JPH11510064A

JPH11510064A - Bacteria detection method

Info

Publication number: JPH11510064A
Application number: JP9-522574A
Authority: JP
Inventors: ウィルソン，スチュアート・マーク
Original assignee: バイオテク・ラボラトリーズ・リミテッド
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 1999-09-07
Anticipated expiration: 2016-12-16

Abstract

(57)【要約】本発明は、第１バクテリアに関するアッセイの応答時間を高める方法に関し、ａ）第１バクテリアが許容するファージ粒子による感染に第１バクテリアをさらし；ｂ）感染バクテリアを処理して外部ファージ粒子を不活性化し；ｃ）上記ファージまたはその複製体に許容性であって第１バクテリアの有効倍増速度より高い倍増速度を有する第２バクテリアの存在下で処理されたバクテリアを培養し；そして、ｄ）培養された第２バクテリア細胞中のファージ形成および／または第２バクテリアの成長の程度を評価することを特徴とする。本発明の方法を用いることにより、サンプル中のバクテリアの存在を評価でき、とりわけ、第１バクテリアがゆっくりと生育するバクテリア、特にミコバクテリウムツベルクロシスである場合であり、本発明の方法により、操作者は、サンプル中の低量のバクテリアの存在を、慣用バクテリア培養技術を用いて必要とされる数週間に代わり、数日以内に検出できる。本発明を用いることにより、薬剤または他の処理のバクテリアへの効果またはウイルスの効果を評価することもできる。本発明は、本発明の方法において使用するための診断キットも提供する。 (57) [Summary] The present invention relates to a method for increasing the response time of an assay for a first bacterium, comprising: a) exposing the first bacterium to infection by a phage particle that the first bacterium allows; b) treating the infected bacterium to inactivate external phage particles. C) culturing the treated bacterium in the presence of a second bacterium that is permissive for said phage or a replica thereof and has a doubling rate higher than the effective doubling rate of the first bacterium; and d) culturing. Evaluating the degree of phage formation and / or growth of the second bacterium in the second bacterial cell. By using the method of the present invention, the presence of bacteria in the sample can be assessed, especially when the first bacterium is a slowly growing bacterium, especially Mycobacterium tuberculosis. The operator can detect the presence of low amounts of bacteria in the sample within days instead of the required weeks using conventional bacterial culture techniques. Using the present invention, the effect of a drug or other treatment on bacteria or the effect of a virus can also be evaluated. The present invention also provides a diagnostic kit for use in the method of the present invention.

Description

【発明の詳細な説明】バクテリア検出方法本発明は、方法、特に、サンプル中のバクテリアの存在を診断する方法に関する。発明の背景適切な培養媒体上において痰のような体液サンプルからのバクテリアを増殖させることにより、視覚によるかまたは試験試薬あるいはアッセイを用いて培養媒体上のバクテリアのコロニーの検出を可能にすることは、共通に実施されている。そのような技術は、広範囲の培養にわたって適用可能であり、標準のバクテリア検出並びに診断の方法として広く受け入れられつつある。しかしながら、検出可能な程にバクテリアの成長が生じるのに数日あるいは数週間さえ要するように、バクテリアが低成長タイプである場合の問題が生じる。これは、特に幾つかのミコバクテリウム（Mycobacterium）種またはレジオネラ（Legionella）種の場合であり、バクテリアの検出可能なコロニーの増殖に４週間以上を要しうる。これは、患者のバクテリアの感染を確証するのに受容不可能な遅延を強いるので、バクテリアの存在および同定のより迅速な評価を提供することが望まれる。 PCT出願番号WO92/02633には、生育可能なバクテリアのサンプルを用意して、そのバクテリアに特異的なウイルスの株を感染させることが提案されており、そのようなバクテリア感染ウイルスは、バクテリオファージまたはより一般にはファージと呼ばれる。ファージ粒子の幾つかは、バクテリアに感染してバクテリア細胞内で複製する。バクテリアにより吸収されないそのようなファージ粒子は、バクテリアのキャリアーの母液またはマトリックス、典型的には培養媒体中に残る。感染されたサンプルを次に例えば加熱および／または酸により処理して殺すかまたは洗浄剤で洗浄するならば、暴露された外側のファージ粒子、即ち、外部のファージ粒子は不活性化されるかまたは除去される。感染性の内部のファージ粒子は不活性化されないが、バクテリアの細胞内で保護されているからである。次に、処理された感染バクテリアは、ファージ粒子により感染されうるのに許容されるようなさらなる未感染バクテリアの存在下において培養できる。感染バクテリア内のファージ粒子は複製して、細胞壁が破壊されるかまたは溶解して複製したファージ粒子を放出させる。この子孫ファージ粒子の第１の世代が他のバクテリア細胞に感染して、感染、複製そして溶解の連続するサイクルを引き起こす。これは、培養媒体中でのファージ粒子の数の対数増加を提供する。初期の感染バクテリア細胞数が小さい場合であっても、バクテリア細胞の成長の低下あるいは多数の複製したファージ粒子のいずれかが測定されるかまたは観察できるので、即ち、評価されるサンプル中の初期のバクテリア細胞の存在の検出感度が高められる。この修飾はバクテリア細胞の検出感度を高めて素早く成長するバクテリア、例えばサルモネラ（Salmonella）種の検出に首尾よく使用されてきた。しかしながら、ゆっくりと成長するバクテリア、例えばミコバクテリア種に関しては、ファージ粒子の検出可能な集団を与えるためのこの方法に必要な時間は他の技術と実質同じままであり、該方法はそのようなバクテリアに伴う時間の問題を解決しないことを我々は見いだした。ゆっくりと成長するバクテリアの迅速且つ正確な検出を達成する方法における要求が、なお存在する。我々は、ゆっくりと成長するバクテリアが迅速に検出されうるような方法を考案し、即ち、そのような検出に関して数日または数週間さえ要したことにおける問題を克服した。その方法は、与えられたバクテリアの抗生物質および他の薬剤に対する感度を測定すること、および与えられた抗生物質または薬剤が与えられたバクテリアに対して活性であるか否か、または与えられた殺ウイルス剤組成物が与えられたウイルスに対して効果を有するか否かを測定することにも使用できる。該方法は単純な装置を用いて熟練していない人にも実施できるので、該方法は、熟練した微生物学者並びに複雑な装置を得ることができない第３国における操作を容易にさせる。発明の概要したがって、一つの側面から、本発明はサンプル中の第１バクテリアの存在を検出するための方法に関するが、該方法は、以下の工程：ａ．第１バクテリア細胞の生育可能なサンプルに該バクテリアに特異的なファージを感染させ、それにより少なくとも幾つかのバクテリア細胞各々にひとつまたはそれ以上のファージ粒子を吸着させ；ｂ．バクテリア細胞により吸着されなかったファージ粒子を不活性化するかまたは除去し；ｃ，第１バクテリア細胞の増殖速度よりも高い増殖速度を有する少なくとも一つの他の第２バクテリアを含む培養媒体中において感染第１細胞を培養し、それにより感染第１バクテリア細胞の溶解により放出されたファージ粒子により少なくとも幾つかの第２バクテリア細胞を感染させ、但し各々の感染バクテリア細胞は感染サイクルの次の世代のさらなる感染源として作用し；そしてｄ．工程ｃにおける複製したファージ粒子の数あるいは第２バクテリアの成長の低下の何れかを監視することにより試験されたサンプル中の第１バクテリア細胞の存在を測定することからなる。好ましくは、第２バクテリアの培養および感染はさらなるバクテリア細胞の成長並びに溶解が実質上停止する定常状態またはそれに近い状態で実施する。この状態において、ファージ粒子の活性のために実質上一定の数のバクテリアの死細胞が培養媒体中に存在する。ファージの複製が生じる培養媒体の領域は、生育可能なバクテリアの成長のためにより濁っているか、不透明であるか、さもなくば視覚上異なる周囲の培養媒体中で明白なスポットとして視覚により検出することができる。ファージの活性によりバクテリアの成長が低下したこれらの領域は、一般にプラークと呼ばれる。第２バクテリアは第１バクテリアよりも高い速度で増殖するから、最初に感染した第１バクテリア細胞が検出可能なプラークを形成するのに要する時間は大幅に低下する。プラーク形成におけるこの加速は、同じバクテリアを初期ファージ感染並びに続く培養工程に用いる場合には生じない。別法として、工程ｃの終わりにおける培養媒体中の複製したファージ粒子の存在は、慣用のファージアッセイ技術を用いて評価することができる。これは、上記のプラークの存在の測定に加えて、または独立に実施することができる。本発明の方法は、即ち、サンプル、例えばミコバクテリウムツベルクロシス（ Mycobacterium tuberculosis）に感染しているかまたはレジオナイレス（Legion n aires）の疾患の疑いのある患者であって、そのようなバクテリアが初期サンプルに存在したことについてあらゆる観察可能な示唆を与えるのに、慣用評価法では数日または数週間を要した患者からのサンプル中の、ゆっくりと成長するバクテリアの検出に適用することができる。そのような場合、初期サンプルの一部を予測されるバクテリアに特異的なファージで感染させて、不活性化工程ｂを通過させるが、ファージ粒子は感染した細胞により保護されるからである。これらの保護されたファージ粒子は、感染細胞の培養において各々の感染された第１バクテリア細胞の周辺においてファージまたはプラークの形成を引き起こす−工程ｃ。疑われたバクテリアがサンプル中に存在しなかったなら、工程ｃにおいてファージまたはプラークは事実上形成されないはずであり、培養媒体は実質上均質な外観を呈するはずである。本発明は、抗生物質または他の薬剤が何らかの殺バクテリア作用を有するか否かを測定する試験において、抗生物質または他の薬剤で処理された公知のバクテリアを用いて実施してもよい。この場合、工程ｃにおけるファージまたはプラークの数は、最初のバクテリアを殺すことにおける抗生物質または薬剤の効果またはその反対を示す。慣用の試験方法においては、抗生物質または薬剤はバクテリアに適用されるはずであり、死細胞の数は抗生物質または薬剤の効果の直接の指標となるはずである。しかしながら、顕微鏡を用いなければ、個々の死細胞を観察することは難しい。本発明のこの応用において、第１バクテリアへの該細胞を殺すかもしれない抗生物質または薬剤の処理は、ファージ粒子による残りの生育可能な第１バクテリアの感染と組合わされて、どれくらいの第１バクテリアが抗生物質または薬剤による殺傷から逃れたかを測定する。本発明の他の応用において、ウイルスまたはファージのサンプルは殺ウイルス作用またはウイルス成長制御作用を有する組成物で処理される。処理されたファージを用いて、次にその特異的なファージに許容性の生育可能な第１バクテリア、即ちそのファージにより感染され得るバクテリアに感染させる。感染したバクテリアは、次にバクテリア細胞に感染せずに外部に暴露されたままのファージまたは細胞に対して外側のファージ粒子を不活性化するように処理される。次に、不活性化された感染第１バクテリア細胞物質を第２の早く増殖するバクテリアの存在下で培養して、プラークを生成させるが、感染第１細胞中のファージ粒子は複製して溶解した。ファージ粒子の最初の処理が完全に効果的であるなら、第１バクテリア物質が感染された際に生育可能なファージ粒子は存在せず、したがって、第２バクテリアの存在下での培養液に生育可能なファージ粒子は持ち込まれない。したがって、第２バクテリアは増殖して、培養媒体に実質的に均一な発色または不透明性を付与する。しかしながら、もしファージ粒子の最初の処理が完全に効果的でなかったなら、ファージ粒子は第２バクテリアの培養液に生育可能なファージ粒子が持ち込まれ、そして視覚により検出可能なプラークを生じる。便宜上、本発明は、以後、ゆっくりと生育するミコバクテリア種の存在の評価に関して記載される。本発明は、広範囲の動物または植物宿主からのバクテリアに適用できるが、哺乳類宿主からのバクテリアの検出に特に有用であり、便宜上、本発明は、バクテリアに感染していると疑われたヒトからの体液の初期サンプル中のゆっくりと生育するバクテリアの評価に特に言及して記載される。用語、ゆっくりと生育するバクテリアは、本明細書においては、7H9として公知の培地90％v/vおよびOADCとして公知の栄養10％v/vを含む培養媒体中での37℃ における普通の増殖条件下で10時間を超えるバクテリア細胞集団が２倍になることにより評価されるとおりの有効な増殖サイクル（有効倍増速度）を有するものを意味する。そのようなバクテリアは、検出可能なファージ集団またはプラークを生ずるのに、普通は慣用培養技術を用いて72時間以上を要するはずであるか、または培養が難しい。本発明の方法を用いれば、ファージまたはプラークは、そのようなバクテリアの場合、通常は16時間以内で検出できる。典型的なゆっくりと生育するバクテリアは、ミコバクテリア種、特にミコバクテリウムツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）、ミコバクテリウムパラツベルクロシス（Mycobacterium paratuberculosis）およびミコバクテリウムエビウム（Mycobacterium avium）；レジオネラ（Legionella）種、特にレジオネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）；ヘリコバクター（Helicobact er）種、特にヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）；ストレプトコッカス（Streptococcus）種、特にストレプトコッカスアジャセンス（Streptococcus adjacens）；およびリッケチア（Rikettsia）種、特にリッケチアプロワゼキ（ Rikcttsia prowazekii）を含む。本発明は、10時間より長い瞬間倍増速度を有するが、例えばストレプトコッカスデフェクテンス（Streptococcus defectens）およびエクストリモービルズ（Extremoobiles）種を最初に増殖させる困難ゆえに、これよりも大きい平均有効倍増速度を有するバクテリアに適用してもよい。ゆっくりと生育するバクテリアなる用語は、したがって、本明細書および請求の範囲にて用いられて、遺伝的に遅いプロパゲーターであるバクテリア、およびそれらの増殖サイクルにおける間欠性の減衰または干渉ゆえに、10時間より長い遅い平均増殖速度を有するバクテリアを指す。本発明はそのようなゆっくりと生育するバクテリアを検出することにおける特別の利益を有するが、本発明は、検出可能なファージ集団またはプラークの形成のスピードを増加させることが望まれる場合のあらゆるバクテリアに適用でき、例えば、ヒトサンプル、食品生成物またはキッチン等のバクテリアの汚染を測定するための採取されたサンプル中の10時間より短い倍増速度、例えば４から10時間の範囲を有するバクテリアの検出において、慣用のバクテリア培養技術を用いて達成されるはずの速度より迅速なバクテリアのための試験を提供する。便宜上、本発明は、以下において、第１バクテリアとしてミコバクテリウムツベルクロシスを用いる場合について記載される。第１バクテリアは、患者からのあらゆる適切な形態において、例えば、痰または他の粘膜分泌物中に存在しうる。しかしながら、本発明は、ヒト、他の哺乳類例えばウマ、ウシ、ヒツジおよびブタの他の体液サンプル、例えば血液、尿または糞便サンプル、および植物体例えば葉または根菜類または実からのサンプルに適用することができる。便宜上、本発明は、ヒト患者の痰サンプルの試験に関して以下に記載される。典型的には、サンプルは、バクテリアがまだ生育可能な新たに採取された液体として存在する。しかしながら、試験前の保存および／または輸送のためにサンプルが凍結または乾燥している場合は、サンプルを適切な培養媒体中において約 20から55℃、好ましくは37℃において保持して、本発明の方法の工程ｂにおいてバクテリアが生育可能であってファージ粒子により感染を受けることができることを保証することが望ましい。所望であれば、初期サンプルは処理することができ、例えばＮ−アセチルシステインで希釈し、および／またはアルカリ、界面活性剤または酸で処理して、評価されるバクテリアの検出を干渉するかもしれない他のバクテリア集団を減少させることができる。そのような前処理は、評価のためのバクテリアサンプルの調製において共通に使用される条件および技術を用いて実施することができる。しかしながら、本発明の方法は慣用試験法より迅速であり、他のバクテリアの作用がほとんど顕著ではないから、他のバクテリアからの初期サンプルを浄化する（decontaminate）必要性は、ゆっくりと生育するバクテリアを評価する慣用法に比較して減じられる。初期サンプルは生育可能な状態において評価されるバクテリアを含む。これは通常液体またはゲル中、例えばカンテン、培養媒体中にある。しかしながら、キャリアー媒体は、粒子状固形物又は小孔（foraminous）材料の孔、例えばセラミックのフリットまたは気泡（foamed）プラスチックまたはフィルターペーパーまたは網状物質中のメッシュ孔であって適切な栄養組成物中に浸されたものでありうる。便宜上、本発明は以下において、続いてゲルキャリアー媒体に適用される初期バクテリアサンプルのための液体キャリアー媒体の使用に関して記載される。初期サンプルは、評価される第１バクテリア種に特異的なファージであって且つ感染した第１バクテリアが本発明の方法の工程ｃにおいて培養される際第１バクテリアに特異的な、適切なファージに感染させる。ファージはバクテリア種に属特異的であってよく、そのためファージは属中の範囲のバクテリアに感染する。しかしながら、特定のバクテリアを評価する場合には、狭い特異性のファージを用いることが好ましいかもしれない。所望であれば、ファージはファージ特異性を増大させるように修飾してよく、それにより、評価されるサンプル中の他のバクテリアの感染を減じる。適切なファージの修飾は、公知の技術例えば感染される特定のバクテリアに関する遺伝上の修飾により達成でき、例えばPCT出願番号WO92/02633に記載されているとおりである。本発明の使用のための典型的なファージは、AG1，B1，BG，BK，C3，D29，D34，D56A，GS4E，HP1，L1，13およびTM4 を含む。本発明の使用のための最適なファージは使用される第１および第２バクテリアに依存するが、このファージまたはバクテリア細胞から溶解により生成したその複製物は用いられるバクテリアに供される必要があるからである。即ち、ミコバクテリウムツベルクロシスの存在を評価する際にミコバクテリウムスメグマティスを第２バクテリアとして用いる場合、ファージD29が適切であり、そしてミコバクテリウムエビウムを用いるならファージTM4が適切である。ファージは例えば液体媒体中の培養物（cultivar）の形態で提供することができ、あるいは、凍結乾燥またはスプレー乾燥粒子の形態で提供することができる。ファージは、任意の適切な技術を用いて且つ任意の適切な条件下で生育可能なバクテリアサンプルと混合する。典型的には、バクテリアサンプルは液体の形態であって、ファージ感染は液体キャリアー中でバクテリアサンプルに適用される。ファージ感染は、55℃まで特に約37℃の温度において10分から４時間進行させて、大多数のバクテリア細胞を各々少なくとも一つのファージ粒子で感染させることが好ましい。しかしながら、過剰の感染は、以下に記載される酸を用いた非吸着ファージ粒子の不活性化にて残存しないほどにバクテリアを弱めるかもしれない。与えられたバクテリアの最適な感染時間は、単純な試行錯誤およびエラーの試験によるか、または感染バクテリアの顕微鏡試験により決定することができ、本発明の方法の次の段階にて経験される条件に関連する。次に、感染したバクテリアサンプルを処理して、バクテリア細胞中に吸収されずにバクテリア細胞外に残ったあらゆる外部ファージ粒子を除去するかまたは不活性化して、不活性化段階の間に導入される条件に暴露される−工程ｂ。便宜上、不活性化なる用語は、本明細書において、非吸着ファージ粒子を、本発明の方法の次の工程において実質上複製不可能にするあらゆる方法を集合して指す。即ち、この用語は、サンプルからのファージ粒子の物理的な分離または除去あるいは粒子の脱活性化を含む。この不活性化は、あらゆる適切な技術、例えばPCT出願番号WO92/0233に記載された技術を用いて実施することができる。好ましい技術は、感染バクテリア細胞から物理的に外部ファージ粒子を分離するために感染サンプルを洗浄することおよび濾過を含み；感染サンプルを酸、界面活性剤または化学薬品により処理して外部ファージ粒子をを殺すかまたは不活性化するか；またはのちにバクテリア細胞から分離可能な適切な基質上に、感染サンプルからの外部ファージ粒子を選択的に吸着させることによる。便宜上、本発明は、以下に感染バクテリア細胞と外部ファージ粒子の混合物の化学薬品または酸処理に関して記載される。そのような処理は、無機酸またはその鉄塩を用いて実施することが好ましく、例えば硫酸アンモニウム鉄またはリン酸または硫酸；Ｃ_1-4脂肪族カルボキシル酸、特に酢酸であり希釈した氷酢酸あるいは酢であってよく；または酸のバッファー媒体である。処理は、用いられたファージを不活性化するが感染第１細胞を殺さないバクテリアキャリアー媒体中でｐＨ値を得る。最適な洗浄およびｐＨ条件は評価されるバクテリアに依存し、単純な試行錯誤およびエラー試験により決定できる。典型的には、感染バクテリア材料は酸性にされて、上昇温度、典型的には37℃にて十分な時間、典型的には約15分間インキュベートされて、次にアルカリまたは塩基の添加によりｐＨをほぼ中性に調節する。別の技術において、外部ファージは殺ウイルス剤を感染バクテリア材料に添加することにより殺される。最適な殺ウイルス剤は殺されるファージおよび第１バクテリアの性質に依存し、単純な試行錯誤およびエラー試験により容易に決定できる。即ち、第１バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスである場合の本発明の使用のための適切な殺ウイルス剤は無機酸の鉄塩および不飽和脂肪酸および12から24の炭素原子を含むアルコールを含み、任意に化学線または他の照射、特に約400から600nmの波長のＵＶ照射を伴う。不活性化後、バクテリア材料は少なくとも幾つかの生育可能なファージ粒子を内部に有する生育可能な第１バクテリア細胞を含む。この混合物は、第２バクテリアを含む培養混合物またはバクテリア混合物と混合される。これらの第２バクテリアは、第１バクテリアの細胞内でファージ粒子により感染可能であること、ファージに対して許容性であること、および評価される第１バクテリアの増殖速度よりも大きい速度で増殖することを特徴とする。第２バクテリアは第１バクテリアの倍増速度の少なくとも２倍の倍増速度を有することが好ましい。最適な相対増殖速度は第１バクテリアの実際の増殖速度に依存し、検出可能なファージ集団および／または減じられた第２バクテリアの成長エリアまたはプラークを生じるのにかかる時間が過剰でないならば、極めてゆっくりと生育する第１バクテリアに関して高い相対増殖速度が望まれる。典型的には、第２バクテリアは第１バクテリアの４から20倍の倍増速度を有する。即ち、初期サンプル中のミコバクテリウムツベルクロシスの評価のためには、ミコバクテリウムスメグマティスを第２バクテリアとして用いた場合に特に迅速な結果を与えることを我々は見いだした。本発明の使用のための他の適切な第２バクテリアは、他のミコバクテリア、例えばミコバクテリウムアウルム（Mycobacterium aurum）を含む。所望であれば、感染した第１バクテリアを、第２バクテリアと混合する前に、不活性化工程ｂの後に放置して少なくとも１世代の複製を達成して感染細胞からファージ粒子を放出させることができる。そのような放置は複製したファージ粒子が感染バクテリア細胞から放出されるのを可能にして、第２バクテリア細胞内の潜在的な感染のための多くの部位を提供して、初期サンプル中の少量の生育可能な第１バクテリアの検出を助ける。本発明の方法の工程ｃにおいて、感染第１バクテリアは第２のより早く増殖するバクテリアの存在下で培養される。ファージ粒子が感染第１バクテリア細胞中で複製するとき、細胞が溶解する際に感染細胞から放出されるより多数のファージ粒子を形成する。放出された各々のファージ粒子は隣のバクテリア細胞に感染することができ、それは第１バクテリア細胞でも第２バクテリア細胞でもよい。それらの新たに感染したバクテリア細胞中の各々のファージ粒子は複製することができて放出されることによりさらにバクテリア細胞等に感染する。第１および第２バクテリアの混合物の培養は、あらゆる適切な技術および条件を用いて実施することができる。典型的には、第２バクテリアは、感染第１バクテリアと混合された液体またはゲル媒体中で培養物の形態で用いられる。しかしながら、第２バクテリアは凍結またはスプレー乾燥粉末の形態で、あるいはその上に含浸またはコートされたバクテリアを有する固形粒子として用いてよい。便宜上、本発明は、以下においてカンテンゲルキャリアー中の第２バクテリアを感染第１バクテリアに適用することに関して記載される。処理された第１バクテリアサンプルに添加される第２バクテリアの量は、サンプル中の第１バクテリア細胞の予測される量に依存して広範囲に変更でき、本発明の方法からの結果の範囲で所望の時間が必要とされる。一般に、大量の、典型的には第１バクテリア細胞の数の２から50倍の第２バクテリア細胞を提供することにより、感染第１バクテリア細胞からの溶解によるファージ粒子が他の第１バクテリア細胞よりも第２バクテリア細胞に感染する可能性を高める。第２バクテリア細胞に対する第１バクテリア細胞の最適な比率は、単純な試行錯誤およびエラーの試験により容易に確立することができる。培養プロセスの間、培養媒体は、複製したファージ粒子、生育可能な第２バクテリアまたはファージ粒子の作用のために死んだバクテリア細胞のプラークの存在を反映する幾つかの検出可能な方法において変化する。典型的には、第２バクテリアの成長はカンテン培養媒体中の曇りまたは発色を起こし、そしてファージ粒子およびそれらが放出される関連のバクテリア死細胞は発色または曇った媒体中にわずかに曇ったかまたは明瞭なスポット、プラークをもたらし、その結果プラークが視覚により検出および評価できる。別法として、異なった生育をするエリアは、慣用染色技術を用いて差別的染色により検出できる。培養媒体が適切な成分を含む場合、バクテリア細胞は溶解した際に発光体（lumiphores）を放出して、それらはＵＶ照射下で検出でき、例えばPCT出願WO92/02633に記載されているとおりである。増大した数の複製ファージ粒子も、免疫技術例えばELISAまたは他の酵素技術により検出できる。ファージ粒子および／またはプラークの数は存在する第１バクテリア細胞の数の指標を与え、よって、初期サンプル中のそのような細胞の存在またはその反対が評価される。上記に示すとおり、本発明の方法は、患者からの初期サンプル中の予測されるバクテリア株の存在の迅速な試験を提供する。第１バクテリアに感染するために使用されるファージ粒子の適切な選択により、試験は特定のバクテリアに特異的にできる。別法として、試験は初期サンプル中に存在するバクテリアの種類に関する広い指標を提供することができる。本発明の方法は、即ち、必要とされる結果にあつらえることができる。結果は今まで必要とされた数日どころか、ものの数時間で得ることができるから、初期の一般的なスクリーンを実施して、初期サンプル中に存在するバクテリアの一般種が同定されれば、特定の試験を実施するのに実用的である。本発明の方法は単純な細胞培養技術を用いて実施することができて、その結果は視覚により評価できるから、本発明の方法は、熟練した労力および複雑な実験室の設備が利用できない第３国において容易に使用することができる。本発明は、サンプル中の第１バクテリアの存在または不在を検出するための本発明の方法において使用される診断キットも提供するが、該キットは、第１バクテリアのための公知のファージ感染源；第１バクテリアよりも早い倍増速度を有し且つ上記ファージ感染により感染した第１バクテリアから放出されるファージ粒子に許容性の生育可能な第２のバクテリアの源を含む。好ましくは、該キットは、ファージ感染の上記源により完成した第１バクテリアからの外部ファージ粒子の不活性化および／または除去のための手段を含む。本発明は以下の実施例により今例示されるが、すべての部（parts）は、他に述べない限り重量により与えられる。実施例１本発明の原理は、少なくとも10時間の典型的倍増速度を有する第１バクテリアおよび約２時間の倍増速度を有する第２バクテリアとしての早く生育するミコバクテリウムスメグマティスを表す、ゆっくりと生育するワクチン株BCGを用いた安全なモデル中で試験された。この実施例は、液体および固体カンテン工程を組み合わせて、外部ファージは酸で不活性化した。工程１．カンテンを基材とする媒体からのBCGのコロニーを7H9プラス10％（v/v ）OADC付加物（ディフコ）（以後、7H9、OADCと呼ぶ）中の液体培地中にて37℃ において生育させて、検出アッセイにおいて使用できる細胞のストックを生じた。臨床の場において、これらの細胞は臨床サンプルを直接の起源とし、この前培養工程を必要としないはずである。臨床の場において、ゆっくりと生育する細胞はミコバクテリウムツベルクロシスである。工程２．BCG細胞を含む液体培地を連続希釈して、各々の希釈駅10μlを10⁵のD29 バクテリオファージ（ファージ）を含む10μlの7H9、OADCと混合した。対照サンプルも、ａ）BCGを含まず、但しあらゆるBCGを含まない媒体10μlをファージと混合し；そしてｂ）ファージと混合する前にBCGを80℃において30分間加熱することにより加熱殺菌した対照を含むように設定した。工程３．37℃において90分間インキュベーションした後、20μlの1.2％（v/v）H Clを添加して、外部ファージ粒子を不活性化した。工程４．次に、20μlの22.2mM NaOHを加えて酸性を中和した。工程５．次に、10μlのこの溶液を、7H9、OADC、定常期のミコバクテリウムスメグマティスの培養液を５％（v/v）および1.5％のバクトアガー（ディフコ）を含むカンテンプレートにスポットした。工程６．次に、プレートを37℃においてインキュベートして保護された内部ファージ粒子がBCG細胞中で複製できるようにした。複製したファージ粒子はBCG細胞の溶解を起こさせて放出された。少なくとも幾つかの放出されたファージ粒子はミコバクテリウムスメグマティスに感染してこれらの早く成長する細胞中の感染サイクルを確立した。工程７．16時間後、次にプレートは、非感染のミコバクテリウムスメグマティスインディケーター細胞の曇った生育の間のファージの溶解またはプラークの透明なエリアについて観察した。結果を記録して以下に示す：サンプル溶解の程度希釈していないＢＣＧ＋１０^-2希釈液１０プラーク１０^-4希釈液 − 熱殺菌ＢＣＧ − ＢＣＧを含まないファージのみ − ＋個々のプラークが観察されるが計数するには多すぎる − プラークなし熱殺菌したBCGおよびファージのみの対照は陰性のままであり、酸による不活性化からファージが保護されるためには、生きた細胞が必要であることを示した。生きたBCGはファージを保護することができて、感染してBCG細胞内で複製した。BCG細胞の溶解に際して、複製したファージ粒子は放出されて少なくとも幾つかのファージは早く生育するミコバクテリウムスメグマティス中で複製サイクルを始め、16時間後にプラークを生じた。溶解を示したBCGの最も高い希釈液は10^- ² であったが、用いた元のBCG培養液がまだ初期対数期にあったので、約10³BCGコロニー形成ユニットを表す。このアッセイは、したがって、与えられたサンプル中のゆっくりと生育するバクテリアの生存数ほんの10³の存在を検出する能力を有する。この感度は顕微鏡に関して記載された感度より高く、慣用法をミコバクテリアの検出に適用した場合の培養物の感度とほぼ同じである。しかしながら、観察可能なプラークを作らせるのに要する時間は、慣用の培養技術に要する４− ６週に比して24時間より短かった。実施例２実施例１の方法を繰り返したが、固体カンテン培地中でアッセイを実施した点、並びに酸処理によらずに洗浄により外部ファージを除去した点が異なる。工程１．工程１は実施例１に記載された通りに実施した。工程２．BCG培養物の連続10倍希釈を7H9，OADC中で実施した。各希釈物10μlをカンテンプレート（7H9，OADC，1.5％バクトアガー）上にスポットした。加熱殺菌したBCG培養物10μlも同様のプレート上にスポットして対照プレートを提供した。プレートは37℃に保った。工程３．１片のフィルターペーパーを7H9，OADC，３％ミルクパウダー，ミリリットルあたり10⁶のD29バクテリオファージで湿潤した。工程４．５片のフィルターペーパーの堆積物をファージで浸したフィルターペーパー上におき、そしてフィルターペーパーの堆積物を通した毛管作用により感染細胞の周囲から外部ファージを除去した。工程５．フィルターペーパーの堆積物を完全に湿潤させた場合、すべてのフィルターペーパーをカンテン表面から除去して捨てた。工程６．次に、ニトロセルロースフィルターを用いてカンテン表面から感染細胞を取り除いた（stripped）。ニトロセルロースフィルターをカンテン上におき、湿潤させてはがした。次に、このフィルターを、より早く生育するミコバクテリウムスメグマティスのインディケーター細胞（7H9，OADC，定常期のミコバクテリウムスメグマティス培養液５％（v/v）、1.5％バクトアガー）を含むカンテンプレート上の下方の細胞側においた。工程７．プラークが視覚により観察できるまで、工程６のプレートを37℃においてインキュベートし、結果を記録した。サンプル溶解の範囲未希釈ＢＣＧ＋＋＋１０^-1希釈＋＋＋１０^-2希釈＋＋１０^-3希釈＋１０^-4希釈 − 加熱殺菌ＢＣＧ − ＋＋＋インディケーター細胞の完全な溶解（細胞生育なし）＋＋プラーク間にインディケーター細胞の幾らかの生育を伴うプラーク＋個々のプラークは観察されるが計数するには多すぎる − プラークなし加熱殺菌された対照は再び陰性のままであったことから、洗浄による除去からのファージの保護には、生きた細胞が必要であったことが示された。生きたBCG は再び、感染してBCG細胞内で複製したファージを保護することができた。BCG細胞の溶解時に、複製したファージは放出されて少なくとも幾つかのファージは早く生育するミコバクテリウムスメグマティス中で複製サイクルを始め、16時間後にプラークを生じた。溶解を示したBCGの最も高い希釈液は10^-3であったが、用いた元のBCG培養液がまだ初期対数期にあったので、約10³BCGコロニー形成ユニットを表す。このフォーマット中のこのアッセイは、したがって、与えられたサンプル中のゆっくりと生育するバクテリアの生存数ほんの10³の存在を検出する能力を有する。実施例３この実施例は、バクテリアアッセイを実施するための別の方法を例示する。ファージ感染工程のための痰サンプルの加工：完全痰サンプルを滅菌20mlスクリューキャップしたガラスボトル中に入れる。１．等量の「浄化剤」をサンプルに添加してサンプルを浄化して液体化する。２．希釈サンプルを数回倒置することにより混合して、混合物を10分間放置して痰を液体化する。３．次に、サンプルを4000×ｇにて10分間遠心分離して、細菌を沈殿させる。４．その結果の上清液体を、希釈しないハイコリン（Hycolin）殺菌剤に注ぎ、捨てる。５．細菌沈殿物を再び20mlの滅菌蒸留水に懸濁する。６．懸濁した細菌混合物を工程４と同じように遠心分離して細菌を沈殿させる。７．細菌沈殿物を次に1.0mlの「生育媒体」中に再懸濁して35-37℃において24時間放置してサンプルをアッセイ試験に提供する。８．対照サンプルは、1.0mlの「生育媒体」を新しいチューブに加えて不活性化対照を提供して；そして「ヘルパー細胞」１滴を新しいチューブ中の1.0mlの「生育媒体」に添加して、内部ファージの保護に関する陽性対照を提供する。細菌へのバクテリオファージの感染９．滅菌パステット（pastette）を用いて、１滴（50μl）の「バクテリオファージ」を、各試験サンプル並びに不活性化対照サンプルに添加する。振盪により混合して、3.0時間、35-37℃において振盪せずにインキュベートする。内部ファージの保護に関する陽性対照はこの時間を進行させない。 10．サンプルにバクテリオファージを添加して2.5時間後に、ミコバクテリウムスメグマティスの沈殿を陽性対照チューブに添加する。 11．すべての試験サンプルおよび対照サンプルを各々全部で３時間インキュベートする。２滴（100μl）の「不活性化試薬」を滅菌パステットとともに各サンプル並びに対照サンプルに添加する。サンプルを完全に混合して５分間放置する。 12．滅菌プラスチックパステットを用いて、「生育媒体」を各サンプル中の５ml の目盛線まで添加して、含有物を混合して、４時間、35-37℃において振盪せずにインキュベートする。バクテリオファージのプラークの視覚化 13．滅菌プラスチックパステットを用いて、1.0mlの「ヘルパー細胞」を各試験サンプルおよび対照サンプルに添加する。 14．５mlの溶解基材カンテンを各サンプルに添加して、サンプルとカンテンをゆっくりとした渦巻きにより混合する。 15．各チューブの含有物を冷却した対応の標識した「インディケータープレート」に添加する。 16．「インディケータープレート」はベンチ上に30分間放置してカンテンを固化させる。 17．「インディケータープレート」を37℃において15時間おく。 18．各「インディケータープレート」上のプレート数を、暗いバックグラウンドに対してプレートを観察することにより視覚により数える。プレート上において、「ヘルパー細胞」の生育は、バクテリオファージがこの濁りの中で明瞭または透明なエリアとして観察されるので（プラーク）溶解エリアと共に不透明なエリアとして観察される。対照チューブの検査試験サンプル中の結果を分析する前に、不活性化対照サンプルについて、不活性化処理後も生きているファージによる溶解の発生に関して試験する。このプレート上には10未満のプラークが存在するべきである。10プラークより多ければ、外部ファージの化学不活性化が不完全であって、アッセイを繰り返さねばならない。陽性対照プレートをプラークに関して試験する。広範囲な溶解が生じるべきであり、このプレート上には多数のプラークが存在するべきである。幾つかの状況においては、プレートがバクテリアの芝生を有さないかもしれない結果を伴う細胞の完全な溶解のために、「ヘルパー細胞」の生育がまったくないかもしれない。試験サンプルプレートの各々を試験して、プラークまたは溶解の存在を以下の基準に従い評価する：＋＋＋完全な溶解、バクテリアの残渣なし＋＋完全な溶解であるが、幾らかのバクテリア残渣＋プラークが重なり合うが幾つかのプラークは独立しているプラークの数を数えることができるならば、この数を記録する − プラークが観察されない溶解を示すそれらのプレートは、それらの痰サンプルが、ミコバクテリオファージの複製の宿主となる生存ミコバクテリアを含むことを示す。肺結核患者からの８つの浄化された痰サンプルを上記ファージアッセイ技術により試験したところ、５つのサンプルが生存ミコバクテリウムツベルクロシスを含み、３つのサンプルが含まなかった。これらの結果を慣用のバクテリアサンプルの培養と比較すると、培養によると陽性であった５つのサンプルはファージアッセイでも陽性であり、即ち、バクテリオファージの生存および複製が支持され、一方培養によると陰性であった３つのサンプルもファージアッセイにより陰性であり、バクテリオファージの生存および複製を支持しなかった。上記試験法において用いた試薬は以下のとおりである：浄化剤：２グラムのNaOH，0.5％のN-アセチルL-システインを滅菌蒸留水中に含む100ml 生育媒体：0.1％グリセロールを付加された7H9，OADC 基材カンテン：1.5％バクトアガーを添加した生育媒体バクテリオファージ：プレート溶解物から調製したバクテリオファージD29。コンフルエントな溶解を示す90mmトリ皿を10mlの7H9，OADC、0.1％のグリセロール、１mMのCaCl₂で浸して冷蔵庫の中に一晩（16時間）放置した。パステットを用いて液体をプレートから回収して4000×ｇにて15分間遠心分離した。上清の液体を0.4μフィルターでフィルター滅菌して、分注して４℃において保存した。ヘルパー細胞：定常期まで生育させて４℃に保存したミコバクテリウムスメグマティス。不活性化剤：100mMの硫酸アンモニウム鉄、フィルター滅菌した。実施例４：本発明の原理は、安全モデル系中のミコバクテリアの薬剤感受性試験について試験した。BCGを感受性ミコバクテリア（低濃度のイソニアジドおよびリファンピシンに感受性）のモデルとして使用し、遺伝学上イソニアジドには耐性であってリファンピシンに一部耐性のミコバクテリウムスメグマティスを耐性または半耐性ミコバクテリアのモデルとして用いた。工程１．カンテンを基材とする媒体からのBCGコロニーを、7H9，OADC中の液体培地中において37℃にて２週間生育させて、検出アッセイにおいて使用できる薬剤感受性細胞のストックを生成した。同様に、ミコバクテリウムスメグマティスのストックを、24時間、7H9，OADC中にて生育させて、薬剤耐性細胞のストックを生成した。臨床において、これらの細胞は臨床サンプルから直接起こせるはずであり、この前培養工程を必要としない。臨床においては、薬剤感受性細胞はミコバクテリウムツベルクロシスのさまざまな株であるかまたは単離物である。工程２．各培養物100μlを72時間イソニアジドおよびリファンピシンと共にさまざまな濃度にて３mlの体積の7H9，OADC中でインキュベートした。この工程は、細胞が抗生物質薬剤により影響を受けるのに必要である。薬剤を含まない対照も用意した。工程３．各培養物100μlを次に試験のために取り出した。工程４．５×10⁶のD29ファージを含む800μlの7H9，OADCを添加して37℃において、BCGの培養に関しては4.5時間あるいはミコバクテリウムスメグマティスの培養に関しては40分間のいずれかでインキュベートした。加熱殺菌したBCGおよびミコバクテリウムスメグマティスおよびファージのみのサンプルも対照実験として含んだ。工程５．次に、外部ファージは100μlの酸バッファー（32.2mlの0.IＭクエン酸２ナトリウムおよび67.8mlの0.1Ｍ HCl）の添加により不活性化した。工程６．５分後、84μlの1.0Ｍ NaOHを添加して酸性を中和した。工程７．さらに４mlの7H9，OADCを添加してミコバクテリウムスメグマティス培養物を直接プレートした。BCG培養物は、しかしながら、37℃において３時間インキュベートして内部の保護されたファージがあらゆる生存細胞中で複製するのを可能にさせた。工程８．次に、100μlの各培養物を、定常期のミコバクテリウムスメグマティス５％（v/v）および0.7％のバクトアガー（ディフコ）を含む５mlの液体7H9，OAD Cと混合して50mmのペトリ皿に注いだ。工程９．カンテンが固まった後に、プレートを37℃において16時間インキュベートした。この時間の間、生育可能なミコバクテリア中での酸処理後に生存していたあらゆる内部ファージが複製して最初の標的細胞を溶解して、少なくとも幾つかのこれらファージはより早く生育するミコバクテリウムスメグマティスインディケーター細胞中で新たな複製サイクルを確立した。工程１０．次に、非感染インディケーター細胞の濁った生育の間のファージ溶解またはプラークの明瞭なエリアに関して、プレートを観察した。結果は記録されて以下に示される：この表は、さまざまな抗生物質の存在下で生育させた異なるミコバクテリアに関して観察されたプラークの数を示す。＋＋プラークが重なり合っており、プラークの間でインディケーター細胞が幾らか成長している＋個々のプラークが観察されるが、計数するには多すぎるゆっくりと生育するミコバクテリウムツベルクロシスは、イソアニジドおよびリファンピシンに感受性である。リファンピシンの存在下で生育させると、細胞は殺されて、その結果、不活性化から保護されてそれらの生育を支持する生存細胞がなくなる。全濃度のリファンピシン存在下で観察されたプラークの数はバックグラウンドレベルを優位に越えず；バックグラウンドは加熱殺菌されたサンプルにおいて観察されたプラークの数であった。早く生育するミコバクテリウムスメグマティスは、しかしながら、低濃度のリファンピシンに耐性であり、これは最も低いリファンピシン濃度においては多数のプラークが観察されうる。リファンピシン濃度が増加するにつれて、細胞は影響されてプラーク数が次第に低下する。ミコバクテリアにおけるリファンピシンの作用は迅速であることが知られているが、イソアニジドはその作用を及ぼすのに幾らか時間がかかる。結果として、もっとも低濃度のイソニアジドにおいて、BCGは影響を受けなかったし、これは観察されたプラーク数に反映されており、薬剤を含まない対照において観察されたプラーク数の近辺であった。高い濃度のイソニアジドにおいては、しかしながら、これらの細胞の死を反映する顕著なプラーク数の低下があった。対照的に、ミコバクテリウムスメグマティスはイソニアジドによりほとんど影響されず、最も高い濃度においてプラーク数のわずかな低下があったにすぎない。この実験は、本発明がゆっくりと生育する細胞、例えばミコバクテリウムツベルクロシスの薬剤感受性を評価するのに使用できることを示す。このアッセイは簡単に実施することができ、少ない細胞数に実施でき、そして薬剤が細胞に影響を及ぼすのに必要な時間を含めて結果を４日以内に得ることができる。培養技術を必要とする慣用の薬剤感受性アッセイは多数の細胞を必要とし、そして結果を得るのに４週以上もかかる。慣用技術よりも早いバクテック（Bactec）システムは高価な器具の大きな完成品を必要とするが、本発明の方法は最小の器具しか必要とせず、安価であり、結核がより普通な第三世界の環境により適している。したがって、本発明は、バクテリアに対する処理効果を評価する方法も提供し、該方法は、ｉ．バクテリアを処理にさらして、次に、 ii．ａ処理されたバクテリアサンプルをバクテリアが許容するファージにより感染させ；ｂ感染サンプル中の外部ファージ粒子を不活性化し；ｃ第１バクテリアよりも早い速度で倍増する第２バクテリアの存在下で不活性化サンプルを培養し；そしてｄプラーク形成の程度および／または第２バクテリアの成長の程度を評価することによりバクテリアのサンプル中に残った生存バクテリア細胞の数を評価することからなる。本発明の方法は、ファージに対する組成物の効果を評価するために使用することもでき、ａ．ファージ粒子を組成物で処理し；ｂ．生きたファージを許容する第１バクテリアに、処理されたファージ粒子を感染させ；ｃ．感染第１バクテリア細胞にとって外部のファージ粒子を不活性化し；ｄ．第１バクテリアよりも早い速度、好ましくは２倍、典型的には４から10倍で倍増する第２バクテリアの存在下で不活性化細胞を培養し；そしてｅ．培養した第２バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および／または第２バクテリアの成長の程度を評価することからなる。本発明の方法のこの応用において、バクテリアの成長の程度はファージ粒子の最初の処理の効果またはその反対を示す。プラークが形成されないならば、最初の処理はファージ粒子を殺すかまたは不活性化して、即ち第１バクテリア細胞へのそれらの感染を妨害した。第２バクテリアの培養段階におけるこれらの細胞の複製は、第２バクテリア細胞を殺すかまたはその複製を妨害するファージ粒子を放出しなかった。培養した第２細胞は、即ち、バクテリア細胞の均一な成長を示す実質的に均一な発色または不透明さを示す。ファージ粒子を殺すかまたは不活性化するのに組成物が効果的でなかった場合、ファージ粒子は第１バクテリアに感染して、感染第１バクテリアの不活性化処理に対して保護される。感染細胞が第２バクテリアの存在下で培養された場合、ファージ粒子は複製して感染第１細胞を溶解して、第２バクテリア細胞に感染して、プラークまたは第２バクテリアの視覚上不均一な成長を与える。プラークまたは不均一な成長の程度は、存在するファージ粒子の数の指標を与え、そして即ち、ファージ粒子への初期処理の効率の範囲の指標を与える。本発明の方法のこの応用は、定量結果を与えないかもしれないが、組成物の定量効果を決定するために他の試験に供されうる、潜在性候補組成物同志を識別するために使用できる迅速な初期スクリーニング技術を提供する。したがって、その最も広い側面において、本発明は第１バクテリアに関するアッセイの応答時間を高める方法を提供するが、ａ．第１バクテリアが許容するファージ粒子による感染に第１バクテリアをさらす；ｂ．外部ファージ粒子を不活性化するように、感染したバクテリアを処理する；ｃ．処理されたバクテリアを、上記ファージまたはその複製物に許容性であって、第１バクテリアよりも早い速度、好ましくは２倍、典型的には４から10倍で倍増する第２バクテリアの存在下で培養する；そしてｄ．培養した第２バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および／または第２バクテリアの成長の程度を評価することからなる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Bacteria detection method The present invention relates to a method, particularly to a method for diagnosing the presence of bacteria in a sample. You.Background of the Invention Growth of bacteria from bodily fluid samples, such as sputum, on a suitable culture medium Allows the culture medium to be determined visually or using test reagents or assays. Enabling detection of bacterial colonies on the body is a common practice . Such techniques are applicable over a wide range of cultures and include standard bacterial A) It is being widely accepted as a method for detection and diagnosis. However, detection So that it takes days or even weeks for bacterial growth to occur as much as possible A problem arises when the bacteria are of a low growth type. This is especially true for some Field for Mycobacterium or Legionella species And the growth of detectable colonies of bacteria can take 4 weeks or more. This This forces an unacceptable delay in confirming the patient's bacterial infection, It would be desirable to provide a more rapid assessment of the presence and identification of bacteria. PCT application number WO92 / 02633 provides a sample of viable bacteria, It has been proposed to infect the bacterium with a strain of a specific virus. Bacterial infectious viruses such as bacteriophages or more commonly It is called an adj. Some of the phage particles infect bacteria and Replicate in cells. Such phage particles that are not absorbed by bacteria, Residues in the mother liquor or matrix of the bacterial carrier, typically in the culture medium You. The infected sample is then killed, for example by treatment with heat and / or acid. Or if washed with detergent, the exposed outer phage particles, Of phage particles are inactivated or removed. Infectious internal phage The particles are not inactivated, but are protected in bacterial cells. The treated infecting bacteria are then allowed to become infected by phage particles. Can be cultured in the presence of additional uninfected bacteria as described. Infected tapir Terrier The phage particles inside replicate and disrupt the cell wall or lyse Release large particles. The first generation of this progeny phage particle is Infects cells, causing a continuous cycle of infection, replication and lysis. this Provides a logarithmic increase in the number of phage particles in the culture medium. Early infection Even if the number of rear cells is small, bacterial cell growth is Because any of the replicated phage particles can be measured or observed, Increases the sensitivity of detecting the presence of early bacterial cells in the sample being evaluated . This modification increases the sensitivity of bacterial cell detection and allows bacteria to grow quickly, e.g. For example, it has been successfully used to detect Salmonella species. But For slow growing bacteria such as mycobacterial species, The time required for this method to provide a detectable population of particle particles is And the method does not solve the time problem associated with such bacteria. We found something wrong. Quick and accurate detection of slowly growing bacteria There is still a need for a way to accomplish the exit. We consider methods that allow slow growing bacteria to be detected quickly. In that it took days or even weeks for such detection Overcame the problem. The method is based on the given bacterial antibiotics and other drugs Measuring the sensitivity to, and given a given antibiotic or drug Or not, given a virucidal composition which is active against bacteria Can also be used to determine whether a drug is effective against a given virus. You. Since the method can be carried out by unskilled persons using simple equipment, the method Is a skilled microbiologist as well as a third country where complicated equipment is not available. Makes operations easier.Summary of the Invention Thus, in one aspect, the present invention provides for determining the presence of a first bacterium in a sample. Concerning a method for detecting, the method comprises the following steps: a. A sample specific to the bacterium is added to a viable sample of the first bacterium. Infection, thereby causing at least some of the bacterial cells to have one at a time. Or more phage particles are adsorbed; b. Bacteria that inactivate phage particles not adsorbed by bacterial cells Or remove; c, at least one having a growth rate higher than the growth rate of the first bacterial cell; Culturing the infected first cells in a culture medium containing two other second bacteria; Less phage particles released by lysis of infected primary bacterial cells Infect at least some secondary bacterial cells, provided that each infected bacterial cell Acts as an additional source of infection for the next generation of the infection cycle; and d. Number of replicated phage particles or growth of second bacteria in step c Primary bacterial cells in the sample tested by monitoring any of the Measuring the presence of vesicles Consists of Preferably, the culturing and infection of the second bacterium is carried out to further bacterial cells. The procedure is carried out at or near a steady state in which dissolution substantially stops. this In the condition, a substantially constant number of bacterial dead cells Vesicles are present in the culture medium. Areas of the culture medium where phage replication occurs are viable More turbid, opaque, or otherwise due to the growth of viable bacteria Visual detection as distinct spots in visually different surrounding culture media Can be. These areas, where bacterial growth was reduced by phage activity, Generally called plaque. The second bacterium is at a higher rate than the first Proliferate so that the first infected primary bacterial cell forms a detectable plaque The time required to do so is greatly reduced. This acceleration in plaque formation is the same It does not occur when the bacteria are used in the initial phage infection as well as in the subsequent culturing steps. Alternatively, the presence of the replicated phage particles in the culture medium at the end of step c Location can be assessed using conventional phage assay techniques. This is It can be performed in addition to or independently of the determination of the presence of the plaque described above. The method of the present invention comprises the steps of: providing a sample, eg, Mycobacterium tuberculosis ( Mycobacterium tuberculosis or Legioneires n aires), who are suspected of having the disease To give any observable suggestions about what was present in the Is a slowly growing strain in a sample from a patient that took days or weeks. It can be applied to terrier detection. In such cases, some of the initial samples Infect with predicted bacterium specific phage and pass inactivation step b The phage particles are protected by the infected cells. these Protected phage particles were used to culture each infected primary bag in culture of infected cells. Inducing phage or plaque formation around terrier cells-step c . If the suspected bacterium was not present in the sample, No plaques or plaques should form practically, and the culture medium should be substantially homogeneous. It should take on the appearance. The present invention is directed to determining whether an antibiotic or other drug has any bactericidal action. In a test to determine whether a known bacterium treated with antibiotics or other drugs You may implement using a rear. In this case, the phage or puller in step c The number of infections depends on the effect of antibiotics or drugs on killing the first bacteria. Indicates the opposite. In conventional test methods, antibiotics or drugs are The number of dead cells should be a direct indicator of the effect of the antibiotic or drug. It should be a mark. However, if you do not use a microscope, you can observe individual dead cells. It is difficult to guess. In this application of the invention, the cells are transformed into a first bacterium. Treatment of antibiotics or drugs that may kill will result in residual growth by phage particles. Combined with possible primary bacterial infections, how many primary bacteria are Determine if you have escaped killing by biomaterials or drugs. In another application of the invention, the virus or phage sample is a virucidal Treated with a composition having an action or virus growth control action. Processed files And then the first bacterium capable of growing viable to its specific phage. Ie, infect bacteria that can be infected by the phage. Infected tapir The terrier is then phage or phage that remains exposed without infecting bacterial cells. Or the cells are treated to inactivate phage particles outside of the cell. next, Unfortunate Activated infected first bacterial cell material present in second fast-growing bacteria Culture in the presence of phage particles in the infected primary cells. And dissolved. If the initial treatment of phage particles is completely effective, There are no phage particles that can grow when the terrier material is infected, and therefore No phage particles capable of growing in culture in the presence of a second bacterium are brought in. No. Thus, the second bacteria can grow and have a substantially uniform color development in the culture medium. Or impart opacity. However, if the initial treatment of phage particles is complete If not effective, the phage particles can grow in a second bacterial culture Phage particles are brought in and give rise to visually detectable plaques. For convenience, the present invention provides for the subsequent assessment of the presence of slowly growing mycobacterial species. Is described. The present invention is directed to bacteria from a wide range of animal or plant hosts. But is particularly useful for detecting bacteria from mammalian hosts, The present invention relates to an early sampling of body fluids from a human suspected of being infected with bacteria. It is described with particular reference to the evaluation of slowly growing bacteria in the bacteria. The term slowly growing bacteria is referred to herein as 7H9. 37 ° C. in a culture medium containing 90% v / v of a known medium and 10% v / v of a nutrient known as OADC Bacterial cell population over 10 hours under normal growth conditions in Having an effective growth cycle (effective doubling rate) as evaluated by Means Such bacteria may contain a detectable phage population or plaque. Should normally take 72 hours or more using conventional culture techniques to produce Or difficult to culture. Using the method of the present invention, the phage or plaque is Bacteria such as are usually detectable within 16 hours. Typical slow growing bacteria are mycobacterial species, especially mycobacteria Terium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) Mycobacterium paratuberculosis and Mycobacterium Ebium (Mycobacterium avium); Legionella species, especially Legionella Hella pneumophila; Helicobact er) species, especially Helicobacter pylori; streptococcus Mosquito (Streptococcus) species, especially Streptococcus adjensens (Streptococcus) adjacens); and Rickettsia species, especially Rickettsia plowazeki ( Rikcttsia prowazekii). The invention has an instantaneous doubling rate longer than 10 hours For example, Streptococcus defectens And difficulty growing first Extremobiles species Alternatively, it may be applied to bacteria having a higher average effective doubling rate. The term slowly growing bacteria is therefore used herein and in the claims. Bacteria that are used in a range and are genetically slow propagators, and Delays greater than 10 hours due to intermittent decay or interference in these growth cycles Refers to bacteria with a high average growth rate. The present invention is of particular interest in detecting such slowly growing bacteria. With another benefit, the present invention relates to the formation of detectable phage populations or plaques. Applicable to any bacteria where it is desired to increase the speed of For example, measuring bacterial contamination in human samples, food products or kitchens A doubling rate of less than 10 hours in a sample taken for For the detection of bacteria having a range between, conventional bacterial culture techniques are used. Provides a faster test for bacteria than would otherwise be achieved. For convenience The present invention relates to the following, wherein the first bacterium is Mycobacterium tuberculosis. The case where cis is used is described. The first bacterium may be in any suitable form from the patient, for example, sputum or May be present in other mucosal secretions. However, the present invention relates to humans and other mammals. For example, other body fluid samples of horses, cattle, sheep and pigs, such as blood, urine or For fecal samples and samples from plants such as leaves or root crops or fruits Can be applied. For convenience, the present invention relates to the testing of sputum samples from human patients. It is described below. Typically, the sample is a freshly collected liquid in which the bacteria can still grow. Exists as However, for storage and / or shipping prior to testing, If the pull is frozen or dried, transfer the sample to approximately Holding at 20 to 55 ° C., preferably at 37 ° C., in step b of the process of the invention Make sure that the bacteria are viable and can be infected by phage particles. It is desirable to guarantee that The initial sample can be processed if desired. Diluted with, for example, N-acetylcysteine and / or alkali, surfactant Treatment with sex agents or acids may interfere with the detection of bacteria being evaluated Other bacterial populations can be reduced. Such pre-processing is an evaluation Using commonly used conditions and techniques in the preparation of bacterial samples for Can be implemented. However, the method of the present invention is faster than the conventional test method. Yes, the effects of other bacteria are almost insignificant, The need to decontaminate the initial sample of Reduced compared to conventional methods of assessing terriers. The initial sample contains the bacteria to be evaluated in a viable state. this is Usually in a liquid or gel, eg agar, in a culture medium. However, The carrier medium may be a particulate solid or pores of a foraminous material, such as a ceramic. Frit or foamed plastic or filter paper Or mesh holes in a reticulated material, soaked in a suitable nutritional composition sell. For convenience, the present invention is subsequently applied to the gel carrier medium Describes use of liquid carrier medium for initial bacterial samples . The initial sample is phage specific for the first bacterial species to be evaluated and When the infected first bacterium is cultured in step c of the method of the present invention, Infect appropriate phage specific for the terrier. Phages turn into bacterial species May be genus-specific, so phage infect bacteria in the genus . However, when assessing a particular bacterium, narrow specificity phage It may be preferable to use Phage is phage specific, if desired May be modified so as to increase the likelihood that other Reduce bacterial transmission. Appropriate phage modifications can be performed by known techniques, such as infection. Can be achieved by genetic modifications for certain bacteria No. WO92 / 02633. Typical files for use in the present invention A Pages are AG1, B1, BG, BK, C3, D29, D34, D56A, GS4E, HP1, L1, 13 and TM4 including. The optimal phage for use in the present invention is the primary and secondary Depending on the terrier, it is produced by lysis from this phage or bacterial cell. In addition, the replica must be provided to the bacteria used. That is, Mycobacterium smeg in assessing the presence of Mycobacterium tuberculosis If Matisse is used as the second bacterium, phage D29 is appropriate and If Mycobacterium ebium is used, phage TM4 is appropriate. Phage can be provided, for example, in the form of a culture in a liquid medium. Or can be provided in the form of lyophilized or spray-dried particles . Phages can be grown using any suitable technique and under any suitable conditions Mix with bacterial sample. Typically, bacterial samples are in liquid form Wherein the phage infection is applied to the bacterial sample in a liquid carrier . Phage infection is allowed to proceed for 10 minutes to 4 hours at a temperature of up to 55 ° C, especially at about 37 ° C. To infect the majority of bacterial cells with at least one phage particle each Is preferred. However, over-infection is not possible with the acids described below. Inactivation of adsorbed phage particles may weaken bacteria so that they do not survive Absent. The optimal infection time for a given bacterium is determined by simple trial and error and error. Or by microscopic examination of the infected bacteria. , Related to the conditions experienced in the next stage of the method of the invention. Next, the infected bacterial sample is processed and absorbed into bacterial cells. Remove or eliminate any extraneous phage particles that remained outside the Activate and expose to conditions introduced during the inactivation step-step b. For convenience The term, inactivating, as used herein, refers to non-adsorbed phage particles as those of the present invention. Collectively refers to any method that renders it virtually impossible to duplicate in the next step of the method. Immediately This term refers to the physical separation or removal of phage particles from a sample, or Involves deactivation of the particles. This inactivation can be performed using any suitable technique, such as PCT It can be carried out using the technology described in application No. WO92 / 0233. Preferred technique Surgery is used to physically separate external phage particles from infected bacterial cells. Sump Washing and filtering; infecting samples with acid, detergent or chemical. Treating with a drug to kill or inactivate external phage particles; or The extraneous material from the infected sample is placed on a suitable substrate that can later be separated from the bacterial cells. By selectively adsorbing phage particles. For convenience, the present invention provides a method for preparing a mixture of infected bacterial cells and external phage particles as follows. Described for chemical or acid treatment. Such treatments can be carried out with inorganic acids or It is preferably carried out using an iron salt of Acid or sulfuric acid; C_1-4Aliphatic carboxylic acids, especially acetic acid, Or it may be vinegar; or an acid buffer medium. Processing was used In a bacterial carrier medium that inactivates the phage but does not kill the infected first cells To obtain the pH value. Optimal washing and pH conditions depend on the bacteria being evaluated, It can be determined by simple trial and error and error tests. Typically, infected bacteria The material is acidified and heated at an elevated temperature, typically 37 ° C, for a sufficient time, typically Incubate for about 15 minutes, then adjust the pH by addition of alkali or base. Adjust to neutral. In another technique, external phages add virucidal agents to infected bacterial material Killed by doing. The best virucidal agent is the phage to be killed and the primary Easy to determine by simple trial and error and error testing, depending on the nature of the terrier Wear. That is, when the first bacterium is Mycobacterium tuberculosis, Suitable virucidal agents for use in the invention are iron salts of inorganic acids and unsaturated fatty acids and And alcohols containing 12 to 24 carbon atoms, optionally with actinic or other irradiation, In particular, it involves UV irradiation at a wavelength of about 400 to 600 nm. After inactivation, the bacterial material converts at least some viable phage particles. It contains the first viable bacterial cell therein. This mixture is It is mixed with a culture or bacterial mixture containing the rear. These second tapirs The terrier is capable of being infected by phage particles within the cells of the first bacterium; Tolerance to phage and the rate of growth of the first bacteria to be evaluated It is characterized by growing at a rate greater than the degree. The second bacterium is the first bacterium It is preferred to have a doubling speed at least twice the rear doubling speed. Optimal phase The growth rate depends on the actual growth rate of the first bacterium; Clusters and / or reduced secondary bacterial growth areas or plaques If the time it takes to grow is not excessive, the first bacteria that grow very slowly A high relative growth rate is desired for a. Typically, the second bacterium is the first bacterium. It has a doubling rate of 4 to 20 times that of Cterrier. That is, the mycobacterium in the initial sample For the assessment of L. tuberculosis, Mycobacterium smegmatis is We have found that they give particularly rapid results when used as bacteria. Was. Other suitable second bacteria for use in the present invention are other mycobacteria, For example, Mycobacterium aurum. If desired, prior to mixing the infected first bacterium with the second bacterium, Allow at least one generation of replication after inactivation step b to achieve Phage particles can be released. Such a leave is not a replicated phage particle Allowing the offspring to be released from the infected bacterial cell and into the second bacterial cell Provides many sites for potential infection of small amounts of viable cells in the initial sample Helps detect active primary bacteria. In step c of the method of the invention, the infected first bacteria grows second faster. Cultured in the presence of bacteria. Phage particles in infected primary bacterial cells When replicated in cells, more cells are released from infected cells as cells lyse. Form diparticles. Each released phage particle infects neighboring bacterial cells And can be a first bacterial cell or a second bacterial cell. Each phage particle in those newly infected bacterial cells replicates Are released and further infect bacterial cells and the like. Culturing the mixture of the first and second bacteria can be performed by any suitable technique and conditions. Can be carried out. Typically, the second bacterium is Used in the form of cultures in liquid or gel media mixed with terriers. However However, the second bacterium may be in the form of a frozen or spray-dried powder or It may be used as solid particles with bacteria impregnated or coated thereon. Flight For convenience, the present invention provides for detecting a second bacterium in a agar gel carrier below. It is described with reference to application to dyed primary bacteria. The treated first bacterium The amount of second bacteria added to the sample depends on the number of first bacteria in the sample. Can vary widely depending on the expected amount of cells, and the range of results from the method of the invention And the desired time is required. Generally, large numbers, typically primary bacterial cells, By providing 2 to 50 times the number of second bacterial cells, Phage particles resulting from lysis from the primary cells are more likely to be in the second cell than the other first bacterial cells. Increases the likelihood of infecting Cterrier cells. First Bacteria against Second Bacterial Cells The optimal ratio of terrier cells is easily determined by simple trial and error and error testing. Can stand up. During the cultivation process, the culture medium contains the replicated phage particles, a viable secondary Presence of plaque from bacterial cells that have died due to the action of terrier or phage particles It varies in several detectable ways to reflect its presence. Typically, the second tap Terrier growth causes clouding or color development in the agar culture medium and phage Particles and associated bacterial dead cells from which they are released are colored or cloudy media Results in slightly cloudy or distinct spots, plaques in the Lark can be visually detected and evaluated. Alternatively, grow differently. Rear can be detected by differential staining using conventional staining techniques. Culture medium is appropriate If it contains components, the bacterial cells release luminophores (lumiphores) when lysed Thus, they can be detected under UV irradiation, for example as described in PCT application WO 92/02633. It is as follows. Increased numbers of replicating phage particles can also be obtained by immunological techniques such as ELISA or Can be detected by other enzyme techniques. The number of phage particles and / or plaques is the number of primary bacterial cells present The presence of such cells in the initial sample or vice versa Is evaluated. As indicated above, the method of the present invention provides for predicting the predicted Provides a rapid test for the presence of bacterial strains. To infect the first bacterium With the proper choice of phage particles used, the test is specific to a particular bacterium Can be. Alternatively, testing may involve determining the type of bacteria present in the initial sample. Can provide a wide range of indicators. The method of the present invention, namely, the required conclusions You can customize the fruits. The results were not just the days needed so far, It can be obtained in a few hours, so perform an initial general screen and Perform specific tests once the general bacterial species present in the sample have been identified It is practical. The method of the present invention can be performed using simple cell culture techniques. Because the results can be evaluated visually, the method of the invention And easy use in third countries where complex laboratory facilities are not available it can. The present invention provides a book for detecting the presence or absence of a first bacterium in a sample. Also provided is a diagnostic kit for use in the method of the invention, wherein the kit comprises Known source of phage infection for terriers; has a faster doubling rate than primary bacteria Released from the first bacteria infected by the phage infection The particles include a second source of viable bacteria that is permissive for the particles. Preferably, the kit Is an external phage particle from the first bacterium completed by the above source of phage infection Means for inactivation and / or removal of offspring. The present invention is now illustrated by the following examples, in which all parts are otherwise Unless stated otherwise, given by weight.Example 1 The principle of the present invention is to use a first bacterium having a typical doubling rate of at least 10 hours. -Growing mycoba as a second bacterium having a doubling rate of about 2 hours Using slow-growing vaccine strain BCG, representing Cterium smegmatis Tested in a secure model. This embodiment combines liquid and solid agar processes. In combination, the external phage was acid inactivated. Step 1. Colonies of BCG from agar-based media were screened for 7H9 plus 10% (v / v ) 37 ℃ in liquid medium in OADC adduct (Difco) (hereinafter referred to as 7H9, OADC) To yield a stock of cells that can be used in detection assays. . In a clinical setting, these cells have a direct source of clinical sample and Nourishment No process should be required. In a clinical setting, cells that grow slowly Mycobacterium tuberculosis. Step 2. Serially dilute the liquid medium containing BCG cells and add 10 μl of each dilution station to 10 μl.^FiveD29 It was mixed with 10 μl of 7H9, OADC containing bacteriophage (phage). Contrast sun Pull also, a) Mix 10 μl of BCG-free but not BCG-free medium with phage ; And b) Add BCG by heating at 80 ° C for 30 minutes before mixing with phage. Heat sterilized control Was set to include. Step 3. After incubation at 37 ° C. for 90 minutes, 20 μl of 1.2% (v / v) H External phage particles were inactivated by addition of Cl. Step 4. Next, 20 μl of 22.2 mM NaOH was added to neutralize the acidity. Step 5. Next, 10 μl of this solution was added to 7H9, OADC, stationary phase Mycobacterium Gumatis culture medium containing 5% (v / v) and 1.5% Bacto agar (Difco) I spotted on the mucan template. Step 6. The plate is then incubated at 37 ° C to protect the protected internal Germ particles were allowed to replicate in BCG cells. Replicated phage particles are BCG cells And was released upon dissolution. At least some of the released phage particles Infection in these fast-growing cells upon infection with Mycobacterium smegmatis Cycle established. Step 7. After 16 hours, the plate is then washed with uninfected Mycobacterium smegmatis. Phage lysis or plaque clearing during cloudy growth of indicator cells We observed about the area. The results are recorded and shown below: sample Degree of dissolution Undiluted BCG + 10^-2Diluent 10 plaques 10^-FourDiluent − Heat sterilized BCG- Only phage without BCG- + Individual plaques observed but too many to count − No plaque Heat-killed BCG and phage only controls remain negative and are inactive by acid Demonstrates that living cells are needed for phage protection from sexual transformation . Live BCG was able to protect phage, infected and replicated in BCG cells . Upon lysis of BCG cells, at least some replicated phage particles are released Some phages replicate in the fast growing Mycobacterium smegmatis Plaques developed 16 hours later. The highest dilution of BCG that showed lysis was 10^- ^Two However, since the original BCG culture used was still in the early log phase, about 10^ThreeBCG Represents a Ronny forming unit. This assay will therefore work with a given sample Only 10 surviving slowly growing bacteria in^ThreeAbility to detect the presence of Have. This sensitivity is higher than that described for the microscope and Approximately the sensitivity of the culture when applied to terrier detection. However, The time required to produce observable plaques is the time required for conventional culture techniques. It was less than 24 hours compared to 6 weeks.Example 2 The procedure of Example 1 was repeated, except that the assay was performed in solid agar medium. And the point that external phages were removed by washing without acid treatment. Step 1. Step 1 was performed as described in Example 1. Step 2. Serial 10-fold dilutions of BCG cultures were performed in 7H9, OADC. 10 μl of each dilution The spot was spotted on a can template (7H9, OADC, 1.5% Bacto agar). Heat kill 10 μl of the inoculated BCG culture was also spotted on a similar plate to provide a control plate. Was. Plates were kept at 37 ° C. Step 3.1 One piece of filter paper is put on 7H9, OADC, 3% milk powder, Milli 10 per title⁶Wet with D29 bacteriophage. Step 4.5 Filter paper with phage soaked sediment of filter paper Infected by capillarity and by capillary action through a pile of filter paper External phages were removed from around the cells. Step 5. When the filter paper deposits are completely wetted, all filter Tar paper was removed from the agar surface and discarded. Step 6. Next, use a nitrocellulose filter to remove infected cells from the agar surface. Was stripped. Put the nitrocellulose filter on agar, Wet and peeled off. Next, filter this filter on mycobacteria that grows faster. Um smegmatis indicator cells (7H9, OADC, stationary phase mycobacteria) Agar containing 5% (v / v), 1.5% Bacto agar (Lium smegmatis) Placed on the lower cell side on the plate. Step 7. Place plate from step 6 at 37 ° C until plaques can be visually observed. And incubated and the results recorded. sample Range of dissolution Undiluted BCG ++ 10^-1Dilution +++ 10^-2Dilution ++ 10^-3Dilution + 10^-FourDilution − Heat sterilization BCG- ++ complete lysis of indicator cells (no cell growth) ++ plaque with some growth of indicator cells between plaques + Individual plaques observed but too many to count − No plaque The heat-sterilized control remained negative again, so It was shown that living cells were required for protection of the phage. Living BCG Was again able to protect the phage that had infected and replicated in BCG cells. BCG fine Upon lysis of the vesicles, the replicated phage is released and at least some phage Starts the replication cycle in the growing mycobacterium smegmatis after 16 hours Plaques formed. The highest dilution of BCG that showed lysis was 10^-3But was for The original BCG culture that was still in early log phase^ThreeBCG colony forming uni Represents a unit. This assay in this format is therefore Only 10 surviving slowly growing bacteria in the sample^ThreeDetect the presence of Have the ability.Example 3 This example illustrates another method for performing a bacterial assay.Processing sputum samples for the phage infection process : The complete sputum sample is placed in a sterile 20 ml screw capped glass bottle. 1. An equal amount of a "cleaning agent" is added to the sample to clean and liquefy the sample. 2. Mix the diluted sample by inverting several times and leave the mixture for 10 minutes Liquidize sputum. 3. Next, the sample is centrifuged at 4000 × g for 10 minutes to precipitate the bacteria. 4. Pour the resulting supernatant liquid into undiluted Hycolin fungicide, throw away. 5. The bacterial precipitate is resuspended in 20 ml of sterile distilled water. 6. The suspended bacterial mixture is centrifuged as in step 4 to precipitate the bacteria. 7. The bacterial precipitate is then resuspended in 1.0 ml of "growth medium" for 24 hours at 35-37 ° C. Allow the sample to serve for assay testing. 8. Control samples were inactivated by adding 1.0 ml of "growth medium" to a new tube Provide a control; and add 1 drop of “helper cells” to 1.0 ml of “ In addition to "growth media", it provides a positive control for protection of internal phage.Bacteriophage transmission to bacteria 9. Using a sterile pastette, add 1 drop (50 μl) of Is added to each test sample as well as to the inactivated control sample. By shaking Mix and incubate without shaking at 35-37 ° C. for 3.0 hours. Internal file Positive controls for page protection do not advance this time. Ten. 2.5 hours after adding bacteriophage to the sample, the mycobacterium Add the smegmatis precipitate to the positive control tube. 11． Incubate all test and control samples for a total of 3 hours each. To Add 2 drops (100 μl) of “inactivation reagent” with sterile pastets to each sample. And control samples. Mix sample thoroughly and leave for 5 minutes. 12． Using sterile plastic pastets, add 5 ml of "growth medium" in each sample. And mix the contents for 4 hours at 35-37 ° C without shaking. Incubate.Visualization of bacteriophage plaques 13. Use sterile plastic pastet to test 1.0 ml of "helper cells" for each test Add to sample and control samples. Add 14.5 ml of dissolved base agar to each sample and shake the sample and agar Mix by a sharp swirl. 15． The corresponding labeled "indicator plate" with cooled contents of each tube ". 16． "Indicator plate" is left on the bench for 30 minutes to solidify the agar Let it. 17． The “indicator plate” is kept at 37 ° C. for 15 hours. 18． Count the number of plates on each "indicator plate" on a dark background. Count visually by observing the plate against On the plate The growth of the "helper cells" is that the bacteriophage Observed as a transparent area, the opaque area along with the (plaque) lysis area Observed as a.Inspection of control tubes Before analyzing the results in the test sample, inactivate the inactivated control sample. Test for the occurrence of lysis by live phage after the sexual treatment. This press There should be less than 10 plaques on the plate. If more than 10 plaques, Incomplete chemical inactivation of external phage and assay must be repeated No. Positive control plates are tested for plaque. Extensive dissolution should occur And there should be a large number of plaques on this plate. Several states In some situations, the result is that the plate may not have a bacterial lawn Due to complete lysis of cells, there may be no growth of "helper cells" No. Test each of the test sample plates to determine the presence of plaque or lysis Evaluate according to the criteria: ++ Complete lysis, no bacterial residue ++ Complete lysis, but some bacterial residue + Plaques overlap but some plaques are independent If you can count the number of plaques, record this number − No plaque is observed Those plates that show lysis show that their sputum samples It contains live mycobacteria that host replication of the page. Eight purified sputum samples from patients with pulmonary tuberculosis were applied to the phage assay technique When tested more, five samples showed viable Mycobacterium tuberculosis And three samples were not included. These results are compared to conventional bacterial sumps. Five samples that were positive by culture compared to cultures of phage Assay, which means that bacteriophage survival and replication is supported. On the other hand, three samples that were negative in the culture were also negative in the phage assay And did not support bacteriophage survival and replication. The reagents used in the above test method are as follows: Purifier: 2 grams of NaOH, 0.5% N-acetyl L-cysteine in sterile distilled water Including 100ml Growth medium: 7H9, OADC with 0.1% glycerol added Substrate agar: Growth medium with 1.5% Bacto agar Bacteriophage: Bacteriophage D29 prepared from plate lysate. A 90 mm bird dish showing confluent lysis was added to 10 ml of 7H9, OADC, 0.1% glycerol. 1 mM CaCl_TwoAnd left in the refrigerator overnight (16 hours). Pastet The liquid was recovered from the plate and centrifuged at 4000 xg for 15 minutes. Supernatant liquid The bodies were filter sterilized with a 0.4μ filter, aliquoted and stored at 4 ° C. Helper cells: Mycobacterium smeg grown until stationary phase and stored at 4 ° C Matisse. Deactivator: 100 mM ammonium iron sulfate, filter sterilized.Example 4 : The principle of the present invention relates to drug susceptibility testing of mycobacteria in a safety model system. Tested. BCG is sensitive to mycobacteria (low concentrations of isoniazid and rifane (Pisin sensitivity) and is genetically resistant to isoniazid. Resistant or partially resistant to Mycobacterium smegmatis, partially resistant to rifampicin Used as a model for resistant mycobacteria. Step 1. BCG colonies from agar-based media can be grown in liquid culture in 7H9, OADC. Drugs that can be grown in the ground at 37 ° C for 2 weeks and used in detection assays A stock of sensitive cells was generated. Similarly, for Mycobacterium smegmatis The stock is grown for 24 hours in 7H9, OADC to obtain a stock of drug resistant cells. Generated. In the clinic, these cells should be able to originate directly from clinical samples Yes, this pre-culture step is not required. In clinical practice, drug-sensitive cells Various strains or isolates of B. tuberculosis. Step 2. 100 μl of each culture for 72 hours with isoniazid and rifampicin Incubation was carried out in 3 ml volumes of 7H9, OADC at various concentrations. This step is Necessary for cells to be affected by antibiotic drugs. Control without drug Prepared. Step 3. 100 μl of each culture was then removed for testing. Step 4.5 × 10⁶Add 800 μl of 7H9, OADC containing D29 phage and incubate at 37 ° C. 4.5 hours for BCG culture or culture for Mycobacterium smegmatis For nourishment, the cells were incubated for 40 minutes. Heat-sterilized BCG and Samples containing only Mycobacterium smegmatis and phage were also used as control experiments. Included. Step 5. Next, the external phage was treated with 100 μl of acid buffer (32.2 ml of 0.1M citrate). Inactivated by the addition of disodium and 67.8 ml of 0.1 M HCl). Step 6.5 minutes later, 84 μl of 1.0 M NaOH was added to neutralize the acidity. Step 7. Add 4 ml of 7H9, OADC and add Mycobacterium smegmatis Nutrition was plated directly. BCG cultures, however, were incubated at 37 ° C for 3 hours. Incubation of protected phage inside replicates in all living cells Was made possible. Step 8. Next, 100 μl of each culture was added to the stationary phase Mycobacterium smegmatis. 5 ml of liquid 7H9, OAD containing 5% (v / v) and 0.7% Bacto agar (Difco) Mix with C and pour into 50 mm Petri dishes. Step 9. After the agar has set, incubate the plate at 37 ° C for 16 hours. I did it. During this time, surviving acid treatment in viable mycobacteria All internal phages replicate and lyse the first target cell, leaving at least some Some of these phages are faster growing Mycobacterium smegmatis indica A new replication cycle was established in the indicator cells. Step 10. Next, phage lysis during turbid growth of uninfected indicator cells Alternatively, the plate was observed for distinct areas of the plaque. The results are recorded Is shown below: This table shows different mycobacteria grown in the presence of various antibiotics. Indicate the number of plaques observed for ++ plaques overlap, indicator between plaques Some cells are growing + Individual plaques observed but too many to count Mycobacterium tuberculosis, which grows slowly, is composed of isoanizide and Sensitive to rifampicin. When grown in the presence of rifampicin, cells Live cells that are killed and consequently protected from inactivation and support their growth Bubbles disappear. The number of plaques observed in the presence of all concentrations of rifampicin was Does not significantly exceed background level; background is heat-sterilized sump The number of plaques observed in the sample. Mycobacterium growing fast Megmatis, however, is resistant to low levels of rifampicin, At the lowest rifampicin concentration, numerous plaques can be observed. Refa As the level of ampicin increases, the cells are affected and the plaque count gradually decreases You. The action of rifampicin in mycobacteria is known to be rapid However, isoanidide takes some time to exert its effect. as a result, At the lowest concentration of isoniazid, BCG was not affected, Reflected in the number of plaques observed and observed in the control without drug Plaque counts were near. At high concentrations of isoniazid, however, There was a significant reduction in the number of plaques reflecting the death of these cells. In contrast, Mycobacterium smegmatis is hardly affected by isoniazid, There was only a slight decrease in plaque count at higher concentrations. This experiment demonstrates that the present invention allows cells that grow slowly, such as Mycobacterium tuberculosis. This shows that it can be used to evaluate drug susceptibility of lucrosis. This assay Can be performed easily, can be performed on low cell numbers, and drugs affect cells Results can be obtained within 4 days, including the time required to produce Culture technology Conventional drug sensitivity assays that require large numbers of cells and It takes more than four weeks to get. Bactec system faster than conventional technology Require large finished products of expensive equipment, but the method of the present invention requires only minimal equipment. It is inexpensive, inexpensive, and more suitable for third world settings where tuberculosis is more common. Therefore, the present invention also provides a method for evaluating the treatment effect on bacteria. The method comprises: i. Exposing the bacteria to treatment, then ii. a The treated bacterial sample is treated with phage Infection; b inactivate external phage particles in the infected sample; c In the presence of a second bacterium that doubles faster than the first bacterium Culturing the inactivated sample; and d Assess the degree of plaque formation and / or the degree of secondary bacterial growth. Deserve The number of surviving bacterial cells in a bacterial sample Consisting of The method of the present invention can be used to evaluate the effect of a composition on phage. Can also be a. Treating the phage particles with the composition; b. Put the treated phage particles into the first bacterium that allows live phage Infect; c. Inactivates phage particles external to the infected first bacterial cell; d. Faster than the first bacterium, preferably 2x, typically 4-10x Culturing the inactivated cells in the presence of a second bacterium that doubles with e. The degree of plaque formation in the cultured second bacterial cells and / or Assess the extent of bacterial growth Consisting of In this application of the method of the invention, the extent of bacterial growth is determined by the extent of phage particles. Indicates the effect of the first treatment or vice versa. If plaque does not form, first Treatment kills or inactivates the phage particles, ie, to the first bacterial cell. Interfered with their infection. Of these cells during the second bacterial culture stage. Replication involves phage particles that kill secondary bacterial cells or interfere with their replication. Did not release. The cultured second cells show uniform growth of the bacterial cells. Exhibit a substantially uniform color or opacity. Kill or inactivate phage particles If the composition was not effective in activating the phage particles, Infects and protects against inactivating treatment of infected primary bacteria. Infected cells When cultured in the presence of a second bacterium, the phage particles replicate and become infected with the primary cells. Lysing the vesicles and infecting the second bacterial cell, resulting in plaque or second bacterial Gives visually uneven growth. The degree of plaque or uneven growth is present To give an indication of the number of phage particles that Give an indication of the range of rates. This application of the method of the invention may not give a quantitative result Potential, but may be subjected to other tests to determine the quantitative effect of the composition Provide rapid initial screening techniques that can be used to identify candidate compositions Offer. Thus, in its broadest aspect, the present invention provides an approach for the first bacterium. Provide a way to increase the response time of a. Infection of the first bacterium with phage particles allowed by the first bacterium Slush; b. Treat infected bacteria to inactivate external phage particles ; c. The treated bacteria are made permissive for the phage or its replica. Faster than the first bacterium, preferably by a factor of two, typically four to ten times Culturing in the presence of a doubling second bacterium; and d. The degree of plaque formation in the cultured second bacterial cells and / or Assess the extent of bacterial growth Consisting of

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. A method for increasing the response time of an assay for a first bacterium, comprising: a. Exposing the first bacterium to infection by a phage that the first bacterium tolerates; b. Treating the infecting bacteria to inactivate external phage particles; c. Culturing the treated bacteria in the presence of a second bacterium that is permissive for the phage particle or a replica thereof and that doubles at a faster rate than the effective doubling rate of the first bacterium; and d. The method is characterized in that the degree of plaque formation and / or the degree of growth of the cultured second bacteria is evaluated. 2. The following steps: a. Infecting a viable sample of a first bacterium with a phage specific for said bacterium, causing one or more phage particles to adsorb to each of at least some of the bacterial cells; b. Inactivate or remove phage particles that were not adsorbed by the bacterial cells; c. Culturing the infected first bacterium in a medium containing at least one other second bacterium having a doubling rate greater than the effective doubling rate of the first bacterium, such that at least some of the second bacterium cells become infected first bacterium cells; Will be infected by the phage particles released upon lysis of each of the above, causing each of the infected cells to act as an additional source of infection for the next generation of the infection cycle; and d. Measuring the presence of the first bacterial cell in the sample to be tested by monitoring the reduced population of phage particles and / or the growth of the second bacterium in step c, the presence of the first bacterium in the sample The method according to claim 1, wherein the method is provided for detecting 3. 2. The method of claim 1, wherein said method provides a method for assessing the effect of a virus control composition or virucidal agent on phage particles by assessing the ability of the phage particles to replicate in bacterial cells or vice versa. Treating a phage particle with a composition; and a. Infecting the treated phage particles with a first bacterium that allows live phage; b. Inactivate phage particles external to the infected first bacterial cell; c. Culturing the inactivated cells in the presence of a second bacterium that doubles at a faster rate than the first bacterium; and d. Assessing the degree of plaque formation and / or the degree of growth of the second bacteria in the cultured second bacterial cells. 4. A method for evaluating a treatment effect on bacteria, comprising: i. Subjecting the bacteria to treatment, and then ii. a. Infecting the treated bacterial sample with bacterial-permitted phages; b. Inactivating external phage particles in the infected sample; c. Inactive in the presence of a second bacterium that doubles at a faster rate than the first bacterium. And then assessing the number of surviving bacterial cells in the bacterial sample by assessing the degree of d plaque formation and / or the degree of secondary bacterial growth. 5. A first bacterium having an effective doubling rate of greater than 10 hours at 37 ° C. in a culture medium comprising 90% (v / v) of a medium known as 7H9 and 10% (v / v) of a nutrient known as OADC; A method according to any one of claims 1 to 4. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the second bacterium has a doubling rate at least two times higher than the effective doubling rate of the first bacterium. 7. The method according to any of the preceding claims, wherein the second bacterium has a doubling rate 4 to 10 times higher than the effective doubling rate of the first bacterium. 8. The method of claim 7, wherein the first bacterium is a Mycobacterium species or a Legionella species. 9. 9. The method according to claim 8, wherein the first bacterium is Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium ebium. Ten. 9. The method of claim 8, wherein the second bacterium is Mycobacterium smegmatis or Mycobacterium aurum. 11． 5. The method according to claim 1, wherein the first bacterium has a doubling rate of 2 to 10 hours. 12． The method according to any one of claims 1 to 11, wherein the phage infection of the first bacterium is carried out at a temperature up to 55 ° C and for a period of 10 minutes to 10 hours. 13. _{Phage, AG1, B1, BG 1,} BK 1, C3, D29, D34, D56A, GS4E, HP1, L1, 13 or TM4, any one method according to claims 1 to 12. 14. 6. The method of claim 1, wherein the first bacterium is Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium ebium, the second bacterium is Mycobacterium smegmatis, and the phage is D29 or TM4. The described method. 15． i. Washing and filtering the infected bacterial material to separate external phage particles from the infected first bacterial cells; or ii. Treating the infected first bacterial material with a virucidal agent, acid or detergent to kill or inactivate external phage particles; and / or iii. 15. The method according to claim 1, wherein the external phage particles are inactivated in step b by selectively adsorbing the external phage particles from the first bacterial material onto a substrate separated from the bacterial cells. A method according to any one of the preceding claims. 16． 16. The second bacterium is provided in step c in an initial amount to provide 2 to 50 times the number of first bacterium cells in the mixture of the second bacterium cultured with the infected first bacterium. The method according to claim 1. 17． 17. The method according to any one of claims 1 to 16, wherein the culturing step c is further carried out to a substantially steady state in which the growth of the bacterial cells and the subsequent substantial lysis are stopped. 18． i. A known source of phage infection for the first bacterium; ii. A second bacterial source having a rate higher than the doubling rate of the first bacterium and capable of growing phage particles released from the first bacterium infected by the phage infection. A diagnostic kit for use in the method according to any one of claims 1 to 5, for detecting the presence or absence of a first bacterium. 19. 19. The diagnostic kit according to claim 18, further comprising means for inactivating and / or removing external phage particles from the first bacterium infected by the phage infectious source.