NO841567L - Fremgangsmaate til fremstilling av haploide froe og dupolider og homozygote planteslekter av disse - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av haploide frø, duploider og homozygote plantelinjer av disse.

Det er kjent at haploide og duploide samt polyploide angiospermer opptrer spontant. Forekomst av haploide angiospermer er registrert i minst 71 arter som er representative for 39 slekter i 16 forskjellige familier. Kimber et al., Bot. Rev., Vol 29, 1963, p. 480-531. Men den spontane opprinnelse

av haploider enten det er monoembryo eller polyembryo av parteno-gen eller androgen opprinnelse kan ikke forutsies og opptrer med meget liten hyppighet. I et forsøk på å øke deres hyppighet er det blitt utviklet mange metoder til innføring av haploiditet i angiospermer. Eksempler på slike metoder omfatter kastrering og isolering, forsinket bestøvning, pseudogami ved anvendelse av aborterende pollen eller fjernhybridisering, semigami, cyto-plasmagene vekselvirkninger ved kromosomeliminering og alloplasma, geneutvelgelsesmetoder, dyrkingsmetoder såsom støvknoppdyrking, pollendyrking og protoplast- eller vevdyrking av haploider samt behandlinger med fysikalske midler, såsom traumatiske skader, temperatursjokk, bestråling med røntgenstråler, gammastråler, radioisotroper og ultrafiolett lys, samt kjemiske midler. Eksempler på slike kjemikalier omfatter colchicin, maleinhydrazid, belbitan, p-fluorfenylalanin, toluidinblått, nitrogenoksyd og kloramfenikol. En oversikt over disse metoder er gitt av Z. Raghavan, Experimental Embryogenesis in Vascular Plants, kapittel 15, Academic Press, 1976 og av J. Lacadena, Spontaneous and Induced Parthenogensis and Androgensis som er et kapittel i Haploids in Higher Plants : Advances and Potential med K.J.

Kasha som utgiver, University of Guelph, Ontario, 1974.

Men alle disse innføringsmetoder er meget trivielle, uforutsibare og resulterer for det meste i meget lav hyppighet av haploider fra ethvert råmateriale. Selv om dyrkingsmetodene kan muliggjøre en større hyppighet er de ikke egnet for mange arter og er i alle tilfeller nokså trivielle, krever avanserte serier av kulturer for utvikling av en embryo og senere en plante og kan nødvendiggjøre stimulering for dublering av haploidet. Noen få av disse metoder, og ingen hvor det anvendes et kjemisk middel, har resultert i tilstrekkelig eller ensartet opptreden av haploider eller duploider slik at disse kan anvendes lettvint ved utviklingen av planteforedlingsmaterialer eller foredlingsprogrammer.

Dessuten er det iakttatt unormale hvetefrø som har haploid-egenskaper, etter behandlingen av hveteplanter med et kjemisk hybridiseringsmiddel. Embryoer som er isolert fra disse frø ble dyrket til småplanter på en kultur som ble anvendt for vekst av haploide planter fra androgenetiske embryoer.

Det har vist seg at haploide angiospermer kan oppnås ved behandling av planter med et apogamisk middel før blomsten er fullt utsprunget og deretter la plantene utvikle frø hvoriblant det oppsamles slike frø som har egenskapene til haploid frø før abort og holde frøet under betingelser som bevarer levedyktigheten til embryo i frøet. En duploid fremstilles i et miljø som fremmer og bibeholder embryoets vekst og dets utvikling til en duploid plante. Fullføringen av dubleringsprosessen iakttas i de fleste av de blomster som setter frø. Disse frø er genetisk stabile, og hvert frø som er dannet representerer en enkelt frø-kilde for en homozygot linje.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse er det iakttatt at tidspunktet for^tilførsel av og doseringen av et kjemisk apogamisk middel er viktig for å oppnå haploider og duploider og for å muliggjøre fremstilling av dem i store antall. Den apogamiske metode ifølge den foreliggende oppfinnelse er anvendbar ved planteforedling for å oppnå genetisk stabile linjer, hvorved behovet for innavl av plantelinjer minskes eller elimineres. Frembringelsen av en homozygot plante kan oppnås i en generasjon. Det er således en nyttig metode for utvikling av nye varieteter og kimplasmaer. Som følge av det store antall duploider som kan fremstilles ifølge oppfinnelsen er metoden dessuten anvendbar i utviklingsfasen av foredlingsprogrammer på grunn av at den vil gjøre det mulig for en foredler å fiksere det genetiske system av individuelle kjønnsceller i testbar, reproduserbar form på ethvert stadium i et foredlingsprogram. I den grad duploide planter representerer tilfeldige kjønnsceller fra sitt kilde-materiale kan dessuten metoden være anvendbar i arvlighetsstu-dier på grunn av at høyere kjønnsceller vil ha samme mulighet som andre kjønnsceller til å inkorporeres i en prøve av kjønns-cellepopulasjon frembrakt via haploider. Dessuten kan metoden være anvendbar ved bestemmelsen av fylogene slektsskap og genetiske forhold.

De etterfølgende termer er definert på den nedenfor angitte måte: "Haploid" er en organisme som har et kjønnscellekromosom-komplement (n). Den omfatter monoploider (x), diploider (2x) og polyploider. Haploiden kan være av hankjønns- og/eller hunkjønns-opprinnelse.

"Duploid" er en organisme hvis kjønnscellekromosomkomple-ment er dublert (2n).

"Apogami" er reproduksjon av en angiosperm hvor kjønns-organene eller beslektede strukturer deltar, men hvor embryoer dannes uten den normale forening av han- og hunkjønnsceller til dannelse av en zygote. Den nøyaktige opprinnelse for de apogame haploider som dannes ifølge den foreliggende oppfinnelse er ikke kjent og er ikke kritisk for oppfinnelsen. F.eks. kan de apogame haploider ha sin opprinnelse fra partenogenese, androgenese, apogami, semigami eller ved kromosomeliminering etter sammen-smeltingen av han- og hunkjønnscellene.

De angiosperme planter som behandles for å danne haploidene og duploidene kan være enten monocotyledoner eller dicotyledoner som er enten homozygote'eller heterozygote. Plantene kan være monoploide, diploide eller polyploide. Oppfinnelsen er særlig anvendbar for kommersielt verdifulle avlinger og frø, særlig kornslag som hvete,' bygg, mais, ris, durra, hirse, havre og rug, samt forplanter som vanlig ryegress, vanlig gress, svingel, timotei og hundegress.

Det apogamiske middel er et kjemikalium som har evnen til

å frembringe apogami i angiospermer. Det kan være ett eller flere av følgende: okso- og tiopyridaziner, såsom de som er kjent fra europeisk patentsøknad 81304487, US-patentskrift 4.345.934 samt japansk patentsøknad 81/156321 og europeisk patentsøknad 83301057, 4-okso-nikotinater (pyrid-4-oner samt tioanaloger), slik som de som er kjent fra europeisk patentsøknad 81302079, US-patentskrifter 4.115.101, 4.051.142, 3.503.986, 4.028.084

og 4.238.220, samt pyrimidoner som de som er kjent fra US-patentskrift 4.147.528, som alle er plantevekstregulatorer. Okso- eller tiopyridazinene og de fenylsubstituerte 4-okso(tio)nikotinater foretrekkes. Kjemiske hybridiseringsmidler er foretrukne apogamiske midler selv om slike forbindelser er generelt ineffektive som hybridiserende midler når de anvendes ved eller etter meiose, det foretrukne tidspunkt for tilførsel ved anvendelse som apogamiske midler.

De foretrukne fenylsubstituerte 4-okso(tio)nikotinater

har følgende struktur:

hvor Z er et oksygen- eller svovelatom, R"*" er en, eventuelt substituert, (C1-C6)alkyl eller (C2-Cg)-2 3 4 alkenyl, mens minst en av R , R og R er

("fenyl-

gruppen") hvor

nå° r R 2 er "fenylgruppen" er R et hydrogenatom, en alkylgruppe eller et halogenatom og R<4>er et hydrogenatom, en alkylgruppe eller, uavhengig, "fenylgruppen",

nåo r R 3 er "fenylgruppen" er R<2>en alkylgruppe eller, uavhengig, "fenylgruppen", og R<4>er et hydrogenatom eller en alkylgruppe,

4 2

nar R er "fenylgruppen" er R en, eventuelt substituert, (C^-Cg)alk<y>l<g>ru<p>pe, en (-Cg)alkenylgruppe eller, uavhengig, "fenylgruppen" og R^ er et hydrogenatom, en (C-^-Cg) alkylgruppe eller et halogenatom, og

Y er et hydrogenatom, et agronomisk akseptabelt salt derav eller en alkylgruppe,

X er et hydrogenatom, et halogenatom, en trihalogenmetyl-gruppe, en (C-^-Cg) alkylgruppe, en nitrogruppe, en cyanogruppe eller en (C^-Cg)alkoksygruppe, og

n er et helt tall fra 1 til 3.

Fortrinnsvis er Z et oksygenatom mens R"<*>" er en (C^-C^) alkylgruppe, helst en metyl-, etyl- eller n-propylgruppe,

2 4

enten R eller, hva som er mer foretrukket, R er "fenylgruppen",

idet når R 2 er "fenylgruppen", er R 3 et (C,-C_)alkyl,

4

brom eller mer foretrukket et hydrogenatom, R er et hydrogenatom, et halogenatom eller en (C^-C^)alkylgruppe, mer foretrukket en (C,-C-.) alkylgruppe ,

0 4 2

nar R er "fenylgruppen" er R et hydrogenatom, et halogenatom eller, mer foretrukket, en (C-^-C^) alkylgruppe, R^ er et halogenatom eller, mer foretrukket, et hydrogenatom,

Y er et hydrogenatom, (C^-Cg)alkyl, fortrinnsvis (C^-C^)-alkyl, eller en alkalimetall- eller jordalkalimetallkation,

mer foretrukket et hydrogenatom, en metylgruppe, etylgruppe, eller en natrium- eller kaliumkation,

X er et hydrogenatom, et halogenatom, en trifluormetylgruppe eller en (C^-C^)alkylgruppe, mer foretrukket et hydrogen-, klor-, brom-, fluor- eller jodatom, i 3- og/eller 4-stilling, og n er 1 eller 2.

De mest foretrukne nikotinater er de hvor Z er et oksygen-1 3 2

atom, R en metyl-eller etylgruppe, R et hydrogenatom, R eller, mer foretrukket, R 4 er "fenylgruppen", Y er en natrium-eller kaliumkation, X er et hydrogen-, klor- eller fluoratom i 3- og/ eller 4-stillingen.

Eksempler på slike foretrukne 4-oksonikotinater omfatter: ety1-1,2-dimetyl-6-(4-klorfeny1)-4-oksonikotinat, etyl-1,2-dimetyl-6-fenyl-4-oksoifikotinat og natrium- og kaliumsaltene av: 1- etyl-2-(4-klorfenyl)-6-metyl-4-oksonikotinsyre, l-etyl-2-(3,4-diklorfenyl)-6-mety1-4-oksonikotinsyre, l-ety1-2-(3-klorfenyl)-6-mety1-4-oksonikotinsyre, 1-mety1-2-(3-klorfenyl)-6-mety1-4 - oksonikotinsyre, l-etyl-2-(4-fluorfenyl)-6-mety1-4-oksonikotin-syre , 1-mety1-2-(4-klorfenyl)-6-mety1-4-oksonikotinsyre, 1-etyl-2- (3-fluorfenyl)-6-mety1-4-oksonikotinsyre, l-metyl-2-(3-fluor-fenyl )-6-mety1-4-oksonikotinsyre, 1,2-dimetyl-6-(4-klorfenyl)-4-oksonikotinsyre, l-metyl-2-n-propy1-6-(4-klorfenyl)-4-oksoniko-tinsyre , 1,2-dimetyl-6-(3-klorfenyl)-4-oksonikotinsyre, 1-metyl-2-n-propy1-6-fenyl-4-oksonikotinsyre, l-etyl-2-metyl-6-(4-klor-fenyl)-4-oksonikotinsyre, l-n-propyl-2-metyl-6-fenyl-4-oksoniko-tinsyre , 1,2-dimetyl-6-(4-trifluormetylfenyl)-4-oksonikotinsyre, 1,2-dimetyl-6-(4-fluorfenyl)-4-oksonikotinsyre, 1,2-dimetyl-2-

metyl-6-feny1-4-oksonikotinsyre.

De foretrukne 4-okso- eller tio-pyridaziner har følgende struktur:

hvor Z<1>er et oksygen- eller svovelatom. 0

R<5>er et hydrogenatom, et halogenatom, -CNRR, hvor R og

R hver uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, alkyl substi-0

11 8

tuert med en karbonyl- eller karboksygruppe, -CWR , hvor W er et oksygen- eller svovelatom og R<8>er et hydrogenatom, en alkyl-, aryloksy-, alkoksyalkyl-, alkylhalogen-, alkylhydroksy-, imino-alkyl(-N=alkyl)-, aryl-, alkenyl-, cyklo(C3-Cg)alkyl- eller cykloalkylgruppe, 0

6

R er et hydrogenatom, alkyl, -CA, hvor A er hydrogen,

9 10 alkyl, aralkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio eller -NR R , 9 10 hvor R og R uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, alkyl substituert med en karbonyl- eller karboksygruppe under forut-setning av at R 5 og R 6*^ ikke begge er hydrogenatomer, og nåo r R<5>er et hydrogen- eller halogenatom er R^ 0 " 9 10 -CA', hvor A1 er en alkoksy-, tioalkyl- eller -NR R -gruppe, og R 7 er alkyl, aryl eller aryl substituert med opp til tre substituenter valgt blant halogen, nitro, trihalometyl, (C^-C^)-alkoksyl (C^-C^)alkyl eller cyano,

n er 0, 1, 2 eller 3,

mens hver X' uavhengig er et hydrogenatom, et halogenatom, en trihalogenmetyl-, alkyl-, alkoksy-, cyano- eller nitrogruppe, samt agronomisk akseptable salter derav.

Fortrinnsvis er Z' et oksygenatom, R~" hydrogen, halogen

ff 8 8

eller -CWR , hvor W er et oksygenatom og R er et hydrogenatom,

en (C1-C4 ) alkyl-, (C1~C4 ) alkylhalogen-, (C-^-C^ ) alkylhydroksy-, (C1-C4)alkoksy(C1-C4)alkyl-, (C1-C2 ) f enyl-, (C-L~C4 ) alkenyl- eller imino (C1-C4) alkylgruppe, eller W er svovel og R er en (C-^-C^)-alkylgruppe,

0

R 6 er hydrogen, (C,- C. )alkyl, -CI'<A,>hvor A er (C,-C. )alkyl, (C1-C4 ) alkoksy, ( C-^- C^ ) alkyltio eller -NR<9>R<10>, og når R<5>er hyd-0

6I'

rogen eller halogen er R -CA, hvor A er (C-, - C. ) alkoksy eller

7

(C^-C4)alkyltio, R er en (C^-C4)alkylgruppe, og X' er et hydrogenatom, et halogenatom eller en trifluormetylgruppe i 3- og/ eller 4-stillingene, n er 1 eller 2, samt de agronomiske akseptable salter derav. 0

5 I' 8

Mer foretrukket er Z' et oksygenatom, R er -CWR , hvor

W er et oksygenatom og R g er et hydrogenatom (fortrinnsvis et natrium-, kalium- eller trietanolaminsalt derav), eller en (C^-C4)alkyl (fortrinnsvis en (C^-C2)alkyl)gruppe, R^ er hyd-

O

II

rogen eller -CA<1>, hvor A' er hydroksy eller en (C,-C4)alkoksy

7 i<»

(fortrinnsvis en (C^-C2)alkoksy)gruppe, R er metyl, etyl eller n-propyl og X<1>er et klor-, brom-, fluor- eller jodatom, fortrinnsvis et klor- eller bromatom, i 3- og/eller 4-stillingene,

n er 1 eller 2, samt de agronomisk akseptable salter derav.

Eksempler på foretrukne oksopyridaziner er følgende: propen-1-y1-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-mety1-pyridazin-3-karboksylat,

tiopropyl-1- ( 4 -k luorfenyl) -1, 4-dihydro-4-okso-6-metyl-pyridazin-3-karboksylat,

trietanolamin-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3-kårboksylat,

mety1-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-etylpyridazin-3-karboksylat,

metyl-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-n-propy1-6-metylpyridazin-3-karboksylat,

metyl-l-(4-jodfenyl)-l,4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3-karboksylat,

n-buty1-1-(4-bromfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-metyl-pyridazin-3 -karboksyl at ,

metyl-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-etylpyridazin-5-karboksylat,

metyl-l-(4-klorfenyl)-l,4-dihydro-3-brom-4-okso-6-etyl-pyridazin-5-karboksylat,

metyl-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-acetyl-6-etylpyridazin-3-karboksylat,

natrium- eller kalium-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-acetyl-6-etylpyridazin-3-karboksylat,

natrium- eller kalium-1-(4-trifluormetylfenyl)-1,4-dihydro-4- okso-5-acetyl-6-etylpyridazin-3-karboksylat,

natrium- eller kalium-1-(4-bromfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5- acetyl-6-etylpyridazin-3-karboksylat,

natrium- eller kalium-l-fenyl-1,4-dihydro-4-okso-5-acetyl-6- etylpyridazin-3-karboksylat,

natrium- eller kalium-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-n-propylpyridazin-5-karboksylat,

l-(4-klorfenyl)-l,4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3-karboksylat, natrium- eller kalium-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5- karboksymetyl-6-etylpyridazin-3-karboksylat, natrium- eller kalium-1-(3,4-diklorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-etylpyridazin-3-karboksylat, l-(3,4-diklorfenyl)-l,4-dihydro-4-okso-5-kårboksy-metyl-6- etylpyridazin-3-karboksylsyre, l-(4-klorfenyl)-l,4-dihydro-3,5-dikarboksymetyl-4-okso-6-etylpyridazin,

natrium- eller kalium-1-(4-jodfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-etylpyridazin-3-karboksylat,

1- ( 4-jodf enyl) -1 ,»4-dihydro-3 , 5-dikarboksymetyl-4-okso-6-etylpyridazin,

natrium- eller .kalium-1-(2-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-étylpyridazin-3-karboksylat,

natrium- eller kalium-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5- karboksymetyl-6-n-propylpyridazin-3-karboksylat,

1-(3,4-diklorfenyl)-1,4-dihydro-3,5-dikarboksymetyl-4-okso-6- etylpyridazin,

natrium- eller kalium-1-(4-bromfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-kårboksyrnety1-6-etylpyridazin,

1-(4-bromfenyl)-1,4-dihydro-3,5-dikarboksymetyl-4-okso-6-etylpyridazin,

1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-3,5-dikarboksymetyl-4-okso-6-etylpyridazin.

Generelt er 4-pyridazinonene mer foretrukne som apogamiske midler enn de fenylsubstituerte 4-oksonikotinater.

Slik det er benyttet her menes med betegnelsen "alkyl" uforgrenete og forgrenete alkylgrupper, fortrinnsvis med opp til 4 karbonatomer. Med aryl menes naftyl, substituert naftyl eller, fortrinnsvis, fenyl eller substituert fenyl. Når aryl-gruppen er substituert har den opp til tre substituenter, fortrinnsvis opp til to substituenter, valgt blant halogen, nitro, trihalogenmetyl, (C-^-C^ ) alkoksy, (C-^-C^alkyl samt cyano.

Idet forbindelsene som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholder både sure og basiske funksjonelle grupper menes med "agronomisk akseptable salter" både salter av karboksyl-gruppen, såsom alkalimetall-, jordalkalimetall-, eller overgangs-metall-, ammonium- eller substituerte ammoniumgrupper samt syre-addisjonssalter som hydroklorid, hydrobromid, sulfat, nitrat, perklorat, acetat, oksalat og liknende. Representative metall-saltkationer omfatter alkalimetallkationer som foretrekkes, såsom natrium, kalium, litium eller liknende, jordalkalimetall-kationer som kalsium, magnesium, barium, strontium eller liknende, samt tungmetallkationer som sink, mangan, kobber-II, kobber-I, jern-III, jern-II, titan, aluminium og liknende.

Eksempler på ammoniumsalter er de med formelen

hvor hver av R'^, R"^, R"^ og R"^ er et hydrogenatom, en hydroksy-gruppe , en (C^-C4 ) alkoksygruppe, en (C^-C2q)alkylgruppe, en (C^-Cg)alkenylgrup^e, en (C^-Cg)alkynylgruppe, en (C2-Cg)hyd-roksyalkylgruppe, en (C2-Cg ) alkoksyalkylgruppe, en (C2~Cg)-aminoalkylgruppe, en (C2~C6)halogenalkylgruppe, en substituert eller usubstituert fenylgruppe, en substituert eller usubstituert fenylalkylgruppe som har opp til 4 karbonatomer i alkyl-delen, en amino- eller alkylsubstituert aminogruppe, eller to av gruppene R , R , R og R kan sammen med nitrogenatomet danne en heterocyklisk 5- eller 6-ring som eventuelt har ett ytterligere oksygen-, nitrogen- eller svovelheterogenatom i ringen, og fortrinnsvis et mettet, såsom en piperidin-, morfolin-, pyrrolidin- eller piperazinring eller liknende, eller tre

11 12 „13 „14

av gruppene R , R , R og R kan sammen med nitrogenatomet danne en heterocyklisk 5- eller 6-ring som eventuelt er substituert, såsom pyrrol, pyridin, nikotin eller histamin. Når am-moniumgruppen inneholder en substituert alkyl-, substituert fenyl- eller substituert fenylalkylgruppe vil substituentene generelt være halogenatom, (C^-Cg)alkyl, (C-^-C^ ) alkoksy, hydroksy, nitro, trifluormetyl, cyano, amino, (C^-C^)alkyltio og liknende. De substituerte fenylgrupper inneholder fortrinnsvis opp til to slike substituenter. Eksempler på ammoniumkationer er ammonium, dimetylammonium-2-etylheksylammonium, bis(2-hydroksyetyl)ammonium, tert-oktylammonium, 2-hydroksyetylammonium, mor-folinium, piperidinium, 2-fenetylammonium, 2-metylbenzylammonium, n-heksylammonium, trietylammonium, trimetylammonium, tri(n-butyl)-ammonium, metoksyetylammonium, diisopropylammonium, pyridinium, diallylammonium, pyrazolium, propargylammonium, dimetylhydra-zinium, hydroksyammonium, metoksyammonium, dodecylammonium, oktadecylammonium, 4-diklorfenylammonium, 4-nitrobenzylammonium, benzyltrimetylammonium, 2-hydroksyetyldimetyloktadecylammonium, 2-hydroksyetyldietyloktylammoniu, decyltrimetylammonium, heksyl-trietylammonium, 4-metylbenzyltrimetylammonium og liknende.

Arten plante som behandles vil bestemme det eller de spesielle apogamiske midler som kan anvendes. F.eks. kan et apogamisk middel som kan forårsake opptreden av apogami i vanlig hvete ikke ha en apogamisk virkning på mais eller soyabønner. Foretrukne apogamiske midler for fremstilling av haploider av Graminaeae planter, særlig små korn som hvete, bygg, havre, rug etc. omfatter følgende f og fortrinnsvis, deres vannløselige salter: 1-(4-klorfenyl)-1, 4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3-karboksylsyre, 1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-etylpyridazin-3-Jc årbok syl syre, l-(4-klorfenyl)-l, 4 - di hy dr o-4-okso-5-propionyl-6-metylpyridazin-3-karboksylsyre, l-ety1-6-metyl-2-(4-klorfenyl)-4-oksonikotinsyre, l-etyl-6-metyl-2-(3,4-diklorfenyl)-4-oksonikotinsyre, 1-(3,4-diklorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-metylpyridazin og 1-fenyl-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-etylpyridazin samt metyl- eller etyl-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-etylpyridazin-5-karboksylat og metyl- eller etyl-1-(4-bromfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-etyl-pyridazin-5-karboksylat. Disse forbindelser er særlig anvendbare for å frembringe haploider og deres etterfølgende duploider i hvete.

Ved anvendelsen av det apogamiske middel produseres det haploide frø vanligvis ved en fremgangsmåte hvor et materiale som inneholder det apogamiske middel og vanligvis en agronomisk akseptabel bærer for dette anbringes i en beholder eller en meka-nisk fordelingsanordning. Den således chargerte beholder eller mekaniske fordelingsanordning anvendes deretter for påføring av det apogamiske middel på planten, f.eks. ved anbringelse av et støv eller en væskedusj på plantenes blader.

Det apogamiske middel påføres på en plante før gjødsling. Vanligvis påføres det på et tidspunkt i plantens vekst som er

fra begynnende blomstring til utsprunget blomst (pollenavgivelse). Det foretrekkes at det påføres omtrent fra meiose til ca. utsprunget blomst. Dersom det apogamiske middel påføres før begynnende blomstring er midlet forholdsvis mindre aktivt og kan forårsake skade på planten. Dersom midlet påføres etter at blomstene er utsprunget dannes det ikke haploider.

Det apogamiske middel påføres i en mengde som er tilstrekkelig til å forårsake apogami og dannelse av haploider. Ofte er egnete påføringsmengder fra 0,01 til 22 kg pr. hektar, fortrinnsvis fra 0,03 til 11 kg og helst fra 0,1 til 6 kg pr. hektar. På-føringsmengden vil variere avhengig av det spesielle apogamiske middel som anvendes, de spesielle plantearter som behandles og vekststadiet ved behandlingen. Jo senere vekststadiet, opp til utsprunget blomst, er, desto mindre apogamisk middel kreves generelt .

For å tilføre apogamiske midler til planter kan disse til-føres på bladene, til jorden eller, når det gjelder risavlinger, på vannflaten. Påføring på bladene foretrekkes.

Generelt er en .eller annen form for stimulering, f.eks. pollen, nyttig når'det gjelder å bevirke at planten produserer frø etter behandling med det apogamiske middel. Dersom det apogamiske middel tilføres før meiose inntreffer er pollen fra en annen plante anvendbar for stimulering av planten til å fort-sette dens reproduktive syklus og danne frø. Dersom det apogamiske middel tilføres etter meiose og planten er selvbestøvende er vanligvis dens eget pollen tilstrekkelig til å stimulere frø-dannelse.

Det apogamiske frø identifiseres ved hjelp av karakteristika som er de samme som for de spesifikke arter av haploide frø som opptrer i naturen eller bibringes på annen måte. Slike karak teristika omfatter f.eks. morfologiske karakteristika og genetiske markeringer. F.eks. er det apogamiske frø av vanlig hvete flatere og mindre, inneholder mindre eller ingen endospermer enn normalt frø som er dannet ved seksuell forplantning. I de tilfeller hvor det haploide frø er vanskelig å identifisere ved hjelp av morfologiske karakteristika kan atskillelse utføres ved anvendelse av genetiske markører, f.eks. på frø- eller frø-plantestadier eller ved floteringsmetoder, f.eks. som beskrevet av J. Lacadena, "Spontaneous and Induced Parthenogenesis and Androgenesis" i K. J. Kasha, Haploids in Higher Plants: Advances and Potential, University of Guelph, Ontario, 1974 (se også referansene som er angitt der). Et haploid frø kan også identifiseres ved bestemmelse av dets kromosomtall fra en rottupp tatt fra den embryo eller plante som utvikles fra frøet.

Det apogamiske frø oppsamles før dets abort, mens frøet inneholder et levedyktig embryo. Det oppsamles av den grunn vanligvis i løpet av fire uker etter at blomsten er utsprunget, fortrinnsvis mellom to og tre uker etter at blomsten er utsprunget .

Etter oppsamling behandles det apogamiske frø på en slik måte at levedyktigheten til frøets embryo bibeholdes. Særlig i de tilfeller hvor det haploide frø inneholder mindre endospermer enn et normalt frø av samme art er det ønskelig å tilføre næringsstoffer og andre betingelser som vil fremme og bibeholde veksten av embryo og dens etterfølgende utvikling i en duploid organisme. Dette muliggjør utvikling av en høyere prosentandel av de haploide frø til duploide planter. Anvendelsen av spesielle næringsstoffer og vekstmetoder kan lettvint bestemmes av fagfolk på området og omfatter f.eks. kjente næringsstoffer som en karbonkilde, mine-raler, aminosyrer,'vekstregulatorer etc. og dyrkingsmedier som våtfilterpapir, agar-agar, jord etc. Slike metoder er f.eks. beskrevet i V. Raghavan, Experimental Embryogenesis in Vascular Plants, Academic Press, New York, 1976. Anvendelsen av aseptiske betingelser, fjerning av embryo fra frøet, temperaturregulering, regulering av daglengde og vernalisering eller andre fysikalske betingelser kan også benyttes for å øke veksten og fordoblingen av haploidet. Dersom en embryo som er dannet ved den apogame teknikk ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke spontant for-dobler dens kjønnscelle-kromosomkomplement, eller dersom det er ønskelig å sørge for at fordoblingen er lettvintere og jevnere, kan det på i og for seg kjent måte anvendes et fordoblingsmiddel, f.eks. colchicin.

Ifølge oppfinnelsen er det frembrakt en mulighet til å oppnå homozygotiske linjer innen én generasjon, enten fra en homozygotisk eller en heterozygotisk plante, hvorved tidsrommet som er nødvendig for utviklingen av bakterieplasma, nye sorter og formeringsmaterialet minskes. F.eks. kan nye homozygotiske linjer oppnås ved å underkaste et hybrid fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, velge og oppsamle det haploide frø, dyrke embryo fra det haploide frø under betingelser som fremmer utviklingen av en duploid plante og oppsamling av frøet som produseres av planten. Selv om frøet som dannes fra samme og en annen plante vil variere genetisk, vil hvert frø være genetisk stabilt og representere en eneste frøkilde for homozygotisk linje. Andre sorter, bakterieplasmaer og formeringsmaterialer oppnås deretter ved å velge de planter som har de ønskete karakteristika.

Det apogamiske middel ifølge oppfinnelsen kan tilføres til vekstmediet eller til planter som skal behandles enten som sådant eller, slik det vanligvis gjøres, som en bestanddel i et materiale som også inneholder en agronomisk akseptabel bærer. Med "agronomisk akseptabel bærer" menes enhver substans som kan anvendes for å løse opp, dispergere eller spre en forbindelse i et materiale uten å svekke forbindelsens effektivitet, og som selv ikke har noen vesentlig ugunstig virkning på jorden, utstyr, avling eller agronomisk miljø. Blandinger av de apogamiske midler kan også anvendes i disse materialer. Materialene som inneholder de apogamiske micller kan enten være faste stoffer eller væsker eller løsninger. F.eks. kan de apogamiske midler formuleres som fuktbare pulver, emulgerbare konsentrater, støv, granulere formuleringer, aerosoler eller flytende emulsjons-konsentrater. I slike materialer tynnes de apogamiske midler med en flytende eller fast bærer, og når det er ønskelig til-settes egnete overflateaktive stoffer.

Det er vanligvis ønskelig, særlig ved påføring på bladene, å tilsette hjelpestoffer, såsom fuktemidler, spredningsmidler, dispergeringsmidler, klebemidler og liknende i overensstemmelse med jordbrukspraksis. Eksempler på hjelpestoffer som er vanlig anvendt på området er angitt i publikasjonen fra John W. Mc-Cutcheon, "Detergents and Emulsifiers Annual".

De apogamiske midler kan løses i ethvert egnet løsnings- middel. Eksempler på løsningsmidler som er anvendbare ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse er vann, alkoholer, ketoner, aromatiske hydrokarboner, halogenerte hydrokarboner, dimetylformamid, dioksan og dimetylsulfoksyd. Blandinger av disse løs-ningsmidler kan variere fra 2 til 98 vekt%, mens et foretrukket område er fra 20 til 75%.

Til fremstilling av emulgerbare konsentrater kan de apogamiske midler løses i organiske løsningsmidler, såsom benzen, toluen, xylen, metylnaftalen, maisolje, furunålsolje, o-diklorbenzen, isoforon, cykloheksanon, metyloleat og liknende, eller i blandinger av disse løsningsmidler, sammen med et emulgerings-middel eller et overflateaktivt stoff som muliggjør dispergering i vann. Egnete emulgeringsmidler er f.eks. etylenoksydderivater av alkylfenoler eller langkjedete alkoholer, merkaptaner, kar-boksylsyrer samt reaktive aminer og partielt forestrede polyoler. Løsningsmiddelsløselige sulfater eller sulfonater, såsom jord-alkalimetallsaltene eller aminsaltene av alkylbenzensulfonater samt fettalkoholnatriumsulfater, som har overflateaktive egenskaper, kan anvendes som emulgeringsmidler enten alene eller sammen med et etylenoksydreaksjonsprodukt. Flytende emulsjons-konsentrater formuleres på tilsvarende måte som de emulgerbare konsentrater og inneholder i tillegg til de ovenfor angitte bestanddeler vann og stabiliseringsmiddel, såsom et vannløselig cellulosederivat eller et vannløselig salt av en polyakrylsyre. Konsentrasjonen av den aktive bestanddel i emulgerbare konsentrater er vanligvis fra 10 til 60 vekt% og i flytende emulsjons-konsentrater opp til 75<<>%.

Fuktbare pulvere som er egnet for sprøyting kan fremstilles ved å blande forbindelsen med et findelt fast stoff, såsom leirer, uorganiske'silikater, karbonater og silisiumdioksyder,

og som inneholder fuktemidler, klebemidler og/eller dispergeringsmidler i blandingene. Konsentrasjonen av de aktive bestanddeler

i disse materialer er vanligvis i området fra 20 til 98 vekt%, fortrinnsvis fra 40 til 75%. Et dispergeringsmiddel vil vanligvis utgjøre fra 0,5 til 3 vekt% av materialet, og et fuktemiddel vil vanligvis utgjøre fra 0,1 til 5 vekt% av materialet.

Støv kan fremstilles ved å blande de apogamiske midler ifølge oppfinnelsen med findelte inerte faste stoffer, som kan være organiske eller uorganiske av natur. Materialer som er anvendbare for dette formål er f.eks. botanisk mel, silisiumdioksyd, silikater, karbonater og leire. En hensiktsmessig fremgangsmåte til fremstilling av støv er å spe et fuktbart pulver med en findelt bærer. Det fremstilles vanligvis støvkonsentrater som inneholder fra 20 til 80% av den aktive bestanddel, og disse tynnes deretter til fra 1 til 10 vekt% anvendelseskonsentrasjon.

Granulere materialer kan fremstilles ved å impregnere et fast stoff, såsom valkejord, vermikulitt, malte maiskolber, frøbelger, såsom kli eller andre kornbelger, eller liknende materialer. En løsning av ett eller flere av de apogamiske midler i et flyktig organisk løsningsmiddel kan sprøytes på eller blandes med det granulere faste stoff og løsningsmidlet deretter fjernes ved fordampning. Det granulere materiale kan ha vilkårlig egnet størrelse, hvorved et foretrukket størrelsesområde er fra 16 til 60 mesh. Den aktive forbindelse vil vanligvis utgjøre fra 2 til 15 vekt% av de granulere materialer.

Salter av apogamiske midler kan fremstilles som vandige materialer. Saltet vil typisk utgjøre fra 0,05 til 75 vekt%, fortrinnsvis fra 10 til 50%, av det vandige materiale.

Også disse materialer kan om ønsket tynnes ytterligere med vann før den aktuelle anvendelse. Ved noen anvendelser kan akti-viteten til disse materialer økes ved å tilsette til materialet et hjelpestoff som glyserol, metyletylcellulose, hydroksyetyl-cellulose, polyoksyetylensorbitanmonooleat, polypropylenglykol, polyakrylsyre, polyetylennatriummaleat, polyetylenoksyd eller liknende. Hjelpestoffet vil vanligvis utgjøre fra 0,1 til 5 vekt%, fortrinnsvis fra 0,5 til 2%, av materialet. Disse materialer kan dessuten eventuelt inneholde et agronomisk akseptabelt overflateaktivt stoff.

De apogamiske midler kan påføres som dusjer, såsom konvensjonelle hydrauliske dusjer, luftdusjer samt støv. Ved påføring

i mindre volumer vil det vanligvis anvendes en løsning av forbindelsen. Tynningen og volumet for tilsetningen vil vanligvis avhenge av slike faktorer som typen anvendt utstyr, påførings-metoden, arealet som skal behandles og typen og stadiet av utvikling av avlingen som skal behandles.

I det etterfølgende vil det bli gitt noen eksempler på oppfinnelsen.

Eksempel 1

En vårhvete-varietet, Fielder, ble dyrket under veksthus betingelser. En andel av plantene ble behandlet med kalium-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3-karbonat (apogamisk middel) i doseringsmengder på henholdsvis 0,28, 1,1, 2,2 og 4,4 kg apogamisk middel pr. hektar. (Det apogamiske middel var formulert med 0,25 volum% Triton(^ r)AG-98 hjelpestoff som en lavtskummende dusj. Dette hjelpestoff er en løsning av det ikke-ioniske overflateaktive stoff oktylfenoksypolyetoksyetanol og isopropanol). Det apogamiske middel ble tilført til hveten på forskjellige vekststadier, nærmere bestemt begynnende ledd-dannelse (stadium 6), andre ledd iakttagbart (stadium 7), blad akkurat synlig (stadium 8), bladslirehinne akkurat synlig (stadium 9), blad halvveis utvokst (stadium 9,5), bladskjede full-stendig utvokst (stadium 10), hode eller aks brutt helt frem (stadium 10,5) samt utsprunget blomst. Etter at blomsten var utsprunget ble utvalgte aks fra disse behandlete planter kryss-bestøvet med pollen fra ubehandlet hvete fra en annen linje.

Det ble benyttet to kontrollprøver. Den ene var Fielder-planter som ikke var behandlet med apogamisk middel. Den andre kontrollprøve var på tilsvarende måte ubehandlet, og dens blomster kastrert for hånd og kryssbestøvet med pollen fra ubehandlet hvete fra en annen linje.

Alle de resterende blomster fra både behandlete og ubehandlete planter fikk bestøve seg selv dersom synlig pollen var til stede.

Tyve dager etter bestøvning (utsprunget blomst) ble fyto-toksisitet overfor hveteaks bestemt, og subjektive observasjoner ble gjort av utseende a*v fruktknute, embryo og frø. Alle frukt-knutene var normale av utseende. Resten av resultatene er angitt i tabell I.

Frøene som inneholdt haploid embryo var innskrumpete og flate og hadde en mørk blågrønn farge sammenliknet med kontroll-prøvene som var tykke og runde og hadde en skinnende lysegrønn farge. Frøene som inneholdt haploide embryo inneholdt også vassen endosperm som manglet stivelse, og deres embryo var vanligvis større og mer utviklet enn embryo hos kontrollprøvene. Embryo fra de haploide frø ble fjernet fra frøene og anbrakt på fuktig filterpapir som var mettet med en sukroseløsning, hvor de spiret.

De morfologiske karakteristika for det haploide frø, dets embryo og plante som ble utviklet derav var typisk av de karakteristika som var blitt iakttatt for naturlig forekommende hvete-haploider.

Eksempel 2

En vårhvete-varietet, Fielder, ble dyrket under veksthusbetingelser. En andel av plantene ble behandlet med kalium-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3-karbonat som apogamisk middel i mengder på ca. 0,6, 1,1, 2,2 og 4,4 kg apogamisk middel pr. hektar. (Det apogamiske middel ble frem-

(R)

stilt med 0,4 volum% Triton^ AG-9 8 lavtskummende hjelpestoff). Det apogamiske middel ble tilført til plantene på tidspunkter som i gjennomsnitt lå på fra 3 dager før full blomst til 4 dager etter full blomst.

Det ble anvendt tre kontrollprøver. Den ene var Fielder-planter som ikke var behandlet med noen dusj. Den andre kontroll-ul

prøve var sprøytet med bare 0,4 volum% Tritorr-^ AG-98 3 dager før og etter full blomst. Blomstene i det tredje sett kontroll-planter ble kastrert for hånd og deretter kryssbestøvet med Fielder som var behandlet med 4,4 kg apogamisk middel pr. hektar 3 dager før full blomst. 14 dager etter full blomst ble frø oppsamlet fra småblomstene på aksene fra hveteplantene, og frøenes gjennomsnittsvekt ble bestemt. Resultatene er angitt i tabell 2.

Selv om noen av resultatene er angitt som etter blomstring blomstret faktisk noen av småblomstene, som frøene ble samlet fra, etter behandling med det apogamiske middel. Dette skyltes at blomstring på samme aks ikke inntreffer i hver blomst på samme dag.

Kontrollfrø

Ingen behandling: 45,1 mg/frø

Behandlet med bare Triton® AG-98 lavtskummende hjelpestoff: 43,4 mg/frø

Håndkastrerte planter krysset med pollen fra planter som var behandlet med det apogamiske middel 3 dager før full blomst:

44,1 mg/frø.

De lavere vekter indikerer haploide frø.

Eksempel 3

Forskjellige rød-hardvinterhveter ("hard red winter wheats")

(tredje generasjon fra de opprinnelige krysninger) ble vernali-sert ved 2°C i 50 dager og deretter plantet i 15,2 cm potter og dyrket i et veksthus inntil plantene varierte i vekst fra stadium 9,0 til sen støvel ("boot"), ca. stadium 10. - Stadiene i dette eksempel refererer t;rl den vanlig benyttede og kjente Feekes-skala: W. Feekes "De tarwe en haar milieu" Versl. techn. Tarwe Comm., Vol 12, 1941, p. 523-888. På dette tidspunkt ble plantene sprøytet med kalium-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-metyl-pyridazin-3-karbonat som apogamisk middel i dosemengder på ca. 1,1, 2,2 og 3,3 kg apogamisk middel pr. hektar. Hvert skudd av hver plante ble utstyrt med merkelapp og identifisert vedrørende dets vekststadium på behandlingstidspunktet. Ca. 2 uker etter behandlingen sto planten i full blomst og frøet forekom i noen av hodene.

Ca. 21 dager etter at planten sto i full blomst ble umodne frø som hadde karakteristika til apogamiske frø, f.eks. frø med kløft i og med uregelmessige skjold og endospermer som var klare og flytende fjernet fra hodene, embryoene ble fjernet fra disse frø og anbrakt på Miller's soyabønne-kallesmedium, dvs. et sterilt næringsagar-agar som inneholdt indoleddiksyre og salter, og fikk vokse under rombetingelser.

Embryoene som vokste og utviklet røtter og skudd ble over-ført til prøverør som inneholdt friskt Miller-medium. Rørene som inneholdt embryoene ble anbrakt i et kammer ved ca. 21°C

og eksponert for 14 dagers dagslys og 10 timers mørke for å muliggjøre videreutvikling av dem. Etter at småplantene hadde utviklet gode røtter og skudd på ca. 7,6 cm ble de anbrakt i et vernaliseringskammer ved 2°C i 50 dager. Ved fjerning fra verna-liseringskammeret ble småplantene plantet i jord i potter og dyrket under veksthusbetingelser i ca. 5 dager. På dette tidspunkt ble det tatt rotspissprøver fra hver plante for å oppnå kromosomtall.

Jorden ble børstet og skyllet (med vann) bort fra rotspiss-prøvene. Rotspissene fra hver plante ble anbrakt i en krukke som var ca. 1/3 full med en mettet vandig løsning av 1-bromnaftalen. Røttene ble værende i bromnaftalenløsningen i fra 3 til 4 timer. Røttene ble deretter overført til et annet sett krukker som inneholdt ca. 1 ml av 3 deler absolutt etylalkohol og 1 del iseddik og oppbevart der i litt mer enn 1 time. De ble deretter overført til et annet sett krukker som inneholdt 5N saltsyre i fra 5h til 7 minutter. Deretter ble røttene fjernet og vasket i destillert vann og anbrakt i et annet sett krukker som inneholdt en liten mengde feulgenbeis. Féulgenbeisen ble fremstilt ved å helle 100 ml kokende vann over 0,5 g basisk fuksin i en kolbe og ryste noen minutter inntil,fuksinet var løst. Løsningen ble deretter avkjølt til ca. 50'°C og filtrert i en brun oppbevaringsflaske, og 15 ml IN saltsyre ble tilsatt. Løsningen ble avkjølt videre til ca. 28°C, og ca. 1,5 g kaliummetabisulfitt ble tilsatt og løst ved rysting. Etter oppbevaring i kjøleskap natten over ble ca. 1-2 spiseskjeer avfargende aktivt kull tilsatt. Løsningen ble rystet godt og filtrert i en annen brun oppbevaringsflaske. Krukkene ble korket og lagret i et kjøleskap inntil kromosomtallene ble bestemt.

Hver av rotspissene ble fjernet fra de feulgenholdige krukker, anbrakt på en glassplate og ca. halvparten av de beisete områder ble skåret bort. En dråpe acetokarminbeis ble anbrakt på resten av prøven, og en dekkplate ble anbrakt over hver prøve. Røttene ble presset sammen ved å utøve et svakt trykk på dekk-platen. Platene ble deretter betraktet under et mikroskop, og kromosomene i de enkelte celler ble talt.

I tillegg til å utføre en kromosomtelling på de ovenfor angitte linjer av frø som var behandlet med det apogamiske middel, ble kromosomtellinger også utført på ubehandlete linjer. Disse frø var anbrakt i petriskåler på et stykke fuktig dekk-papir med spiresiden opp. Frøene fikk spire ved romtemperatur i ca. 48 timer inntil hovedroten var ca. 1,27 cm lang. Prøver av hovedrøttene fra hver plante ble tatt og kromosomtellingene utført slik som beskrevet ovenfor. Resultatene av kromosomtellingene er angitt i tabell 3. Ingen resultater ble oppnådd med ubehandlet frølinje 5 på grunn av at det ikke ble iakttatt noen celler som hadde tellbare kromosomer.

Idet det normale kromosomtall for en hvetecelle av hard rødvinterhvetelinjer er 42 angir kromosomtallene 21 meget klart haploide hveteplanter og tallene mellom 21 og 42 at kromosomene gjennomgår endofordobling som når den er fullført, f.eks. på et senere stadium av plantens utvikling, resulterer i duploide planter.

Apogamiske midler som er anvendbare ifølge den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved forskjellige fremgangsmåter som er kjent på området. F.eks. kan de fenylsubstituerte 4-okso(tio)-nikotinater fremstilles på følgende måte når Z, R , Y, X og n er som definert ovenfor og R 2 er fenylgruppen, R 3 er et hydrogenatom, en alkylgruppe, et halogenatom eller fenylgruppen og R<4>er hydrogen eller en alkylgruppe: en egnet substituert 4-hydroksy-2-pyron med formelen hvor R 4 er som angitt ovenfor, omsettes med et benzoylhalogenid med formelen hvor X er som angitt ovenfor, i nærvær av en ""forbindelse som reagerer med syre,.såsom pyridin, trietylamin og liknende, ved temperaturer på fra 0 til 10°C, hvorved det dannes en 4-benzoyl-oksy-2-pyron med formelen

hvor R 4, X og n er som angitt ovenfor.

Denne reaksjon er diskutert i E. Marcus, J. F. Stephen, J. K. Chan, Journal of Heterocyclic Chemistry, 1966, p. 13. Dette benzoat kan gjennomgå en Fries-omleiring med vannfritt aluminiumklorid ved høyere temperatur til dannelse av en forbindelse med formelen

slik som diskutert i den ovennevnte publikasjon av E. Marcus et. al. Benzoylpyronen med formelen (VI) ovenfor kan deretter omsettes med en egnet alkohol (ROH), hvor R er en alkylgruppe, i nærvær av et tilsvarende substituert trialkylortoformiat (RCO^CH under anvendelse av en sur katalysator valgt blant svovelsyre, saltsyre, trifluoreddiksyre, eddiksyre, hydrobromsyre og liknende, ved temperaturer på fra 0 til 200°C, hvorved det dannes 3-kar-boksy-4-pyron med formelen 3-karboksy-4-pyronestrene med formelen (VII) kan omsettes med et vilkårlig egnet substituert amin med formelen til dannelse av en l-alkyl-2-aryl-4-oksonikotinatester med formelen

Denne reaksjon utføres vanligvis i et inert løsningsmiddel, såsom toluen, xylen, benzen, kloroform, metylenklorid, metanol, etanol eller liknende, ved romtemperatur eller ved en temperatur hvor vannet som dannes under reaksjonen kan fjernes ved azeotropisk destillasjon, under anvendelse av 0-5 vekt% av en syrekatalysator som p-toluensulfonsyre, saltsyre, svovelsyre, metansulfonsyre eller liknende. Den frie syre, dens salter, amider og andre estrer kan deretter fremstilles ved konvensjonelle metoder.

Reaksjonen av 3-karboksy-4-pyronesteren med formelen (VII) med overskudd av amin med formelen (VIII) i metanol eller etanol ved 0-50°C resulterer også i dannelsen av et 2:1 amin:pyronaddukt med formelen (X)

Forbindelsen (X) kan omdannes til forbindelsen (IX) ved hydrolyse ved fortynnete vandige syrer, såsom saltsyre, svovelsyre, trifluoreddiksyre eller metansulfonsyre, ved 0-50°C. Alternativt kan 2:1 adduktet (X) alkyleres med henholdsvis et alkyl-halogenid, molekylært klor eller brom eller et aktivert aryl-halogenid i et inert løsningsmiddel som metylenklorid, benzen, tetrahydrofuran, dietyleter og liknende, til dannelse av en forbindelse med formelen (XI), hvor R5 er an alkylgruppe:

Denne forbindelse kan hydrolyseres i vandige syrer ved 0-50°C slik som beskrevet ovenfor til dannelse av den tilsvarende 1,5-dialkyl-2-aryl-4-oksonikotinatester med formelen (IX), hvor R er en alkylgruppe. Oksonikotinsyreestrene som dannes ved reaksjonen ovenfor kan omdannes til de frie syrer ved hydrolyse med en sterk base som natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd, etterfulgt av nøytralisasjon med en sterk syre.

En annen fremgangsmåte til fremstilling av disse forbin-deiser, hvor R 1 og X er som angitt ovenfor, R 3 er hydrogen og R 4 er metyl, er angitt ved følgende reaksjonssekvens:

hvor Y er en (C1-Cg-)alkylgruppe. hvor Y er en (C^-Cg)alkylgruppe. Formel XV

I reaksjonssekvensen ovenfor kan løsningsmidlene for ligning (1) velges blant metanol, etanol, vann og liknende, og reaksjonen utføres ved temperaturer på fra 20 til 100°C. I ligning (2) velges de inerte løsningsmidler blant etre, metylenklorid, aromatiske hydrokarboner, aceton, acetonitril og liknende, og reaksjonen utføres ved temperaturer på fra 10 til 150°C. I ligning (3) utføres forsåpningsreaksjonen ved 10-100°C med en sterk base, såsom natrium- eller kaliumhydroksyd, og alkalisaltet omdannes til den frie syre ved hjelp av mineralsyrer som saltsyre, svovelsyre og liknende.

En annen fremgangsmåte til fremstilling av forbindelsene hvor R 1 er som angitt ovenfor, R 4 er hydrogen eller en alkylgruppe og R 3 er hydrogen eller alkyl er vist i ligning (4) nedenfor:

hvor Y er en alkylgruppe.

I reaksjonssekvensen i ligning (4) kan reaksjonen utføres enten ublandet eller i et inert koløsningsmiddel, eventuelt i nærvær av en syrekatalysator som toluensulfonsyre, svovelsyre, eddiksyre og liknende, ved temperaturer på fra 100 til 300°C.

En fremgangsmåte til fremstilling av 5-halogen (R^)-forbindelsene er vist i ligning (5) nedenfor:

I denne reaksjonssekvens kan det anvendes et vilkårlig protonisk løsningsmiddel som vann, metanol, etanol og liknende som reaksjonsmedium, og reaksjonen kan utføres ved temperaturer på fra 10 til 50°C.

(2). Nå° r R 3 er fenylgruppen, R<2>en alkylgruppe eller, uavhengig, fenylgruppen, og R<4>er et hydrogenatom eller en alkylgruppe kan forbindelsene fremstilles på følgende måte:

Trinn 1:

(a) metanol, etanol, vann eller liknende inerte løsnings-midler (b) 20-100°C

Trinn 2:

(a) MDC, benzen, eter eller andre inerte løsningsmidler (b) eventuelt syreakseptor

(c) 0-100°C, fortrinnsvis 0-50°C

Trinn 3:

(a) DMF-løsningsmiddel, overskudd av amidacetal (b) eventuelt basisk katalysator (Et^N)

(c) 20-150°C, fortrinnsvis 50-100°C

Trinn 4:

(a) vandig NaOH, Na-jCO^, andre baser

(b) eventuelt blandbart koløsningsmiddel (EtOH,MeOH)

(c) surgjøring med HC1, H2S04etc.

(3). Nar R 4 er fenylgruppen, R 2 er en, eventuelt substituert, (C2~C6)alkylgruppe eller (C^-Cg)alkenylgruppe og R<3>er et hydrogenatom, en (C-^-Cg) alkylgruppe eller-.-et halogenatom:

Alternativt kan disse forbindelser fremstilles ved følgende reaksjonssekvens:

I den sistnevnte reaksjonssekvens førte cykliseringstrinnet til én eller flere av pyridonene XXVIII, XXIX og XXX. Generelt ga pyrolyse (ublandet) av det akryl-C-akrylerte mellomprodukt (XXVIII) oksonikotinsyrén (XXX) direkte. Cyklisering av akryl-mellomproduktet (XXVII) i aproniske løsningsmidler ved lavere temperaturer ga varierende resultater avhengig av reaksjons-betingelsene og virkningene av substituentene X, R<1>og R<2>. I noen tilfeller ble det oppnådd blandinger av forbindelser (estrer, esterhydroklorid samt syre), i andre tilfeller ble bare én av forbindelsene isolert.

(4). Når både R^ og R<4>er fenylgruppen og R^ et hydrogenatom, en alkylgruppe eller et halogenatom, kan forbindelsene fremstilles som følger:

Trinn 1:

(a) NaHC03, Na2C03,

(b) klorbenzen, diklorbenzen, toluen, dekalin, andre

inerte løsningsmidler,

(c) temp.: 50-250°C, fortrinnsvis 100-200°C, og (d) liknende fremgangsmåten som er beskrevet i F. Arndt, B.

Ber., Vol 69, 1936, p. 2373.

Trinn 2:

(a) metanol,

(b) trimetylortoformiat som tørkemiddel,

(c) H2S04, HC1, andre sterke syrer,

(d) temp.: 25-200°C, fortrinnsvis 50-150°C.

Trinn 3:

(a) alkylamin,

(b) inert løsningsmiddel; alkoholer, etre, hydrokarboner,

vann,

(c) eventuelt syrekatalysator,

(d) temp.: 0-150°C, fortrinnsvis 25-50°C.

Trinn 4:

(a) vandig base,

(b) eventuelt inert koløsningsmiddelj metanol, DMSO, (c) temp.: 20-150°C, fortrinnsvis 50-100°C,

(d) syre for nøytralisasjon.

En annen fremgangsmåte til fremstilling av disse forbindelser i gruppe (4) er:

Trinn la:

(a) 1:10 mellom P~Cv :CH-,SO-H etter vekt,

(b) temp.: 20-150°C, fortrinnsvis 20-60°C.

Trinn 2a:

(a) alkylamin,

(b) inert løsningsmiddel', alkoholer, etre, hydrokarboner,

vann,

(c) eventuelt syrekatalysator,

(d) temp.: 0-150°C, fortrinnsvis 25-50°C.

Trinn 3a:

(a) vandig base,

(b) eventuelt inert koløsningsmiddel: metanol, DMSO, (c) temp.: 20-150°C, fortrinnsvis 50-100°C,

(d) syre for nøytralisasjon.

Enda en annen fremgangsmåte til fremstilling av disse forbindelser i gruppe (4) "fremgår av følgende reaks jonssekvens:

Trinn lb:

(a) R<1>NH2,

(b) inert løsningsmiddel: metanol, ^0,

(c) eventuelt syrekatalysator,

(d) temp.: 20-150°C, fortrinnsvis 20-100°C.

Trinn 2b:

(a) utført i inert løsningsmiddel (metylenklorid, benzen,

toluen, eter),

(b) eventuelt syreakseptor (pyridin, Et^N),

(c) temp.: 0-150°C, fortrinnsvis 10-50°C,

(d) resten oppvarmet til 100-200°C, fortrinnsvis 150-180°C.

Enda en annen fremgangsmåte til fremstilling av disse halogenerte forbindelser i gruppe (4) er vist ved følgende reaksjonsligning: (a) utført i forenelig løsningsmiddel (MeOH, vann)

(b) romtemperatur

(c) eventuelt tilsetning av base (NaOH, Na-jCO^, etc.)

De apogamiske midler i form av 4-okso- eller -tiopyridazin kan fremstilles f.eks. ved følgende fremgangsmåter:

hvor R er et hydrogenatom, en aralkylgruppe eller en alkylgruppe og R 7 er som definert ovenfor, eller et salt av en pyron med formelen (1), fremstilt ved å behandle pyronen med en ekvivalent av en egnet vandig base, såsom kalium- eller natriumhydroksyd, -acetat eller -karbonat, omsettes ved fra -10 til 50°C i et polart løsningsmiddel, såsom vann, metanol, etanol, glym;., dimetylformamid eller liknende, med et diazoniumsalt, såsom di-azoniumklorid, fremstilt ved konvensjonelle diazoteringsmetoder, fra et amin med formelen Produktet, hydrazonet, som har formelen hvor R 6 og R 7 er som definert ovenfor, omsettes deretter med en vandig syre, såsom saltsyre, trifluoreddiksyre, svovelsyre, metansulfonsyre, salpetersyre eller liknende, eller en vandig base som natriumkarbonat, natriumhydroksyd, eller et alkoholisk sekundært amin som morfolin, piperidin, dialkylamin og liknende, ved en temperatur på fra 0 til 150°C, fortrinnsvis fra 40 til 100°C, hvorved det ved omleiring dannes et pyridazinon med formelen

eller et salt derav, hvor R 6 og R 7 er som angitt ovenfor.

Pyridazinonene ifølge oppfinnelsen, hvor R^ er et halogenatom, kan fremstilles ved å omsette de tilsvarende pyridazinoner, hvor R^ er et hydrogenatom, med en ekvivalent halogeneringsmiddel, såsom brom, klor, sulfurylbromid, sulfurylklorid, eller liknende, i et egnet inert løsningsmiddel som heksan, benzen, etylendi-klorid, metanol eller liknende, ved en temperatur på fra 0 til 50°C, fortrinnsvis ved romtemperatur.

0

6li

(2). Nar R er -CA og A er hydrogen, alkyl eller aralkyl

og resten av substituentene er som angitt ovenfor, kan følgende fremgangsmåte benyttes:

Saltene av pyridazinonene med formlene 4, 10, 14 og 15 og deres 5-halogenderivater, kan fremstilles på konvensjonell måte, såsom ved nøytralisasjon med en egnet uorganisk eller organisk base, i et løsningsmiddel som vann eller metanol.

Estrer av pyridazinonene med formlene 4, 10, 14 og 16 fremstilles ved forestring med en egnet alkohol, fortrinnsvis en ) alkanol. En hensiktsmessig fremgangsmåte er en Fischer-forestring hvor det anvendes vannfri saltsyre eller svovelsyre som katalysator og alkoholen som løsningsmidlet. Forestringen utføres vanligvis ved fra 35 til 150°C, eventuelt under anvendelse av et inert koløsningsmiddel som metylenklorid, etylen-klorid, dietyleter, toluen, xylen eller liknende.

En annen hensiktsmessig forestringsmåte er omsetning av det ovenfor fremstilte pyridazinonacylhalogenid med en egnet alkohol under anvendelse av alkoholen eller et vilkårlig inert koløsningsmiddel for reaksjonsmediet. Alternativt kan det anvendes et tionylhalogenid for å først fremstille et halogensulfinitt med den egnete alkohol, hvoretter dette halogensulfinitt kan omsettes med pyridazinonkarboksylsyren til dannelse av esteren. Disse forestringsmåter kan utføres ved fra 0 til 80°C. Alkoholen i esteren kan også anvendes som løsningsmiddel ved denne reaksjon.

Enda en annen forestringsmåte omfatter anvendelsen av halogenkarboksylat til dannelse av et pyridazinonacylanhydrid etterfulgt av enten termisk dekomponering for fjerning av karbondioksyd og dannelse av den ønskete ester, eller tilsetning av en ekvimolar (eller overskudd) mengde av alkoholen av esteren for å danne den ønskete ester. Denne reaksjon kan i begynnelsen utføres ved ca. 0°C og temperaturen økes inntil utviklingen av karbondioksyd er opphørt. Reaksjonen utføres i nærvær av en syreakseptor i et inert løsningsmiddel. Tioestrene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles slik som beskrevet ovenfor ved anvendelse av en tioalkohol.

Pyridazinonkarbamidene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved standard fremgangsmåter, såsom omsetning av det ovenfor dis-kuterte acylhalogenid med et egnet amin i et inert løsningsmiddel ved fra 0 til 150°C. Ifølge en annen hensiktsmessig aminerings-metode omsettes pyridazinonkarboksylsyren med et egnet halogenkarboksylat, hvorved det først dannes et acylanhydrid, som i sin tur omsettes med et egnet amin ved temperaturer på fra 25 til 110°C i et inert løsningsmiddel, også med utvikling av karbondioksyd, hvorved karbamidet dannes.

Oksopyridazinene og oksonikotinatene omdannes på enkel måte til deres tioanaloger under anvendelse av konvensjonelle metoder.

Claims (17)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av haploide frø ved inn-føring av haploider i en angiosperm, karakterisert ved at det tilføres et apogamisk middel til planten på et tidspunkt mellom begynnende blomstdannelse og utsprunget blomst i en mengde som er tilstrekkelig til å frembringe apogami, at planten tillates å danne frø, samt at det fra frøet oppsamles levedyktig, haploid frø.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, til fremstilling av duploider i en angiosperm, karakterisert ved at det haploide frø dyrkes i et miljø som fremmer utviklingen av embryoet i en plante som er i stand til å produsere duploid frø.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, for oppnåelse av en homozygotisk plantelin j<e, karakterisert ved at det haploide frø dyrkes i et miljø som fremmer veksten av dets embryo til en mcjden, frøproduserende plante, hvor hvert frø er genetisk ståbilt og representerer kilden for en homozygotisk linje.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, hvor de homozygotiske plantelinjer er et korn eller en forplante, karakterisert ved at det apogamiske middel tilføres i en mengde på fra 0,03 til 11 kg pr. hektar og tilføres til planten på et tidspunkt mellom meiose og utsprunget blomst.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3 eller 4, karakterisert ved at en homozygotisk plantelinje dyrkes av frøet som er dannet av de duploide planter.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at det apogamiske middel tilføres i en mengde på fra 0,01 til 22 kg pr. hektar.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 6, karakterisert ved at det apogamiske middel tilføres til en plante med bare ett frøblad på et tidspunkt mellom meiose og utsprunget blomst.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 6, karakterisert ved at det som apogamisk middel anvendes et av følgende: l-(4-klorfenyl)-l,4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3- karboksylsyre, l-(4-klorfenyl)-l,4-dihydro-4-okso-5-kårboksy-rne ty1-6-etylpyridazin-3-karboksylsyre, 1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4 -okso-5-propiony1-6-metylpyridazin-3-karboksylsyre, 1-ety1-6-mety1-2-(4-klorfenyl)-4-oksonikotinsyre, l-etyl-6-metyl-2-(3,4-diklorfenyl)-4-oksonikotinsyre, 1-(3,4-diklorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-metylpyridazin og l-fenyl-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-etylpyridazin og vannløselige salter derav og metyl- eller etyl-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4- okso-6-etylpyridazin-5-karboksylat og metyl- eller etyl-1-(4-bromfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-etylpyridazin-5-karboksylat.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8, karakterisert ved at det apogamiske middel tilføres i en mengde på fra 0,03 til 11 kg pr. hektar.

10. Fremgangsmåte til frembringelse av apogami i en angiosperm plante, karakterisert ved at det til planten på et tidspunkt på fra begynnende blomstring til utsprunget blomst tilføres i en tilstrekkelig mengde til å forårsake apogami et apogamisk middel som inneholder ett eller flere 4-okso(tio)-nikotinater og/eller 4-okso(tio)pyridaziner, som har vekstregu-lerende egenskaper.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10, karakterisert ved at det apogamiske middel er et effektivt kjemisk hybridiserende middel i forhold til planten som det til-føres til.

12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2, hvor planten er en korn- eller forplante, karakterisert ved at det apogamiske middel tilføres på et tidspunkt mellom meiose og umiddelbart før utsprunget blomst og i ien mengde på fra 0,03 til 11 kg pr. hektar.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2, hvor planten er et korn eller en forplante, karakterisert ved at det apogamiske middel tilføres på et tidspunkt fra meiose til umiddelbart før utsprunget blomst i en mengde på fra 0,03 til 11 kg pr. hektar.

14. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10 eller 13, karakterisert ved at det som apogamisk middel anvendes ett eller flere 4-okso(tio)nikotinater eller (tio)pyridaziner med formelen

hvor Z er et oksygen- eller svovelatom,1 e R er en, eventuelt substituert, (C,-C,)alkyl eller (C„-C,)-alkenyl, mens minst én av R 2 , R og R er ( f^) x("fen yl- gruppen") hvor når R <2> er "fenylgruppen" er R <3> et hydrogenatom, en alkylgruppe eller et halogenatom og R <4> er et hydrogenatom, en alkylgruppe eller, uavhengig, "fenylgruppen", nåo r R 3 er "fenylgruppen" er R en alkylgruppe eller, uavhengig, "fenylgruppen", og R <4> er et hydrogenatom eller en alkylgruppe, nar R 4 er "fenylgruppen" er R 2 en, eventuelt substituert, (C2-Cg)alkylgruppe, en (C3 -Cg)alkenylgruppe eller, uavhengig, "fenylgruppen" og R3 er et hydrogenatom, en (C^-Cg)alkylgruppe eller et halogenatom, Y er et hydrogenatom, et agronomisk akseptabelt salt derav eller en alkylgruppe, X er et hydrogenatom, et halogenatom, en trihalogenmetyl-gruppe, en (C-^-Cg) alkylgruppe, en nitrogruppe, en cyanogruppe eller en (C-^-Cg ) alkoksygruppe, og n er et helt tall fra 1 til 3, og

hvor Z' er et oksygen- eller svovelatom, 0 5 II R er et hydrogenatom, et halogenatom, -CNRR, hvor R og R hver uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, alkyl substi-0

11 8 tuert med en karbonyl- eller karboksygruppe, -CWR , hvor W er et oksygen- eller svovelatom og R ger et hydrogenatom, en alkyl-, aryloksy-, alkoksyalkyl-, alkylhalogen-, alkylhydroksy-, imino-alkyl(-N=alkyl)-, aryl-, alkenyl-, cyklo(C3~ Cg)alkyl- eller cykloalkylgruppe, 0 6 II R er et hydrogenatom, alkyl, -CA, hvor A er hydrogen, 9 10 alkyl, aralkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio eller -NR R , 9 10 hvor R og R uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, alkyl substituert med enkarbonyl- eller karboksygruppe under forut-setning av at R~ <*> og R^ ikke begge er hydrogenatomer, og når R^ er et hydrogen- eller halogenatom er R gO II -CA', hvor A' er en 9 10 alkoksy-, tioalkyl- eller -NR R -gruppe, og R^ er alkyl, aryl eller aryl substituert med opp til tre substituenter valgt blant halogen, nitro, trihalometyl, (C^ -C^ )-alkoksyl (C-^-C^) alkyl eller cyano, n er 0, 1, 2 eller 3, mens hver X <1> uavhengig er et hydrogenatom, et halogenatom, en trihalogenmetyl-, alkyl-, alkoksy-, cyano- eller nitrogruppe, samt agronomisk akseptable salter derav.;

15. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at Z og Z' er oksygenatomer, X og X' uavhengig av hverandre er et hydrogen- eller halogenatom eller en trifluormetylgruppe, n er 1 eller 2, R1 er en (C,-C.)alkylgruppe, 2 4 R eller R er "fenylgruppen", idet når R 2 er "fenylgruppen" er R 3 en (C,-C,)alkylgruppe, 4 et brom- eller et hydrogenatom, R et hydrogenatom, et halogenatom eller en (C^ -C^ )alkylgruppe, nao r R <4> er "fenylgruppen" er R <2> et hydrogenatom, et halogenatom eller en (C-^-C^) alkylgruppe mens R <3> er et halogen- eller hydrogenatom, Y er et hydrogenatom, en (C-^-Cg) alkylgruppe eller en alkalimetall- eller jordalkalimetallkation, 0 5 11 8 R er hydrogen, halogen eller -CWR , hvor W er et oksygenatom og R ger et hydrogenatom, (C-^-^ ) alkyl, (C^-C^ )alkylhalogen, (C1~C4 ) alkylhydroksy, (C1~C4 ) alkoksy- ( C^ C^ ) alkyl, (C1-C2 ) fenyl, (C^ -C4 )alkenyl eller imino(C^ -C4 )alkyl eller W er svovel og R <5> er en (C,-C.)alkylgruppe, 0 6 I' R er hydrogen, (C,-C.)alkyl, -CA, hvor A er (C,-C.)alkyl, (C1~ C4 )alkoksy, (C-^^ ) alkyltio eller -NR 9 R 10 , og når R <5> er et 0 hydrogen- eller halogenatom er R <6> -C« <A> og A er (C^ -C4 )alkoksy eller (C,-C.)alkyltio, R 7er en (C^ -C4 )alkylgruppe, samt agronomisk akseptable salter derav.;

16. Fremgangsmåte i samsvar med krav 15, karakterisert ved at Z og Z' er oksygenatomer, X er et hydrogen-, klor-, brom-, fluor- eller jodatom, X' er et klor-, flur- eller jodatom, n er 1 eller 2, R"*" er en metyl-, etyl- eller n-propylgruppe, R 2er en (C,-C.)alkylgruppe, 3 R er et hydrogenatom, 4 R er "fenylgruppen", Y er en natrium- eller kaliumkation, O 5 II g g R er -CWR , hvor W er et oksygenatom og R er et hydrogen atom eller et natrium-, kalium- eller trietanolaminsalt derav eller en (C,-C_)alkylgruppe, 0 6 I' R er et hydrogenatom eller -CA', hvor A' er en hydroksy-eller (C,-C~ )alkoksygruppe, R 7er en metyl-, etyl- eller n-propylgruppe, samt de agronomisk akseptable salter derav.

17. Fremgangsmåte i samsvar med krav 12 eller 13, hvor kornet et hvete, bygg, havre, ris, rug, mais, durra, hirse eller tri-ticale, og det apogamiske middel tilføres i en mengde på fra 0,1 til 6 kg pr. hektar, karakterisert ved at det som apogamisk middel anvendes én eller flere av forbindelsene : 1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-metylpyridazin-3-karboksylsyre, 1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksy-metyl-6-metylpyridazin-3-karboksylsyre, 1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-propionyl-6-metylpyridazin-3-karboksylsyre, l-etyl-6-metyl-2-(4-klorfenyl)-4-oksonikotinsyre, l-ety1-6-metyl-2-(3,4-diklorfenyl)-4-oksonikotinsyre, 1-(3,4-diklorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksyrnety1-6-metylpyridazin og 1-fenyl-1,4-dihydro-4-okso-5-karboksymetyl-6-etylpyridazin og vannløse-lige salter derav og metyl- eller etyl-1-(4-klorfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-etylpyridazin-5-karboksylat og metyl- eller etyl-1-(4-bromfenyl)-1,4-dihydro-4-okso-6-etylpyridazin-5-karboksylat.