NO743660L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer celleanalyse og går nærmere bestemt ut på en anordning og en fremgangsmåte for celleanalyse ved po t ensi almåling.

Innen cytologien fins et stadig okende behov for automatisk celle-telling og volumetrisk differensiering og analyse av celler. Sort-erirg av cytologisk materiale, f.eks. for oppdagelse av kankrose eller maligne celler, gjennomfores nå for tiden ved hjelp av en sorteringsprosess i to trinn. Cellene underkastes forst en forberedende visuell sortering av en observator med evne til å bestemme hvilke prover som etter alt å dbmme inneholder abnorme celler og for å bestemme den celle man håper å telle inne i en prbve. De prover som inneholder abnorme celler undersokes senere av en erfaren cytolog eller patolog, som sluttelig avgjor om cellene i disse prover virkelig er kankrose. Ved hjelp av denne fremgangsmåte kan man temmelig noyaktig finne kankrose celler, men metoden lider av flere ulemper. For det forste er den langsom, for det andre er den kostbar p.g.a. at den legger beslag på lang arbeidstid for det involverte personale, og for det tredje er den ikke kvantitativ, ettersom kriteriene m.h.t. abnormitet og likeledes m.h.t. mengde av celler som er tilstede i en spesiell prdve, hovedsakelig er subjek-tive. P.g.a, tidstilgangen og de involverte omkostningene er det vanligvis ikke gjennomførbart å undersoke store befolkninger med anvendelse av tidligere kjente teknikker.

Dessuten er de fleste av de i et medisinsk laboratorium undersokte celleprovene normale. Årvåkenheten og interessen hos dem som utforer cellesorteringen er derfor vanskelig å opprettholde. Ved cytologisk undersøkelse m.h.t. forekomsten av carcinom i livmor-halsen har eksempelvis 98% av de undersokte kvinner vist seg frie for symtomer. Personalomsetningen kan således ha en tendens til å bli hoy, og testresultatene blir mindre kvantitative og mere kost-bare.

Det er derfor onskelig å få et system for automatisk bestemmelse av den volumetriske fordelingen av cellene i en prove. En årsak er at utsignalene kan anvendes for å normalisere lyssignaler fra

en oelleanalysator, f.eks. den som beskrives i US-patentsoknad nr. 5.66.892 (Mullaney m.fl. - inngitt den 4.juni 1973).

For nærværende baserer den vanligste typen av tidligere kjente elektriske analyseanordninger seg på anvendelsen av et enkelt munnstykke med to elektroder ved hver ende av åpningen plassert i en omgivende saltlosning. En individuell celle, som beveger seg gjennom munnstykket, fortrenger en del av den Redende væsken i munnstykket. Ettersom cellens konduktivitet er mindre enn den væske som den fortrenger, okes resistansen av munnstykke-innholdet p.g.a. cellens nærvær. Elektriske kretser, som er sluttet til elektrodene, avfoler denne resistansendring og produserer et pulssignal. I en slik anordning blandes det onskede signal fra cellen med uonskede forstyrrelsessignaler fra munnstykkets utside, ettersom de avfoiende elektrodene er plassert utenfor munnstykket.

De ovennevnte mangler som knytter seg til tidligere kjente anordninger for undersokelse av cellene i en suspensjon av celler i en væske, er avhjulpet ved at oppfinnelsen har fått de i krav 1 angitte karakteristiske trekk.

I motsetning til tidligere forslag baserer oppfinnelsen seg på anvendelsen av avfoiende elektroder inne i selve munnstykket. Derfor gir en differensialforsterkning av det inne i munnstykket avfolte potensial et pulssignal som er fritt for stor forstyrrende brus fra utsiden.

Ved en foretrukket utforelsesform for oppfinnelsen anvendes en beholder, som inneholder en saltlosning i hvilken de for analyse bestemte cellene er suspendert. I beholderen er nedsenket et nytt munnstykke med flere elektroder, som er forbundet med munnstykke-veggene og over hvilke et elektrisk potensial avfoles. Munnstykkets innlopsside kommuniserer med den celleholdige saltlosningen i beholderen, og munnstykkets utlopsside kommuniserer med en anordning for utsugning av celleholdig saltlosning gjennom munnstykket. En differensialforsterker med hoy impedans er over elektrodenes utgang-er sluttet til en pulshoydeanalysator og en registrerings- og frem-visning sanordning.

Etterhvert som utsugningsanordningen suger saltlosning, som inneholder cellene, fra beholderen gjennom munnstykket, varierer individuelle celler, som passerer gjennom munnstykket, resistansen inne i munnstykket og folgelig potensialet over de to elektrodene. Denne variasjon i potensial oppsamles av den hoyimpedanse differensialforsterkeren og forsterkes for å frembringe et pulssignal for pulshoydeanalysatoren, hvis utsignal kan fremvises eller opptegnes.

En fordel med oppfinnelsen består i at, p.g.a. den store munnstyfcke-åpningen og den smale pulsbredden, flere celler kan telles per tidsenhet enn med tidligere kjente anordninger. En annen fordel er at storre celler kan telles enn med tidligere anordninger. En ytterligere fordel er at tilstoppingsproblemet ved tidligere anordninger er vesentlig redusert.

En ytterligere fordel med oppfinnelsen består i at det kan oppnås

et hoyere signalforstyrrelsesforhold sammenliknet med kjente apparater og metoder.

Oppfinnelsen beskrives nærmere i det folgende under henvisning til tegningsfigurene, av hvilke Fig. 1 skjematisk viser en anordning ifolge oppfinnelsen; Fig. 2 er et planriss som viseE en foretrukket utforelsesform for det potensialavfoiende munnstykke ifolge oppfinnelsen; og

Fig. 3 viser et tverrsnitt gjennom munnstykket ifolge fig. 2.

I fig. 1 vises en potensialavfoiende celleanalysator ifolge en foretrukket utforelsesform for oppfinnelsen. En beholder 10 inneholder saltlosning 12, i hvilken celler som skal analyseres er suspendert. En med munnstykke forsynt blokk 14 er nedsenket i losningen 12. Munnstykkeblokkens 14 innlopsside 16 kommuniserer med saltlosningen 12 i beholderen 10. Munnstykkeblokkens 14 utlopsside 18 kommuniserer med en anordning 20 for utsugniig av celleholdig saltlosning 12 fra beholderen 10 gjennom munnstykket. Et på anordningen 20 påfort undertrykk suger fortrinnsvis losning 12 inn i anordningen 20.

Som vist i fig. 2 og 3 omfatter blokken 14 separate elektroder 22

og 24, som er laminert mellom sjikt av et dielektrikum 26, som f.eks. kan bestå av plast. For fagfolk er det åpenbart at den i fig. 2

og 3 viste elektrodekonstruksjonen bare er valgt som eksempel og at oppfinnelsen ikke er begrenset til denne. Således kan f.eks. anvendes tre eller flere elektroder, og likeledes kan det konstru-eres flere ulike dielektriske sjikt. Dessuten kan elektrodene om-slutte munnstykkehullet delvis istedenfor fullstendig. De viste elektrodene består fortrinnsvis av platina, men også andre metaller

såsom solv og kobber kan anvendes. Platina foretrekkes ettersom motstandsdyktigheten overfor korrosjon er god. Ved den som eksempel valgte utforelsesformen ifolge fig. 2 og 3 har munnstykket en diameter av 87 yum og en lengde av 412 yum, og avstanden mellom elektrodene 22,24 er 144 yura. Som det fremgår av fig. 3 kan munnstykkets innlop og utlop være rettvinklete. Med en sådan anordning og utform-ning av munnstykket minskes imidlertid volumopplosningen, ettersom celler i ulike posisjoner i forhold til munnstykkets lengdeakse strommer med forskjellige hastigheter gjennom munnstykket. Ved eller nær midtaksen strommer cellene hurtigere enn cellene nærmere munnstykkeveggen. Ved typiske tidligere munnstykker er diametrene ved munnstykkenes innlop og utlop relativt store, og diameteren minsker i retning mot et eller annet indre punkt, der den er tilstrekkelig liten til å gi gode stromningsegenskaper forbi måle-området. I den foretrukne utforelsesformen av et munnstykke ifolge oppfinnelsen som vist i fig. 2, er munnstykket relativt stort. Derfor er munnstykkets geometri ikke kritisk. Imidlertid er det frem-deles fordelaktig å kanalisere cellene ned gjennom munnstykke-sentret for å sikre noyaktigere volumetriske målinger (volumetrisk opplosning); dette ettersom pulslengdene av de som gjensva© på cellevolumet produserte signalene er avhengige av cellenes strom-ningshastighet. De ved eller nær sentrum av et spesielt munnstykke forbistrommende cellene produserer derfor signaler med kortere pulslengder enn de utenfor sentrum langsommere forbistrommende cellene, hvorved selvsagt desto hoyere pulstall for celletellingen erholdes, jo smalere pulslengden er. Selv om munnstykkene ifolge oppfinnelsen kan ha munnstykkehull med rettvinklete inn- og utlop, er det derfor åpenbart for fagfolk at de bedre stromningsegenskapene, som oppnås hvis munnstykkene gjores avrundede såsom vises med strek-ete linjer 28 i fig. 3 eller gjores kontinuerlig avsmalnende mot midten såsom ved tidligere munnstykker, vil være til hjelp når det gjelder å avstedkomme korte pulslengder i de produserte signalene.

Fig. 2 viser dielektrisk materiale i form av sirkulære skiver med 1 cm diameter rektangulære platinaplateelektroder som krysser munn-stykk ehullet. Denne geometri er bare valgt av bekvemmelighetshensyn, og oppfinnelsen er åpenbart ikke begrenset hertil. Det kan ifolge oppfinnelsen anvendes hvilken som helst geometrisk form, som gir elektroder med den rette avstanden og diolektriske sjikt.

Ved den i fig»1 viste anordningen for munnstykkets anvendelse er blokken 14 montert på en sådan måte at munnstykkehullet forloper horisontalt. Munnstykket kan alternativt monteres med hvilken som helst skråning i forhold til horisontalplanet, f.eks. vertikalt eller annen stilling for å sikre god adkomst til cellene i saltlosningen.

Elektroder 30 og 32 er anordnet for å holde potensialforskjell mellom saltlosningen i beholderen 10 og saltlosningen i evakueringsanord-ningen 20. En konstantstromkilde 34 leverer strom som går gjennom munnstykket mellom elektrodene 30 og 32. En hoyimpedans-differensialforsterker 28 mottar signaler fra munnstykkeelektrodene 14 og 16 gjennom ledere 40 og 41 og avgir det forsterkede signalet til en pulshoydeanalysator og en fremvisnings- eller opptegningsanordning som representeres av en blokk 44.

Ved driften r/passerei» celleholdig saltlosning 12 gjennom munnstykket inn i anordningen 20 p.g.a. det i denne påforte undertrykket. Når en celle passerer gjennom området mellom elektrodene 22 og 26, endres potensialet over disse, ettersom cellenes konduktivitet er en annen enn konduktiviteten hos selve saltlosningen. Konduktivitets-endringen er proporsjonal med cellens volum. Denne konduktivitets-forskjell gir opphav til en endring i munnstykkets resistans p.g.a. cellens nærvær i munnstykkehullet. Munnstykkets resistansendring /\r multiplisert med munnstykkets konstante stromstjrke I fra stromkilden 34 gir potensialendringen A V ■» I & r. Potensial-forskjellen V) overfores til hoyimpedans-differensialforsterkeren 28, som avgir det forsterkede differenssignalet til pulshoydeanalysatoren og opptegnings- eller fremvisningsanordningen 44»

Slik fagfolk er velkjent med, er den i tidligere anordninger produserte pulslengden direkte proporsjonal med munnstykkehullets totale lengde. Dette skyldes at pulslengden er proporsjonal med den tid det tar for cellen å passere gjennom munnstykket. Ifolge foreliggende oppfinnelse er pulslengden direkte proporsjonal med avstanden mellom elektrodene 22 og 24, hvilken kan gjores helt liten, d.v.s. tilstrekkelig liten for at de produserte signalene skal få pulslengder av ca. 1 -yus (millisekunder). For et munnstykkehull med gitt diameter vil imidlertid det produserte signals puls-hoyde bli desto mindre jo nærmere elektrodene befinner seg fra hverandre. Elektrodene kan selvsagt plasseres langt borte fra hverandre over munnstykkehullets lengde, og plasseres ved dets innlop og utlop.

Oppfinnelsen tillater anvendelsen av et onskelig langt munnstykkehull ettersom elektrodene er plassert inne i munnstykkeveggen og kan plasseres helt nær hverandre. Ved det tidligere kjente munnstykket med ytre elektroder blir lengdene av de produserte pulsene desto storre jo lengre munnstykkehullet er. Hvis man derfor anvender et ldngt munnstykkehull for å få gode stromningsegenskaper, skulle man derfor være tvunget til å oke pulslengden og derved minske den oppnåelige telletakten. Et langt munnstykkehull er onskelig ettersom det jevner ut turbulens og andre ulineariteter som ugunstig påvirker cellebevegelsene innen avlesninger tas. Ifolge oppfinnelsen utgjor munnstykkediameteren fortrinnsvis mellom ca. 30yus og ca. 250yus,

og munnstykkelengden mellom ca. 100 um og ca. 500 um.

Claims (7)

1. Potensialavfoiende celleanalysator, omfattende en beholder-anordning (10) for oppbevaring av en losning i hvilken celler er suspendert, karakterisert ved en munnstykke-anordning (14), omfattende en munnstykkeåpning gjennom hvilken celle-suspensjonen kan utsuges fra beholderen, hvilken munnstykkeåpning er tilstrekkelig stor for å tillate cellenes passasje derigjennom; en elektrodeanordning (22,24) kommuniserende med munnstykkeveggen for avfoling av det elektriske potensialet over munnstykkeåpningen; og en anordning (40, 42, 28, 44) for avfoling av en potensialendring, for å indikere tilstedeværelsen av en celle i munnstykkeåpningen, idet nevnte potensialendring forårsakes ved at i det minste én celle passerer gjennom munnstykkeåpningen.

2* Analysator ifolge krav 1, karakterisert ved at elektrodeanordningen omfatter deler av munnstykkeveggen.

3. Analysator ifolge krav 1, karakterisert ved at elektrodeanordningen omfatter minst to elektroder.

4. Analysator ifolge krav 1, karakterisert ved at elektrodeanordningen omfatter skiver av elektrisk ledende materiale som er laminert mellom skiver (26) av dielektrisk materiale slik at alternerende ledende og isolerende sjikt i det minste delvis omslut-ter munnstykkeåpningen.

5. Analysator ifolge krav 4, karakterisert ved at i det minste én elektrisk ledende skive er positivt ladet og at i det minste én elektrisk ledende skive er negativt ladet, idet de positivt og negativt ladede skivene er atskilt fra hverandre ved hjelp av i det minste én dielektrisk skive.

6. Analysator ifolge krav 1, karakterisert ved at munnstykkediameteren er flere ganger storre enn den maksimale bredden

av noen av cellene.

7. Analysator ifblge krav 1, karakterisert ved at den avfoiende anordningen omfatter organer for kvantitativ avfoling av det ved tilstedeværelsen av nevnte celle i munnstykkeåpningen forårsakede potensialendring en og organer for produsering av et utsignal i overensstemmelse med nevnte potensialendring for derved å gi indikasjon på cellens volum.

8» Fremgangsmåte for avfoling av en celle i en saltlosning med anvendelse av et munnstykke med deri anordnede atskilte elektroder, karakterisert ved folgende foranstaltninger:

å påtrykke et elektrisk potensial over elektrodene og derved over munnstykkeåpningen;

å bringe losning, som inneholder den for volumetrisk måling bestemte cellen, til å stromme gj"ennom munnstykket og forbi elektrodene for å produsere en ved tilstedeværelsen av cellen forårsaket resistansendring og folgelig en endring i potensialet mellom elektrodene;

å avfole potensialendringen; og

å differensialforsterke potensialendringen for å produsere et utsignal, som er representativt for volumet av den avf61te cellen.

9, Fremgangsmåte ifolge krav 8, karakterisert ved at losningen bringes til å stromme gjennom munnstykket på en slik måte at cellen beveger seg gjennom munnstykkets sentrum.