NO840823L

NO840823L - Fremgangsmaate for utfoerelse av en mutagenitetsproeve

Info

Publication number: NO840823L
Application number: NO840823A
Authority: NO
Inventors: Kai Falck
Original assignee: Labsystems Oy
Priority date: 1982-07-12
Filing date: 1984-03-05
Publication date: 1984-03-05
Also published as: IT1162893B; DE3366962D1; SU1442090A3; FI822473A0; FI67404B; EP0112888A1; IT8367732A0; AU566150B2; WO1984000384A1; JPS59501294A; US4675288A; DD210076A5; AU1761883A; FI822473L; FI67404C; CA1204373A; EP0112888B1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for utførelse av en mutagenitetsprøve slik at en celle-populas jon utsettes for et mutagen, hvorved en del av populasjonen muterer, hvorpå den opprinnelig enhetlige cellepopulasjonen differensieres i underpopulasjoner.

Mutagenitetsprøving brukes til hurtig foreløpig prøving av stoffer som mistenkes for å være carcinogener ettersom det i bakterielle mutagenitetsprøver er blitt fastslått at minst 90% av kjente carcinogener også er mutagener. Ut fra biologiske prøver er det mulig å fastslå, for eksempel i form av mutagen virkning av urin, at en berørt person kanskje har vært utsatt for mutagene stoffer som følgelig muligens forårsaker risikoen for kreft.

Det er mulig å bestemme mutagener som er tilstede i prøvene av luft, vann og matvarer, og for eksempel mulige spor av mutagene pesticider og andre midler i matvarer.

Mutagenitetsprøving er i en stadig økende utstrekning en del av den lovbestemte toksikologiske analyse av et produkt eller en ekvivalent derav. Noen av de viktigste brukerne av disse prøver er for tiden den farmasøytiske og kjemiske indu-stri. Det dannes et eget, spesifikt område av myndighetene som behandler miljøbeskyttelse og yrkesmessig sikkerhet, som vanligvis må undersøke sammensatte prøver som inneholder flere forskjellige kjemikalier. Sammen med den tiltagende lovgiv-ning for beskyttelse av forbrukere, innlemmes for eksempel også matvarer og tilsetningsstoffer for matvarer innenfor ram-men av mutagenitetsundersøkelser. Undersøkelsen av disse prøvene kan være problematisk ettersom vekstfaktorene som er tilstede i de nevnte produkter kan forårsake falske positive resultater.

I den tidligere kjente teknikk har en mikrobiologisk fluktuasjonsprøve vært brukt til undersøkelse av mutagenitet. Fluktuasjonsprøven er en to-trinns prøve på bakteriell mutagenitet, som er egnet for undersøkelsen av lave, ikke-giftige konsentrasjoner av mutagene stoffer. I det første prøvetrinn, som tar 18 til 20 timer, finner den eventuelle mutasjon sted. Deretter finner det sted en seleksjon i tre dager i et dyr-kingsmedium fritt for vekstfaktorer.

Ettersom prøven finner sted i et flytende medium hvori det gjøres forsøk på å isolere hver originalmutant, følger det av kravet ovenfor at utførelsen av prøven krever et stort antall prøverør. Dess flere prøverør som er tilgjengelig pr. prøve, dess større er sannsynligheten for at hver av de fremstilte originalmutantene kan isoleres i sitt eget rør.

Iakttagelsen av mutantvekst er basert på bruken av en pH-indikator ettersom de muterte celler utskiller sure fer-menteringsprodukter når de dyrkes i seleksjonsmediet.

Den mikrobiologiske fluktuasjonsprøve er en av de mest følsomme mutagenitetsprøver som hittil er blitt utviklet. Ames-prøven som er den vanligst brukte bakterielle mutageni-tetsprøve, krever ca. 10 til 100 ganger høyere konsentrasjoner av mutagener for å få en lignende positiv respons sammenlignet med fluktuasjonsprøven.

En ulempe ved fluktuasjonsprøven er dens følsomhet for den toksiske virkning og vekstfaktor-virkning til stoffet, og det er årsaken til at prøven krever mye arbeid. Det brukes minst 50 prøverør pr. prøve og, dersom prøven er ukjent med hensyn til dens toksiske egenskaper, kan det kreves opp til 8 forskjellige fortynninger av prøven for å nå ikke-toksiske, men fremdeles mutagene konsentrasjonsområder. I et slikt til-felle kan det totale antall rør være opp til 4 00 pr. prøve. Med alle arbeidsstrinn tar utførelsen av prøven ca. 30 minutter pr. fortynning (50 rør), noe som begrenser antallet prøver som kan analyseres betydelig. Mutageniseringen og seleksjonen som skal utføres på senere dager begrenser oppstartingsdagen for prøven til kun mandager og torsdager dersom arbeid i løpet av helgene skal unngås. En ulempe ved prøven på mutagen evne som utføres manuelt, er den høye kostnad.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er hovedsakelig kjennetegnet ved at variasjonen i turbiditet forårsaket av endringen i tettheten av de differensierte cellepopulasjoner måles som en endring i optisk tetthet ved hjelp av et fotometer som måler vertikalt ved en bestemt bølgelengde, og mengden celler i underpopulasjonen bestemmes som optisk tetthet.

Ved hjelp av et fotometer som måler vertikalt er det mulig å måle cellemengden i en populasjon av bakterier nøyaktig som optisk tetthet, idet målingsresultatet ikke påvirkes ved

sedimentasjon av cellene eller ved variasjoner i væskevolumet.

I tillegg til ved hjelp av et fotometer, kan målingen også utføres ved hjelp av et vertikalt målende fluorometer, nefelometer, luminometer eller ethvert annet apparat som er istand til å registrere variasjon i veksten av cellepopulasjoner.

En opprinnelig enhetlig auxotrof cellepopulasjon kan differensieres genetisk ved virkningen av et mutagen i auxotrof e og prototrofe underpopulasjoner. Ved å iaktta veksten av populasjonene ved hjelp av et fotometer, som kan finne sted i en felles kyvette, er det fra vekstkurven fremstilt som en funksjon av tiden, f.eks. mulig å finne den mutagene evne til prøven, toksisitet, toksisitetens natur (bakteriostat, baktericid) , dekomponering av en giftig forbindelse under prøven,

samt eventuelle vekstfaktorer som er tilstede i prøven, og veksthastighetene til de auxotrofe og prototrofe celler. For å avsløre disse parametre er det ikke nødvendig å gripe inn i selve prøven eller i prøveorganismene.

For å fastslå den spontane mutasjonsfrekvens (såkalt "bakgrunn"), trengs det en prøve som svarer til de andre prø-ver, men som ikke inneholder mutagener. Fremgangsmåtens opera-bilitet bekreftes ved en tilsvarende prøve som inneholder kjente mutagener. Avhengig av den ukjente prøve som skal undersøkes, er det mulig å lage flere parallelle analyser og/ eller fortynninger av den.

I en mikrobiologisk mutagenitetsprøve er det mulig å bruke genetisk nøyaktig karakteriserte aminosyre-auxotrofe, enkeltmarkørbakteriestammer. En endring i genotypen som er forårsaket av mutasjon, påvises som fenotypisk endrede vekst-faktorkrav slik at cellene som har fått en korrekt type mutasjon, er blitt uavhengige av virkningen av vekstfaktor-amino-syrene.

I prøven utsettes den opprinnelige genetisk enhetlige populasjon av bakterier for mutagener, hvorved en del av populasjonen muterer fra auxotrof til prototrof. Økningen i turbiditeten hos underpopulasjonene som er differensiert på denne måte, kan iakttas spektrofotometrisk i det under-minimale vekst-mediet ved hjelp av et FP-9 01 fotometer ved vertikal måling, hvorved endringer i væskevolum og sedimentasjon av bakterie-celler ikke påvirker målingsresultatet for absorbansen. Et fotometer av typen FP-901 er beskrevet f.eks. i den publiserte BRD patentsøknad nr. 2 451 769.

Når all vekstfaktor-aminosyren er oppbrukt, er bare de celler som fikk mutasjonen istand til å fortsette sin vekst. Dess større populasjon mutantceller indusert ved oppstartings-øyeblikket for prøven, dess hurtigere når de en spektrofotometrisk målbar tetthet. Tiden som går fra begynnelsen av prøven til øyeblikket for påvisning, er omvendt proporsjonal med den mutagene aktivitet som er inneholdt i prøven. Diagrammet som ble erholdt ut fra veksten av populasjonene på basis av absorbans, den såkalte vekstkurven, gir informasjon foruten om prøvens mutagene evne, også om eventuelle vekstfaktorer som er inneholdt i den.

Fordelene ved fremgangsmåten sammenlignet med tidligere prøver er som følger: 1. Hastighet: Resultatet av prøven erholdes på mindre enn 24 timer. Med Ames-prøven tar det 48 timer å få resultatet,

og med fluktuasjonsprøven tar det 96 timer.

2. Mindre forbruk av prøve og reagenser ettersom det totale prøvevolum er mindre ved den turbidometriske fremgangsmåte. 3. Materialøkonomi: Ved den turbidometriske fremgangsmåte analyseres én prøve i én kyvette, mens det ved Ames-prøven trengs minst seks petriskåler og ved fluktuasjonsprøven

minst 150 prøverør pr. prøve.

4. Arbeidsmengde-økonomi: Den turbidometriske fremgangsmåte kan automatiseres fullstendig ved hjelp av FP-901-systemet. Tiden som trengs pr. prøve er ca. 20 sekunder. Ved Ames-prøven krever én prøve minst 20 minutter og ved fluktua-sjonsprøven ca. 1,5 timer. 5. Oppstartingstiden kan velges fritt i løpet av arbeidsuken: Varigheten av en turbidometrisk prøve er mindre enn 24 timer, mens de 4 8 timer som trengs ved Ames-prøven begrenser oppstartingstiden til perioden fra mandag til onsdag, og ved fluktuasjonsprøven er oppstartingen mulig bare på mandag og torsdag dersom det ikke finner sted noe arbeid

i løpet av helgen.

6. Følsomhet: Den turbidometriske fremgangsmåte er i teorien den mest følsomme, mulige prøve på bakteriell mutagen evne. Med dens hjelpemidler er det til og med mulig å påvise genereringen av én indusert revertant. Det spontane reversjonsnivå for null-kontrollen er vanligvis mindre enn én pr. prøve. En indusert revertant-celle påvises som turbid vekst etter ca. 20 timer dersom G.T. (generasjons-tiden) er ca. 4 0 minutter. 7. Den turbidometriske mutagenitetsprøve er den eneste muta-genitetsprøve hvor det også fås informasjon mellom starten og slutten på prøven uten å gripe forstyrrende inn i prø-ven. Ved Ames-prøven er det mulig å bestemme den akutte toksisitet til prøven, men dette fordobler arbeidsmengden som trengs til prøven. På den annen side gjøres det ved fluktuasjonsprøven forsøk på å eliminere toksisiteten ved hjelp av omfattende serier med fortynninger.

Oppfinnelsen og dens detaljer vil bli nærmere beskrevet nedenunder under henvisning til de vedlagte tegninger,

hvor fig. 1 til 3 illustrerer forskjellige vekstkurver, dvs. absorbans-verdier, som en funksjon av tid, idet absorbansverdiene er gjengitt i den logaritmiske skala.

Den turbidometriske prøve på bakteriell mutagenitet er følgelig basert på en differensiering, indusert ved hjelp av et mutagen, av en opprinnelig genetisk enhetlig cellepopulasjon i auxotrofe og prototrofe underpopulasjoner og på iakttagelsen av en endring i turbiditeten til disse underpopulasjonene.

Organismene som brukes i prøven er E.coli WP2 (trp ) og Salmonella typhimurium (his ) eller hvilke som helst andre passende aminosyre-auxotrofe, enkeltmarkør-stammer. Veksten og differensieringen av cellepopulasjonene iakttas ved hjelp av et FP-901 spektrofotometer som måler vertikalt, hvorved endringer i væskevolum og sedimentasjon av celler ikke påvirker målingsresultatet for absorbansen. A = E ™a-(Suovaniemi, 0., "Performance and Properties of the Finnpipette Analyzer System", Proceedings of the Second National Meeting on Biophysics and Biotechnology in Finland, 1976, sidene 183-187, av A.-L. Kairento, E. Riihimaki og P. Tarkka; og Suovaniemi, 0. og Jarnefelt, J., "Discrete/Multichannel Analyzing Systems with a Vertical Optical Path and Batch Processing", 1982, Internatio-nal Laboratory, under trykking).

Prøven og dyrkingen av celler finner sted i en +37°C inkubator-beholder, i et 9 x 1 ml kyvette-sett, én kyvette pr. prøve, enten i Davis-Mingioli, Vogel-Bonner eller hvilket som helst annet passende under-minimalt væskemedium. Den opprinnelige størrelsen til cellepopulasjonen er 5 x 10 og den brukes som sin egen blindprøve i FP-901, hvoretter veksten av cellene forårsaker en endring i absorbansen dA^Q^/10 celler = 0,001.

I mutageniseringstrinnet oppdeles cellene auxotroft fem ganger ved virkningen av vekstfaktoren. Etter at all vekstfaktor er oppbrukt, tar veksten av auxotrofe celler slutt, men cellene som har mutert til prototrofe celler fortsetter sin vekst. Dess høyere forholdet av prototrofe celler er i hele populasjonen, dess hurtigere når de en målbar tetthet.

Den tid som har gått ved påvisningsøyeblikket, kan brukes direkte som et mål for mutagen virkning i tilfellet med ikke-toksiske prøver.. Varigheten av utførelsen av prøven varierer avhengig av veksthastigheten til prøveorganismen; i tilfellet med E.coli og S.typhimurium overskrider den ikke 24 timer.

Kurven erholdt som et resultat av absorbansverdien er en typisk illustrasjon på diauxisk vekst.

I fig. 1 svarer kurve 1 til ikke-inhibert vekst (ikke-toksisitet, overlevelsesverdi 100%), kurve 2 svarer til overlevelsesverdien 80%, kurve 3 svarer til overlevelsesverdi 50% og kurve 4 til overlevelsesverdi 20%. Omfanget av døde celler kan beregnes ut fra formelen

n = omfanget av den opprinnelige populasjon (1 000),

t = tiden som har gått i det øyeblikk at 0-nivået overskrides

*t0+' fcl' t2+* '

gt= genereringstid (t^- t^).

I fig. 2 viser kurve 5 ikke-inhibert vekst, kurve 6 et baktericid (dødelighet 50%), kurve 7 og 9 ikke-dekomponerte bakteriostater og kurve 9 en dekomponerende bakteriostat.

I fig. 3 representerer 1^lg ^= a^ andelen til vekstfaktoren.

Ut fra diagrammet for diauxisk vekst kan de følgende faktorer bestemmes: 1. Prøvens toksisitet ut fra startøyeblikket for log-fasen I (fig. 1). 2. Arten av toksisitet hos prøven (baktericid, bakteriostat, dekomponerende bakteriostat) ut fra formen på vekstkurven

i log-fase I (fig. 2).

3. Veksthastighet for ikke-reverterte celler ut fra størrel-sen på vinkelfaktoren til vekstkurven i log-fase I (fig. 3). 4. Veksthastighet for revertantene ut fra størrelsen pa vinkelfaktoren til log-fase II (fig. 3). 5. Eventuelle vekstfaktorer som er tilstede i prøven ut fra størrelsen på absorbansen i platå-fase I. Antallet til-leggsrevertanter forårsaket av vekstfaktorene finnes ut fra formelen Fp. = 2^ ^ x g x r, hvor Fp. = tilleggsrevertan-ter etter forbruk av tilleggs-vekstfaktor, g = antall cellegenerasjoner, r = mengde revertanter produsert pr. generasjon x populasjonsstørrelse; z = revertanter (r) pr. generasjon (g) x populasjonsstørrelse (s)

1q = utgangsnivå for overskudd = D. - Dq = s 1^ = sluttnivå for overskudd = D2- DQ

g = antall cellegenerasjoner =

D1VD2= k1/t5+fc0k17t5t

6. Prøvens mutagene evne ut fra lengden på platå-trinn I (fig. 3). 7. Antall revertanter ved tidspunktet tQved ekstrapolasjon ved å benytte seg av veksthastighetene i fasene II log og I log.

D = påvist størrelse for sluttpopulasjonen

a = k^/t^ - tg = antall delinger i fase log I

b = ^2^*"n + 2 ~ *"5 = an*-all delinger i fasene platå I og

log II

X = antall revertanter ved tidspunktet t^.

Utførelse av prøven

Metabolsk aktiveringssystem (S-9) 20 yl (dersom det kreves)

Bestanddelene ovenfor blandes i en 1 ml kyvette, om-røres ved hjelp av en rystemaskin i 15 sekunder, plasseres i en +3 7°C inkubatorbeholder, brukes som blindprøve ved en bølge-lengde på 405 nm i en FP-901, inkuberes deretter i 20 til 24 timer hvorunder absorbansen til prøven måles ved 405 nm i overensstemmelse med et på forhånd fastsatt tidsfordelingssystem.

Ut fra absorbansverdiene dannes en vekstkurve som en funksjon av tiden hvorav prøvens mutagene evne og flere andre parametre utledes.

Den turbidometriske prøvé på bakteriell mutagen evne egner seg for alle typer prøving av mutagen evne hvor det skal finnes ut hvorvidt den aktuelle prøve er istand til å reagere med DNA på en måte som forårsaker mutasjoner.

Claims

1. Fremgangsmåte for utførelse av en mutagenitetsprøve slik at en cellepopulasjon utsettes for et mutagen hvorved en del av populasjonen muterer, idet den opprinnelig enhetlige cellepopulasjon differensieres i underpopulasjoner,karakterisert vedat variasjonen i turbiditet forårsaket ved endringen i tettheten av de differensierte cellepopulasjonene måles som en endring i optisk tetthet ved hjelp av et fotometer som måler vertikalt ved en bestemt bølge-lengde, og cellemengden i underpopulasjonene bestemmes som optisk tetthet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat veksten av differensierte cellepopulasjoner måles ved hjelp av et vertikalt målende fotometer, fluorometer, nefelometer eller luminometer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat absorbansverdiene måles i overensstemmelse med et på forhånd programmert tidsfordelingssystem og det lages en vekstkurve ut fra verdiene som en funksjon av tiden.