NO783783L - Diagnostisk fremgangsmaate. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til in

vitro gjennomførende diagnostikk av den celleformidlede immuni-tetsstilling av mennesker og dyr ved påvisning av den endrede bevegelighet av oppladede indikatorpaftikler i det elektriske felt, som har blitt behandlet med et medium av med antigener inkuberte lymfosyter.

Fra de tyske søknader 24 41 536 og 24 62 416 er det kjent in vitro diagnostisk fremgangsmåte. Ifølge denne inkuberes lymfosyter med antigener, inkubasjonsblandingen eller det cellefrie ovenstående haes til en dispersjon av indikatorpartikler og deretter måles vandringshastigheten av indikatorpartiklene i et elektrisk felt. Som indikatorpartikler anvendes derved slike partikler som i det elektriske felt viser et i det vesentlige enhetlig forhold og som med det lymfosyt-overstående inngår vekselvirkninger, hvorved partiklenes forhold i det elektriske felt endres målbart. I en foretrukket utførelsesform anvendes som indikatorpartikler denaturerte erytrocyter. Som denaturerende stoffer foretrekkes tannin'og/eller sulfosalizilsyre. Med denne fremgangsmåte som går tilbake til E.J. Field og E.A. Caspary,

The Lancet, 1970, side 1337-1341, er det mulig å diagnostere maligne sykdommer når det som antigener anvendes den såkalte .enzefalitogehe faktor (EF) eller et basisk protein fra sentral-nervøs vevnad.

Disse antigene stoffer er ikke bare vanskelig defi-nert,men også■vanskelig tilgjengelig, deres egenskaper er påvirket av fremgangsmåten for deres fremstilling. Med henblikk på be-tydningen av påvisningen av sensibiliserte lymfocyter til diagnostikk av maligne sykdommer, fremkommer derfor den oppgave å erstatte det angjeldende antigen med definerte kjemiske stoffer.

Ifølge oppfinnelsen er det nu mulig at en erstatning av EF resp. det basiske protein fra sentralnervøs vevnad ved syntetiske peptider er mulig.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig en diagnostisk fremgangsmåte in vitro, hvor lymfocyter inkuberes med et syntetisk peptid av høy basisitet, hvoretter vandringshastigheten i det elektriske felt måles. Lymfocytene er følgelig indikatorpartikler, hvis elektriske forhold etter deres inkubasjon med et syntetisk peptid endres målbart. Inkubasjonsblandingen bestående av lymfocyter og peptidet får ved inkubasjonen på sin side en endring av sin sammensetning, som kan påvises ved et endret elektrisk forhold av en annen partikulær indikator. Påvisningen av det endrede elektriske forhold foregår hensiktsmessig i målingen av vandringshastigheten i det elektriske felt.

Som basiske peptider innen oppfinnelsens ramme anvendes fortrinnsvis syntetiske polypeptider, bestående i det vesentlige av lysin, arginin og/eller ornitin, spesielt poly-L-lysin, poly-L-arginin eller poly-L-ornitin, men også deres homogene eller heterogene blandinger. Spesielt fordelaktig anvendes innen oppfinnelsens ramme poly-L-lysin med en molekylvekt på 750-10.000, fortrinnsvis et slikt med en molekylvekt på 750-5.000. Poly-L-lysin har den fordel at det er oppnåelig som salt, f.eks. som hydrobromid eller hydroklorid, i sterkt stabil form.

I første rekke er det som indikatorpartikler å anse' selve lymfocytene, hvis elektriske forhold etter inkubasjon med syntetisk peptid av høyere basisitet endres målbart. En høyere følsomhet viser fremgangsmåten når ikke lymfocytene selv måles i deres forhold, men når de ved inkubasjon i inkubasjonsblandingen opptredende endringer overføres på andre indikatorpartikler og deres endrede elektriske forhold bestemmes. Som slike andre indikatorpartikler kommer det i det vesentlige på tale de som i et elektrisk felt viser et praktisk talt enhetlig forhold og som inngår vekselvirkninger med bestanddelene av inkubasjonsblandingen av syntetisk peptid og lymfocyter, således at partiklenes forhold i det elektriske felt endres målbart og som direkte er iakttagbar og målbar med en egnet innretning. Spesielt er det som indikatorpartikler anvendbart med denaturerende stoffer behandlede, eksempelvis tannin- og/eller sulfosalizilsyre-behandlede, menneske-lige og dyriske erytrocyter. Fortrinnsvis anvendes som indikatorpartikler tannerte erytrocyter, som ble stabilisert ved fremgangsmåten av Becht, J.Immunol. 101, side 18-22 (1968) med sulfosali-cilsyre. Egnet er også liposomen-membranpartikler.

Lymfocytene isoleres etter i og for seg kjente frem-gangsmåter fra perifert blod, etter at det som vanlig er gjort koagulerbart, eksempelvis ved tilsetning av et koagulerings- :.. hemmende stoff som heparin. De på denne måte fremstilte rensede lymfocyter kan nu inkuberes med de syntetiske basiske polypeptider under betingelsene av ovennevnte fremgangsmåte. Er i inkubasjonsblandingen lymfocyter tilstede, som er sensibilisert med tumor-assosierte antigener, frigjøres stoffer, muligens såkalte lymfo-kiner, Deres vekselvirkning med indikatorpartiklene fører til en endring av deres vandringshastighet i det elektriske felt. Denne endring er målbar.

Anvendes tannerte erytrocyter eller andre indikatorpartikler som blandes med et inkubasjonsmedium av det cellefrie lymfocytoverskudd, lønner det seg å blande 0,1 til 1,0 ml av en suspensjon med 1 x 10 7 til 5 x 10 7 partikler pr. ml med 1 til 10 ml fortrinnsvis 3 ml av inkubasjonsmediet.

Inkubasjonsmediet kan fåes som følger:

1 x 10 6 til 1 x 10 7 ved hjelp av gradientsentrifugasjon fremstilte lymfocyter av en prøve inkuberes med 0,01 til 100 yg er syntetisk peptid, fortrinnsvis poly-lysin, 90 minutter til 1800 minutter ved 25 til 37°C. Deretter adksilles lymfocytene

fra det ovenstående, hensiktsmessig ved sentrifugering, og det overstående anvendes til ladning av indikatorpartiklene som anført ovenfor. Det er imidlertid ikke nødvendig å anvende det cellefrie lymfocytoverstående. Tilstedeværende lymfocyter forstyrrer blandingen knapt.

De behandlede indikatorpartikler analyseres eksempelvis i et celleelktroforesesystem som muliggjør registrering av vandringshastigheten. Vurderingen foregår ved fastslåelse av avvikning av den elektroforetiske vandringshastishet fra null-verdien bg den verdi som fremkommer ved anvendelse av lymfocyter av friske personer. Lymfocyter fra en tumorantatt pasient be-virker i inkubasjonsoverstående en forlangsomgjøring av den elektroforetiske bevegelighet av de dermed oppladede indikator-patikler i forhold til indikatorpartikler som ble fremstilt bare med et fysiologisk tålbar inkubasjonsmedium (nullverdi), samt overfor indikatorpartikler, som er blitt fremstilt med overstående av inkubasjonen av polypeptider med lymfocyter av sunne personer. En slik langsomgjøring vurderes diagnostisk som patologisk.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler:

Eksempel 1

I en sprøyte med 0,5 ml heparinoppløsning uttas en prøve 25 ml venøst blod. Blodprøven has på en søyle (2 cm diameter, 30 cm høyde) fylt med glassperler (2 mm diameter) og hen-settes i dyrkningsskap ved 37°C i 90 minutter. Deretter fortynnes eluatet av søylen i forholdet 1:4 med Hank's oppløsning med et innhold av 0,05 % EDTA, Na2_saltet av etylendiamintetraeddiksyre. Det fortynnede eluat sjiktplasseres over 1/4 av volumet av en opp-løsning bestående av natrium-, kalsium-, magnesium- og metyl-glukaminsalter av metrizoe-syre("Ronpacon", Cilag-Chemie GmbH, Alsbach) og en høymolekylær kopolymer av sakkarose og epiklorhydrin ("Ficoll", Pharmacia, Uppsala) med tetthet 1,074 og sentrifugeres

i 15 minutter ved 250 g. Den over tetthetsgradienten liggende lymfocytring taes av med hevert, vaskes en gang med nevnte Hank's og EDTA-oppløsning og deretter to ganger med Hank's oppløsning. Cellene fra-sentrifugeres og opptas i 0,5 ml RPMI 1640 medium uten serum. RPMI 1640-medium er et kulturmedium for cellevekst og består av en blanding av aminosyrer, vitaminer, uorganiske salter, pufferstoffer og antibiotika i følgende sammensetninger:

Moore, G.E., Sandberg, A.A. og Ulrich, K., J.Vat. Can. Inst., 36/3: 405 (mars 1966). Den er oppnåelig i handelen.

Celletallet bestemmes i en Coulter-teller (Fremstiller: Coulter Electronics, Krefeld) og lymfocyt-suspensjonen innstilles med RPMI 1640-medium på 1 x 10 7 celler pr. ml. 0,7 ml av denne cellesuspensjon sentrifugeres, sedimentet opptas i 3 ml RPMI 1640-medium som inneholder 0,01 mg/ml poly-L-lycin MG 3400 og inkuberes i 18 timer. Deretter frasentrifugeres lymfocyten og 3 ml av det overstående inkuberes med 1 ml av en cellesuspensjon (5 x 10 stabilisert og tannerte erytrocyter pr. ml Hank's) 1-2 timer. Deretter hås denne cellesuspensjon for måling i et apparat for celleelektroforese og vurderes den elektroforetiske vandring av partiklene diagnostisk på nærvær av en kreftsykdom.

Som apparat for celleelektroforese tjener; et mikroskop' som er egnet for bestemmelse av den elektriske overflateladning av suspenderte mikroskopiske partikler på grunn av deres vandringshastighet i det elektriske felt. (elektroforese). Den dertil an-vendte suspensjon befinner seg i målekammere av et såkalt elektroforese system. Den optiske akse av mikroskopet er anordnet hori-sontalt, da målekammeret må stå loddrett. Derved utkobles på-virkninger som kunne forfalske målingen" av vandringshastigheten.

Claims (5)

1. Diagnostisk fremgangsmåte som skal gjennomføres in vitro,karakterisert vedat lymfocyter inkuberes med et syntetisk peptid av høy basisitet, hvoretter deres vandringshastighet måles i det elektriske felt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at etter inkubasjon av lymfocytene med det syntetiske peptid has enten inkubasjonsblandingen eller det cellefrie overstående til en dispersjon av indikatorpartikler og således måles i deres vandringshastighet i det elektriske felt.

3. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 og 2,karakterisert vedat som syntetisk peptid av høy basisitet anvendes en syntetisk polypeptid, bestående i det vesentlige av lysin, arginin eller ornitin.

4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-3,karakterisertvedat det som syntetisk peptid av høy basisitet anvendes poly-L-lysin, poly-L-arginin eller poly-L-ornitin.

5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-4,karakterisert vedat det som syntetisk peptid av høy basisitet anvendes poly-L-lysin med en molekylvekt på 750 - 100.000.