NO893378L

NO893378L - FISH PATHOGENES ASSAY SYSTEM.

Info

Publication number: NO893378L
Application number: NO89893378A
Authority: NO
Inventors: Tsvi Hirschfeld; Judith Bahar
Original assignee: Hy Lab Ltd
Priority date: 1988-08-23
Filing date: 1989-08-22
Publication date: 1990-02-26
Also published as: DK411789A; IE892696L; AU4008889A; JPH02238898A; GB8918170D0; GB2223580A; IL87533A0; DK411789D0; NO893378D0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et assay-system for differensiell diagnose av fiskepatogener basert på sukkerfermentering såvel som pigmentdannelse av melanin fra aminosyrer som er spesifikke for forskjellige patogener. Assay-systemet omfatter en beholder hvori det er anbragt minst to separate sterile kulturmedier med forskjellige sukker- og/eller aminosyrekomponenter såvel som anordninger for identifisering slik som pH-indikatorer og anordninger for identifisering såsom melanindannelse. Det nye diagnostiske system gjør det mulig på et tidligt tidspunkt å påvise og identifisere fiskepatogener. The present invention relates to an assay system for differential diagnosis of fish pathogens based on sugar fermentation as well as pigment formation of melanin from amino acids which are specific for different pathogens. The assay system comprises a container in which are placed at least two separate sterile culture media with different sugar and/or amino acid components as well as devices for identification such as pH indicators and devices for identification such as melanin formation. The new diagnostic system makes it possible to detect and identify fish pathogens at an early stage.

I de senere år har fiskeoppdrett blitt stadig mer om-fangsrikt og siden fisk under oppdrettsbetingelser eksi-sterer i tette populasjoner har forskning på fiskesykdommer inntil idag i hovedsak vært rettet mot patologien av sykdommene, vaksinering og profylaktisk behandling. Ingen vekt er blitt lagt på lett diagnose fulgt av målrettet behandling, og siden profylaktisk behandling i de senere år har vært kilde for skade som påvirker miljøet er målrettet behandling blitt den egnete metode. Metodene brukt så langt er blitt foretatt enten ved å ta slike prøver fra fisken og sende dem til et laboratorium for analyse (avtørkningsprøver fra fisk blir vanligvis skjult ved forurensende akvaflora på den tid de når laboratoriet) eller ved å sende fisk til laboratoriet hvor de blir diagnostisert ved obduksjon og tidkrevende cytologiske eller histologiske metoder. Mediene for bakterievekst som blir brukt var vanligvis ikke selektive og hemmer ikke forurensende akvaflora (slik som Karel Kovacek et al., Acta vet. Scand 1987, 28 47.54). In recent years, fish farming has become increasingly extensive and since fish under farming conditions exist in dense populations, research into fish diseases has until today mainly been directed at the pathology of the diseases, vaccination and prophylactic treatment. No emphasis has been placed on easy diagnosis followed by targeted treatment, and since prophylactic treatment in recent years has been a source of damage affecting the environment, targeted treatment has become the appropriate method. The methods used so far have been carried out either by taking such samples from the fish and sending them to a laboratory for analysis (wiping samples from fish are usually hidden by contaminating aquaflora by the time they reach the laboratory) or by sending fish to the laboratory where they are diagnosed by autopsy and time-consuming cytological or histological methods. The media for bacterial growth used were usually not selective and did not inhibit contaminating aquaflora (such as Karel Kovacek et al., Acta vet. Scand 1987, 28 47.54).

Disse patogener er mikroorganismer som fermenterer forskjellige sukkertyper ved på forhånd bestemte betingelser på forskjellige måter og enkelte danner melanin i nærvær av visse aminosyrer. Dette tillater således den spesielle stamme å bli lett identifisert. Mediet blir videre gjort selektivt ved bruk av høye konsentrasjoner av salter såvel som antisoppmidler, hvorav alt hindrer vekst av foruren sende akvaflora. Mediene er utstyrt med pH-indikatorer for å lette avlesningen av fermenteringsprosessen. Videre, med én gang bakteriene har vokst på festeinnretningen blir de undersøkt med det kommersielt tilgjengelige oksydasetestsy-stem, og kun bakterier som er oksydasepositive blir derpå undersøkt med bekreftende forsøk. Tabell I viser fer-menteringsreaksjonene til sukre av forskjellige patogener og forurensende materialer funnet i akvafloraen, men dette er ikke begrenset til sukrene som er vist eller til bak-terietypene som er nevnt. Det er også en ikke-fermentativ reaksjon av fiskepatogenene som kan bli brukt, dvs. dannelsen av et brunt pigment med fenylalanin eller tryptofan eller tyrosin eller en blanding av disse aminosyrer av Aeromonas salmonicida. These pathogens are microorganisms that ferment different types of sugar under predetermined conditions in different ways and some form melanin in the presence of certain amino acids. This thus allows the particular strain to be easily identified. The medium is further made selective by the use of high concentrations of salts as well as antifungal agents, all of which prevent the growth of contaminating aquaflora. The media are equipped with pH indicators to facilitate the reading of the fermentation process. Furthermore, once the bacteria have grown on the attachment device, they are examined with the commercially available oxidase test system, and only bacteria that are oxidase positive are then examined with confirmatory tests. Table I shows the fermentation reactions of sugars of various pathogens and polluting materials found in the aquaflora, but this is not limited to the sugars shown or to the types of bacteria mentioned. There is also a non-fermentative reaction of the fish pathogens that can be used, ie the formation of a brown pigment with phenylalanine or tryptophan or tyrosine or a mixture of these amino acids by Aeromonas salmonicida.

Oppfinnelsen vedrører et assay-system for differensiell diagnose av fiskepatogener basert på sukkerfermentering som er spesifikk for forskjellige patogener såvel som dannelsen av melanin med visse aminosyrer. Assay-systemet omfatter en beholder hvor det er plassert minst to separate sterile medier med forskjellige sukker og aminosyrekomponenter såvel som anordninger for identifisering, slik som pH-indikatorer og anordninger for identifisering såsom melanindannelse. Det nye diagnostiske system gjør en tidlig påvisning og iden-tifikasjon av fiskepatogener mulig. Bestemmelsen av deres antibiotiske sensitivitet kan derpå utføres. The invention relates to an assay system for the differential diagnosis of fish pathogens based on sugar fermentation which is specific for different pathogens as well as the formation of melanin with certain amino acids. The assay system comprises a container in which are placed at least two separate sterile media with different sugar and amino acid components as well as devices for identification, such as pH indicators and devices for identification such as melanin formation. The new diagnostic system makes early detection and identification of fish pathogens possible. The determination of their antibiotic sensitivity can then be carried out.

Mere spesielt vedrører oppfinnelsen et assay-system for påvisningen og bestemmelsen av fiskepatogener omfattende en beholder med minst to adskilte kulturmedia, adskilt fra hverandre, hvor hver av disse inneholder en forskjellig sukker- og pH-indikator, hvor fermenteringen av sukrene indikerer naturen til fiskepatogenet. Fortrinnsvis omfatter settet også anordninger for påvisning av oksydaseaktivitet. Eksmepler på sukre brukt i assay'et er mannitol, sukrose, arabinose, cellobiose, ribose, sorbitol, trehalose, laktose, inositol, salicin eller galaktose. Det er fordelaktig å bruke et kulturmedium inneholdende en høy konsentrasjon av salter og et antisoppmiddel som hindrer utvikling av forurensende akvaflora. Videre er det brukt et medium som er fritt for sukker, men som inneholder fenylalanin, tryptofan, tyrosin eller enhver kombinasjon av disse tre for påvisning av Aeromonas salmonicida ved dannelse av brun farge. De separate kulturmedia kan være anbragt på to eller flere overflater av en åre som er opphengt fra kapslen til et rør. More particularly, the invention relates to an assay system for the detection and determination of fish pathogens comprising a container with at least two separate culture media, separated from each other, each of which contains a different sugar and pH indicator, where the fermentation of the sugars indicates the nature of the fish pathogen. Preferably, the kit also includes devices for detecting oxidase activity. Examples of sugars used in the assay are mannitol, sucrose, arabinose, cellobiose, ribose, sorbitol, trehalose, lactose, inositol, salicin or galactose. It is advantageous to use a culture medium containing a high concentration of salts and an antifungal agent that prevents the development of contaminating aquaflora. Furthermore, a medium which is free of sugar but which contains phenylalanine, tryptophan, tyrosine or any combination of these three has been used for the detection of Aeromonas salmonicida by the formation of a brown colour. The separate culture media can be placed on two or more surfaces of a vein which is suspended from the capsule of a tube.

Typene av mediasammensetninger som brukes er vist nedenfor kun som eksempler, hvor sukkerkomponentene kan veksles om hverandre, hvor diverse forskjellige pH-indikatorer kan anvendes og forskjellige peptoner også kan brukes. The types of media compositions used are shown below as examples only, where the sugar components can be interchanged, where various different pH indicators can be used and different peptones can also be used.

EKSEMPEL 1EXAMPLE 1

I mengder av g/l av destillert vann: In amounts of g/l of distilled water:

Sterilisert ved 121'C i 20 minutter og deretter helt inn i årene. pH 7,3 +/- 0,3. Mannitol positive vil være gule og negative blå/grønne. Se tabell 1. Sterilized at 121'C for 20 minutes and then completely into the veins. pH 7.3 +/- 0.3. Mannitol positive will be yellow and negative blue/green. See table 1.

EKSEMPEL 2EXAMPLE 2

I mengder i g/l destillert H20In quantities in g/l of distilled H20

Sterilisert ved 121°C i 20 minutter og deretter helt inn i årene pH 7,3 +/- 0,3. Sukrosepositive vil være gule og negative rød/rosa. Se tabell 1. Sterilized at 121°C for 20 minutes and then completely into the veins pH 7.3 +/- 0.3. Sucrose positives will be yellow and negative red/pink. See table 1.

EKSEMPEL 3EXAMPLE 3

I mengder g/l destillet H20.In amounts of g/l distilled H20.

Steriliser ved 121°C i 20 minutter, hell derpå agar i egnet beholder pH 7,3 +/- 0,3. Positiv reaksjon viser brunt pigment, og negativ reaksjon har ingen fargeforandring. Sterilize at 121°C for 20 minutes, then pour agar into a suitable container pH 7.3 +/- 0.3. Positive reaction shows brown pigment, and negative reaction has no color change.

Disse formuleringer er kun indikative og sukrene kan byttes om hverandre såvel som pH-indikatorene. Eksempel 4 er med aminosyre. Andre sukre og pH-indikatorer kan anvendes som beskrevet såvel som forskjellige næringsmidler. pH-indikatorer som kan bli brukt er: alizarin, M-dinitroben-zolenurea, brilliant gult, fenolrødt, nøytralrødt, m-Nieofe-nol, kresolrødt og andre. Næringsmidler kan være alle typer peptoner, tryptoner, fra alle kilder, gjærekstrakter, kjøtt-ekstrakter og andre. These formulations are only indicative and the sugars can be interchanged, as well as the pH indicators. Example 4 is with amino acid. Other sugars and pH indicators can be used as described as well as different foodstuffs. pH indicators that can be used are: alizarin, M-dinitrobenzene-zolenurea, brilliant yellow, phenol red, neutral red, m-Niofe-nol, cresol red and others. Nutrients can be all types of peptones, tryptones, from all sources, yeast extracts, meat extracts and others.

PRØVETAKNINGSAMPLING

1. Åpne beholderen og fjerne åren ved å holde kapslen i én hånd, eller eksponer agaroverflåtene dersom den ikke foreligger i åreform. Berør ikke åre- eller agaroverflaten med hender eller fingre. 2. Ta prøver fra anbefalt sted av fisken og med steril svamp/løkke inokuler på alle sider ved å påføre forsiktig trykk og spre ut prøven med en sikk-sakk bevegelse ned lengde og bredde av agaroverflaten. 3. Sett tilbake åren i beholderen eller dekk til overflatene med lokket - LUKK IKKE TETT: FOR Å TILLATE FRI 1. Open the container and remove the vein by holding the capsule in one hand, or expose the agar surfaces if it is not in vein form. Do not touch the vein or agar surface with hands or fingers. 2. Take samples from the recommended location of the fish and with a sterile sponge/loop inoculate on all sides by applying gentle pressure and spreading the sample with a zig-zag movement down the length and width of the agar surface. 3. Return the paddle to the container or cover the surfaces with the lid - DO NOT CLOSE TIGHTLY: TO ALLOW FREE

INNVIRKNING FRA ATMOSFÆREN:INFLUENCE FROM THE ATMOSPHERE:

4. Inkuber ved romtemperatur, 20°C for Vibrio an<g>uilarum og Aeromonas salmonicida i 40-48 timer og ved 15"C for Vibrio salmonicida i opp til 4 dager. Vibrio an<g>uilarum og Aeromonas salmonicida vil også vokse ved 15°C, men langsom-mere. 4. Incubate at room temperature, 20°C for Vibrio an<g>uilarum and Aeromonas salmonicida for 40-48 hours and at 15"C for Vibrio salmonicida for up to 4 days. Vibrio an<g>uilarum and Aeromonas salmonicida will also grow at 15°C, but slower.

RESULTATERRESULTS

Analyser resultatene med de følgende tabeller. Dersom sukkerfermenteringen passer mønstret bekreft resultatene ved å bruke oksydasetesten. Analyze the results with the following tables. If the sugar fermentation matches the pattern, confirm the results using the oxidase test.

Claims

1. Assay system for the detection and identification of fish pathogens, characterized in that it comprises a container which contains at least two culture media separated from each other, each of which contains a different sugar and pH indicator, and which optionally contains devices for detecting oxidase activity of cultured pathogens after fermentation, or where a culture medium is free of sugar and instead contains tryptophan, tyrosine or phenylalanine for the detection of specific pathogens by color formation, fermentation of a special sugar and color formation indicating the identity of the particular fish pathogens.

2. Assay system according to claim 1, characterized in that devices are provided to detect oxidase activity of pathogens grown on a culture medium to determine whether such pathogen is oxidase positive or negative.

3. Assay system according to claim 1, characterized in that a culture medium contains phenylalanine, tryptophan and tyrosine instead of a type of sugar whose presence is detected by the formation of a brown color for the detection of Aeromonas salmonicida.

4. Assay system according to claim 1, characterized in that the sugar types are selected from mannitol, sucrose, arabinose, cellobiose, ribose, sorbitol, trehalose, lactose, inositol, salicin and galactose.

5. Assay system according to any one of claims 1-4, characterized in that it contains phenylamine or tryptophan or tyrosine or a mixture of these for the detection of Aeromonas salmonicida by brown color change.

6. Assay system according to claim 1, characterized in that it is suitable for the detection of the fish pathogens Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida and Aeromonas salmonicida, where a combination of amino acid formation with sucrose fermentation identifies each of these, as Vibrio anguillarum is sucrose positive and melanin negative, Vibrio salmonicida is sucrose and melanin negative and Aeromonas salmonicida is sucrose negative and melanin positive.

7. Assay system according to any one of claims 1-3, characterized in that it contains a high concentration of salts and an antifungal agent, which prevents the development of contaminating aquaflora.

8. Assay system according to any one of claims 1-7, characterized in that the separated culture media are placed at two or more surfaces of a vein that hangs down from the capsule into a tube.

9. Assay system according to any one of claims 1-7, characterized in that the different culture media are placed in a number of wells in a suitable culture plate.