NO873487L - Fremgangsmaate til bestemmelse av konsentrasjonen av enzyminduserende kjemikalier. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en antistoffbasert biologisk fremgangsmåte til bestemmelse av konsentrasjonen av enzyminduserende kjemikalier.

Mange xenobiotiske forbindelser (forbindelser som normalt ikke finnes i en dyrekropp) induserer i dyreceller dannelse av enzymer som gjør forbindelsene ugiftige eller modifiserer dem. Resultatene av avgiftningsprosessen bedrer i de fleste tilfeller lettere utskilling av forbindelsen. En hovedkilde for xenobiotisk modifisering i pattedyrceller er det mikrosomale blandingsfunksjon-oksidasesystem, en kjede av enzymer som ender med én av en familie enzymer som er kjent som cytokromene P-450. Det er disse endecytokromer som faktisk samvirker med den xenobiotiske forbindelse og forandrer eller metaboliserer denne kjemisk.

Spektret av xenobiotiske forbindelser som kan påvirkes av det mikrosomale blandingsfunksjon-oksidasesystem er meget mang-foldig. Studier som er utformet for å undersøke kilden for denne mangfoldighet har vist at den har sin opprinnelse i endecyto-kromene selv. Der er faktisk mange former av cytokrom P-450, hvor hver innvirker på en gruppe svakt beslektede kjemiske typer. For-men av cytokromer P-450 som behøves for å samvirke med en xenobiotisk forbindelse er bestemt når forbindelsen befinner seg inne i den levende celle. Cellen reagerer på nærværet av denne fremmede forbindelse ved økning av dannelsen av det cytokromet som er hensiktsmessig. Denne økning i cytokromkonsentrasjon som reaksjon på nærværet av en spesifikk kjemikalie benevnes induksjon.

De to former av endecytokromet som er relevante for den foreliggende oppfinnelse er gitt navnene cytokrom P^-450, også kjent som alkylhydrokarbonhydroksylase, og cytokrom P-44 8, også benevnt arylhydrokarbonhydroksylase. Slik de er benyttet her referer alkyl- eller arylhydrokarbonhydroksylasebetegnelsene til den type enzymatiske aktivitet eller substratpreferanser som er knyttet til induksjonen av disse enzymer. Betegnelsen "AHH" vil referere enten til alkyl- eller arylhydrokarbonhydroksylase som begge faktisk er en gruppe beslektede enzymer.

I nærvær av polycykliske aromatiske hydrokarboner (arylhydrokarboner) øker konsentrasjonen og aktiviteten av cytokrom P-44 8 i cellene. Når forbindelser som barbituratene er nærværende

(hydrokarboner med mindre aryl- eller benzenlignende karakter)

økes cytokrom P^-450. Økning av induksjonen av disse enzymer med spesielle kjemikalier, f.eks. ved å utsette dyrkede celler for prøver som inneholder forskjellige konsentrasjoner av én eller eller de andre typer induserende stoffer, skaffer således en basis for bestemmelse og måling av disse kjemikalier i forskjellige typer prøver.

AHH-enzymene er induserbare enzymer, dvs. at deres aktivitet økes i nærvær av alkyl- eller arylhydrokarboner. En AHH-induserende kjemikalie trenger hurtig gjennom en levendes celles membran, og når den er inne i cytoplasmaet samvirker den med et bindingsprotein og danner et kompleks. Komplekset vandrer hurtig inn i cellekjernen hvor det bindes til et spesifikt sete på DNA. Denne binding tjener som et signal for transkripsjon av det til-støtende DNA til budbærer-RNA som koder for AHH-enzymer. Denne budbærer-RNA vandrer hurtig inn i cellecytoplasmaet hvor den translateres til AHH-enzymer. Disse enzymer modifiserer eller av-gifter toksiske kjemikalier.

Komplekset aktiviserer også andre grupper gener som koder for proteiner som styrer celledeling og -differensiering. Aktivi-sering av disse gener kan føre til kreftlignende transformasjon, en kjent egenskap hos mange AHH-induserende stoffer. Andre AHH-induserende stoffer er meget toksiske eller skadelige på andre måter for levende celler og organismer. Måling av induksjonen av AHH ved hjelp av spesielle kjemikalier gir således en basis for bestemmelse og måling av konsentrasjonene av disse kjemikalier i forskjellige typer prøver.

Graden av AHH-induksjon kan måles ved måling av et vil-kårlig av AHH-enzymene. 7-etoksyresorufin-O-deetylase (EROD), et av enzymene cytokrom P^-450, er fordelaktig å anvende på grunn av at substratet, 7-etoksyresorufin er meget lite toksisk og pro-duktet, resorufin, kan måles spektrofotometrisk ved 572 nm ved fremgangsmåten til Klotz et al., Anal. Bioch., Vol 140, 1984, p. 138-145, eller fluorimetrisk slik som beskrevet av Prough et al., Meth. Enzylmol., 52C, 1978, p. 372-377.

AHH-induserende stoffer omfatter dibenzodioksinene, diben-zofuranene og bifenylene. Polyklorerte dibenzodioksiner har vært i fokus for mye vitenskapelig og regulerende oppmerksomhet på grunn av sin store toksisitet overfor forsøksdyr og deres mulige fare for mennesker. De opptrer som biprodukter og forurensninger ved fremstillingen av klorerte fenoler og deres omdanningspro-dukter, såsom fenoksyeddiksyreherbicidene. Den mest toksiske forbindelse som hittil er kjent i denne gruppe er 2,3,7,8-tetraklor-dibenzo-p-dioksin (TCDD). På grunn av toksisiteten til TCDD er det ønskelig å kunne påvise den i konsentrasjoner på noen få deler per kvadrillion.

Kjente fremgangsmåter til påvisning av 2,3,7,8-tetraklordibenzo-p-dioksin og beslektede kjemikalier omfatter vanligvis en eller annen form for lav- eller høyoppløsningskromatografi, vanligvis gasskromatografi, samt høy- eller lavoppløsningsspektro-metri, (se Environmental Protection Agency Publication EPA/600/3-85/019, fra april 1985 med tittelen National Dioxin Study). Denne teknologi gjør det nødvendig med meget kostbart, avansert utstyr, en høy grad av dyktighet hos personen som ut-fører forsøket og et betydelig tidsrom. Det koster således så mye som fra kr. 6000,- til kr. 19000,- å undersøke en prøve på nærvær av TCDD. I tillegg lar denne teknikk mye tilbake å ønske når det gjelder følsomhet. Den laveste konsentrasjon av 2,3,7,8-tetraklordibenzo-p-dioksin som kan påvises omtrent 1 del per trillion.

Antistoffpåvisningsmetoder ville kunne senke kostnadene og tiden som er forbundet med påvisningen av TCDD og lignende kjemikalier. Men slike metoder er begrenset av sin følsomhet. En antistoffmetode, radioimmunologisk metodikk, har vært foreslått som en måte til å påvise TCDD i området noen deler per trillion. Albro et al., Methods in Enzymology, Vol 84, 1982, p. 619-628, Albro et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., Vol 50, 1979, p. 137-146. Men radioimmunologisk metodikk er ennå ikke tilstrekkelig følsom for påvisning av konsentrasjoner av TCDD under 10 deler per trillion. Den krever også forsiktig håndtering på grunn av radioaktiviteten og spesielle fremgangsmåter for de-ponering av de radioaktive materialer.

Nærværet av en AHH-induserende kjemikalie i en prøve kan påvises ved hjelp av dens evne til å indusere AHH i forskjellige typer celler. En slik cellekulturmetode er beskrevet av Bradlaw og Casterline, J. Assoc. Off. Anal. Chem., Vol 62, 1979, p. 904-916. Metoden er en biologisk cellekultur-enzyminduksjonsmetode hvor det benyttes induksjon av AHH-aktivitet i rottelever-tumorcellelinje H411E til påvisning av meget små mengder dibenzodioksiner, dibenzofuraner og bifenyler. Forfatterne bekrefter at metoden er et nyttig system for screening av store antall spesielt fremstilte matvareekstrakter for forurensning ved disse forbindelser, men at systemet kanskje ikke vil være i stand til å identifisere den eller de reaktive substanser spesifikt. Systemet kan således være anvendbart for identifisering av nærværet av AHH-induserende kjemikalier i en prøve, men det kan ikke benyttes til identifisering og kvantitative bestemmelse en spesiell AHH-induserende kjemikalie, såsom 2,3,7,8-tetraklordibenzo-p-dioksin.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved:

a) at konsentrasjonen av alle enzyminduserende kjemikalier i en første del av prøven bestemmes, b) at en andre del av prøven bringes i kontakt med antistoffer til den enzyminduserende kjemikalie til dannelse av komplekser av kjemikalien og antistoffene, c) at konsentrasjonen av alle enzyminduserende kjemikalier som ikke har dannet komplekser bestemmes i den andre prøven, samt d) at konsentrasjonen av kjemikalien i prøven bestemmes ved at konsentrasjonene av kjemikaliene bestemt i trinn c) substraheres fra konsentrasjonen av kjemikaliene bestemt i trinn a) hvorved konsentrasjonene av kjemikaliene i den første og den andre del bestemmes ved at delene bringes i kontakt med celler som inneholder et induserbart enzym, den prosentvise induksjon av enzymet i cellen bestemmes, den prosentvise induksjon sammenlignes med en standardkurve for prosentvis induksjon av enzymet i cellene i et område av kjente konsentrasjoner av kjemikalien og konsentrasjonene ekstrapoleres fra standardkurven.

I en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten er den enzyminduserende kjemikalie dibenzodioksin, og i en særlig foretrukket utførelsesform er den enzyminduserende kjemikalie 2,3, 7,8-tetraklordibenzo-p-dioksin.

Som anført ovenfor vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til bestemmelse av konsentrasjonen av en enzyminduserende kjemikalie, såsom et giftstoff, i en prøve. Den omfatter anvendelse av et antistoff til et giftstoff for å regulere enzym-aktivitet indusert av giftstoffet i levende celler. Dette fører til en meget ømfintlig og spesifikk metode for dette giftstoff.

En metode basert på induserbarhet av et spesielt enzym eller gruppe av enzymer ved hjelp av en spesiell kjemikalie i levende celler kan være en meget ømfintlig metode for denne kjemikalie, men den skjelner ikke mellom lignende kjemikalier av samme type. Dersom man ønsker å påvise og måle konsentrasjonen av en spesiell kjemikalie i en prøve er den vanligvis forurenset av en blanding av kjemikalier av samme type eller klasse. En enzyminduksjonsmetode er ikke tilstrekkelig spesifikk for å skjelne blant atskillige, lignende kjemikalier. F.eks. vil resultatene av en enzyminduksjonsmetode for TCDD bli sterkt påvirket av nærværet av andre klorinerte dibenzodioksiner eller andre enzyminduserende kjemikalier.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes det antistoffer til den spesielle kjemikalie som skal identifiseres og måles, såsom TCDD, for å frembringe spesifisitet for metoden. Dette oppnås ved sammenligning av den prosentvise induksjon av enzymet i cellene med enzyminduserende kjemikalier i prøven før og etter at antistoffene til den spesielle kjemikalie som skal påvises er blitt tilsatt til prøven. De prosentvise induksjoner sammenlignes deretter med en standardkurve som er frembrakt ved måling av de prosentvise induksjoner med kjente konsentrasjoner av den enzyminduserende kjemikalie. Dette muliggjør bestemmelse av konsentrasjonen av den enzyminduserende kjemikalie før og etter tilsetning av antistoffene. På grunn av at antistoffene bindes til kjemikalen kan denne ikke indusere enzymet. En forskjell i de to konsentrasjoner signaliserer derved nærværet av kjemikalien som skal påvises, og mengden av differansen representerer konsentrasjonen av kjemikalien. På den annen side betyr samme induksjon ved hjelp av en ukjent kjemikalie i nærvær og fravær av antistoffer til kjemikalien at prøven ikke inneholder denne kjemikale. Dessuten betyr induksjon i fravær, men ikke i nærvær, av antistoffene at prøven utelukkende inneholder vedkommende kjemikalie. Induksjon i fravær, og delvis induksjon i nærvær av, antistoffene indikerer nærvær av en blanding av forbindelser i prøven.

Ved sammenligning av graden av induksjon forårsaket av den ukjente kjemikaliekonsentrasjon med induksjonen forårsaket av standardkjemikaliekonsentrasjonen kan således nivået av kjemikalien i prøven bestemmes, basert på antistoffets inhibering av induksjon. Denne metode gjør det mulig å påvise en enzyminduserende kjemikalie i konsentrasjoner helt ned til 1 del per kvadrillion.

Spesielt omfatter fremgangsmåten ifølge følgende trekk:

a) at konsentrasjonen av alle enzyminduserende kjemikalier i en første del av prøven bestemmes, b) at en andre del av prøven bringes i kontakt med antistoffer til kjemikalien til dannelse av komplekser av kjemikalien

og antistoffene,

c) at konsentrasjonen av alle enzyminduserende kjemikalier i cellen eller cellene bestemmes i den andre prøven, samt d) at konsentrasjonen av kjemikalien i prøven bestemmes ved at konsentrasjonene av kjemikaliene bestemt i trinn c) substraheres fra konsentrasjonen av kjemikaliene bestemt i trinn a) hvorved konsentrasjonene av kjemikaliene i den første og den andre del bestemmes ved at delene bringes i kontakt med celler som inneholder et induserbart enzym, den prosentvise induksjon av enzymet i cellen bestemmes, den prosentvise induksjon sammenlignes med en standardkurve for prosentvis induksjon av enzymet i cellene i et område av kjente konsentrasjoner av kjemikalien og konsentrasjonene ekstrapoleres fra standardkurven.

Prøven kan være ethvert materiale, såsom matvare, jord, grunnvann eller væsker eller vev, som det er mistanke om at er forurenset med én eller flere enzyminduserende kjemikalier. Prøven fremstilles for analyse på kjent måte, slik at den endelige prøve som skal testes ved den biologiske metode ifølge oppfinnelsen er i væskeform og den enzyminduserende kjemikalie er løst i prøven. F.eks. kan materialet som inneholder TCDD frem stilles for analyse ved de fremgangsmåter som er beskrevet i Environmental Protection Agencys publikasjon med tittelen National Dioxin Study, (EPA/600/3-85/019 fra april 1985).

En av del tilberedningen av en prøve som inneholder en kjemikalie, såsom TCDD, omfatter tynning inntil TCDD er i løs-ning. Dette inntrer ved en konsentrasjon på ca. 200 deler per trillion for TCDD.

Når prøven er blitt fremstilt tas en del av prøven slik at konsentrasjonen av den enzyminduserende kjemikalie i prøven kan bestemmes ved å bringe prøven i kontakt med indikatorcellene. I dette trinn bestemmes faktisk konsentrasjonen av alle kjemikalier i prøven som induserer det spesielle enzym (eller klasser enzymer) i indikatorcellene). Dersom f.eks. den prosentvise induksjon av arylhydrokarbonhydroksylase måles kan prøven inneholde mange beslektede forbindelser som vil indusere denne familie av enzymer. Men dersom bare en kjemikalie skal påvises, såsom TCDD, vil konsentrasjonen av denne kjemikalie alene ikke kunne bestemmes i dette trinn. På dette punkt bestemmes således konsentrasjonen av alle kjemikaliene i den første del av prøven ved at denne prøvedel bringes i kontakt med indikatorcellene og den prosentvise induksjon i enzymet i cellene bestemmes.

Den prosentvise induksjon sammenlignes deretter med en standardkurve av de prosentvise induksjoner av enzymet i cellene ved hjelp av en rekke kjente konsentrasjoner av kjemikalien som skal påvises og måles. Ved ekstrapolering fra standardkurven kan den totale konsentrasjon av kjemikaliene som induserer det spesielle enzym bestemmes. Dette betyr at den første del vil inneholde en konsentrasjon av enzyminduserende kjemikalier som er like den konsentrasjonen av den kjente kjemikalie som gir samme prosentvise induksjon på standardkurven.

En andre del av prøven blandes deretter med antistoffer til kjemikalien som skal påvises og måles. Dette muliggjør dannelse av komplekser mellom antistoffene og kjemikalien. Når kjemikalien bindes til antistoffene kan den ikke indusere enzymet i cellene. Den prosentvise induksjon av enzymet i indikatorcellene i denne del måles deretter og sammenlignes med standardkurven. Konsentrasjonen av enzyminduserende kjemikalier bestemmes igjen. Dette er konsentrasjonen av beslektede, men forstyrrende kjemikaler. Dersom der ikke foreligger slike kjemikalier vil konsentrasjonen i dette trinn være 0.

Konsentrasjonen av kjemikalien som skal påvises og måles bestemmes deretter ved at konsentrasjonene av kjemikaliene i den andre del, slik disse er bestemt i det tredje trinn substraheres fra konsentrasjonene av kjemikaliene i den første del slik disse er bestemt i det første trinn.

Frembringelsen av standardkurve av de prosentvise induksjoner av kjente konsentrasjoner av kjemikaliene utføres på kjent måte. Slik standardisering kan gjøres før, under eller etter undersøkelsen av prøven som inneholder den ukjente kjemikalie.

Nevnte første og andre deler av prøven, samt prøvene som anvendes ved frembringelsen av standardkurven får være i kontakt med indikatorcellene i tilstrekkelig tid for enzyminduksjon. Generelt er dette fra 4 til 20 timer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes på enhver enzyminduserende kjemikalie. En enzyminduserende kjemikalie er en kjemikalie som når den samvirker med en levende celle forårsaker at cellen ved én eller flere mekanismer frembringer et høyere nivå av ett eller flere celleenzymer. I en foretrukket ut-førelsesform er kjemikaliene slike kjemikalier som induserer alkyl- eller arylhydrokarbonhydroksylase (AHH). Disse er vanligvis alkyl- eller arylhydrokarboner som inkluderer de halogenerte dibenzodioksiner, dibenzofuraner, bifenyler, azyoksybenzener samt bifenylener. Fortrinnsvis er de AHH-induserende kjemikalier som påvises og måles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen halogenerte dibenzodioksiner eller polyklorerte bifenyler. Kjemikalien er mest foretrukket 2,3,7,8-tetraklordibenzo-p-dioksin (TCDD). Det skal bemerkes at fremgangsmåten kan benyttes til påvisning av mer enn en enzyminduserende kjemikalie i en prøve ved å anvende antistoffer til hver kjemikalie som skal påvises.

Enhver levende celle som er i stand til enzyminduksjon ved hjelp av en kjemikalie som skal påvises og måles kan anvendes som indikatorcelle. Generelt vil slike celler være pattedyrceller eller andre dyreceller som er i stand til å vokse i kultur og i stand til effektiv enzyminduksjon. For AHH-induksjon foretrekkes leverceller. Særlig foretrukket er rottelevertumorcellelinjen H4IIE, som er kommersielt tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. 20852 som cellelinje CRL 1548, og som ble rediponert 21. august 1986 under ATCC aksesjonsnummeret CRL 9185. For mer detal-jert beskrivelse av denne cellelinje henvises til Bradlaw og Casterlinje, J. Assoc. Off. Anal. Chem., Vol 62, 1979, p. 904-916.

Induksjonen av enzymet eller gruppen av beslektede enzymer, såsom AHH, kan måles ved metoder som er kjente på området. Enhver av AHH-enzymene kan også måles. Fortrinnsvis måles induksjonen ved måling av induksjonen av 7-etoksyresorufin-O-deetylase (EROD), som på sin side kan måles ved omdanning av 7-etoksyre-soruf in (ER) til resorufin, som katalyseres av EROD. Denne reaksjon kan måles spektrometrisk ved 572 nm ved metoden til Klotz et al., Anal. Bioch., Vol 140, 1984, p. 138-145, eller spektro-fluorimetrisk ved metoden til Prough et al., Meth. Enzymol., Vol 52, 1978, p. 372-377. En sidereaksjon, reduksjon av resorufin med kinonoksidoreduktase, inhiberes ved tilsetning av 10 mikromolar dikumarol til reaksjonsblandingen, slik som beskrevet av Nims et al., Arch. Bioch. Biophys., Vol 229, 1984, p. 459-465. Som nevnt ovenfor måles induksjonen etter at prøven har vært i kontakt med cellene i fra 4 til 24 timer. Den ovennevnte cellelinje H4IIE har lave basalnivåer av EROD, men EROD induseres i konsentrasjoner på noen nanomolar av kjemikalier som TCDD, noe som er en av årsakene til at denne cellelinje er særlig foretrukket.

Antistoffene som anvendes ved fremgangsmåten kan være polyklonale eller monoklonale antistoffer. Polyklonale antistoffer kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjent på området, se Albro et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., Vol 50, 1979, p. 137, og Albro et al., Meth. Enzymol., (J. J. Langone og H. van Vunakis, eds.), Vol 84, p. 619-629 (Academic Press, New York, 1982). Polyklonale antistoffer foretrekkes dersom det skal påvises en klasse eller gruppe av AHH-induserende kjemikalier. Monoklonale antistoffer foretrekkes når en spesiell kjemikalie skal påvises, på grunn av deres større spesifisitet. I tillegg vil monoklonale antistoffer generelt foretrekkes på grunn av at tilgjengeligheten er mer konstant og pålitelig, og de er lettvintere å standardi-sere .

Fremstillingen av monoklonale antistoffer til AHH-induserende kjemikalier nødvendiggjør spesialmetoder for å overvinne spesielle problemer. Slike antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent fra US-patentsøknad 899.163 av 22. august 1986.

Oppfinnelsen vil bli nærmere belyst i det etterfølgende eksempel.

Eksempel

Antistoffbasert biologisk metode for TCDD

Materialer

Følgende kjemikalier ble anvendt i den biologiske metode: TCDD (Kor Isotopes, Cambridge, MA, levert 1 mg/ml i anisol), di-metylsulfoksid (DMSO), etoksyresorufin (ETR) (Molecular Probes, Inc., Junction City, OR, katalog R-352), dikumarol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, katalog M 1390, som 3,3'-metylen-bis-(4-hydroksykumarin).

Følgende biologiske reagenser ble anvendt: Williams Medium E (WME, Gibco, Grand Island, NY) levert med L-glutamin (2mM) samt HEPES-buffer med pH 7,3-7,4 (10 mM) og 10% serum fra storféfoster (FBS, GIBCO), som ble betegnet komplett WME, H4IIE rottelever-tumorceller (J. Assoc. Off. Anal. Chem., Vol 62, 1979, p. 904, Tox. Let., Vol 13, 1982, p. 87), tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, som cellelinje CRL 1548 er cellelinje CRL 9185, samt Tris (0,05M) - sukrose (0,2M) buffer med ph 7,6-7,8, betegnet Tris-sukrose.

Følgende utstyr ble anvendt for utførelse av den biologiske metode: Bio-Tek EIA leser, modell 310, utstyrt med 570 nM filter, of vevkulturskåler med 96 brønner med brønnene i 12 rekker med 8 brønner i hver rekke (Falcon nr. 3072).

Fremgangsmåte

Første dag ble H4lIE-celler fra en kultur i log-vektfase anbrakt i en plate med 9 6 brønner i et antall pa 5 x 10 4 eller pr. brønn i 250 mikroliter komplett WME. Neste dag ble det i hver brønn igjen anbrakt 270 mikroliter komplett WME. Tredje dag ble det i hver brønn anbrakt medium inneholdende TCDD i konsentrasjon på fra 10"<8>M til 10<_16>M.

Tynningene av TCDD og behandling av cellene ble utført på følgende måte: Først ble en prøve av TCDD-materialet (100 mikrogram pr. milliliter anisol) tynnet til 3200 nanogram pr. milliliter i DMSO. På dette tidspunkt var konsentrasjonen av anisol 0,32% og av DMSO 99,68%. TCDD-løsningen ble deretter tynnet til 32 nanogram pr. milliliter i komplett WME (ca. 10 M). Løsnings-middel-sluttkonsentrasjoner: anisol = 0,00329%, DMSO = 0,9968%. Cellene som skulle behandles med TCDD-standarder befant seg i rekkene A-H, kolonnene 2-4 og i rekke A kolonner 5-7 i platen med 96 brønner (se fig. 1 som viser et skjematisk riss av en mikro-— 18

literplate). 30 mikroliter TCDD, 10 M, ble tilsatt til cellene i brønnene A 2-4 som allerede inneholdt 270 mikroliter komplett WME. TCDD-konsentrasjonen i disse brønner var 10 — 8.30 mikroliter fra rekke A (3-5) ble overført til rekke B (3-5), og løsningen ble blandet med en pipette for å sikre fullstendig blanding. Dette var en fortynning på 1:10, noe som resulterte i en molar konsentrasjon av TCDD i B (2-4) på 10 — 9. 30 mikroliter fra B (2-4) ble overført til C (2-4). Samme overføringsmønster ble fortsatt gjennom rekke H og deretter til A (5-7). I kontroll-brønner ble det bare anbrakt løsningsmiddel, som ble plassert i B (5-7). Ukjente prøver i løsningsmidler ble tynnet for å bringe løsningsmiddelkonsentrasjonen ned til 0,1% eller mindre, og løsningsmiddelkontrollprøver, som inneholdt de samme konsentrasjoner av løsningsmiddel som prøvene, men uten TCDD, ble også testet. Ukjente prøver ble testet i minst 4 forskjellige serie-tynninger, fremstilt som beskrevet ovenfor når det gjaldt stan-dardene .

Cellene ble inkubert i 24 timer.

Den fjerde dag ble mediet fjernet, og cellene ble vasket to ganger med serumfritt WME, en gang med tris-sukrose og deretter tilført tris-sukrose igjen supplert med 10 mikromolar dikumoral og 3,26 mikrogram pr. milliliter etoksyresorufin (ETR). Dikumo-ralforrådsløsningen inneholdt 3700 mikrogram pr. milliliter i 0,IN NaOH, og ble deretter tynnet til 1:1100 i tris-sukrose til en sluttkonsentrasjon på 10 mikromolar. ETR-forrådsløsningen inneholdt 652 mikrogram pr. milliliter i etanol. 5 mikroliter pr. ml tris-sukrose ble tilsatt.

Brønnene A-I - H-l tjente som bakgrunnskontroller og ble derfor ikke tilført ETR. De inneholdt bare dikumarol i tris-sukrose .

Platen ble plassert i Bio-Tek-leseren med 570 nm filter, og satt på avlesning i 30 minutter. Blindprøver var A-I - H-l.

Gjennomsnittlig optisk tetthet ved 570 nm for hver tynning av TCDD eller ukjent prøve ble beregnet på tidspunkt 0 og igjen etter 1 time. Differansen, betegnet delta-optisk tetthet, ble registrert.

Data fra de kjente doser av TCDD ble benyttet for å frembringe en kurve hvorav TCDD-konsentrasjonene ble beregnet. Disse data ble omdannet til en prosentvis AHH-induksjon for opptegning, slik som vist i fig. 2 (lukkede sirkler) hvor den faste linje representerer den prosentvise induksjon av 7-etoksy-resorufin-O-deetylase (EROD) med forskjellige konsentrasjoner av 2,3,7,8-tetraklor-dibenzo-p-dioksin (TCDD). Den stiplede linje representerer samme dosereaksjon utført i nærvær i av ett mikrogram pr. milliliter av anti-TCDD-antistoff.

For å bekrefte spesifisiteten i den biologiske metode med TCDD ble følgende tillegg gjort til fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor: Behandlingen av celler med TCDD var den samme med unntagelse av at for standardprøver og ukjente prøver ble det utført et andre sett behandlinger, hvorved tynningene av TCDD eller ukjente prøver ble utført med et medium som inneholdt polyklonale antistoff-TCDD-antistoffer fremstilt i kaniner slik som beskrevet av Albro et al., Methods in Enzymology, Vol 84, 1982, p. 619-628, Albro et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., Vol 50, 1979, p. 137-146. Konsentrasjonen av det anvendte antistoff var den konsentrasjon som forårsaket minst 50% minskning av EROD-induksjon med TCDD i en konsentrasjon på o 10 —9M, bestemt i kvali-tetsgarantiforsøk. Kvalitetsgarantiforsøk utført ved bestemmelse av den antistoffbevirkede minskning i EROD-induksjon med 10 -9M TCDD for atskillige konsentrasjoner antistoff.

Resultater

Fig. 2 viser et diagram av forsøksdata for to standardkurver, en utført med TCDD alene (lukkede sirkler) og en utført med TCDD pluss polyklonalt anti-TCDD-antistoff (åpne sirkler). Ved en TCDD-konsentrasjon på 100 nM var der ingen forskjell mellom de to kurver, noe som indikerte at der ikke var mer TCDD enn det som kunne nøytraliseres ved denne spesielle konsentrasjon av anti-TCDD-antistoff. Men ved en TCDD-konsentrasjon på 0,1 nM ble det iaktatt nær maksimal induksjon av AHH i de antistoff-ube-handlede celler, mens de anti-TCDD-behandlede celler viste fullstendig inhibering av AHH-induksjon. Dette sistnevnte resultat indikerte at hele AHH-induksjonen skyldtes TCDD. Tynninger av ehukjent prøve utført med og uten anti-TCDD-antistoff kan sammenlignes med disse standardkurver for å bekrefte identiteten av det induserende stoff (f.eks. TCDD), og for å bestemme dens konsentrasjon nøyaktig, idet antistoffet vil bindes bare til en kjemikalie (f.eks. TCDD) og ikke påvirke EROD-induksjon med andre forbindelser i prøven. Dersom således all induksjon av EROD elimi-neres i nærvær av et anti-TCDD-antistoff kan enhver induksjon iaktatt i fravær av antistoff henføres til TCDD. Dessuten indikerer delvis minskning av EROD-induksjon med et anti-TCDD-anti-stof f nærvær av noe TCDD i prøven. Denne forskjell i induksjon for prøve med og uten antistoff kan sammenlignes med en til-svarende forskjell på standardkurven for å fastslå konsentrasjonen av TCDD i prøven. Endelig indikerer ingen forskjell i induksjon at prøven ikke inneholder TCDD.

Den biologiske metode i eksemplet antas å være hurtigere, billigere og sikrere enn kjente metoder, samt mer ømfintlig og spesifikk for vedkommende toksiske kjemikalie.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til bestemmelse av konsentrasjonen av enzyminduserende kjemikalier i en prøve, karakterisert ved a) at konsentrasjonen av alle enzyminduserende kjemikalier i en første del av prøven bestemmes, b) at en andre del av prøven bringes i kontakt med antistoffer til den enzyminduserende kjemikalie til dannelse av komplekser av kjemikalien og antistoffene, c) at konsentrasjonen av alle enzyminduserende kjemikalier som ikke har dannet komplekser bestemmes i den andre prøven, samt d) at konsentrasjonen av kjemikalien i prøven bestemmes ved at konsentrasjonene av kjemikaliene bestemt i trinn c) substraheres fra konsentrasjonen av kjemikaliene bestemt i trinn a) hvorved konsentrasjonene av kjemikaliene i den første og den andre del bestemmes ved at delene bringes i kontakt med celler som inneholder et induserbart enzym, den prosentvise induksjon av enzymet i cellen bestemmes, den prosentvise induksjon sammenlignes med en standardkurve for prosentvis induksjon av enzymet i cellene i et område av kjente konsentrasjoner av kjemikalien og konsentrasjonene ekstrapoleres fra standardkurven.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den enzyminduserende kjemikalie er en kjemikalie som induserer en aryl- eller alkylhydrokarbonhydroksylase (AHH), og at det induserbare enzym er arylhydrokarbonhydroksylase eller alkylhydrokarbonhydroksylase.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2, karakterisert ved at den AHH-induserende kjemikalie er et dibenzodioksin, 2,3,7,8-tetraklor-dibenzo-p-dioksin (TCDD) eller en polyklorert bifenyl.

4. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-3, karakterisert ved at cellene er rottelever-tumorceller.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 4, karakterisert ved at rottelevertumorcellene omfatter cellelinjen H4IIE.

6. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 2-5, karakterisert ved at det induserbare enzym er 7-etoksyresorufin-O-deetylase (EROD).

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 6, karakterisert ved at bestemmelse av induksjonen av EROD omfatter måling av 7-etoksyresorufin til resorufin med hjelp av EROD.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 7, karakterisert ved at målingen omfatter spektrofotometrisk bestemmelse av konsentrasjonen av resorufin.

9. Fremgangsmåte til bestemmelse av konsentrasjonen av en aryl- eller alkylhydrokarbonhydroksylase-(AHH)-induserende kjemikalie i en prøve, karakterisert ved a) at en serie kjente konsentrasjoner av den AHH-induserende kjemikalie bringes i kontakt med celler som inneholder AHH, b) at den prosentvise induksjon av AHH i cellene bestemmes ved hver av de kjente konsentrasjoner av kjemikalien, c) at en første del av prøven bringes i kontakt med prøven og med cellene, d) at den prosentvise induksjon av AHH forårsaket av den første del bestemmes, e) at den totale konsentrasjon av AHH-induserende kjemikalier i prøven bestemmes ved sammenligning av den prosentvise induksjon av AHH forårsaket av den første del med de prosentvise induksjoner av AHH i cellene forårsaket av de kjente konsentrasjoner av den AHH-induserende kjemikalie, f) at en andre del av prøven bringes i kontakt med antistoffer til den AHH-induserende kjemikalie, g) at trinnene c)-e) gjentas med den andre del av prøven, samt h) at konsentrasjonen av den AHH-induserende kjemikalie i prøven bestemmes ved at konsentrasjonen av AHH-induserende kjemikalier bestemt i trinn g) substraheres fra konsentrasjonen av AHH-induserende kjemikalier bestemt i trinn e).

10. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-9, karakterisert ved at antistoffene er monoklonale antistoffer.