NO832905L - Carcinoembryonalt antigen, fremgangsmaate til dets isolering og dets anvendelse - Google Patents

Description

Ved det carcinoembryonale antigen (CEA) dreier det

seg om et glykoprotein med elektroforetisk beta^-mobilitet og tilsynelatende molekylvekt på ca. 200.000 Dalton som kan påvises i en liten konsentrasjon på noen ng/ml i serum og/

eller plasma hos sunde pasienter, hos pasienter med benigene sykdommer fremfor alt i tarm, lever og bukspyttkjertel i transitorisk måtelig forhøyede konsentrasjoner inntil ca.

20 - 30 ng/ml eller konstant lavt forhøyet speil og dannes typisk ved pasienter med et flertall av maligne sykdommer (overveiende gastrointestinale karcinomer, pankreaskarcinom, lungekarcinom, metastaserende mammakarcinom) i tumoren og inngår med tydelig sterkt forhøyet konsentrasjoner (inntil maksimalt over 10.000 ng/ml) i blodet eller andre kropps-

væsker. Dets vesentlige kliniske betydning består i tera-

pi- og forløpskontroll (operasjon, hormo-, radio- og kjemo-terapi) av tumorpasienter da det ved en stor del av dem opp-

trer CEA-speilendringer og ofte kan gå måneder foran klin-

isk utvikling (oversikt i Klin. Wschr. 53, 193 - 203, 1975).

Et flertall av metoder til ekstrahering, rensing

og isolering av CEA omtales i den vitenskapelige litteratur (oversikt se ovenfor). Oftest ble det anvendt ekstrahering

av tumorvevnad ved hjelp av perklorsyre. Den ytterligere rensing foregår ved de fleste fremgangsmåter ved kombinasjon av et gelfiltrerings- med et elektroforese-trinn, ved noen metoder også ved ekstra anvendelse av en immunadsorbsjon.

Som utgangsmateriale egner det seg også en CEA fra

en tilsvarende cellekultur.

Det er nå funnet at uten elektroforesetrinn fås et meget rent CEA fra CEA-holdige perklorsyreekstrakter når

a) høymolekylære proteiner adskilles ved gelfiltrering,

b) fra eluatet ved immunadsorbsjon seleksjoneres proteinene med CEA-antigenitet, som c) adskilles ved flytende kromatografi med høyoppløsende søyler (i det følgende betegnet som "høyytelseskromato-grafi).

Det således oppnådde CEA er elektroforetisk hetero-gent, immunologisk imidlertid enhetlig. Det egner seg til fremstilling av radiojodmarkerte derivater for diagnostiske formål.

I det følgende forklares foretrukne utførelses-former ifølge oppfinnelsen nærmere: Adskillelsen av de høyeremolekylære proteiner foregår ved gelfiltrering og hertil egnede søyler ved hjelp av tverrfornettede dekstraner med et proteinfraksjoneringsområde som også adskiller proteiner med en tydelig høyere molekylvekt enn for CEA. Eluatet oppfanges fraksjonert, CEA-innholdet fastslås med vanlige analytiske metoder, de tilsvarende CEA-positive fraksjoner forenes og konsentreres.

Alt etter innholdet av ekstraktet av med CEA kryss-reagerende komponenter (overveiende NCA= nonspecific cross reacting antigen) foregår allerede på dette trinn en forrens-ing under adskillelses av det senere eluerte (fordi lavere-molekylært) NCA.

Det er mulig, imidlertid ikke nødvendig, å rense eluatene ved hjelp av et ytterligere kromatograferingstrinn. Hertil kan det anvendes en søyle med et snevrere skilleområde av proteinfraksjonene, eksempelvis med et fraksjoneringsområde fra 5 10 3 til 5 10 5 D. Herved kan det ofte oppnås en bedre adskillelse av CEA og NCA.

De på denne måte av de høyeremolekylære resp. også laveremolekylære proteiner befridde CEA-positive fraksjoner oppdeles i neste trinn ifølge oppfinnelsen ved hjelp av immun-adsorbs jon. Hertil opplades en egnet adsorbsjonssøyle med forrenset IlgG-globuliner av et polyklonalt anti-CEA-antiserum som delvis ble utvunnet ved immunisering på kaniner eller geiter, eller monoklonalt anti-CEA-antiserum. På denne affini-tetskromatografisøyle has de CEA-positive fraksjoner av det foregående trinn og i første rekke elueres de ikke-bundne proteiner. Deretter elueres med en desorbsjonsbuffer anti-legeme-bundne proteiner og eluatene konsentreres.

Det er mulig å beskikke en annen affinitetskromato-grafisøyle med tilkoplet normalt perklorsyre-lungeekstrakt med et polyklonalt anti-CEA-antiserum idet da antilegemene bindes mot NCA og elimineres fra antiserumet.

Videre er det mulig å fremstille en ekstra affini-tetskromatografisøyle med koplede IgG-antilegemer mot humane serumproteiner som albumin, alf a-^-antitrypsin og surt alfa1~glykoprotein. Ved kromatografi av CEA-holdige preparater på denne søyle er det mulig å fjerne serumproteinforurensinger som ved den første affinitetskromatografi hadde adsorbert uspesifikt.

De således dannede fraksjoner inneholder ved siden

av intakt CEA og NCA dessuten CEA-bruddstykker som likeledes hadde reagert med immunadsorbsjonssøylens anti-CEA-antilegemer. For ytteligere oppdeling slutter det seg derfor til et HPLC-trinn.

I dette siste trinn deles på en høyoppløsende HPLC-søyle de CEA-positive fraksjoner fra de foregående trinn.

Man får således følgende fraksjoner:

1. Molekylvektsområde 250.000 - 150.000: rent intakt CEA,

II. Molekylvektsområde 150.000 - 80.000: immunorekative CEA-bruddstykker (ikke egnet til immunisering) og III. Molekylvektsområde 60.000 - 40.000: intakt NCA og laveremolekylære CEA-bruddstykker.

Fraksjon I kan etter konsentrasjon anvendes direkte for en radiojodmarkering av CEA etter kloramin-T-fremgangsmåten.

"De konsentrerte fraksjoner kan avsaltes ved hjelp

av en egnet søyle og deretter lyofiliseres.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av

noen eksempler.

Prosentangivelsene refererer seg herved til vekt

hvis intet annet er angitt.

Det i eksemplene anvendte CEA-ekstrakt ble utvunnet etter en modifikasjon av fremgangsmåten til Krupey et al.

(Immunochem. 9, 617, 19 72):

Poolet tumorvev (primærtumorer: Colonkarcinom

bl.a., levermetastaser, pr. ekstrahering ca. 500 - 1000 g fuktig vekt) oppbevares ved -70°C, opptines til forarbeidelse og forknuses grovt med saks og kniv og deretter med en maskin-ell knuser (Braun-MULTIMIX, VIRTIS-Homogenizer "60" fra

firma Cenco: 30.000 omdr./min., 1 time, 4°C) med omtrent samme volum destillert vann og homogeniseres til slutt med et apparat ifølge Potter-Elvehjern (60 ml-kar, fra firma Braun) og en motordreven glasspistill til en findispers

grøt. Denne vevgrøtblanding eller sterkt CEA-holdige kropps-væske (f.eks. pleura-eksudat eller ascites, CEA-kons. over 1000 ng/ml) blandes med et likt volum 1,2-molar perklorsyre og omrøres i 30 minutter ved værelsestemperatur. Etter sen-trifugering (1000 g, 20 - 30 minutter, værelsestemperatur) kasseres presipitatet og det overstående overføres ved klart utseende med en gang eller ved uklart utseende (fettholdig) først etter forfiltrering ("Blauband"-filter nr. 589, firma Schleicher&Schiill) i dialyseslange (firma Kalle, Nieder-lassung der Hoechst Aktiengesellschaft, kaliber 38, lengde inntil 100 cm) og dialyseres i dette i en beholder med flytende springvann og stadig til- og bortløp (1-3 l/min.) i 24 - 48 timer. Deretter blandes dialysatet (ca. 1-31)

med NaN^(0,02%) og inndampes ved hjelp av en konsentrerings-innretning (firma Amicon, ultrafiltrasjonscelle "UF 400"

med dialysermembran PM 10, reservoir på 4 1) til ca. 100 ml, oppfylles igjen til 10 ganger volumet med sterilt dobbelt-destillert vann og inndampes igjen til 100 ml. Dette slutt-konsentrat sentrifugeres (10.000 g, 1 time, 4°C) og det overstående lyofiliseres etter ultrafiltrering (Sartorius-filter diameter 25 mm, 0, 2, 0,6 og 3,0 ym). Det fra en utgangs-mengde på 500 - 1000 g fuktig vev dannede perklorsyreekstrakt gir en sluttvekt på 500 - 5000 mg.

Eksempler

1. Gelfiltrering

250 - 350 mg ekstrakt gelfiltreres over en søyle (2,5 x 80 cm) som er fylt med med N,N'-metylenbisakrylamid tverrfornettet allylekstran med en perlediameter på 40 - 150 ym og et proteinfraksjonsområde på 2 x 10 4 til 8 x 10<6>"Sephacryl S 400" fra Pharmacia) (søyle 1) under anvendelse av 0,05-molar tris-HCl-buffer av pH 6,5 (tris-(hydroksyrnetyl)-aminometan-hydroklorid, buffer 1). Elueringshastigheten ut-gjorde 20 - 25 ml/time, samlet ble enkeltfraksjoner til 5 ml.

Det fremkom følgende elueringsdiagram (måling av transmisjon ved 280 nm):

L. Liten fortopp (fraksjon 1),

2. mellomsone (fraksjon 2),

3. bred hovedtopp med steil økning (fraksjon 3) og

4. flatere fall (fraksjon 4).

De oppfangede enkeltfraksjoner på 5 ml ble under-

søkt i immunodiffusjonsprøven med anti-CEA-referanse-anti-

serum resp. i CEA-RIA og forenet i ovennevnte samlefraksjoner.

Fraksjon 1 er fri for CEA (og NCA), i fraksjonene

2-4 avtar mengden av CEA suksessivt og delen av NCA øker fra fraksjon 3. \

Hvis ønskelig kan det ved rekromatografi av fraksjonene 2-4 (enkeltvis eller forenet) oppnås en bedre adskillelse av CEA- og NCA-holdige enkeltfraksjoner. Hertil tjener en "Sephacryl S 200"-søyle (2,5 x 80 cm, proteinfraksjonsområde fra 5 x 10 3 til 2,5 x 10 5, søyle 2). Herved får man fraksjonene 5 -7, idet fraksjon 5 hovedsakelig inneholder CEA og fraksjonene 6 og 7 hovedsakelig NCA.

Fraksjonene 2-4 resp. 5-7 dialyseres i en kon-sentrerer/dialyseringsinnretning (inndampningskar med kollodiumhylser, firma Sartorius) mot en buffer (0,15-molar natrium-klorid i 0,02-molar natriumfosfatbuffer, pH 7,3 med 0,02% natriumazid, buffer 2) og inndampes til 0,5 - 1,5 ml.

Anvender man istedenfor søyle 1 en agarosesøyle "Sepharose 6B" (firma Pharmacia, søyle 3), så får man like-

ledes gode resultater.

Anvender man istedenfor søyle 2 "Sephadex G 200"-

søyle (firma Pharmacia, søyle 4), så oppnås en sammenlignbar adskillelse.

2. Affinitetskromatografi ( immunadsorbsjon)

Det for immunadsorbsjonssøylen nødvendige anti-CEA-antiserum ble fremstilt ved immunisering av kaniner med høyrent CEA resp. forrenset CEA-holdig perklorsyreekstrakt.

Det ble absorbert med lyofilisert normalserum (ca. 10 mg/ml)

og voksne humane A/B-erytrocytter (etter dekomplementering av

antiserumet) inntil ikke-reaktivitet (immunodiffusjons, mikro-skopisk prøve).

Etter avsluttet absorbsjon av antiserum foregår en IgG-preparering ved kontinuerlig anioneutvekslerkromatografi på en "DEAE-Sephacel"-søyle (dietylaminoetylcellulose, firma Pharmacia, søyle 5). Som start-buffer benyttes 0,01-molar natriumfosfatbuffer, pH 8,0 (buffer 3) og som grensebuffer 0,5-molar natriumfosfatbuffer pH 4,5 (buffer 4), idet det elueres med en ekstremt konkav pH- og molaritetsgradient (f.eks. ved hjelp av "Ultrograd" gradientblander, firma LKB). Valget av CEA-reaktive rene anti-CEA-IgG-fraksjoner (begyn-nelsesfraksjoner, fraksjon 8) foregår etter immunodiffusjons-resp. immunelektroforesepr.ven, tidsmessig senere eluerte CEA-reaktive antilegemer som imidlertid er forurenset med andre proteiner samles adskilt og anvendes"som antisera for immunodiffusjonen, resp. immunelektroforese (fraksjon 9).

For fremstilling av immunadsorbsjonssøylen fylles en søyle (1,5 x 20 cm) med 10 - 20 g av en fornettet dekstran (bromcyan-aktivert "Sepharose 4 B" fra firma Pharmacia, søyle 6) og tilkoplet 100 - 200 mg av det kromatografisk rensede IgG-globulin av anti-CEA-antiserum (fraksjon 8). På denne søyle has 2 - 4 ml av fraksjonene 2-4 resp. 5 - 7 og elueres langstomt (20 sekunder/dråper) med buffer 2 i løpet av 2-4 timer (transmisjonsmåling ved 280 nm). Etter fullsten-dig eluering av de ikke-bundne proteiner elueres de antilege-me-bundne proteiner med en desorbsjonsbuffer (buffer 2 med 2,0 m KSCN, pH 7,3, buffer 5) (10 sek./dråper). Derved frem-kommer i elueringsdiagrammet en høy spiss gradient som ved ytterligere eluering etter hvert faller til et platå som på grunn av KSCN-transmisjonspåvirkning ved 280 nm ligger tydelig over utgangsnivået (100% transmisjonslinje). Etter full-stendig eluering (platålinje parallell til 100%-linjen) rege-nereres søylen med buffer 2, idet det i elueringsdiagrammet platålinjene igjen faller til 100%-utgangslinjen av trans-misjonsmålingen.

Det oppfanges følgendes fraksjoner:

Fraksjon 10 (ikke-bundne proteiner),

fraksjon 11 (mellomfraksjon) og

fraksjon 12 (bundne proteiner). Fraksjon 12 inneholder intakt CEA, CEA-bruddstykker og NCA.

Fraksjon 10 konsentreres til 0,5 - 1,0 ml ved dia-lyse mot buffer 2 (kollodiumhylser) og prøves på CEA/NCA. Fraksjon 11 kasseres. Fraksjon 12 dialyseres mot 0,05 m natriumfosfatbuffer pH 7,5 (buffer 6) og inndampes til 50 - 200 yl.

Når søyle 6 i tillegg opplades med anti-CEA-IgG-antilegemer av et antiserum som på forhånd ble absorbert med normal milt- resp. lungevevekstrakt (sterkt NCA-holdig) dg derfor fri for antilegemer mot NCA, inneholder fraksjon 12

i dette tilfelle ikke mere NCA.

Når fraksjon 12 på grunn av uspesifikk absorbsjon fra søyle 6 ennå har serumproteinforurensninger (f.eks. albumin, alf a-^-antitrypsin, surt alfa^-glykoprotein) , kan disse fjernes ved immunadsorbsjon over en ytterligere' søyle 7 med tilkoplede IgG-antigener mot humane serumproteiner resp. perklorsyreekstraherte serumproteiner, idet da den først eluerte fraksjon (fraksjon 13) inneholder serumproteinfritt

CEA/NCA.

De til videre forarbeidelse anvendte fraksjoner inneholder ved siden av intakt CEA og NCA dessuten CEA- bruddstykker.

3. Høyytelseskromatografi

Den avsluttende isolering av CEA, NCA og CEA-bruddstykker foregår, ved høytoppløsende sterisk oppslutnings-kromatografi med en HPLC-søyle ("Ultro-Pac TSK" G 4000 SW, 7,5 x 600 mm, proteinfraksjonsområde 5000 - 1 million, firma LKB, søyle 8). Det ble anvendt en HPLC-innretning fra firma LKB ("Multi-Perpex"-pumpe, UV-gjennomstrømningsfotometer "Uvicord S", fraksjonssamler "Ultro-Rac II", 2-kanals flat-lagringsskriver). Det påføres 50 - 500 yg protein i 50 - 250 yl av den inndampede fraksjon 12. Det elueres med buffer 6 ved en elueringshastighet på 6 ml/time i 350 yl-fraksjoner over 5 timers samlet skilletid.

I elueringsdiagrammet /måling av transmisjon og absorbsjon med variabel følsomhet fra 0,01 - 0,1 ved 280 nm) befinner det seg tre hovedtopper idet den midlere topp har en skulder, dvs. består av minst 2 underfraksjoner.

Tilsvarende elueringsdiagrammet ble det samlet følgende fraksjoner:

Fraksjon 14 (hovedfraksjon, CEA-reaktiv),

fraksjon 15 (CEA-reaktiv) og

fraksjon 16 (NCA-reaktiv og CEA-reaktiv).

Etter en kalibrering av HPCl-søylen med referanse-proteiner (tyroglobulin (molekylvekt 330.000) inntil alfa-laktalbumin (molekylvekt 14.400)) kan molekylvekten av de dannede fraksjoner vurderes som følger: Fraksjon 14: 250.000 - 150.000 D,

fraksjon 15: 150.000 - 80.000 D,

fraksjon 16: 80.000 - 40.000 D.

Etter konsentrasjon til 100 - 200 yl i buffer 6 kan fraksjonene umiddelbart anvendes for en radiojodmarkering etter kloramin-T-fremgangsmåten. De kan også avsaltes på en "Sephadex G 25"-søyle (2,0 x 20 cm, søyle 9) og deretter lyofiliseres idet det fås sluttproteinmengder mellom 100 og 1000<yg.>

Fraksjon 14 inneholder høyrenset intakt CEA og fraksjon 16 intakt NCA mens fraksjon 15 inneholder immunreaktive CEA-bruddstykker som f.eks. dessuten kan anvendes til immunisering.

4. Jodering av CEA

20 yg CEA i 20 yl 0,05-molar natriumfosfatbuffer

av pH 7,4 (idet følgende "buffer 7") blandes med ca. 1,5 m

125

CiNA- J (avbufret med 10 yl 0,5-molar buffer 7) og etter tilsetning av kloramin-T-oppløsningen (20 yg kloramin T i 100 yl 0,05-molar buffer 7) omrøres reaksjonsblandingen i 60 sekunder. Deretter stoppes reaksjonen ved tilsetning av natrium-metabisulfitt (20 yg Na2S205i 50 yl 0,05-molar buffer 7).

Det blandes ytterligere 30 sekunder og tilsettes til stabili- sering 0,2 ml storfeserumalbuminoppløsning (1% storfeserum-albumin, 0,05-molar buffer 7, 0,1% NaN-.) .

Rensingen av det<125>J-markerte CEA foregår ved høy-ytelseskromatografi-adskillelse av joderingsblandingen over en søyle 8.

Elueringsbuffer: 0,0 5-molar buffer 7, 0,1% NaN3, strømning: 0,1 ml/min.

Spesifikk aktivitet: ca. 30 m Ci/mg, immunreakti-vitet: ca. 90%.

Claims (10)

1. Carcinoembryonalt antigen (CEA) oppnåelig av CEA-holdige perklorsyreekstrakter ved a) adskillelse av hø yeremolekylære proteiner ved gelfiltrering, b) seleksjonering av proteinene med CEA-antigenitet fra eluatet ved immunadsorbsjon og -c) oppdeling ved væskekromatografi med høyoppløsende søyler.

2. Fremgangsmåte til isolering av CEA fra CEA-holdige perklorsyreekstrakter, karakterisert ved at a) høyeremolekylære proteiner adskilles ved gelfiltrering, b) fra eluatet æleksjoneres ved immunadsorbsjon proteiner med CEA-antigenitet som c) oppdeles ved væskekromatografi på høyoppløsende søyler.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at de høyeremolekylære proteiner adskilles ved gelfiltrering på tverrfornettede dekstraner.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at til immunadsorbsjon opplades en søyle med IgG-globuliner av et anti-CEA-antiserum.

5. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 2-4, karakterisert ved at ved væskekromatografi med høytoppløsende søyler adskilles CEA som fraksjon med molekylvektsområde på 250.000 - 150.000.

6. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 2-5, karakterisert ved at det CEA-holdige eluat av væskekromatografien etter konsentrering anvendes for en radiojodmarkering.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at radiojodmarkeringen foregår etter kloramin-T-fremgangsmåten.

8. Radiojodmarkert CEA, oppnådd ifølge krav 6 eller 7.

9. Anvendelse av CEA ifølge krav 1 til fremstilling av diagnostika.

10. Diagnostikum inneholdende et radiojodmarkert CEA ifølge krav 8. 3