NO794255L

NO794255L - Stabilt kalibreringspreparat.

Info

Publication number: NO794255L
Application number: NO794255A
Authority: NO
Inventors: Douglas Armstrong
Original assignee: Coulter Electronics
Priority date: 1978-12-26
Filing date: 1979-12-21
Publication date: 1980-06-27
Also published as: BR7908391A; ES487222A0; SE7910607L; AU5414779A; ES8102678A1; DE2951783A1; BE880822A; IL58991A0; US4250051A; IT7951169A0; FR2445529A1; AR222515A1; GB2040044A; NL7909237A; JPS55124072A; DK550579A

Description

Stabil kalibreringssammensetning.

Det er en vanlig medisinsk fremgangsmåte å analysere og å prøve en pasients blodprøve for å gjennomføre visse klassiske bestemmelser i forbindelse med blodprøven. De ka-rakteristiske parametre som skal bestemmes, er antall røde blodlegemer (RBC), antall hvite blodlegemer (WBC), hematokrit-verdien (HCT), hemoglobininnholdet (HGB), det midlere blod-legemevolumet (MCH) og den midlere blodlegemehemoglobinkonsen-trasjon (MCHC). Det finnes på markedet adskillige modeller av instrumenter for beregning og analysering av blodlegemer, og slike instrumenter er godt kjente for fagmannen. Det selges instrumenter som tar i mot en pasients blodprøve og automatisk og kontinuerlig behandler denne prøve for å frembringe én eller flere av de ovenfor nevnte parametre. Den generelle fremgangsmåte i forbindelse med slike instrumenter, er å tilsette et lyseringsmiddel til en suspensjon av fortynnet fullblod som inneholder et antikoaguleringsmiddel. Lyseringsmidlet øde-legger de-..røde blodlegemer og frigjør disses innhold i opp-løsningen. Den resulterende suspensjon har et farvestoff frembrakt av de sprengte røde celler og de upåvirkede hvite celler. Et reagens tilsettes for å fiksere hemoglobinet i oppløsningen, slik at farven bevares og gjøres tilgjengelig for hemoglobinmåling.

Før anvendelse av automatisert utrustning for en diag-noseprøving in vitro av blodlemeger, kreves en kalibrering av instrumentet, avhengig av utstyrets konstruksjon og automa-tiseringsgrad. Det er utviklet kalibreringssammensetning av en slik type som anvenderen kontinuerlig støter på, og denne er grundig bedømt mot det instrument som kalibreres ved hjelp av referansefremgangsmåter. Denne sammensetning som er frembrakt med en tildelt verdi, tilbys anvenderen for at denne skal'kunne kalibrere sitt instrument med den tildelte verdi på hurtig og nøyaktig måte.

Som det var å vente, har en hematologisk sammensetning for anvendelse ved en slik kalibrering en tendens til forurens-ning på grunn av bakterier og sopper. Et hensiktsmessig konserveringsmiddel bør derfor tilsettes. De typiske konserve-ringsmidler som anvendes innenfor hematologien, har vist seg å gi sidevirkninger, eller virker i andre henseender ikke på

egnet måte for dette formål.

Konserveringsmidlet skal være forenlig med den blod-prøve som analyseres på allerede angitt måte, og midlets konserveringsegenskaper skal ikke reduseres merkbart på grunn av det blodprotein som foreligger. På samme måte skal konserveringsmidlet ikke danne pigment med blodhemolysatet eller med andre midler som tilsettes senere ved hemoglobinbestemmelsen. Dessuten skal det ikke danne en gel som kan forstyrre opprett-holdelsen av hemolysatet i flytende tilstand under den begren-sede tid som kalibreringsmidlet anvendes, hensiktsmessig under ca. 120 døgn ved 4°C.

Konserveringsmidlet skal være tilstrekkelig oppløselig

i hemolysatet ved den pH-verdi som oppstår på grunn av konsentrasjonen av og med mengden av det spesielle lyseringsmiddel som anvendes for å frembringe en konserverende mengde av mid-let mot slike bakterier som vanligvis finnes i disse omgivelser, og spesielt mot Pseudomonas aeruginosa, som generelt forefinnes i slike omgivelser.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, har visse halogensubstituerte fenolforbindelser som i det følgende kalles for "halogenfenoler" vist seg å være anvendelige somantibakterielle og antifungicide midler for å konservere kalibreringssammensetninger som er oppnådd ved lysering av full-blodprøver ved hjelp av saponin, hvorved disse sammensetninger kan anvendes som kalibreringsmidler for instrumenter som bestemmer hematologiske verdier i blodprøver.

Det er kjent at fenoler er effektive bakteriocider

mot patogener når de anvendes i de riktige konsentrasjoner, og at deres antibakterielle virkning sammenligningsvis er uavhen-gig av bakteriell konsentrasjon og organiske stoffer. Generelt resulterer innføring av alkylgrupper og av halogenatomer i fe-nolkjernen i en markert økning av fenolkoeffisienten, men resulterer også i en markert redusert oppløselighet i vannopp-løsninger, spesielt når pH-verdien ligger innenfor 4-7. Som en følge av dette, er mange av fenolene anvendelige som bakteriocider kun ved nærværet av visse organiske oppløsnings-midler, eller i alkalisk oppløsning som et fenolsalt.

Helt uventet har det vist seg at visse halogenfenoler som er kun meget lite oppløselige i destillert vann, er mange ganger oppløselige i et hemolysat av røde blodceller som er lysert ved hjelp av sapomin til å oppvise en resulterende pH-verdi mellom 4 og 7. Som et eksempel kan det angis at selv om 4-klor-3,5-xylenol er oppløselig i destillert vann, kun i en størrelsesorden 1:3000 vekt/volum, hvorved denne mengde er utilstrekkelig til å være effektiv som konserveringsmiddel mot Psuedomonas aeruginosa, vil nærværet av 1 % vékt/volum saponin

i hemolysatet øke oppløseligheten til en verdi større enn 1:1000 vekt/volum, ved hvilken konsentrasjon idenne klorfenol er kjent å være effektiv mot vanlige bakterier i omgivelsene som omfatter Pseudomonas aeruginos. I denne henseende skal det hen-vises til side 7 6 i "Disinfectants, Their Values and Uses", av W.E. Finch, The MacMillan Company, New York, 1953. Den fore-trukne konsentrasjon av halogenfenolen i hemolysatet er fra ca. 1:1000 til 1:1750 vekt/volum.

Laboratorieresultater bekrefter at 4-klor-3,5-xylenol oppløses i et omfang som er 7 ganger større i en 2 %-saponin-oppløsning enn i destillert vann.

Oppløseligheten av 4- klor- 3, 5- xylenol er:

De ovenfor angitte resultater er oppnådd ved ultra-fiolettavsøkninger (A-max for 4-klor-3,5-xylenol ved 2800 Å) for en fortynning på 1:1000. vekt/volum.

Forbindelsen 4-klor-3,5-xylenol er kommersielt tilgjengelig under betegnelsen "OTTASEPT". Ifølge produsenten, er oppløseligheten i vann ved 25°C 0,025 g/dl. Fenolkoefi-sienten er 60.

Ifølge et trekk ved oppfinnelsen, angis det en fremgangsmåte som kan anvendes for kalibrering av instrumenter som bestemmer hematologiske verdier som inkluderer beregning av hvite legemer i blodprøver, og den omfatter lysering av de røde blodlegemer ved omrøring med en vannoppløsning av saponin for å danne et hemolysat, og den karakteriseres spesielt ved at til hemolysatet settes en konserverende mengde av et halogenfenol som har en fenolkoeffisient mellom 20 og 90, hvorved konsentrasjonen av det nevnte halogenfenol i hemolysatet er fra ca. 1:1000 til 1:1750 vekt/volum, og det nevnte hemolysatet har en pH-verdi mellom 4 og 7.

Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen, frembringes det en stabil kalibreringssammensetning som kan anvendes for kalibrering av instrumenter som bestemmer hamatologiske verdier i fullblodprøver, og den omfatter et hemolysat av røde blodlegemer som er lysert ved hjelp av en saponinoppløsning. Det spesielt karakteriserende er en mengde konserveringsmiddel av et halogenfenol som har en fenolkoeffisient mellom 20 og 90, og der videre det nevnte hemolysatets konsentrasjon er fra ca. 1:1000 til 1:1750 vekt/volum, og det nevnte hemolysat har en pH-verdi mellom 4 og 7.

Ifølge ytterligere et trekk ved oppfinnelsen, anvendes det et halogenfenol for å ,stabilisere'en sammensetning for kalibrering av instrumenter som bestemmer hamatologiske verdier i fullblodprøver, og det karakteristiske er anvendelse av en konserverende mengde av en halogenfenol som har en fenolkoeffisient mellom 20 og 90 og er tilsatt til et hemolysat av røde blodlegemer som er lysert ved hjelp av en vannoppløsning av saponin, idet hemolysatets konsentrasjon ligger mellom ca. 1:1000 og 1:1750 vekt/volum og med en pH-verdi i hemolysatet mellom 4 og 7.

Eksempler på andre halogene fenoler med høy fenolkoeffisient og som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, er 2,4-diklor-3,5-dimetylfenol (PCMX); 4-brom-fenol; 2-klorfenol; 3-klorfenol og 4-klor-3-metylfenol (PCMC). De forskjellige halogene fenolers fenolkoeffisient er angitt i forskjellige referansebøker, f.eks. Merck Index, 9. opplag, 1976, eller de kan bestemmes ved metoder som er godt kjent for fagmannen. En fenol koeffisient mellom 20 og 90 er å foretrekke.

Saponin er et naturprodukt som finnes i visse veksters røtter, og som danner skum i vannoppløsninger. I kjemisk henseende består saponin av en sapongenin som kan utgjøres av en steroid eller en triterpen, og en sukkerart som kan ut-gjøres av glykose, galaktose, pentose eller metylpentose. Saponin er kommersielt tilgjengelig fra en rekke fabrikanter. Saponin som anbefales for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse, er det kommersielle produkt som er av høy hemo-lytisk kvalitet. Saponin tilsettes i en konsentrasjon av 0. 5 til 3 % vekt/volum, beregnet på sluttproduktet. Når den anvendes som et lyseringsmiddel for de røde blodlegemer i fullblod, har den resulterende oppløsning en pH-verdi mellom 4 og 7.

Foreliggende oppfinnelse angir at den felles anvendelse av saponin og 4-klor-3,5-xylenol vil øke oppløseligheten av 4-klor-3,5-xylenol til en verdi der forbindelsen virker som et effektivt konserveringsmiddel for å forbringe stabile kalibreringssammensetninger for apparater som bestemmer hematologiske verdier i blodprøver.

For prosedyrer og utstyr som omfatter telling av hvite blodlegemer, tilsettes de aldehydfikserende røde celler (fra mennesker, dyr, fugler eller reptiler) som utgjør et substi-tutt for de hvite legemer, plater eller røde blodlegemer som finnes i de vanlige blodprøver, til det hemolysat som inneholder konserveringsmidlet, for å frembringe et egnet kalibreringsmiddel for hematologisk analyse.

Den følgende detaljerte prosedyre en fremgangsmåte

for frembringelse av en stabil kalibreringssammense.tning som kan anvendes for apparater som frembringer en bestemmelse av de hvite blodlegemer(WBC) og/eller hemoglobin (HGB). Denne fremgangsmåte kan også anvendes i apparater som gjør enten én eller begge disse bestemmelser i kombinasjon eller som tilsetning til andre blodcelleparametermålinger.

1. Enheter av ferske og med steril koksaltoppløsning (0,9 % vekt/volum^natriumklorid i destillert vann) tre ganger vaskede pakkede røde legemer tilrettelegges som et legeme for å danne et volum som overstiger det volum som er nødven-dig for sluttproduktets satsstørrelse. 2. Efter en grundig blanding som f.eks. skjer ved å rulle den stengte flaske med 8 til 12 omdreininger pr. min. i en pe-riode på 15 til 39 minutter, tas det ut en prøve og hemoglobinet må bestemmes. Ved hjelp av det bestemte hemoglobinnivå, be- regnes det volum av pakkede røde blodceller som er nødvendig for å medføre det ønskede produkthemoglobinnivå. 3. Den nødvendige volum pakkede celler måles derefter i en annen steril flaske med et volum som er nødvendig for slutt-produktsatsen.

4. Til de pakkede celler settes et beregnet volum av et

2 % vekt/volum vannoppløsning av saponinoppløsning, frembrakt med sterilt destillert vann, for å bringe hemoglobinet til det ønskede nivå. For dette formål, filtreres saponin av kommer-siell kvalitet gjennom et filtermembran med en porestørrelse på 1,2 ym. Den endelige saponin konsentrasjon i hemolysatet er ca. 1 % vekt/volum. 5. Flasken stenges og vendes opp ned diverse ganger. Lyseringen av de røde blodlegemer fremgår av oppløsningens dyp-røde farve. 6. Pulver av 4-klor-3,5-xylenol settes derefter til hemolysatet i en mengde av 0,1 g/dl av sluttproduktets satsvolum. 7. Flasken stenges og vendes opp ned flere ganger og an-bringes derefter på en mekanisk rulleblander i ca. 2 til 3 timer. Efter at oppløsningen er grundig blandet, tilsettes et beregnet volum av formaldehydfikserende røde blodlegemer til oppløsningen. Det beregnede volum av fikserte blodlegemer vil avhenge av den ønskede partikkeberegning av hvite blodlegemer i sluttproduktet. 8. Efter tilsetning av de formaldehydfikserte røde blodlegemer, stenges flasken og plasseres i den mekaniske rulleblander i ca. 30 min. Efter at blandingen er grundet blandet, tas det ut en prøve for telling av hvite blodlegemer, og hemoglobinbestemmelse under anvendelse av den instru-menttype der kalibreringsmidlet skal anvendes. 9. Hvis de tellede hvite blodlegemer og/eller hemoglo-binverdien ligger utenfor området for de forventede verdier, kan disse justeres ved tilsetning av ytterligere pakkede røde blodlegemer eller saponinoppløsning eller fikserte celler, avhengig av hvilket tilfelle det er tale om. 10. Når en sats kalibreringsmiddel er brakt ferdig, kan den anvendes umiddelbart for fylling av små glassflasker som derefter lagres ved lav temperatur, f.eks. 4°C. Alternativt kan den store flasken lagres ved en så lav temperatur som 4°C inntil den anvendes for påfylling. Før påfylling i de små flasker, oppvarmes oppløsningen til en temperatur av omtrent 22°C og rulles til det er skjedd en grundig blanding. 11. Når kalibreringsmidlet er fylt i de små flasker, skjer det en statistisk gyldig prøvetaging av disse for bestemmelse av kalibreringsmidlets kalibreringsverdi. 12. Kalibreringsmidlets kalibreringsverdi oppnås ved å an-vende samtlige prøvetatte små flasker på det instrument eller det instrumentsystem der de er ment å komme til anvendelse. Instrumentet eller instrumentsystemet er tidligere blitt kali-brert ved anvendelse av en fersk normal blodprøve. Hemoglobin-verdien og antallet hvite blodlegemer er bestemt ved erkjente referanseprosedyrer. Efter at kalibreringsmidlets kalibreringsverdi er bestemt og analysisert statistisk, blir de gitt de endelige kalibreringsverdier for å kunne brukes av brukeren for kalibrering av dennes instrumenter.

Da den her beskrevne prosedyre er utviklet spesielt

for anvendelse i utstyr som arbeider ifølge Coulter-prinsippet, kan kalibreringssammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes ved andre hemoglobinbestemmelser og partik-keltellingsystemer, hvis tidligere referanseverdier er oppnådd for kalibreringssammensetningen ifølge den alternative metode eller systemet på samme måte som for foreliggende kalibreringsmiddel.

Claims

1. Fremgangsmåte for tilveiebringelse av en stabil sammensetning som kan anvendes for kalibrering av::instrumenter som bestemmer hematologiske verdier som inkluderer telling av hvite blodlegemer i blodprøver og omfatter lysering av de røde blolegemer ved rysting med en vannoppløsning av saponin for å danne et hemolysat, karakterisert ved at det til hemolysatet settes en konserverende mengde av en halogensubstituert fenolforbindelse, et halogenfenol, som har en fenolkoeffisient på mellom 20 og 90, idet den nevnte halogenfenols konsentrasjon i hemolysatet går fra 1:1000 til 1:1750 vekt/volum, og der hemolysatet oppviser en pH-verdi mellom 4 og 7.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en beregnet mengde aldehydfikserte røde blodlegemer som er tilstrékkelig til å erstatte de hvite blodlegemer som vanligvis finnes i fullblod, settes til hemolysatet under det i den karakteriserende del av krav 1 angitte trinn.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at man som halogenfenol benytter 4-klor-3,5-xylenol.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at en 2% vekt/volum vannoppløsning av saponin i destillert vann anvendes som fortynningsmiddel for å frembringe en omtrentlig saponinkonsentrasjon på 1 % vekt/volum i hemolysatet.

5. Stabil kalibreringssammensetning for anvendelse ved kalibrering av instrumenter som bestemmer hematologiske verdier i fullblodprøver, og omfattende et hemolysat av røde blodlegemer som er lysert ved hjelp av en. vannoppløsning av saponin, karakterisert av en konserverende mengde av en halogenfenol som har en fenolkoeffisient på mellom 20 og 90, der hemolysatets konsentrasjon er fra 1:1000 til 1:1750 vekt/- volum, og hemolysatet oppviser en pH-verdi på mellom 4 og 7.

6. Sammensetning ifølge krav 5, karakterisert av tilsetning av en beregnet mengde aldehydfikserte røde blodlegemer som er tilstrekkelig til å erstatte de hvite blod legemer som vanligvis finnes i fullblod.

7. Sammensetning ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at halogenfenolen er 4-klor-3,5-xylenol.

8. Sammensetning ifølge krav 5 eller 6, karakterisert" ved at en 2% vekt/volum vannoppløsning av saponin i destillert vann anvendes som fortynningsmiddel for å oppnå en omtrentlig konsentrasjon på 1 % vekt/volum i hemolysatet.

9. Anvendelse av en halogenfenol for å stabilisere en sammensetning for kalibrering av instrumenter som bestemmer hematologiske verdier i fullblodprøver, karakterisert ved anvendelse av en konserverende mengde av en halogenfenol som har en fenol koeffisient mellom 20 og 90, tilsatt til et hemolysat av røde blodlegemer som er lysert ved hjelp av en vannoppløsning av saponin, der hemolysatets konsentrasjon er fra 1:1000 til 1:1750 vekt/volum, og der hemolysatet oppviser en pH-verdi mellom 4 og 7.

10. Anvendelse av en halogenfenol ifølge krav 9, karakterisert ved tilsetning av en beregnet mengde aldehydfikserte røde blodlegemer som er tilstrekkelig til å erstatte de hvite blodlegemer som vanligvis finnes i fullblod .

11. Anvendelse av halogenfenol ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at halogenfenolen utgjøres i av 4-klor-3,5-xylenol.

12. Anvendelse av halogenfenol ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at en 2% vekt/volum vann-oppløsning av saponin i destillert vann anvendes som fortynningsmiddel for å frembringe en omtrentlig konsentrasjon på . il % vekt/volum i hemolysatet.