NO344212B1 - Nevropeptider for dyrkning av akvatiske organismer - Google Patents

Description

Teknisk område

Den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg til feltet av landbruksbioteknologi, spesielt med anvendelsen av hypofyse adenylat-syklase-aktiverende polypeptid ved oppdrett av akvatiske organismer. Anvendelsen av peptidet i akvatiske organismer ved immersjon, injeksjon eller som et fôradditiv, gir en økning i appetitten til disse organismene, en større grad av vekst og overlevelse, en overlegen immunaktivitet og en økning av prolaktinfrigjøring.

Tidligere teknikk

Det hypofyse adenylat-syklase-aktiverende polypeptidet (PACAP) ble isolert for første gang i 1989 fra bovin hypotalamus og det ble vist at dens kapasitet for å stimulere veksthormonsekresjon skjer gjennom adenylat-syklase enzymaktivering. (Miyata og col. (1989) Isolation of a novel 38 residu hypotalamic polypeptid which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:567-574). PACAP tilhører peptidfamilien som omfatter secretin, glukagon og det tarmvasoaktive peptidet (Arimura og Shioda (1995) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAO) and its receptors: Neuroendocrine and endocringe interaction. Front.

Neuroendocrinol. 16:53-88). I pattedyr er grunnsubstansene til PACAP og det veksthormonfrigivende hormonet (GHRH) kodet av to forskjellige gener (Hosoya og col (1992) Structure of the human pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) gen. Biochim. Biophys. Acta.1129:199-206). I alle arter av dyr studert per i dag (fugler, reptiler og fisk), er GHRH og PACAP peptider kodet av samme gen og er inneholdt i samme grunnsubstans (Montero and col. (2000) Molecular evolution of the growth hormone-releasing hormone/pituitary adenylate cyclase-activating polypeptid gene family. Functional implication in the regulation of growth hormone secretion. Journal of Molec. Endocrinol. 25:157-168). PACAP-genet blir uttrykt fundamentalt i: sentralt og perifert nervesystem, øyene som stimulerer nervefibre, åndedrettssystemet, spyttkjertelen, gastrointestinalsystemet, reproduktive systemorganer, pankreasen og urinveisorganene. Det blir også syntetisert i binyrene, i gonadene og i immuncellene (Sherwood and col. (2000) The origin and function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptid (PACAP)/Glucagon Superfamily. Endocrine Review 21:619-670). PACAP viser ulike biologiske funksjoner, som er overensstemmende med dens ulike distribusjon i ulike vev og med dens hypofysiotropiske, nevrotransmitter, nevromodulerende og vasoregulerende aktivitet. (Chatterjee og col. (1997) Genomic organization of the rat pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor gene.

Alternative splicing within the 59-untranslated region. J. Biol. Chem.272:12122-12131).

Differensiering og død er omfattet i reguleringen av celledelingen (Sherwood og col. (2000) The origin and function of the Pituitary Adenlyate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/Glukagon Superfamily. Endocrine Review 21:619-670).

PACAP stimulerer veksthormon-(GH) frigjøringen. Peptideffekten i GH-frigjøring har blitt vist in vitro i mange arter av pattedyr, fugler og amfibier. (Hu and col. (2000) Characterization and messenger ribonucleic acid distribution of a cloned pituitary adenylate cyclase-activating polypeptid type I receptor in the frog Xenopus laevis brain. Endocrinol. 141:657-665) og fisk (Anderson L.L. and col. (2004) Growth Hormone Secretion: Molecular and Cellular Mechanisms and In Vivo Approaches. Society for Experim. Biol. and Med. 229:291-302). Det er få studier om virkningen av PACAP i GH-sekresjon og frigjøring, in vivo. Per i dag er det kjent at dette peptidet øker in vivo nivåene av GH i rottenes plasma (Jarr and col.1992 Contrasting effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on in vivo and in vitro prolactin and growth hormone release in male rats. Life Sci.51:823-830) og i bovineplasma (Radcliff and col. (2001) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide induces secretion of growth hormone in cattle. Domestic. Animal. Endocrinol.21:187-196). Mens i søyer (Sawangjaroen og Curlewis (1994) Effects of pituitary denylate cyclase-activating polypeptide (PECAP) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) on prolactin, lutenizing hormone and growth hormone secretion in the ewe. J. Neuroendocrinol. 6:549-555) og mennesker (Chiodera and col. (1996) Effects of intravenously infused pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on adenohypophyseal hormone secretion in normal men. Clin Neuroendocrinol. 64:242-246) gir det ikke denne effekten.

Funnene antyder at peptideffekten på GH-sekresjon varierer hos pattedyr fra art til art. (Anderson and col. (2004) Growth Hormone Secretion: Molecular and cellular Mechanisms and In Vivo Approaches. Society for Experim. Biol. and Med.229:291-302).

Hittil eksisterer det ikke studier på fisk in vivo som viser PACAP-funksjonen i GH-reguleringen, ytterligere eksisterer ikke bakgrunn for bruken av dette peptidet i appetittstimuleringen i akvatiske organismer. I krepsedyr er det så langt ikke noen bevis for eksistensen av dette peptidet, og strømmen av signaler som regulerer veksten i disse organismene er ikke kjent. I forhold til fisk er det kjent en slankeeffekt av PACAP som er beskrevet i artikkelen «Anorexic action of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in the Goldfish:..» Neurosci Lett., Limerick, IE, vol.386, nr.1, 23. september 2005, s. 9-13, XP004986031, ISSN: 0304-3940.

PACAP stimulerer prolaktinfrigjøring ved hypofysecellene i pattedyr (Ortmann and co. (1999) Interactions of ovarian steroid with pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and GnRH in anterior pituitary cells. Eur. J. Endocrinol.140:207-214). Det fremmer melantropin α-melanocytt-stimulerende hormon (MSH) frigjøring ved de melantrofiske cellene til hypofysen. (Vaudry and col. (2000) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions. Pharmacol. Rev. s 52:269-364). Anvendelse av PACAP er også beskrevet i EP 1477181 A1 og WO9426897A.

I fisk er det ingen studier, in vivo, som viser aktiviteten av dette peptidet i prolaktinfrigjøring. Det er heller ingen funn omhandlende denne effekten i utviklingen av fiskens farge.

I pattedyr er PACAP-immunsystemfunksjonen svært godt karakterisert og det er mange patenter som beskriver deres anvendelse i mennesker som en immunologisk responsmodulator. Hittil ar det ingen bakgrunn i litteraturen som forklarer PACAP-immunsystemfunksjonen i akvatiske organismer.

PACAP-genet har blitt klonet fra mange virveldyrarter og den ene protokordaden (kappedyr). I fisk har det blitt isolert én av noen arter av laks og mallefisker (Sherwood and col. (2000) The Origin and Function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activatin olypeptide (PACAP)/Glucagon sperfamily Endocrine Reviews 21(6):619-670, gullfisk (Leung y col. (1999) Molecular cloning and tissue distribution of in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) the goldfish. Rec. Progr. Mol. Comp.

Endocrinol. 338-388) sebrafisk (Fradinger and Sherwood (2000) Characterization of the gene encoding both growth hormone-releasing hormone (GRF) and pituitary adenylate cyclase-acitvating polypeptide. Mol. and Cell. Endocrinol. 165:211-219), trucha (Krueckl and Sherwood. (2001)) og ørret (Krueckl and Sherwood. (2001)), Developmental expression, alternative splicing and gene copy number for the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and growth hormone-releasing hormone (GRF) gene in rainbow trout. Molec. and Cell. Endocrinol.182:99-108).

Patentet US 5695954 beskytter isolasjonen og rensingen av genenes nukleotidsekvens som koder for fisk GHRG-PACAP polypeptid, så vel som vektorer og verter som uttrykker disse sekvensene med mål om å bli anvendt for å øke veksten i fisk via trangenisk å introdusere de nevnte genetiske konstruksjoner i befruktede fiskeegg. Det er også beskrevet en fremgangsmåte for å detektere genmodifisert fisk som innholder disse sekvensene.

I dette patentet rapporteres spesifikt gensekvensene som koder for GHRH-PACAP polypeptid av Oncorhynchus NErka-, Clarias macrocephalus- og Acispenser transmontanus-artene.

I den foreliggende oppfinnelsen ble det anvendt forskjellige varianter av PACAP aminosyresekvensen, med N-terminale modifikasjoner, oppnådd i vårt laboratorium for Clarias gariepinus- og Oreochromis niloticus-arter. Disse variantene ble anvendt i akvatiske organismer som vekststimulatorer via ikke-transgenese, ved deres administrasjon ved immersjonsbad og som var uttrykt i E.coli og P. pastoris ved supernatantdyrkning, uten tidligere rensing av dem. Vi fant uventet at disse variantene er i stand til, under disse betingelser, å fremme signifikant økning av den immunologiske aktiviteten i disse organismene og å elevere prolaktinkonsentrasjon i serum. Disse peptidegeneskapene hadde ikke blitt beskrevet for akvatiske organismer.

Noen forfattere har rapportert at vekststimulatoreffekt i fisk ved den rekombinante veksthormonadministrasjonen ved immersjonsbad. Uansett, den direkte anvendelsen av veksthormonet er emne for mange regulære krav, det samme hender med bruk av transgenisk fisk som uttrykker veksthormonene eller en veksthormonfrigivende faktor.

I den foreliggende oppfinnelsen er en ikke-transgenetisk metodologi beskrevet for å øke veksten og for å forbedre immunsystemet til akvatiske organismer, inkludert virvelløse dyr. Foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for å øke produktiviteten av fisk eller skalldyrkulturer som omfatter mating eller administrering av et hypofyse adenylat-cyklase-aktiverende polypeptid (PACAP) nevropeptid med aminosyresekvensen identifisert som SEQ ID nr.12, 13 eller 14 som angitt i krav 1.

I dag er akvatiske organismer en viktig proteinkilde, men fangsten i deres naturlige miljø er fullt ut utnyttet. Av denne grunn, for å øke produksjonen, er det nødvendig å dyrke disse akvatiske artene (Pullin og col..; Conference Proceeding 7, 432 p.

International Center for Living Aquatic Resources Management. Manila, Philippines.

1982, ISSN 0115-4398).

For å øke effektiviteten av den akvatiske dyrkningen gjennom vekststimulering, er økning av organismens overlevelse og forbedring av kvaliteten på larven, fremholdt som et viktig problem å løse i akvakulturen.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen gir en løsning på problemet nevnt ovenfor ved å tilveiebringe varianter av hypofyse adenylat-syklase-aktiverende polypeptid med aminosyresekvenser identifisert som SEQ ID nr.12, 13, og 14. Disse polypeptidene kan øke veksthastigheten av akvatiske organismer, inkludert virvelløse organismer over en kort tidsperiode, som er svært viktig for akvakulturen, i tillegg, øker disse peptidene overlevelsen av fiskelarver og krepsedyr av kommersiell interesse når anvendt som immersjonsbad eller som fôradditiv. De stimulerer immunaktiviteten i disse organismer, så vel som appetitten, utviklingen av fiskens farger og prolaktinfrigjøring.

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen blir de nevnte PACAP-varianter anvendt på fisk eller krepsedyr ved periodevise injeksjoner med intervaller på 3 dager i en konsentrasjon på 0,1 μg/g av dyrets vekt, ved immersjonsbad hver 4 dag i ferskvann eller sjøvann til en peptidkonsentrasjon mellom 100 til 200 μg/liter vann, og som et fødeadditiv til en konsentrasjon på 5 mg/kg av formulert fôr. Det oppnås en signifikant økning i vekst og en overlegen immunaktivitet.

PACAP-variantenes anvendelse byr på fordeler pga. dens lille størrelse (5KDa), som gjør god absorpsjon gjennom hud og slimhinner hos disse organismene mulig når de blir anvendt ved immersjonsbad, administrasjonen ved de foreliggende kostnads- og manipuleringsfordeler for akvakulturen og med en lav indeks for kontaminasjon, signaliserer i tillegg PACAP at transduksjonsmekanismen som begynner med adenyl syklase aktivering, ikke med aktiveringen av et hormon og dets veksthormonfrigivende aktivitet i pattedyr, inkludert hos mennesker, er svak, noe som forklarer hvorfor deres anvendelse viser bedre allmenn persepsjon og færre obligatoriske krav.

Andre PACAP-fordeler er deres kapasitet til å stimulere den naturlige og adaptive immunaktiviteten hos fisk og å øke motstandsdyktigheten mot infeksjoner av patogener.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, blir PACAP-variantene tilført akvatiske organismer, slik som tilapia Oreochromis sp, mallefisk Clarias sp, laks Salmon sp. og reke Penaeus sp.

I en annen foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen blir PACA tilført til fisken eller krepsedyrene for å forebygge eller behandle infeksjoner av patogene midler.

En materialisering av den foreliggende oppfinnelsen beskriver anvendelse av PACAP nevropeptid som angitt i krav 1 for fremstilling av en sammensetning for å behandle fisk eller krepsedyr i oppdrett for å stimulere deres vekst og for å øke deres motstandsdyktighet mot sykdommer, så vel som for forebyggende og terapeutisk behandling av en infeksjon av patogene midler, alt dette med mål om å forbedre produktiviteten.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1. PACAP-kloingsstrategiene i bakterieekspresjonsvektoren (fig.1A) og i gjæringsekspresjonsvektoren (Fig. 1B).

Figur 2. Vekststimuleringseksperiment i en ung Clarias gariepinus ved den intraperitoneale injeksjonen av det rekombinante PACAP, renset i affinitetskromatografi, ved en dose på 0,1 μg/g av dyrets vekt. Grafen representerer gjennomsnittet av kroppsvekten for den PACAP-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen.

Figur 3. Vekststimuleringseksperiment i ung Clarias gariepinus ved intraperitoneal injeksjonen av det rekombinante PACA, renset ved affinitetskromatograf, i en dose på 0,1 μg/g av dyrets vekt. Grafen representerer gjennomsnittet av den hepatosomatiske indeksen og muskel tørrvekt av den PACAP-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen.

Figur 4. Vekststimuleringseksperiment i tilapialarve ved immersjon i E. coli sprengnings supernatanter inneholdende det rekombinante PACAP i en dose på 100 μg/liter vann. Grafene 4A og 4B representerer gjennomsnitts kroppsvekt og lengde av behandlede grupper sammenlignet med negative kontroller.

Figur 5. Vekststimuleringseksperiment i tilapialarve ved immersjon i E.coli sprengnings supernatanter inneholdende det rekombinante PACAP i en dose på 100 μg/liter vann. Grafene representerer gjennomsnitts kroppsvekt av behandlede grupper sammenlignet med negative kontroller, 22 dager etter behandlingsstart.

Figur 6. Vekststimuleringseksperiment i tilapialarve ved immersjon i E. coli sprengnings supernatanter inneholdende det rekombinante PACAP i en dose på 100 μg/liter vann. Bildet viser forskjeller i lengde 30 dager etter siste immersjonsbad av den PACAP-behandlede fisken (A og C) sammenlignet med kontrollgruppen (B).

Figur 7. Vekststimuleringseksperiment i tilapialarve ved immersjon i E.coli sprengnings supernatanter inneholdende den rekombinante PACAP i en dose på 100 μg/liter vann. Bildet viser den tidligere utviklingen av fiskens farger i PACAP-behandlet fisk (A og B) i forhold til kontrollgruppen (C).

Figur 8. Evaluering av den rekombinante PACAP, renset ved affinitetskromatografi, i tilapia Oreochromis niloticus appetitt, i en dose på 0,5 μg/g av dyrets vekt. Bildet viser gjennomsnittet av mat inntatt av fisken etter 6 timer og 22 timer fra begynnelsen av behandlingen.

Detaljert beskrivelse av særlige utførelsesformer/eksempler

Eksempel 1: Konstruksjon av ekspresjonsvektorer inneholdende de kodende sekvensene av PACAP for deres intracellulære ekspresjon i E. coli og den ekstracellulære produksjon i supernatantkulturen av P. pastoris.

Clarias gariepinus PACAP-genet ble isolert ved polymerase kjedereaksjon ved anvendelsen av GHRH-PACAP cDNA som en mal tidligere klonet inn i en T-vektor. Vi anvendte de spesifikke oligonukleotidene korresponderende til sekvensene SEQ ID nr.1 og SEQ ID nr.2 for å oppnå GRH-PACAP komplett sekvens inkludert signalpeptidsekvens, og særlig oligonukleotider SE Q ID nr.3 og SEQ ID nr.4 for å forsterke kun PACAP-genet med restriksjonssetet nødvendig for dens kloning i E. coli ekspresjonsvektor.

Tilapia PACAP-genet ble isolert på lik måte som beskrevet ovenfor ved anvendelse av de spesifikke oligonukleotidene SEQ ID nr.3 og SEQ ID nr.4. I forhold til den foreliggende oppfinnelsen utgjør dette den første rapporten av isolering av dette genet i tilapia.

Den CAPAP-kodifiserende sekvensen ble klonet inn i E.coli ekspresjonsvektor pAR 3040 ved anvendelse av restriksjonssetene Ndel og BamHI (figur 1A). Vi valgte én til det rekombinante plasmidet for å omdanne E.coli BL21D3 bakterier, og for å indusere PACAP-ekspresjon under regulering av T7-promoteren ved anvendelse av 0,5 mM IPTG som induktor.

Genekspresjonen ble utført ved 28 °C i løpet av 5 timer. Ekspresjonen av det rekombinante PACAP og dens integritet ble bekreftet med Mass Espectrometry. Til PACAP-ekspresjon i P. pastoris anvendte vi gjæringsekspresjonesvektor pPS9 og pPS10. vi anvendte de spesifikke oligonukleotidene SEQ ID nr.7 og SEQ ID nr.6 til pPS9-genkloning og oligonukleotidene SEQ ID nr.5 og SEQ ID nr.6 til pPS10-kloning. Vi anvendte restriksjonsseter Ncol og Spel til pPS7-kloning, denne kloningstilnærmelsen gir i tillegg til proteinet av interesse, et metionin og et glycin i N-terminalen. Til pPS10-kloning anvendte vi restriksjonssetene Nael og Spell, denne kloningsstrategien tilsetter ikke aminosyrer til proteinet av interesse (Figur 1B).

Før transformasjonen ble plasmidene linealisert med enzymet Sph I. Pichia pastoris MP36-kjeden ble transformert ved elektroporasjon med den rekombinante ekspresjonsvektoren. Denne kjeden er en auxotrofisk mutant his3 som oppnår en His+ fenotyp etter transformasjon.

Transformererne, identifisert med Dot Blot, ble også analysert ved Southern blot for å bestemme i hvilke integrering skjedde ved erstatningen av genet AOX1 av P. pastoris for ekspresjonskassett av det rekombinante plasmidet. Denne integrasjonshendelsen produserer en Muts (lave nivåer av metanolutnyttelse) og His+ fenotyper. Den genetiske erstatningen av AOX1 skjer ved rekombinering mellom promoterregionene AOX1 og 3’AOX1 i vektoren og genomet. Som et resultat av rekombinasjonen, skjer en sletting i den kodende regionen for AOX1. Den rekombinante kjeden med en Muts fenotype støtter alkoholoksidaseproduksjonen i AOX2-genet og de har lav veksthastighet i metanol.

Genene som koder for polypeptidene av interesse og tilapiaveksthormon er under kontroll av AOX1-promoteren, induserbar med metanol, og de har et signalpeptid. Pichia pastoris avsondrer lave nivåer av selvproteiner og dens dyrkningsmedium trenger ikke proteiner som supplementer. Derfor kan det ventes at avsondret heterologt protein vil være en høy prosent av de totale proteinene i mediumet (mer enn 80 %) (Tschopp og col.; Bio/Technology 1987, 5: 1305-1308, Barr et al.; Pharm. Eng. 1992, 12: 48-51). Produksjonen av de rekombinante proteinene forklart i denne beskrivelsen ble gjort i bioreaktorer av 5l med tilsetning av metanol til dyrkningen.

Eksempel 2. Vektstimuleringseksperiment i ung Clarias gariepinus, bestemmelse av den hepatosomatiske indeks og fiskemuskel tørrvekt.

Vi anvendte 18 mallefisker av Clarias gariepinus-arten, uten kjønnsdistinksjon, på omtrent samme alder og med gjennomsnittlig kroppsvekt på 30 til 40 gram. To eksperimentgrupper ble formet med ni individer i hver. Gruppene ble akklimatisert i separate tanker med stabil vannresirkulasjon, til en temperatur på 28 °C og med en fotoperiode på 14 timer lys og 10 timer mørke. Dyrene ble matet to ganger daglig, med ekvivalente rasjoner på 5 % av den totale kroppsvekten i hver tank. Dyrene ble identifiserte før eksperimentet. En gruppe ble behandlet med semi-renset PACAP (70 % renhet) SEQ ID nr.13, mens den andre, anvendt som kontrollgruppe, ble behandlet med E.coli-proteiner inneholdt i PBS 1X (E.coli-proteiner ble oppnådd ved den samme renselsesprosedyren som peptidet av interesse, med mengden ekvivalent av kontaminanter til stede i den rensede PACAP-prøven). PACAP-behandlet fisk ble intraperitonealt injisert med en dose på 0,1 μg peptid per gram av dyrets kroppsvekt, 2 ganger per uke. Kontrollgruppen ble injisert likeledes som beskrevet ovenfor. 22 dager etter eksperimentstart viste de PACAP-injiserte dyrene i det peritoneale hulerommet en signifikant økning (p<0,5) av kroppsvekten sammenlignet med de negative kontrollene (figur 2).

Den hepatosomatiske indeksen og muskeltørrvekten ble bestemt for å vise at økning i fiskens kroppsvekt ikke var grunnet økningen i organstørrelse, eller økningen av vanninnhold i muskel. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom hepatosomatisk indeks og muskel tørrvekt-verdier i eksperimentgruppene (figur 3). Lignende resultater ble oppnådd når rekombinant PACAP av sekvens SEQ ID nr.12 ble tilsatt.

Eksempel 3. Eksperiment av vektstimulering, av motstanden til patogener og av prolaktinfrigjøring, i tilapialarve ved immersjonsbad med E.coli- sprengnings supernatantene inneholdende det rekombinante PACAP.

Vi laget et eksperiment for å evaluere funksjonen av Clarias gariepinus rekombinant PACAP til stede i E.coli- sprengnings supernatanten i tilapialarvevekst. To eksperimentgrupper ble formet med 60 individer i hver, en gruppe ble behandlet med PACAP-neuropeptidet (SEQ ID nr.13) og den andre ble brukt som kontrollgruppe. Larvegruppene ble akklimatisert i separate tanker med stabil vannresirkulasjon ved en temperatur på 28 °C og med fotoperiode på 14 timer lys og 10 timer mørke og dyrene ble matet med den oppnådde mengden fra følgende ligning: Mengde mat = # dyr X gjennomsnittlig kroppsvekt (g) X 40 %/100. Behandlingene besto av immersjonsbad i 2 l vann, tre ganger i uken i 60 minutter i løpet av 20 dager, dosen var 200 μg av målprotein/liter vann. Som resultat oppnådde vi at 10 dager etter start på eksperimentet viste den PACAP-behandlede gruppen signifikant kroppsvekt og lengdeøkning sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,01), 15 dager etter initiering av eksperimentet var forskjellen mellom gruppene svært signifikant (p<0,001) (Tabell 1 og figur 4A og 4B). 20 dager etter start av immersjonsbadene var forskjellene mellom den PACAP-behandlede gruppen og kontrollgruppen statistisk signifikant (p<0,001) (Figur 5).

Tabell 1. Gjennomsnittskroppsvekten og lengden til tilapialarve, 10 dager og 15 dager etter start på eksperimentet.

Masse og lengde er vist som middelverdi ± standardavvik.

Det ble observert at effekten av PACAP i veksten var over tid, fordi 30 dager etter det siste immersjonsbadet var forskjellene mellom kroppsvekt og lengde i eksperimentgruppedyrene svært signifikant (p<0,01) (figur 6). I tillegg ble det observert at PACAP-behandlet fisk viste skinnfarging på et tidlig utviklingsstadium sammenlignet med negativ kontroll (figur 7). I dette eksperimentet studert vi også tilstedeværelsen av kutan protozoo Trichodina sp, 10 dyr ble utvalgt tilfeldig fra hver eksperimentgruppe og invasjonsintensiteten av dette patogenet ble bestemt. Verdiene av invasjonsintensitet ble bestemt i henhold til ligningen:

(I: # totale fiskeparasitter) I=Σ N/n-F0og E = n-F0x 100/n

I: (gjennomsnittlig invasjonsintensitet) E: (# parasitt fisk fra totalen)

Σ N: (totalt funn av parasitter) F0: (antall av ikke parasitt angrepet fisk) N: (antall analyserte fisk)

PACAP-behandlet fisk viste en invasjonsintensitet (gjennomsnitt på I=2,20) med protozoo Trichodinas sp som var signifikant lavere (p<0,01) med hensyn til kontrollgruppen (gjennomsnitt på I = 5,56).

Fisken ble behandlet med immersjonsbad 45 dager etter start av eksperimentet under samme betingelser som tidligere beskrevet, og 24 timer etter behandling ble blodet ekstrahert til 10 dyr per gruppe for prolaktinmåling i serumet ved Western blot og ELISA. Et polyklonisk antistoff anti-tilapia prolaktin ble anvendt for disse assayene. Vi observerte statistisk signifikante forskjeller mellom PACAP-behandlet gruppe sammenlignet med kontrollgruppe p<0,01 (tabell 2). Disse er svært ønskede resultater i kommersielle akvatiske organismer, slik som tilfellet er for laks, som har sin livssyklus i ferskvann og sjøvann og hvori prolaktin har en viktig funksjon i osmoregulering.

Tabell 2: Prolaktinkonsentrasjon (ng/ml) i tilapiaserum i 45 dager etter starten av eksperimentet.

Konsentrasjonen er vist som middelverdi ± standardavvik

*indikerer en signifikant forskjell P<0,01

Eksempel 4. Eksperiment for å evaluere effekten av rekombinant PACAP på appetitten til den unge tilapia Oreochromis niloticus.

Hittil har den biologiske effekten av PACAP på appetitten til fisk ikke blitt studert. I virveldyr (undergrupper av pattedyr) har aktiviteten av disse peptidene i appetitt blitt lite beskrevet. (Jensen, 2001, Regulatory peptides and control of food intake in nonmammalian vertebrates. Comp. Biochem. And Phisiol. Part A 128:471-479).

For å analysere effekten av PACAP på fiskens appetitt anvendte vi tilapia av Oreochromis niloticus artene, uten kjønnsdistinksjon og omtrent den samme gjennomsnittlige kroppsvekten. Tre eksperimentgrupper ble formet, med tre individer i hver og tre replikater per gruppe. Gruppene ble akklimatisert i separerte tanker med stabil vannresirkulasjon og en temperatur på 28 °C og med en fotoperiode på 14 timer lys og 10 timer mørke.

En gruppe ble behandlet med semi-renset PACAP (87 % renhet) SEQ ID nr.13 ved intraperitoneal injeksjon på 0,5 μg/g av dyrets kroppsvekt. Den andre gruppen ble behandlet med GHRP-6 (Lipotec, S.A. Spania) med samme administrasjon ved en dose på 0,1 μg peptid per gram av dyrets kroppsvekt. Kontrollgruppen ble behandlet med E.coli-proteiner inneholdt i PBS 1X (E.coli proteiner ble oppnådd ved den samme renselsesprosedyren av peptidet av interesse, med mengden av ekvivalent av kontaminanter til stede i den rensede PACAP-prøven).

Etter behandlinger ble den samme mengden mat tilsatt til de tre eksperimentgruppene, oppsamling av mat ikke spist og tilsetting av mat igjen. Appetitten ble igjen målt, 22 timer etter starten på eksperimentet. Maten som ikke var spist i hver tank ble tørket i ovnen (100 °C, i 24 timer) og ble tillagt vekt i analytisk balanse. Den spiste maten ble beregnet ved bestemmelse av differansen mellom mat tilsatt tankene (10 gram, med 20 % fuktighetsgrad) og maten ikke spist av fisken.

PACAP og GHRP-6 behandlet tilapia viste en signifikant appetittøkning (p<0,05) sammenlignet med kontrollgruppen (figur 8).

Eksempel 5. Evaluering av den rekombinante PACAP i mullefisken Clarias gariepinus immunsystem.

Ung Clarias gariepinus ble anvendt. To grupper ble bestemt, med 10 individer i hver gruppe. Gruppene ble akklimatisert i separate tanker med stabil vannresirkulasjon ved en temperatur på 28 °C og med en fotoperiode på 14 timer lys og 10 timer mørke. Dyrene ble matet 2 ganger daglig, med ekvivalente rasjoner til 5 % av den totale kroppsvekten i hver tank. Dyrene ble identifisert før eksperimentet. PACAP (SEQ ID nr. 13) behandlet fisk ble intraperitonealt injisert med en dose på 0,1 μg av peptidet per gram av dyrets kroppsvekt, 2 ganger per uke.

Tyve dager etter initiering av eksperimentet ble fiskeblodet ekstrahert for å måle lysozym og lectin-nivåer i serum. Lysozymaktivitet i serum ble målt ved å anvende en metode basert på evnen av lysozym til å lyse bakterie Micrococcus lysodeikticus. I et 86-brønns mikrofat ble 100 μl prøver i fire tofoldige serieoppløsninger i fosfatbuffer (0,05M, pH 6,2) blandet med 100 μl 3 mg/ml suspensjon av Micrococcus lysodeikticus (Sigma). Mikrofatet ble inkubert ved 22 °C og O.D. ble målt ved 450 nm ved 0, 2, 3, 5, 10, 15, 25, 35 og 45 minutter. For en positiv kontroll ble fiskeserum erstattet av høneegg hvitt lysozym (seriefortynning som starter ved 8 μg/ml) og for en negativ kontroll, buffererstattet fiskeserum. En enhet av lysozymaktivitet ble bestemt som mengden av larvehomogenater som forårsaket en økning i O.D. lesing av 0,001 min-1. Vi observerte statistisk signifikante forskjeller (p<0,01) mellom PACAP-behandlede grupper sammenlignet med kontrollgruppe (tabell 3).

Tabell 3: Lysozymkonsentrasjon (μg/ml) i fiskeserum 20 dager etter begynnelsen av eksperimentet.

Konsentrasjon er vist som middelverdi ± standardavvik.

* indikerer en signifikant forskjell P<0,01

For å bestemme tilstedeværelsen av lectin i blodserum laget vi en haemagglutinerinsassay. Serie tofoldige fortynninger av serumet ble laget ved anvendelse av PBS pH 7,2 i U-bunnsformede (96 brønner, Greiner, Microlon) mikrotitreringsbrønner til hvilke et likt volum av ferskt preparert 2 % erytrocyttsuspensjon (kanin i PBS) ble tilsatt.

Brønner ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og en titer ble lest visuelt og var lik fortynningen i den siste brønnen for å vise agglutinering (som manifestert ved et jevnt fordelt lag av celler over hele brønnbunnen). Hemaglutininaktivitet av prøver ble studert og hvor hver titer ble gitt en verdi. Aktiviteten ble uttrykt som titer, dvs. omvendt av den høyeste fortynningen som viste fullstendig agglutinasjon.

PACAP-behandlet fisk viste en signifikant økning i lectinnivåene i serum sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,05) (Tabell 4).

Tabell 4: Titer av hemaglutininaktivitet (den omvendte av den høyeste fortynningen som viser høyeste fullstendige agglutinasjon) i fiskeserum ved 45 dager fra begynnelsen av eksperimentet.

Student t-test. * indikerer en signifikant forskjell P<0,05

Eksempel 6. Eksperiment av vekststimulering i tilapialarve ved immersjon med P. pastoris dyrkningssupernatanter inneholdende rekombinant PACAP.

Vi laget et eksperiment for å evaluere funksjonen av Clarias gariepinus PACAP (SEQ ID nr.14) inneholdt i P. pastoris dyrkningsupernatanter i veksten av tilapialarven.

Tre eksperimentgrupper ble dannet, av 50 larver i hver. En gruppe ble behandlet med rekombinant PACAP (SEQ ID nr.14) inneholdt i P. pastoris dyrkningsupernatanter. Den andre gruppen ble behandlet med det rekombinante tilapiea veksthormonet (GH) inneholdt i P. pastoris dyrkningssupernatanter. Kontrollgruppen ble behandlet med ikke-transformert P. pastoris dyrkningssupernatant. Larven ble matet to ganger daglig, med den oppnådde mengden fra den følgende ligningen: Matmengde = # av dyr X gjennomsnittlig kroppsvekt (g) X 49 %/100. Behandlingen ble utført ved immersjon i volumet av 30 liter, tre ganger i uken i 90 minutter. Dosen var 100 μg av målproteinet/liter vann.

Vi oppnådde resultater hvor PACAP-behandlede grupper etter 5 uker (35 dager) fra begynnelsen av eksperimentet viste signifikant kroppsvektsøkning sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,01). Veksthormonbehandlete dyr viste en signifikant økning av kroppsvekt sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,05) (tabell 5).

Tabell 5: Tilapialarve vekt i gram

Masse er vist som middelverdi ± standardavvik

Eksempel 7. Eksperiment for vekststimulering og forbedring i larvekvalitet i reken Litopenaeus schmitti behandlet med Pichia pastoris dyrkningssupernatanter inneholdende det rekombinante PACAP.

Vi anvendte rekelarven av Litopenaeus schmitti-arten. To eksperimentgrupper ble formet, med 100 larver i hver. En gruppe ble behandlet med rekombinant PACAP (SEQ ID nr.14) inneholdt i P. pastoris dyrkningssupernatanter og den andre som ble anvendt som en kontrollgruppe ble behandlet med ikke-transformert P. pastoris dyrkningssupernatant.

Larven ble dyrket i fiberglasstanker med en kapasitet på 100 l. Matingen ble basert på diatomerer (Chaetoceros gracilis), den flagellerte algen (Tetraselmis suecica) og Artemia nauplius (Aquatic Eco-Systems Inc.).

De abiotiske vekstfaktorene var de følgende:

● Illuminasjon (24:00 (L/D)

● Stabil aerasjon.

● Salinitet på 34ppm.

● Oppløst oksygen 5,2±0,5 (i larvesyklusen).

● Resirkulasjon forandret PZIIIav 80 %.

Fire immersjonsbad ble tilsatt til eksperimentgruppene, ett hver tredje dag med 1 times varighet. Vi oppnådde resultater hvor PACAP-behandlede grupper viste en signifikant kroppsvektsøkning sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,01) (Tabell 6).

Tabell 6: Rekelarvevekt i milligram

Masse er vist som middelverdi ± standardavvik.

Vi observerte i den PACAP-behandlede gruppen en høyere homogenitet og bedre kvalitet på larven (mer brankial forgrening og nebblignende modifikasjoner) som er svært viktig i rekeavl. Forskjellen i PL9-stadiet for overlevelse var større enn 40 % i PACAP-behandlet gruppe.

Eksempel 8. Vekststimulering i ung Clarias gariepinus ved å inkludere rekombinant PACAP i fiskediettformuleringen.

Det rekombinante PACAP (SEQ ID nr.14) inneholdt i Pichia pastoris dyrkningssupernatant ble konsentrert og formulert i den næringsholdige fiskedietten til en konsentrasjon på omtrent 5 mg/kg av føde.

To eksperimentgrupper ble dannet, med 100 larver i hver med gjennomsnittlig kroppsvekt på 0,1 g. En gruppe ble behandlet med rekombinant PACAP (SEQ ID nr.

14) inneholdt i P. pastoris dyrkningssupernatanter og de, andre anvendt som en kontrollgruppe, ble behandlet med ikke-transformert P. pastoris dyrkningssupernatant. Eksperimentet ble utført i løpet av 30 dager. Gruppen med den rekombinante PACAP (SEQ ID nr.14) inkludert i dietten ved en dose på 5 mg/kg føde viste en økning i vekst på 30 % sammenlignet med kontrollgruppen med høye signifikante statistiske forskjeller (p<0,01).

Claims (20)

Patentkrav

1. Fremgangsmåte for å øke produktiviteten av fisk eller skalldyrskulturer som omfatter mating eller administrering av et hypofyse adenylat-syklase-aktiverende polypeptid (PACAP) nevropeptid med aminosyresekvensen identifisert som SEQ ID nr. 12, SEQ ID nr. 13 eller SEQ ID nr. 14, til fisk eller skalldyr under oppdrett i en mengde som er effektiv til å stimulere deres vekst.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet anvendes for å øke prolaktinsekresjon og for å forbedre fiskeosmoreguleringen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet anvendes for å regulere appetitt i de akvatiske organismer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet anvendes for å forbedre utviklingen av farge i ornamentale fisk og skalldyr.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet oppnås ved kjemisk syntese.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet oppnås ved rekombinant teknologi.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvori PACAP nevropeptidet anvendes uten rensing, inneholdt i supernatanten av sprengt E. coli som uttrykker PACAP.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvori PACAP nevropeptidet anvendes uten rensing, inneholdt i dyrkningssupernatanten av P. pastoris som uttrykker PACAP.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvori PACAP nevropeptidet anvendes renset begynnende fra rekombinante produksjonssystemer.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet anvendes på fisk eller skalldyr ved periodiske injeksjoner hver tredje dag i konsentrasjonen på 0,1 μg/g av dyrets vekt.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet tilsettes til fisk eller skalldyr ved immersjonsbad ved intervaller på 1 til 4 dager i ferskvann, sjøvann, i en konsentrasjon på mellom 100 og 200 μg av PACAP per liter vann.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori PACAP nevropeptidet tilsettes til fisk eller skalldyr som en formulert fôr i konsentrasjon på 5 mg av PACAP per kg fôr.

13. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 12, hvori PACAP nevropeptidet er tilsatt til tilapia Oreochromis sp.

14. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 12, hvori PACAP nevropeptidet er tilsatt til mallefisk Clarias sp.

15. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 12, hvori PACAP nevropeptidet er tilsatt til laks Salmon sp.

16. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 12, hvori PACAP nevropeptidet er tilsatt til reke Penaeus sp.

17. Anvendelse av PACAP nevropeptid med aminosyresekvensen identifisert som SEQ ID nr. 12, SEQ ID nr. 13 og SEQ ID nr. 14, for fremstilling av en sammensetning for oppdrett av fisk og skalldyr for å stimulere deres vekst.

18. Anvendelse av PACAP nevropeptid med aminosyresekvensen identifisert som SEQ ID nr. 12, SEQ ID nr. 13 og SEQ ID nr. 14 for fremstilling av en sammensetning for behandling av fisk og skalldyr ved oppdrett for å øke dens motstandsdyktighet mot sykdommer.

19. Anvendelse av PACAP nevropeptid med aminosyresekvensen identifisert som SEQ ID nr. 12, SEQ ID nr. 13 og SEQ ID nr. 14, for fremstilling av en sammensetning for forebyggende eller terapeutisk behandling av en infeksjon forårsaket av patogener i fisk- eller skalldyrsoppdrett.

20. Anvendelse av PACAP nevropeptid med aminosyresekvensen identifisert som SEQ ID nr. 12, SEQ ID nr. 13 og SEQ ID nr. 14, for å stimulere vekst av fisk og skalldyr ved oppdrett, for å forbedre produktivitet.