruksjon

For å lette ytterligere arbeid ble et plasmid inneholdende et eneste Nrul-sete konstruert. pSP64X.Y22H11 ble behandlet med Bgll, ligert med oligonukleotider R1273 og R1274 og deretter behandlet med EcoRI. Dette tillater isolering av et EcoRI-fragment inneholdende V.CH1 med Nrul og Xhol-seter ved begynnelsen av hengselregionen.

Dette EcoRI-fragment ble klonet inn i EcoRI-setet av EE7.HCMV for å frembring EE7.HCMV(V.CHl.Nrul)Y22•

PEE7.HCMV.(V.CH1.H A 2 cys)y22

EE7.HCMV (V.CHl.Nrul)Y22ble behandlet med Nrul og ligert med oligonukleiotidene R1315 og R1316. Denne reaksjonsblanding ble så kuttet med Xhol og religert til å danne EE7.HCMV(V.CH1.H A 2 cys)Y22

Denne nukleotidsekvens over hengselregionen av dette plasmidet ble bestemt, å være:

A<*>markerer alaniner i stedet for cysteiner.

. EE7.HCMV.(V.CHl.Nrul)Y22ble behandlet med Nrul og ligert med oligonukleotidene R1317 og R1318. Denne reaksjonsblanding ble så kuttet med Xhol og religert for å danne EE7.HCMV.(V.CHl A 2 cys)-Y22F

PEE7.HCMV.(V.CH1.H A 2 cys)Y22-K2sP

EE7.HCMV. (V.CHl. H A 2 cys)Y22-F ble behandlet med Xhol og ligert med Xhol-fragmentet inneholdende Kringle 2- og serin- protease-domenet av tPa og frembrakte EE7.HCMV.(V.CHl. H A 2 cys)Y22.K2SP.

Psp65.pUK ble behandlet med Ncol som kutter nukleotidet 336 i Kringle-domenet. Syntetisk oligonukleotider R1319 og R1320 ble ligert til Ncol-setet for å komplettere Kringle-regionen opp til intron/exon-forbindelsesstedet ved nukleotid 272 og anbringe et Xhol-sete oppstrøms fra Kringle-regionen.

Sekvensen av oligonukleotiden er som følger:

KSPpUK-domenene ble så isolert på et XhoI-SacI-fragment.

EE7.(VCHI.H)NIP ble behandlet med SacI og Sali og 600pb-fragmentet isolert. EE7.HCMV.(VCHI.H A 2 cys)Y22.F ble be~handlet med Xhol og Sali og behandlet med alkalisk fosfatase. De tre fragmenter beskrevet i det foregående ble ligert

. sammen og dannet EE7.HCMV.(V.CHl.H 2 cys)Y22•KSPpUK. Nukleotidsekvensen over forbindelsesstedet ble bestemt å være:

I oppfinnelsens sammenheng ble anti-NIP lettkjeden erstattet med Y22 lettkjeden og for å bevirke kotransfeksjon av vektorene som koder for tung- og lett-kjedegenene.

Det ble således fremstilt antifibrinanaloger av konstruksjonene vist i tabell 1. Som et eksempel ble en konstruksjon, betegnet. Y22-K2SP undersøket. Denne konstruksjon har en Y22 lettkjede og en tungkjede omfattende det Y22-variable domene og et naturlig hengsel knyttet til det annet Kringle- og serinprotease-domenet av tPa. Resultatene angitt i det følg-ende indikerer at denne konstruksjon har øket fibrinbindende kapasitet i forhold til tPA og et lignende mønster med enzymatisk aktivitet.

Videre vil det være klart at dimerisering, ved hengselregionen av konstruksjonene, vil gi hybride plasminogenaktivatorer av den difunksjonelle dimere struktur som er omhandlet i det foregående.

EKSEMPEL

Uttrykking av det hybride protein Y22-K2SP

CHO celler ble transformert med vektor pEE7.HCMV.Y22-L1217, som koder for Y22-lettkjeden, og deretter retransformert medPEE7.HCMV.(V.CH1.H)Y22-K2SP- Flere kloner ble så undersøkt for å etablere deres vekst og produktivitet under lave serum-betingelser. Transformerte CHO celler som var dyrket på for-hånd knyttet til plastmaterial ble tilpasset til å gro i sus-pensjon i Dulbecco's minimale essensielle medium (DMEM) inne-, holdende 1% føtalt kalveserum (FCS), serumfri supplementer inneholdende bovint serumalbumin, insuling og andre slike proteiner, som inneholdt i kommersielle serumfri media, og 2 x gpt. Cellene av hvert klon ble dyrket i rysteflasker og vekst og produktivitet overvåket. Produktivitet ble bedømt på basis av plasminogenaktiverende aktivitet av det produserte hybride proteinet (betegnet Y22-K2SP), bestemt ved hjelp av en S2251 aktivitetsbestemmelse. Denne bestemmelse måler den. plasminogenaktiverende aktivitet av konstruksjonen ved å anvende den for å katalysere omdannelsen av lys-plasminogen til plasmin. Plasminet bevirker så omdannelse av det kromo-gene substrat S2251 til et gult produkt og intensiteten av fargingen anvendes så på et mål for enzymaktiviteten. Resultater oppnådd for 3 CHO cellekloner betegnet RT14, RT11 og RT23 er vist i tabell 2.

RT14 ble selektert for ytterligere studium i betraktning av dets gode vekst og produktverdier. Cellelinjen ble vist å være stabil i fravær av gpt seleksjon og viste ikke noen særlig nedsettelse i spesifikk produktivitet med økende genera-sjonstall ved videreføring i 96 generasjoner.

RT14 var egnet for vekst i stor skala (1-1001). F.eks. ble RT14 dyrket opp til generasjon 42 i DMEM + 1% FCS + serumfri supplementer og overført til en 1-liters omrørt fermenter. En tilførsel av glukose og aminosyrer ble tilsatt når celleden-siteten nådde 1 x 10^ celler/ml og cellene fortsatte å vokse til en 3 x IO<6>til levedyktige celler/ml. Produktet ble høstet ved 50% levedyktighet. Produktivitetsdata viste en gradvis økning i tPA aktiviteten tidlig ved fermentering, men øker sterkt etter at cellene nådde maksimal levedyktighet og gikk inn i den synkende fase. Maksimale verdier oppnådd ved høstingen var ca. 3.000 IU/ml. Dette tilsvarer en konsentrasjon må 6,8 ug/ml og forutsetter en spesifikk aktivitet på 440 IU/ug. Ved zymografi viste fermentasjonsprofilen nedbrytningsprodukter tilsvarende størrelsen av serinproteasen. Dannelse av disse nedbrytningsprodukter ble markert redusert ved tilsetning av 5 0- KIU/ml aprotinin til fermenteringsmediet. Denne prosess ble oppskalert til 5L i en luftet fermenter og lignende resultater ble oppnådd. Ved hosting var produktinn-hold 3.800 IU/ml som målt ved S2251 aktivitetsbestemmelse.

Rensing av proteinet

Initial rensing av det hybride protein fra fermentasjonene beskrevet i det foregående ble oppnådd ved bruk av et Fibrinogen-Reakti-Gel ® addukt. Fibrinogen-Reacti-Gel ® ble fremstilt fra 1,1'-karbonyl-diimidazol (CDI) Reacti-Gel

(6x) fra Pierce Chemical Company på følgende måte.

100 ml CDI-Reacti-Gel ® ble filtrert gjennom en sintret glasstrakt for å fjerne aceton og deretter vasket tre ganger med en koplingsbuf f er (0.1 M Na2CC>3pH6.1). 1 g av fibrinogen ble oppløst i 200 ml koplingsbuffer. 1 ml av oppløsningen ble tatt og dens A28Obestemt. Den vaskede Reacti-Gel ® ble resuspendert i 100 ml av koplingsbufferen i en 1 1 rulleflas-ke og det oppløste fibrinogen tilsatt. Gel/ligand blandingen ble så omrystet ved 4° C i 3 døgn for å bevirke kopling. Deretter ble Gel vasket gjennom en sintret glasstrakt med koplingsbuf f er. Overskudd av aminer ble blokkert ved tilsetning til; gelen av 3.00 ml blokkerende buffer (1 M etanolamin, pH 9,0) og gelen ble rystet over natten, hvoretter supernatanten ble tatt ut, dialysert mot vann og A2qq mål. Ved sammenligning med A28Omålt initialt kunne en kontroll foretas ved at alt fibrinogen hadde koplet til Reacti-Gel Ubundet ligand ble fjernet ved sekvensmessige vaskinger med 1 M NaCl, injek-sjonsrent vann og koplingsbuffer. Fibrinogen-Reacti-Gel

addukt ble så vasket med lagringsbuffer (50 mM Tris; 0,1 M NaCl, 0,9% Tween ® 80; pH 8,0) og lagret ved 4° C inntil det var behov for det.

En fibrinogen-Reacti-Gel ® kolonne ble så fylt og dyrkings-supernatant fylt inn i kolonnen. Etter fullstendig innfyl-ling ble kolonnen vasket med en natriumfosfatbuffer (50 mM natriumfosfatbuffer; 0,9% NaCl; 0,05% Tween ® 80; pH 7,4) og deretter på nytt med samme buffer inneholdende 50 mM E-amino kapronsyre for å fjerne eventuelt nedbrutt material og egen t-PA produsert av cellelinjen.

Det hybride protein kunne så elueres fra kolonnen under anvendelse av en buffer av 0,3 M glysinhydroklorid, 0,9% NaCl, 0,05% Tween ® 80 og 50 mM E-aminokapronsyre (pH 2,5). Fraksjonene ble samlet i 1 M Tris og proteinet eluert i omtrent 5 kolonnevolumer. En bred topp iakttatt ved ved A2go under eluering og fraksjonene samlet over denne topp ble kombinert og underkastet ytterligere rensing.

Sekundær rensing ble gjennomført på S-sepharose. En S-sepa-rosekolonne ble ekvilibrert med en buffer av 50 mM natriumfosfat og 0,01% Tween ® 80 (pH 5,5). Eluatet fra fibrinogen-Reacti-Gel ® ble fortunnet to ganger med den samme buffer og pH innstilt til 5,5 med konsentrert saltsyre og fylt inn på kolonnen. Fosfatbufferen ble anvendt for å vaske kolonnen før det hybride protein ble eluert med to kolonnevolumer av buffer som var 50 mM i natriumfosfat, 0,1 M i NaCl og inneholdt 0,01% Tween ® 80 (pH 7,4).

Fraksjoner samlet over elueringstoppen ble bedømt under anvendelse av S2288 for å lokalisere de mest aktive fraksjoner, og disse ble kombinert, konsentrert om nødvendig ved ultra-filtrering ved anvendelse av en YM10 membran og dialysert mot en arginin/f osf orsyre/Tween ® 80 inj eks j onsbuf f er -(pH 7,0 - 7,5). tPA og Y22-K2SP konstruksjonen vil både katalysere omdannelsen av S2288 (Ile-Pro-Arg-para-nitroanilin) til et gult produkt. Intensiteten av fargen utviklet av enzymene kan så anvendes for å bedømme enzymaktiviteten.

Elektroforese ved hjelp av redusert SDS-PAGE viste bånd for de tunge og lette kjeder av det hybride produkt såvel som. tre ytterligere bånd som skyldes oppdeling av adduktet for å ut-vikle B-kjeden av tPA og tilsvarende Y22-fraksjoner.

Zymogrammer av det elektroforesebehandlede material ble også utviklet ved å overlegge en fibrin-agar gel på en fremkalt ikke-reduserende SDS-PAGE gel. Sterk klaring av fibrin-agar gelen ble iakttatt ved en enkel flekk og dette indikerte at det meste av den enzymatiske aktivitet var assosiert med en enkelt species identifisert som det hybride protein. Noe svak klaring av gelen ble iakttatt ved andre posisjoner og dette er i samsvar med med noe spaltning av serinproteasen som nevnt ovenfor.

In-vitro propplyse ved hjelp av det hybride protein

200 ml frisk humanblod ble oppnådd fra en giver og samlet i citratholdig buffer. 500 ml av blodet ble dekantert mens de resterende 150 ml ble sentrifugert ved 3.000 g i 25 minutter i en avkjølt sentrifuge. 50 ml av blodet ble anvendt for å danne hele blodpropper ved tilsetning av 2,5 ml 0,5 M CaCl2, 125 I.U. humantrombin (Sigma) og 0,5 - 10 ug av 1^<25>humanfibrinogen (Amersham International). Blodet ble så suget inn i lengder av silikonrør som var lukket i hver ende ved hjelp av treveis haneventiler og inkubert ved 37° C i 25 minutter.

Plasma fra 150 ml av blod oppdelt i glass-scintillasjons-hetteglass og den passende konsentrasjon av trombolytisk middel under test eller buffer ble tilsatt. Ved noen forsøk inneholdt hetteglassene også Krebs buffer eller buffer eller plasma hvortil 20 ul 250 A.T.U./ml hirudin var blitt tilsatt.

Etter inkubasjon av blodet i silikonrørene ble 1,5 - 2 cm lengder kuttet av og blodproppene helt inn i plast-petri-skåler inneholdende 0,9% NaCl. Proppene ble vasket i. salt-løsning og deretter ble hver propp anbrakt i et plastrør med 1 ml NaCl for telling i en gammateller. Etter tellingen ble saltløsningen dekantert og hver propp ble anbrakt i en av glass-scintillasjonshetteglassene inneholdende humanplasmaet.

25 ul prøver av plasmamiljøet ble fjernet fra hvert hette-glass med passende mellomrom og impulstelling ble foretatt i<g>ammatelleren. Tilsynekomst av i<125>i plasmamiljøet indikerer propplyse. Lysegraden ble beregnet fra totale impulstall i proppen og forekomst av impulstall i plasmaet i løpet av de neste 4-6 timer.

Under anvendelse av denne protokoll ble de fibrinolytiske aktiviteter av Y22-K2SP konstruksjoner i samsvar med oppfinnelsen sammenlignet med tilsvarende for rekombinant tPA som fremstilt av Genentech og K2SP-delen av tPA alene. Fig. 7 viser en sammenligning mellom de tre enzymer ved 500 enheter/ml i plasma. Det er klart at konstruksjonen har en propplysende aktivitet in-vitro som kan sammenlignes med de andre to enzymer. Fig. 8 viser en sammenligning mellom Genentech tPA og konstruksjonen når forsøkene gjennomføres i buffer. De grafiske fremstillinger indikerer at selv om aktiviteten av begge enzymer er sammenlignbare vil konstruksjonen begynne å lyse propper hurtigere enn tPA selv, det vil si at konstruksjonen synes å være målrettet mot proppen.

Titrering av aktivt sete av renset Y22-K2SP konstruksjon

I tillegg til propplyseforsøkene beskrevet i det foregående ble titrering av aktivt sete i den rensede konstruksjon, av kommersielt tilgjengelig tPA, og av K2SP alene, gjennomført for å bestemme om antifibrin, Y22, del av konstruksjonen hadde en innvirkning på enzymaktiviteten. De iboende aktiviteter av de tre molekyler overfor lavmolekylvektsubstratet Ile-Pro-Arg-pNA (S2288) og høymolekylvektsubstratet Lys-plasminogen ble bestemt. I hvert tilfelle ble aktiviteten av enzymet målt på basis av graden av substrathydrolyse pr. mol aktivt enzym.

Aktiviteten av hvert enzym ble målt mot den konsentrasjon av en inhibitor, nemlig diisopropylfluorfosfat (DFP) som binder

. tPA av 1 : 1 irreversibel reaksjon. En avsetning av aktiviteten mot det DFP-konsentrasjonen gir da aktiviteten av enzymet som krysningspunktet på ordinaten og konsentrasjonen av

Disse resultater viser at tPA og K2SP har lignende aktivitet overfor det naturlige substrat, Lys-plasminogen. Dette inne-bærer at fjernelse av den del av tPA-molekylet som ikke direkte er involvert ved katalysen, ikke påvirker dets aktivitet. Den lavere aktivitet av Y22-K2SP konstruksjonen indikerer at Y22-delen av molekylet innvirker på reaksjonen anvendt ved denne bestemmelse. Dette kan være p.g.a. sterisk hindring eller forvridning av den aktive setestruktur.

Aktivitet av Y22-K2SP konstruksjonen in-vivo

Aktiviteten av Y22-K2SP konstruksjonen ble testet i en kanin-halsvenemodell.

Tre kaniner ble bedøvet og et kateter ble innført i femoral-arterien for å tillatte blodprøvetagning. Opptak av<l25>i i tyroidkjertelen ble forhindret ved intravenøs tilførsel av 0,5 ml av en 2% oppløsning av natriumjodid.

En kunstig trombe ble fremstilt i halsvenen som følger: den ytre halsvene ble eksponert et paramedialt innsnitt i halsen og omhyggelig dissektert. Små sidegrener ble ligert og ansiktsvenen kanylert. En ulltråd ble innført i halsvene for å opprettholde proppen på plass under lyse. To klemmer ble anbrakt ved den proximale og distale ende av halsvenesegmentet (omtrent 4 cm lengde) som så ble tømt for blod ved å suge gjennom ansiktsvenekateteret.<125>i humanfibrinogen innehold ende omtrent 800.000 cpm ble blandet med frisk kaninblod og 10 IU trombin og injisert i halsvenesegmentet gjennom ansiktsvenekateteret. Proppen ble aldret i 3 0 min. for kar-klemmene ble fjernet. Tretti minutter etter fjernelse av klemmene ble tilførsel av det trombolytiske middel igangsatt.

Trombolysen ble bedømt ved å overvåke frigivningen av<125>i i blodet og sammenligne denne med den opprinnelige mengde av 125j som var injisert og mengden av 125j som var tilbake.

Resultatene av foreløpige forsøk som gir en lokal infusjon av det trombolytiske middel via den ipsilaterale ørevene (10 ml i løpet av en periode på 10 0 minutter) er som vist i tabell 5. De lytiske aktiviteter er sammenlignet med de tilsvarende for kommersielt tilgjengelig tPA.

Disse resultater indikerer at konstruksjonen i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er trombolytisk aktiv in-vivo og at dens aktivitet stort sett tilsvarer aktiviteten av tPA.

Det innsees at den foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet i illustrerende hensikt og at detalj variasjoner og modifikasjoner kan gjøres uten å gå utenfor rammen for oppfinnelsen .

KEFERANSELTSTF.

[1] Pennica et al. , Nature. 301, 214-721, 19S 3 .

(2) Harris, Protein Ens i neer i ng , 1, »■ ^9-^55 , 19S7.

13] Robbins og Tanaka, Biochemistry, 25., 3603-3611, 1986.

[4] Robbins og Boireishe, Biochemistry, 26, 4&6?..-4667 , 1987.

[5] 3ode et al., Science, 229., 765-767, 1935.

[6] Bode et al., J. Biol. Chera. , 26.2, 10819-10823, 1987.

[7] Runge, PNAS-USA, 84, 7659-7662, 1987.

|8] Runge, Biocheaistry, 2.7, 1153-1157, 19B8.

[9] Schnee et al., PNAS-USA, 84, 6904-6908, 1987.

[10] Haber, E. , Miami Winter Symposium, \ 2. ' f.ebr.uar- 1988.

[11] Reichmann et al., Nature. 312, 323-324, 1988.

112] Neuberger et al., Nature, 312, 604-608, 1984.

[13] Williams gg Neuberger, Gene, 43, 319-324, 1986.

[14] Haniatls, T. et al.., Holecultr Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Hdrbor Laboratory, Cold Spring Harboe, ilew York, 1982.

115] Rhodes og Birch, Biotechnology, 6, 518-523, 1988.

[16] Boshart et al., Cell, 41, 521-530, 1985.

:.7] Harris et al., Hei. Biol. ond lied., 3, 779-292,1986. 118J Melton et al., Nuc..\_ids. Res., 12. 7035-/070, 1984.

[19] Wood et al., Nature, 314, 446-449, 1985.

[20] Cathala et al., DNA, 2, 239-335, 1983.

121] Gubler og'. Hof fman, Gene, 25, 263-269, 1983.

i

[22] Aruffo Og Seed, PNAS-USA, 84, 8573-8577, 1987.

123] Max et al., J . Biol.Chem.. 256, 5116-5120, 1981.

[24] Chen og Seeburg, DNA, 4, 165-170, 1985.

[25] Whittle et al., Prot. Eng., 1, 499-505, 1987.

[26] Feinberg °g Vogelstein, Anal. Biochera. , 132. 6, 1983.

[27] Honjo et al., Cell, 18, 559-568, 1979

Claims

1. En hybrid plasminogenaktivator omfattende: (1) et enkeltkjede protein som ved sin N-ende har det variable domene av den tunge eller lette kjede av et fibrinspesifikk antistoff, et Kringledomene knyttet til C-enden av det variable domene, og ved C-enden av proteinet et serinproteasedomene av en plasminogenaktivator knyttet til C-enden av Kringledoment, og (2) et komplementært lett- eller tungkjede variabelt domene av et antifibrin antistoff assosiert med det variable domene i det enkelt-kjedede protein for å danne et antigenbindende sete.

2. Hybrid plaminogenaktivator som angitt i krav 1, karakterisert ved at antistoffets tunge og lettkjededeler er avledet fra et monoklonalt antistoff.

3. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i krav 2, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er et ikke-humant antistoff som er blitt humanisert ved å pode de hypervariable regioner av det ikke-humane antistoff på et humant antistoffs rammeverk.

4. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det variable domene i enkeltkjedeproteinet er et tungkjededomene og at det komplementære domene er et lettkjedevariabelt domene.

5. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at der ikke er noen plasminogenaktivatordomener mellom Kringledomenet og det antistoffavledede domene.

6. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at enkeltkjedeproteinet inneholder et tungkjedevariabelt domene og et tungkjede første konstant domene, men ingen hengselregion.

7. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i krav 6, karakterisert ved at enkeltkjedeproteinet ytterligere omfatter en hengselregion eller en modifisert hengselregion fra den tunge kjede av et antifibrin antistoff.

8. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i krav 7, karakterisert ved at hengselregionen fører direkte inn i Kringledomenet uten noen mellomliggende antistoff- eller plasminogenaktivatorsekvenser.

9. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i krav 7 eller 8, karakterisert ved at hengselet er blitt modifisert ved reduksjon av antallet av cysteinrester.

10. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 7 - 9, karakterisert ved at en cysteinrest er tilstede i hengselregionen.

11. Dimer hybridplasminogenaktivator, karakterisert ved at den omfatter to molekyler av en hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 7-10, sammenknyttet ved deres hengselregioner.

12. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 6 - 11, karakterisert ved at de konstante domener er avledet fra et human antistoff.

13. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at Kringledomenet er K2 domenet av tPA.

14. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at serinprotease-domenet er avledet fra tPA.

15. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 1 - 13, karakterisert ved at serinprotease-domenet er avledet fra u-PA.

16. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at enkeltkjedeproteinet har et u-PA Kringledomene inkludert mellom en antistoff-tungkjede hengselregion og et tPA Kringledomene.

17. Hybrid plasminogenaktivator som angitt 1 et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at enkeltkjedeproteinet er blitt spaltet ved det naturlige spaltningssete av plasminogenaktivatordelen av det enkeltkj edede protein, idet serinproteasedomenet forblir bundet til resten av proteinet.

18. Farmasøytisk preparat omfattende en hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av de foregående krav og et fysiologisk holdbart hjelpestoff, fortynningsmiddel eller bærer.

19. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat omfattende at en hybrid plasminogenaktivator som angitt i ette eller flere av kravene 1-17 blandes med et fysiologisk holdbart hjelpestoff, fortynningsmiddel eller bærer.

20. Hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 1-17, for bruk som et trombolytisk middel.

21. Anvendelse av den hybride plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 1-17 ved fremstilling av et trombolytisk middel.

22. Fremgangsmåte for behandling av tromboser i et pattedyr, karakterisert ved at pattedyret til-føres en effektiv mengde av en hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 1-17.

23. En uttrykkingsvektor for fremstilling av en hybrid plasminogenaktivator som angitt i et eller flere av kravene 1-17, idet vektoren inkluderer et operon omfattende en første DNA-sekvens som koder for det variable domene av den tunge eller lette kjede av et fib-ringspesifikt antistoff, en annen DNA-sekvens som koder for et Kringledomene av en plasminogenaktivator knyttet i leseramme til 3'-enden av den første DNA-sekvens, og en tredje DNA-sekvens som koder for et serinproteasedomene av en plasminogenaktivator, knyttet i leseramme til 3 <1-> enden av den annen DNA-sekvens.

24. Uttrykkingsvektor som angitt i krav 23, karakterisert ved at den første DNA-sekvens koder for et tungkjedevariabelt domene.

25. Uttrykkingsvektor som angitt i krav 23 eller 24, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en fjerde DNA-sekvens som koder for det komplementære variable domene.

26. Vertcelle transfektert med uttrykkingsvektoren som angitt i et eller flere av kravene 22 til 24.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av en hybrid plasminogenaktivator karakterisert ved å transfektere en vertcelle med uttrykkingsvektoren som angitt i et eller flere av kravene 23 til 25 og uttrykking av de kodede domener.