NO744552L

NO744552L -

Info

Publication number: NO744552L
Application number: NO744552A
Authority: NO
Inventors: M E Beker; V D Belyaev; A Y Kalninsh; Y V Epshtein; G K Liepin; A R Valdman; V F Beker; U E Viestur; N A Vedernikov; E B Trusle; R Y Karklin; Z K Zommer; V T Luka; A V Ponomarenko
Original assignee: Inst Mikrobiologii Im A Kirkhe
Priority date: 1974-12-17
Filing date: 1974-12-17
Publication date: 1976-06-18

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et L-lysinf6rkonsentrat som kan brukes som tilset-ning til f6r i forbindelse med husdyroppdrett. The present invention relates to a method for producing an L-lysine concentrate which can be used as an additive to fodder in connection with livestock farming.

Det er velkjent at man kan fremstille L-lysin med en såkalt nedsenket fermentering av Brevibacterium sp. 22 under kontinuerlig gjennomlufting i et næringsmedium som inneholder nitrogen og karbonkilder såvel som mineralsalter og vekststimulerende midler hvoretter man innvinner L-lysinproduktet; It is well known that L-lysine can be produced with a so-called submerged fermentation of Brevibacterium sp. 22 under continuous aeration in a nutrient medium containing nitrogen and carbon sources as well as mineral salts and growth stimulants, after which the L-lysine product is recovered;

Forskjellige sukkerholdige materialer så som melasseVarious sugary materials such as molasses

har vært brukt som karbonkilden.has been used as the carbon source.

Den kjente fremgangsmåte for fremstilling av L-lysin bruker kostbare sukkerholdige forbindelser og stoffer noe som i be-tydelig grad påvirker prosessens økonomi. The known method for producing L-lysine uses expensive sugar-containing compounds and substances, which significantly affects the economics of the process.

Det er følgelig en hensikt ved foreliggende oppfinnelseIt is therefore a purpose of the present invention

å tilveiebringe en økonomisk fordelaktig fremgangsmåte for fremstilling av L-lysin. to provide an economically advantageous method for the production of L-lysine.

Nevnte fordel oppnås i foreliggende fremgangsmåte for fremstilling av L-lysin ved nedsenket fermentering av en L-lysinfremstillende mikroorganisme, nemlig Brevibacterium sp. 22, på et næringsmedium som inneholder nitrogen og karbonkilder så vel som mineralsalter og vekststimulerende stoffer under kontinuerlig gjennomluftning hvoretter man innvinner det forønskede produkt, og hvor man ifølge foreliggende oppfinnelse bruker torvhydrolysat som karbonkilden. Said advantage is achieved in the present method for the production of L-lysine by submerged fermentation of an L-lysine-producing microorganism, namely Brevibacterium sp. 22, on a nutrient medium containing nitrogen and carbon sources as well as mineral salts and growth-stimulating substances under continuous aeration, after which the desired product is obtained, and where, according to the present invention, peat hydrolyzate is used as the carbon source.

Det er foretrukket at karbonkilden er i form av en blanding av torvhydrolysat og melasse og inneholder totalt fra 10 til 12 vekt-^ reduksjonsmidler. It is preferred that the carbon source is in the form of a mixture of peat hydrolyzate and molasses and contains a total of from 10 to 12 by weight reducing agents.

Foreliggende fremgangsmåte gjennomføres på følgende måte. The present procedure is carried out in the following way.

Torvhydrolysatet fremstilles på vanlig måte. Torv medThe peat hydrolyzate is prepared in the usual way. Turf with

en dekomponeringsgrad fra 10 til 20^ og et fuktighetsinnhold fra 25a degree of decomposition from 10 to 20^ and a moisture content from 25

- 5~ 0% finfordeles i en hammer knusemaskin til en partikkelstørrelse på ca. 10 mm og blandes med svovelsyre med en konsentrasjon på ^ 2% og denne tilsettes i mengder på ca. 20 vekt-$ i forhold til torvens tørr- - 5~ 0% is finely distributed in a hammer crusher to a particle size of approx. 10 mm and mixed with sulfuric acid with a concentration of ^ 2% and this is added in amounts of approx. 20 weight-$ compared to the peat's dry

vekt.weight.

Den resulterende blanding bearbeides i' et varmet hy-drolyseringsapparat ved temperaturer fra 105 til 110°C hvorved torv-polysaccaridene underkastes en mekanisk-kjemisk nedbrytning til vann-oppløselige produkter. The resulting mixture is processed in a heated hydrolysis apparatus at temperatures from 105 to 110°C, whereby the peat polysaccharides are subjected to a mechanical-chemical breakdown into water-soluble products.

Det resulterende faste intermediære hydrolyseprodukt oppløses i varmt vann i et forhold på 1 del hydrolysat til 2 deler vann, blandingen oppvarmes til 120 eller 130°C og holdes på denne temperatur i fra 20 til 30 minuttersslik at oligosaccaridene kan' The resulting solid intermediate hydrolysis product is dissolved in hot water in a ratio of 1 part hydrolyzate to 2 parts water, the mixture is heated to 120 or 130°C and held at this temperature for from 20 to 30 minutes so that the oligosaccharides can

omdannes til monosukkere.converted to monosugars.

Massen avkjøles til 70 eller 80°G og filtreres for å The mass is cooled to 70 or 80°G and filtered to

utskille ikke-hydrolyserbart residum. Utbyttet av reduserende sukkere utgjør fra 72 til 75$ av det opprinnelige innhold av polysaccarider, og hydrolysatet inneholder fra 6,0 til 7,0 vekt-$ reduserende sukkere, inklusive fra 66 til 71 vekt-$ av følgende monosaccarider: excrete non-hydrolyzable residue. The yield of reducing sugars is from 72 to 75% of the original content of polysaccharides, and the hydrolyzate contains from 6.0 to 7.0% by weight of reducing sugars, including from 66 to 71% by weight of the following monosaccharides:

Det midlere innhold av tørrstoff er 9*0 vekt-$, aske-innhold er 0,6 vekt-$ og det totale nitrogeninnhold er 0,1 vekt-$ ;og pH = 1,0.;For å heve innholdet av reduserende sukkere til 11 til 13 vekt-$ kan hydrolysatet konsentreres med vakuumfordampning ved temperaturer fra 70 til 80°C. ;Hydrolysatet blir deretter nøytralisert med 25$ ammoni-akvæske til en pH-verdi på 7,0 - 0,2, og ammoniumsulfat tilfører det nitrogen som er nødvendig for bakterien under fermenteringen. ;Brevibakterium sp. 22-kultu.ren blir først kultivert på skråagarrør og så i kolber i et risteapparat. Deretter blir inokuleringsmiddelet kultivert i start-fermenteringsapparater på et melasse-næringsmedium. Næringsmediumet består dessuten av fra 4-5 volum-$ av maisvæske og 1,5 vek£-$ ammoniumsulfat. ;Nevnte kultur underkastes så en.fermentering på et næringsmedium som består av torvhydrolysat pluss fosfater og mais-væske, og mengden av sistnevnte stoff vil være avhengig av under-skuddet på visse faktorer så som biotin, treonin og metionin. ;Mediet blir så sterilisert ved 120°C i 1 time.;Under de første 24 timer av fermenteringen holdes konsentrasjonen av oppløst oksygen på fra 15 til 20 % av det totale mettningsnivå og deretter til slutten av fermenteringen, på fra 1 ;til 5 % av det totale mettningsnivå under kraftig røring. ;Kultiveringstemperaturen er 29 - 1°C.;Skumdannelse reguleres ved hjelp av spermolje eller et silikon antiskumdannelsesmiddel. ;Fra 65 til 72. time av kultiveringen vil innholdet av L-lysin i kulturvæsken normalt være fra 10 til 12 g/liter for natur-lig hydrolysat eller fra 19 til 21 g/liter i et konsentrert hydrolysat. ;Ved slutten av fermenteringen vil innholdet av uassimi-lerte reduserende sukkere være fra 0,7 til 1,1 vekt-$. ;Tilsettingen av melasse i varierende mengder kan bringe utbyttet av L-lysin opp til 30 g/liter. ;Etter at fermenteringen er ferdig underkastes kulturvæsken en vakuumfordampning og L-lysinproduktet tørkes i en forstøv-ningstørker. ;Foreliggende fremgangsmåte kan brukesbillig torvhydrolysat som karbonkilden og dette gjør fremgangsmåte meget fordelaktig økonomisk. I motsetning til tidligere kjente fremgangsmåter så vil et L-lysinf6rkonsentrat fremstilt ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte ikke være hygroskopisk. ;De etterfølgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse. ;Eksempel 1.;Et første kultur av brevibakterium sp. 22 ble kultivert på skråagar av kjøtt-ekstrakt med følgende sammensetning: 2 vekt-$ agar-agar, 1 vekt-$ glukose og 97 vekt-$ vann. Denne kultur ble kultivert i fra 18 til 30 timer i en inkubator ved temperaturer fra 29 til 31°C. ;Den L-lysin-fremstillende mikroorganisme ble vasket av agar-skråkulturene ved hjelp av sterilt vann (10 ml) og i 2 ml-por-sjoner tilsatt sterile 750 ml kolber inneholdende 70 ml sterilt medium med følgende sammensetning: melasse, 88 g (sukkerinnhold i melassen var 46 vekt-$). mais-væske, 20 g (inneholdende 50 vekt-$ tørrstoff) ammoniumsulfat 60 kg ;monokaliumfosfat 1,5 kg;dikaliumhydrogenfbsfat 1,5 kg;vann til 3000 liter;Mediets pH = 6,8 til 7,2.;Mediet ble sterilisert ved oppvarming til 126°C og så holdt på minst 120°C i 1 time. ;Kultiveringstemperaturen var fra 29 til 30°C, gjennom-luftningshastigheten var 60 mg 0^ pr. liter pr. minutt; pH i mediet ble holdt på 6,8 til 7, 2 ved tilsettning av en 40 $ oppløsning av kaustisk soda. ;Antiskumdannelsesmiddelet var spermolje. ;Kultiveringstiden i forfermentereren var 24 timer og inokuleringsmiddelet ble etterpå overført til et fermenteringskar på 50 000 liter. ;Det industrielle fermenteringsmedium ble fremstilt på følgende måte. ;Først ble torv hydrolysatefremstilt på følgende måte: Torv med en dekomponeringsgrad på 20$ og fuktighetsinnhold på 30 $ ble finfordelt i et knuseapparat til en partikkelstørrelse på maksimalt 10 mm og blandet med 92 $ svovelsyre tilsatt i mengder på 18 vekt-$ i forhold til torvens tørrvekt. Det resulterende materi-ale ble bearbeidet i et varmhydrolyseringsapparat ved temperaturer fra 105 til 110°C, oppløst i varmt vann i et vektforhold på 1:2, oppvarmet til 120°C og holdt på denne temperatur i 30 minutter. Etter avkjøling til 70 eller 80°C ble massen filtrert for å få utskylt det ikke-hydrolyserbare residum. Utbyttet av reduserende sukker utgjør 72$ av de tilstedeværende polysaccarider, og mengden av reduserende sukre i hydrolysatet er 6 vekt-$. 29 500 liter av torv-hydrolysatproduktet ble nøytrali-sert under røring med 1770 liten av en 25-$ ammoniakvannoppløsning. ;Det nøytraliserte hydrolysat inneholdt 1 vekt-$ ammoniak-nitrogen eller 4,7 vekt-$ l(fNH^)^SO^samt 4,7vekt-$ monosaccarider. ;For å fremstille det forønskede næringsmedium ble føl-gende stoffer tilsatt det nøytraliserte torvhydrolysatet: mais-væske, 640 kg (50 vekt-$ tørrstoff) ;monokaliumfosfat, 16 kg;dikaliumhydrogenfosfat, *l6 kg The average dry matter content is 9*0 wt.-$, ash content is 0.6 wt.-$ and the total nitrogen content is 0.1 wt.-$; and pH = 1.0.; To raise the content of reducing sugars to 11 to 13 wt.-$ the hydrolyzate can be concentrated by vacuum evaporation at temperatures from 70 to 80°C. The hydrolyzate is then neutralized with 25% ammonia solution to a pH value of 7.0 - 0.2, and ammonium sulphate supplies the nitrogen required by the bacteria during fermentation. ;Brevibacterium sp. The 22-culture is first cultivated on slanted agar tubes and then in flasks in a shaker. The inoculum is then cultivated in starter fermenters on a molasses nutrient medium. The nutrient medium also consists of from 4-5 volume-$ of corn liquid and 1.5 vec£-$ of ammonium sulphate. Said culture is then subjected to a fermentation on a nutrient medium consisting of peat hydrolyzate plus phosphates and corn liquid, and the amount of the latter substance will depend on the deficit of certain factors such as biotin, threonine and methionine. ;The medium is then sterilized at 120°C for 1 hour.;During the first 24 hours of the fermentation, the dissolved oxygen concentration is kept at from 15 to 20% of the total saturation level and then until the end of the fermentation, at from 1 to 5% of the total saturation level under vigorous stirring. ;The cultivation temperature is 29 - 1°C.;Foam formation is regulated with the help of sperm oil or a silicone anti-foaming agent. From the 65th to the 72nd hour of cultivation, the content of L-lysine in the culture liquid will normally be from 10 to 12 g/litre for natural hydrolyzate or from 19 to 21 g/litre in a concentrated hydrolyzate. At the end of fermentation, the content of unassimilated reducing sugars will be from 0.7 to 1.1% by weight. The addition of molasses in varying amounts can bring the yield of L-lysine up to 30 g/litre. After the fermentation is finished, the culture liquid is subjected to a vacuum evaporation and the L-lysine product is dried in a spray dryer. The present method can use cheap peat hydrolyzate as the carbon source and this makes the method very economically advantageous. In contrast to previously known methods, an L-lysine concentrate produced using the present method will not be hygroscopic. The following examples illustrate the present invention. ;Example 1.;A first culture of brevibacterium sp. 22 were cultured on slanted meat extract agar with the following composition: 2 wt-$ agar-agar, 1 wt-$ glucose and 97 wt-$ water. This culture was cultivated for from 18 to 30 hours in an incubator at temperatures from 29 to 31°C. The L-lysine-producing microorganism was washed off the agar slants using sterile water (10 ml) and added in 2 ml portions to sterile 750 ml flasks containing 70 ml of sterile medium with the following composition: molasses, 88 g ( sugar content in the molasses was 46 wt.-$). corn liquid, 20 g (containing 50 wt-$ dry matter) ammonium sulfate 60 kg; monopotassium phosphate 1.5 kg; dipotassium hydrogen phosphate 1.5 kg; water to 3000 liters; pH of the medium = 6.8 to 7.2.; The medium was sterilized by heating to 126°C and then holding at least 120°C for 1 hour. The cultivation temperature was from 29 to 30°C, the through-aeration rate was 60 mg O^ per liters per minute; The pH of the medium was maintained at 6.8 to 7.2 by the addition of a 40% solution of caustic soda. ;The antifoaming agent was sperm oil. The cultivation time in the pre-fermenter was 24 hours and the inoculum was afterwards transferred to a fermentation vessel of 50,000 litres. The industrial fermentation medium was prepared in the following way. ;First, peat hydrolyzate was prepared as follows: Peat with a degree of decomposition of 20$ and a moisture content of 30$ was finely divided in a crusher to a particle size of 10 mm maximum and mixed with 92$ sulfuric acid added in amounts of 18% by weight-$ in relation to the dry weight of the peat. The resulting material was processed in a hot hydrolyzer at temperatures from 105 to 110°C, dissolved in hot water in a weight ratio of 1:2, heated to 120°C and held at this temperature for 30 minutes. After cooling to 70 or 80°C, the mass was filtered to wash out the non-hydrolyzable residue. The yield of reducing sugar amounts to 72% of the polysaccharides present, and the amount of reducing sugar in the hydrolyzate is 6% by weight. 29,500 liters of the peat hydrolyzate product was neutralized under stirring with 1,770 liters of a 25-$ ammonia water solution. The neutralized hydrolyzate contained 1 wt.-$ ammonia nitrogen or 4.7 wt.-$ l(fNH^)^SO^ and 4.7 wt.-$ monosaccharides. To prepare the desired nutrient medium, the following substances were added to the neutralized peat hydrolyzate: corn liquid, 640 kg (50 weight - dry matter); monopotassium phosphate, 16 kg; dipotassium hydrogen phosphate, *16 kg

pH = 7,2.pH = 7.2.

Mediet ble sterilisert ved oppvarming til 126°C i 1 time. The medium was sterilized by heating to 126°C for 1 hour.

Etter at den L-lysinfremstillende mikroorganisme var blitt overført til den industrielle fermenteringstanken ved hjelp av trykk, blir fermenteringen utført under følgende betingelser: After the L-lysine-producing microorganism had been transferred to the industrial fermentation tank by means of pressure, the fermentation is carried out under the following conditions:

temperatur 31 - 1°C, gjennomluftingshastighet 0,8 tiltemperature 31 - 1°C, ventilation rate 0.8 to

1,0, kubikkmeter luft pr. 1 kubikkmeter flytende medium pr. minutt ved et overtrykk fra 0,2 til 0,8 atmosfære,pH 6,8 til 7,6, antiskum- 1.0, cubic meters of air per 1 cubic meter of liquid medium per minute at an overpressure of 0.2 to 0.8 atmospheres, pH 6.8 to 7.6, antifoam

dannelsesmiddel, spermolje. Fra den 65. til 72. timervar fermenteringen var konsentrasjonen av L-lysin i kulturvæsken fra 10 til 12 g/liter, mengden av gjenværende reduserende sukker var fra 0,7 forming agent, sperm oil. From the 65th to the 72nd hour of the fermentation, the concentration of L-lysine in the culture liquid was from 10 to 12 g/liter, the amount of remaining reducing sugar was from 0.7

til 1,1 vekt-$ og tørrstoffinnholdet var 11 vekt-$.to 1.1 wt-$ and the dry matter content was 11 wt-$.

L-lysinproduktet ble stabilisert i kulturvæsken ved hjelp av 50 kg natriumbisulfitt, og pH-verdd!en på mediet ble ved hjelp av svovelsyre justert til 6,4 0,2, hvoretter mediet ble underkastet en vakuumfordampning til en tørrstoffkonsentrasjon på The L-lysine product was stabilized in the culture liquid using 50 kg of sodium bisulphite, and the pH value of the medium was adjusted to 6.4 0.2 using sulfuric acid, after which the medium was subjected to a vacuum evaporation to a dry matter concentration of

fra 30 til 40 vekt-$.from 30 to 40 weight-$.

Den konsentrerte kulturvæsken ble surgjort med saltsyre til pH 4,0 og tørket i en forstøvningstørkei?til et residualt fuktighetsinnhold på 6 vekt-$, og man fikk et løst, brunt L-lysinf6rkonsen-trat. The concentrated culture liquid was acidified with hydrochloric acid to pH 4.0 and dried in a spray dryer to a residual moisture content of 6 wt%, and a loose, brown L-lysine concentrate was obtained.

Utbyttet av L-lysinen var 3700 kg. Innholdet av L-lysin monohydroklorid var fra 11 til 13 vekt-$. The yield of L-lysine was 3700 kg. The content of L-lysine monohydrochloride was from 11 to 13% by weight.

Eksempel 2.Example 2.

I dette eksempel var fremgangsmåten i henhold til inokuleringskultiveringen og fremstillingen av torvhydrolysatet det samme som i eksempel 1. Torvhydrolysatproduktet ble konsentrert ved for-dampning til 12 vekt-$ reduserende sukker som inneholdt 7,8 vekt-$ monosaccarider. In this example, the procedure according to the inoculation cultivation and the preparation of the peat hydrolyzate was the same as in example 1. The peat hydrolyzate product was concentrated by evaporation to 12 wt% reducing sugars containing 7.8 wt% monosaccharides.

Selve fermenteringsprosessen var som angitt i eksempelThe fermentation process itself was as indicated in the example

1. 1.

Fra den 65. til 72. time av fermenteringen inneholdt kulturvæsken fra 19 til 21 g/liter av L-lysinen og mengden av residu-ale reduserende sukker var fra 0,9 til 1,3 vekt-$ og tørrstoffinn-holdet var 18 vekt-$. L-lysinfSrkonsentratutbyttet var 58OO kg. From the 65th to the 72nd hour of the fermentation, the culture liquid contained from 19 to 21 g/liter of L-lysine and the amount of residual reducing sugars was from 0.9 to 1.3 wt.-$ and the dry matter content was 18 wt. -$. The L-lysine concentrate yield was 5800 kg.

Konsentrasjonen av L-lysin monohydroklorid var fra 17 til 19 vekt-$. The concentration of L-lysine monohydrochloride was from 17 to 19% by weight.

Eksempel J> .Example J> .

Inokuleringskultiveringen og fermenteringen var som ang-gitt i eksempel 1. Fra 24. til 36. time av fermenteringen tilsatte man fra l80 til 220 g/steril melasse med et sukkerinnhold på 23 vekt-$ pr. liter av mediet hvorved dette ble anrikket med fra 4l til 51 g sukrose pr. liter. Fra 65. til 72. timerav fermenteringen inneholdt kulturvæsken fra 22 til 25 g/liter av lysin. Mengden av residual%-o sukkerevar 0,9 til 1,3 vekt-$. Tørrstoffinnholdet var 12,5 vekt-$. The inoculation cultivation and fermentation were as indicated in example 1. From the 24th to the 36th hour of the fermentation, from 180 to 220 g/sterile molasses with a sugar content of 23 wt.-$ per liter of the medium whereby this was enriched with from 4l to 51 g of sucrose per litres. From the 65th to the 72nd hour of the fermentation, the culture liquid contained from 22 to 25 g/litre of lysine. The amount of residual sugar was 0.9 to 1.3% by weight. The dry matter content was 12.5 wt-$.

Utbyttet av L-lysinfdrkonsentrat var 4300 kg. Innholdet av L-lysin monohydroklorid var fra 19 til 21 vekt-$. The yield of L-lysine concentrate was 4300 kg. The content of L-lysine monohydrochloride was from 19 to 21% by weight.

Claims

1. Method for the production of L-lysine concentrate by submerged cultivation of an L-lysine-producing microorganism, i.e. Brevibacterium sp. 22, on a nutrient medium containing nitrogen and carbon sources as well as mineral salts and growth-stimulating substances during aeration, after which the desired product is obtained, characterized in that the carbon source is peat hydrolyzate.

2. Method according to claim 1, characterized in that the carbon source is a mixture of peat hydrolyzate and molasses with a total content of reducing sugars of from 10 to 12% by weight.