KR101190022B1 - 어류 및 갑각류용 성장-촉진 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 틸라피아 성장 호르몬에 비해 증가된 효과를 보이는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드는 어류 및 갑각류 유생의 성장, 생존율 및 질을 자극할 수 있다. 또한, 기생충에 대한 저항을 증가시키고 수생 생물의 면역계에 관한 파라미터를 자극한다. 유전자를 코딩하는 폴리펩티드를 피치아 파스토리스 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 이러한 벡터는 목표 단백질의 세포외 발현을 가능하게 한다. 목표 폴리펩티드를 함유하는 배양 상청액을 액침 배스 또는 먹이 첨가물로서 수생 생물에 투여하였다.
틸라피아, 피치아 파스토리스, 성장 호르몬, 갑각류, 어류
Description
본 발명은 수생 생명공학 분야, 특히 틸라피아 성장 호르몬 보다 높은 활성을 갖는 폴리펩티드 및 액침 또는 사료 첨가물로서 처리 유생의 생존율 및 질을 향상기키기 위한 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
수생 생물의 성장을 촉진하는 약제의 조사는 여러 조사 연구소에서 관심을 기울여 왔다. 성장 호르몬(Growth hormone; GH)는 이러한 조사의 주요 과제이다.
포유동물, 조류, 파충류, 양서류 및 어류에서의 GH의 존재는 보고되었다. GH 또는 소마토트로핀은 시상하부 펩티드에 반응하는 뇌하수체전엽의 소마토트로포스(somatotrophos)에 의해 합성되고 분비되는 폴리펩티드이다(Barinaga M., 등의 (1985) Independent effects of growth hormone releasing factor on growth hormone release and gene transcription. Nature 314: 279-281). GH는 어류의 성장 조절, 발달, 대사, 식욕 및 삼투압조절에 관련되어 있다(Donaldson E. M., 등의 (1979) Hormonal enhancement of growth. Fish Physiol. 8: 455-597). 어류에서 체간의 산후 성장에 걸친 동화작용 효과 이외에도, 또한 면역 시스템 세포에도 영향을 미친다. GH는 T-세포 증식을 촉진한다. 이의 항원 수용체 활성 및 림프구의 성 장에서 공-자극제로서의 이의 역할에 관한 문헌이 있다(Harris H. and Bird D. J. (1997) The effects of a-MSH and MCH on the proliferations of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) lymphocytes in vitro. In : Kawashima , S., Kikuyama , S., (Eds), Advances in Comparative Endocrinology . Monduzzi Editoire , Bologn pp. 1023-1026a).
IL-2, IL-4, IL-5, 과립구 집락 자극 인자, 대식세포-과립구 자극 인자 및 인터페론과 같은 많은 사이토카인과 구조적 유사성을 가진다는 것이 매우 흥미롭다(Sprang S. R. and Bazan J. F. (1993) Cytokine structural taxonomy and mechanisms of receptor engagement. Curr . Opin . Struc . Biol . 3: 815-827).
포유동물에서, GH는 흉선세포의 식작용, 성숙 및 분화를 자극하며(Ortega E., 등의 (1996) Effects of prolactin on the in vitro phagocytic capacity of macrophages. Comp . Immunol . Immunopathol . 61: 389-393) T-세포 생성 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 자극한다(Murphy W. J. and Longo D. L. (2000) Growth hormone as an immunodulating therapeutic agent. Immunol . Today 121: 211-213).
유사하게, O. keta의 백혈구의 유사분열생식과 함께 스파루스 아우라타(Sparus aurata) 및 스파루스 사르바(Sparus sarba)의 림프구생성 및 식작용 자극체(Sakai M., 등의 (1996) Increase in Haemolytic activity of serum from rainbow trout Oncorhyncus mykiss injected with exogenous growth hormone. Fish Shellfish Immunol . 6: 615-617), 식작용, NK 세포의 활성, 항체 생성, 온코르힌추스 마이키스(Oncorhynchus mykiss)의 보체 용혈성 활성(Yada T., et al. (1999) Effects of prolactin and growth hormone on plasma immunoglobulin M levels of hipophysectomized rainbow trout, Oncorhyncus mykiss. Gen . Comp . Endocrinol . 115: 46-52) 및 무지개 송어(온코르힌추스 마이키스) 및 디센트라르추스 라브락스(Dicentrarchus labrax)의 백혈구 호흡폭발labrax (Munoz P., et al. (1998) Modulation of the respiratory burst activity of Mediterranean sea bass (Dicentrarchus labrax L.) phagocytes by growth hormone and parasitic status. Fish Shellfish Immunol . 8: 25-36)과 같은 GH의 효과를 연구하였다.
두신(head kidney) 백혈구의 식세포 활성의 증가 및 플라스마 리소자임 농도의 증가와 관련된 갑상선 호르몬의 감소된 수준을 수반하는 담수로부터 해수로의 살모 트루타(Slamo trutta) 전환 결과로서 혈장 GH 수준의 증가를 증명하였다.
몇몇 연구는 림프구의 특이 GH 수용체 및 IGF 수용체의 발현을 지적하였다lymphocytes (Tapson V. F., et al. (1988) Structural and functional characterization of the human T lymphocyte receptor for insulin-like growth factor I in vitro. Clin , C. Invest. 82: 950-957). T-세포 증식에서 IGF-I의 생체외 효과를 증명하였다. B-세포, 이뮤노글로블린 및 혈장 세포 상의 IGF-I의 유도 효과는 널리 공지되어 있다. B-세포는 GH 수용체의 고수준의 발현을 보여준다(Badolato R., et al. (1994) Differential expression of surface membrane growth hormone receptor on human peripheral blood lymphocytes detected by dual fluorochrome flow cytometry. J Clin Endocrinol Metab . 79: 984-990).
GH는 마크로파지 및 모노파지 상에 활성화 효과를 통해 림프구 B 및 T에 영 향을 미칠 수 있다(Edwards C. K., 등의 (1988) A newly defined property of somatotropin: priming of macrophages for production of superoxide anion. Science 239: 769-771). 후자는 퀴미오탁시스(quimiotaxis)를 촉진한다. 이러한 세포들은 또한 사이토퀴닌 분비에 의해 림프구에 작용한다. GH는 NK 세포 결핍을 복귀시킨다(Davila D. R., et al. (1987) Role of growth hormone in regulating T-dependent immune events in aged, nude, and transgenic rodents. Neurosci . Res . 18: 108-116).
여러 어류 성장 호르몬의 DNA 상보성은 클로닝되고 서열결정되었다. 주입(Tsai H. J., 등의 (1993) Expression of rainbow trout growth hormone cDNA in yeast. Bull . Inst . Zool . Acad . Sin. 32: 162-170) 또는 액침(Moriyama S. and Kawauchi H. (1990) Growth stimulation of juvenile salmonids by immersion in recombinant salmon growth hormone. Nippon Suisan Gakkaishi 56: 31-34)에 의해 어류의 성장에 걸친 재조합 GH의 유력한 효과가 증명되었다.
인간 GH는 뇌하수체(Baumann G., 등의 (1983) The molecular nature of circulating growth hormone in normal and acromegalic man: evidence for a principal and minor monomeric forms. J. Clin . Endocrinol . Metab. 56: 946-952), 혈장(Baumann G., 등의 (1985) Molecular forms of circulating growth hormone during spontaneous secretory episodes and in the basal state. J. Clin. Endocrinol . Metab . 60: 1216-1220) 및 뇨(Baumann G. and Abramson E. C. (1983) Urinary growth hormone in man: evidence for multiple molecular forms. Endocrinology 56: 305-311)에서 발견될 수 있는 것과 구조적으로 관련된 단백질의 이종 그룹으로서 존재한다. 인간 GH의 우세 변이체는 독특한 폴리펩티드 사슬에 의해 구성되는 22kDa의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 면역반응성 인간 GH의 85%를 구성한다(Lewis U. J., 등의 (1994) Variant forms and fragments of human growth hormone in serum. Acta Paediatr . Suppl. 399: 29-31). 다른 인간 GH의 변이체는 20kDa의 분자량을 갖는 단일 폴리펩티드 사슬(Lewis U. J., 등의 (1978) A naturally occurring structural variant of human growth hormone. J. Biol . Chem. 253: 2679-2687), 아세틸화되고 탈아미드화된 22 KDa 형태(Lewis U. J., 등의 (1981) Altered proteolytic cleavage of human growth hormone as a result of deamidation. J. Biol . Chem . 256: 11645-11650) 및 이황화 결합에 의해 연결된 두 폴리펩티드 사슬을 갖는 단백질분해 절단에 의한 절단 변이체(Singh R. N., et al. (1974) Modified forms of human growth hormone with increased biological activities. Endocrinology 94: 883-891)를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 여러 연구는 후자의 변이체가 가장 활성적임을 증명하였다. 이러한 분자는 22kDa hGH의 아미노산 134 및 150 사이를 프로테나제 소화에 의한 것이다(Wroblewski V. J., 등의 (1991) Proteolytic cleavage of human growth hormone (hGH) by rat tissues in vitro: influence on the kinetics of exogenously administered hGH. Endocrinology 129: 465-474). 이러한 절단된 변이체의 증가된 생물학 활성은 증가된 안정성 및 다른 것보다 낮은 대사 청소율을 갖는다는 사실에 의한 것임이 제안되었다(Baumann G. (1979) Metabolic clearance rates of isohormones of human growth hormone in man. J. Clin . Endocrinol . Metab. 49: 495-499).
재조합 DNA 기술의 발전은 상대적으로 적은 비용으로 관심있는 단백질을 생성하기 위한 숙주 시스템으로서 박테리아 및 이스트를 사용하는 것을 가능하게 했다. 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 이종 단백질을 생성하기 위해 숙주로서 널리 사용된다. 이러한 생물은 높은 발현 수준, 쉬운 핸들링 및 배양에 관련된 E. coli와 같은 다른 시스템의 장점을 제공하며 단백질분해 과정, 재접힘, 글리코실화 및 이황화 결합 형성과 같은 번역후 변이를 실현하는 진핵 시스템의 장점을 갖는 것들과 결합할 수 있다(Higgins D. R. and Cregg J. M. (1998) Introduction to Pichia pastoris. Pichia protocols. Humana Press Inc., Towota 1-15).
발현 시스템으로서, 이 시스템은 간단한 유전자 및 분자 조작이 요구된다; 이는 성장 및 발현을 위한 배지에서 특별한 보충물을 요구하지 않기 때문에 곤충 세포 또는 포유동물 조직 배양에서의 발현보다 비용이 적게 든다. 이러한 효모는 대규모의 발효에 쉽게 적용되며 이는 호흡기 성장, 고밀도에서 이의 배양을 촉진하는 생리학적 특성에 적합하다.
성장 호르몬을 발현하는 재조합 효모를 사용한 성장 자극의 여러 연구가 공지되었다. GH를 발현하는 재조합 피치아 파스토리스가 풍부한 먹이를 투여한 후 닭의 성장에 있어서의 영향이 증명되었다(Chen C. M. et al. (2000) Growth enhancement of fowls by dietary administration of recombinant yeast cultures containing enriched growth hormone. Life Sciences 67: 2103-2115). 게다가, Tsai 등의, 1993 문헌에서 GH를 발현하는 재조합 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 식용 투여에 의해 촉진된 성장을 나타내었다(Tsai H. J., et al. (1993) Enhancement of tilapia growth by dietary administration of recombinant yeast lysates as a supplement. J. Fish . Soc . Taiwan 20: 339-345).
특허 US 제6,239,100호 "어류 성장 호루몬과 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드 및 어류의 성장 촉진 및 유생 사망률 감소를 위한 이의 용도"에서 보호된다.
촉진된 성장, 생존율 증가 및 유생 질적 발달은 수산양식에서 주요 문제 중 하나이다.
본 발명은 틸라피아 GH에 비해 높은 높은 활성을 나타내는 아미노산 서열 SEQ ID No. 7 및 8을 갖는 폴리펩티드 및 이의 어류 및 갑각류용 적용으로 상기 언급된 문제점을 해결하는 것에 관한 것이다. 주요 결과에 따라, 피치아 파스토리스에서 세포외 발현되는 이러한 폴리펩티드들을 발견하였으며, 이 폴리펩티드들은 상기 기재된 아미노산을 포함하며 어류 및 갑각류에게 액침 배스에 의해 또는 식품 첨가물로서 투여되었을 때 성장율, 생존 및 유생의 질을 증가시킨다. 또한, 면역 상태를 개선시킨다. 틸라피아 성장 호르몬에 비해 펩티드의 우수성이 입증되었다.
수생배지에서의 이러한 폴리펩티드의 용도는 여러 장점을 갖는다: 1) 이 폴리펩티드는 어류 GH보다 작은 분자로, 생물에 의해 흡수될 수 있으며 쉽게 혈류에 이를 수 있다 ; 2) 폴리펩티드는 어류 GH의 단편이기 때문에, 인간에게는 생물학적 활성을 나타내지 않는다 ; 3) 어류 GH보다 성장에 대해 더 큰 효과를 갖는다 ; 4) 광범위한 어류 종에서 성장, 생존 및 유생의 질에 대해 주목할 만한 효과를 갖는다.
미국 특허 제6,239,100호는 어류 유생의 성장을 촉진하고 사망률을 감속시키기 위해 어류 GH와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드의 사용에 대해 기재하고 있다.이 폴리펩티드에 대한 서열은 틸라피아 GH와 73%의 상동성을 가지며 N-말단의 51개 누클레오티드가 결여되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 틸라피아 성장 호르몬으로부터 수득한 것이다. 폴리펩티드 SEQ ID NO. 7은 C-말단에 상응하는 46개의 아미노산의 단편이 결여되어 있다. 폴리펩티드 SEQ ID NO. 8은 C-말단에서 동일한 단편이 결여되어 있으며 N-말단에서 17개의 아미노산이 결여되어 있다.
GH와 유사한 활성을 갖는 미국 특허 제6,239,100호의 폴리펩티드와는 다르게, 본 발명의 폴리펩티드는 GH보다 높은 활성을 갖는다. 게다가, C-말단에서 단편이 결여된 폴리펩티드 SEQ ID NO. 7은 폴리펩티드 SEQ ID NO. 8에 비해 우수한 성장 촉진 활성을 갖는다.
본 발명의 구체화에서, 아미노산 서열 SEQ ID NO. 7 및 8에서 정의된 폴리펩티드의 어떤 부분을 포함하는 조성물은 어류 및 갑각류의 성장을 자극한다.
본 발명은 피치아 피스토리스 발현 벡터 pPS10으로의 상기 언급한 폴리펩티드의 코딩 서열의 클로닝을 포함한다.
주형으로서 pR17에 미리 클로닝한 tiGH의 cDNA를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응에 의해 이러한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 수득한다(Guillen I. I., 등의 (1998) Physiological changes in the juvenile euryhaline teleost, the tilapia Oreochromis hornorum, injected with E. coli-derived homologous growth hormone. J Mar . Biotechnol . 6: 142-51). 틸라피아 성장 호르몬은 또한 같은 벡터(pR17)로부터 PCR에 의해 증폭된다.
피치아 파스토리스에서의 타겟 단백질 발현에 대한 유전학적 구성물에서 사용되는 벡터는 피치아 파스토리스 AOX1 프로모터(pAOX1), S. 세레비시애 수크로스 인버타제 2의 신호 펩티드(spSUC 2) 및 S. 세레비시애의 효소 글리세르알데히드-3P-데스히드로게나제의 말단 신호(GAPt)를 포함한다. 효소 선별 마커를 갖는 S. 세레비시애 및 효소 사이의 상동 재조합에 대해 필수적인 3' AOX 영역에 상응하는 크로모좀 DNA의 단편을 또한 포함한다. 벡터는 E. coli에서 기능적 복제 기원 및 박테리아 선별 마커로서 암피실린 내성 유전자를 갖는다. 재조합 피치아 파스토리스 균주를 재생하기 위해 사용된 벡터는 일반적으로 통합된다. 형질전환하기 전에 AOX1 유전자에 의한 상동 재조합을 촉진시키기 위해 플라스미드를 선형화시킬 수 있다. 피치아 파스토리스 MP36 균주를 재조합 단백질의 세포외 생성에 사용하였다. 이 균주는 발현 벡터로 형질전환한 후 표현형 His+를 습득한 피치아 파스토리스 BKM-90 균주(EP 00438200)로부터 수득된 his3 영양요구성 돌연변이체이다(Yong V., 등의 (1992) HIS-3 gene of Saccharomyces cerevisiae complement his mutation in yeast Pichia pastoris. Biotecnologia Aplicada 9: 55-61).
여러 연구에서 다른 어류종의 재조합 GH의 액침을 통한 투여에 의해 성장 촉진 효과를 입증하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 타겟 단백질의 이전 정제 없이 GH에 비해 높은 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 피치아 파스토리스 내로 액침하여 물고기의 성장 촉진을 하는 것에 대해 처음으로 보고하였다. 성장, 병원체 내성 및 면역계 파라미터에 대한 본 발명에 기재된 폴리펩티드의 효과는 틸라피아 유생에서 시험하였으며 틸라피아 성장 호르몬과 비교하였다.
액침을 통해 투여하여 치료하였다. 실험군은 다음과 같다:
- 폴리펩티드를 포함하는 재조합 파스토리스 MP36 균주의 배양 상청액
- 틸라피아 GH를 포함하는 재조합 파스토리스 MP36 균주의 배양 상청액
- 비-형질전환 파스토리스 MP36의 배양 상청액을 포함하는 음성 대조
- 비처리군.
이러한 결과는 폴리펩티드를 처리한 군은 tiGH, 음성 대조 및 비처리군에 비해 중량이 증가함을 보여준다.
면역계에 대한 효과를 분석하기 위해, 20마리 동물을 균질화하였다. 라이소좀 및 렉틴과 같은 다른 비-특이 체액성 인자의 존재 및 산화 스트레스의 하기 파라미터를 측정하였다.
- 감소된 글루타티온: GSH는 효소 글루타티온 페록시다제의 보조인자이다. 이는 산화 스트레스에 대한 방어 메카니즘 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 폴리펩티드 1 및 2로 처리한 군에서 증가하는 경향이 있다.
- 수퍼옥사이드 디스무타제(Superoxide dismutase): SOD는 산화방지제 방어에 속하는 효소이다. 이는 수퍼옥사이드 유리 라디칼을 포획한다. 군들 사이의 어떤 통계차이도 발견되지 않았다. 폴리펩티드 1 및 2로 처리한 군에서 증가하는 경향이 있다.
- 총 조직과산화물(organoperoxides): 이는 산화촉진제의 요소 중 하나이고 히드록시 라디칼 전구체 중 하나이다. 이는 또한 유전자 발현의 유도자, 세포 메카니즘의 활성화 및 포스파타제와 키나제의 조절자일 수 있다. 또한 생체이물의 무독화에 관련된 글루타티온-S-트랜스퍼라제에 대한 보조인자이다. 군 사이의 통계적 유의차는 없었다.
- 카탈라제: 생분자 산화를 생성하는 산화 스트레스의 지시약이다. 카탈라제의 수준이 증가되었을 때 글루타티온 페록시다제를 통해 물질대사될 수 없는 자유 라디칼의 존재를 나타낸다. 실험 시작 후 21일에 군들 사이에 통계 차이는 없었다. 45일에, 카탈라제 수준은 폴리펩티드를 처리한 군에서 대조보다 감소하였다.
- 과산화 잠재성. 이는 지질 산화를 나타내는 것이다. 비처리군에 비해 처리군에서 폴리펩티드 1 및 2로 처리한 군에서 증가하는 경향을 갖는 통계학적 유의차를 얻었다.
- 단백질 산화. 이는 단백질 산화를 나타내는 것이다. 군들 사이의 통계적 차이를 발견하지 못했다.
과산화 잠재성은 생물에서 산화 스트레스 지표이기 때문에, 비처리군에 비해 일부 산화 스트레스를 생성하는 폴리펩티드를 검정하는 것을 추론할 수 있다. 산화 스트레스는 중요한 조절 사건이다. 실험을 시작한 후 45일에, 지질 산화에 대한 효과를 갖는 산화 스트레스가 있을 때조차도, 비처리군엥 비해 처리군 사이의 카탈라제 수준이 상당히 감소하였다. 이러한 사건은 유리 라디칼 수준 및 산화 스트레스의 감소를 나타낸다.
지질은 에너지를 저장하는 다른 생분자에 비해 두드러진 비율 에너지/질량을 제공한다. GH가 지방생성을 저해하고 지방분해를 활성화하며 생성된 자방산이 이상적인 산화성 기질임이 증명되었다. 결과로서, 아미노산은 산화 과정으로부터 성장으로 이동한다. 본 출원인의 실험에서 발견된 지질 산화는 이러한 과정에 관련될 수 있다.
면역계에 관련된 다른 파라미터는 리소자임과 렉틴이다.
리소자임은 바이러스 및 박테리아 감염엥 대한 비-특이 면역 기능의 구성요소 중 하나이다. 어류에서의 리소자임 수준 및 GH 사이의 상관관계가 관찰되었다(Yada T., 등의 (2002) Immunomodulatory effects of prolactin and growth hormone in the tilapia, Oreochromis mossambicus. J Endocrinol . 173: 483-492).
렉틴은 병원체의 다양한 배열에 반응하며 생물에 고유의 면역을 제공한다(Alexander J.B. and Ingram G.A., (1992) Noncellular nonspecific defence mechanismof fish. Annu . Rev . Fish . Dis . 2: 249-279).
비처리군에 비해 폴리펩티드 1 및 2 처리군에서 두 파라미터의 통계적 유의차를 발견하였다.
이러한 폴리펩티드들의 효과는 또한 관상어 유생에서 시험되었다. 이들은 대조에 비해 폴리펩티드-처리군에서 성장 및 생존을 촉진시킬 수 있다. 또한 어류 색소침착을 향상시킨다. 이 파라미터는 관상어 상업화에 결정적이다. 이러한 폴리펩티드에 의해 생성된 효과는 처리를 종료한 후 15일에 보여진다.
도 1은 피치아 파스토리스 발현 벡터의 클로닝 전략을 나타낸 것이다.
도 2는 MutS 표현형을 보이는 형질전환체의 발현 분석을 나타낸 것이다. 피치아 파스토리스에섯 발현된 타겟 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 1 라인: 비-형질전환 MP36; 2 라인: 폴리펩티드 1; 3 라인: 폴리펩티드 2; 4 라인: 틸라피아 성장 호르몬.
도 3은 물의 리터 당 0.1㎎의 투여량의 대상 단백질을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액에 액침시킨 틸라피아 유생의 성장 실험을 나타낸 것이다. 그래프는 음성 대조과 비교한 처리군의 평균 체중을 나타낸다.
도 4는 물의 리터 당 0.1㎎의 투여량의 대상 단백질을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액에 액침시킨 금붕어 유생의 성장 실험을 나타낸 것이다. 그래프는 음성 대조과 비교한 처리군의 평균 체중을 나타낸다.
도 5는 물의 리터 당 0.1㎎의 투여량의 대상 단백질을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액에 액침시킨 금붕어 유생의 성장 실험을 나타낸 것이다. 그래프는 실험 시작 후 45일에 실험군의 생존율을 나타낸다.
도 6은 물의 리터 당 0.1㎎의 투여량의 대상 단백질을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액에 액침시킨 금붕어 유생의 성장 실험을 나타낸 것이다. 처리된 어류는 음성 대조보다 더 선명한 색을 나타낸다.
도 7은 세 가지 다른 투여량(물의 리터 당 0.02; 0.1 및 0.5 ㎎)의 폴리펩티드 1을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액에 액침시킨 잉어 유생의 성장 실험을 나타낸 것이다. 그래프는 음성 대조과 비교한 처리군의 평균 체중을 나타낸다.
도 8은 두 가지 다른 투여량(먹이의 ㎏ 당 폴리펩티드 4.8㎎ 및 먹이의 ㎏ 당 폴리펩티드 38.4㎎)의 폴리펩티드 1을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액의 먹이 투여에 의한 틸라피아의 성장 실험을 나타낸 것이다. 그래프는 음성 대조과 비교한 처리군의 평균 체중을 나타낸다.
실시예
1: 본 발명의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는
피치아
파스토리스
발현의 구성 및
틸라피아
성장 호르몬,
MP36
균주로의 형질전환 및 대상 단백질의 발현.
상술된 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 pR17 벡터 내로 미리 클로닝된 주형으로서 틸라피아 cDNA를 사용하는 특이 올리고누클레오티드와 함께 PCR하여 수득하였다. 폴리펩티드 SEQ ID No. 7에 대한 코딩 서열을 증폭하기 위해, 서열 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2에 상응하는 올리고누클레오티드를 사용하였다. 폴리펩티드 SEQ ID No. 8에 대한 코딩 서열을 증폭하기 위해, 서열 SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4에 상응하는 올리고누클레오티드를 사용하였다.
tiGH에 대한 코딩 서열을 서열 SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6에 상응하는 올 리고누클레오티드를 사용하여 벡터 pR17로부터 PCR하여 증폭시켰다. PCR 산물을 폴리누클레오티드 키나제 효소로 처리하여 유전자 말단을 인산화시키고 발현 벡터로의 클로닝을 촉진하였다. 피치아 파스토리스 발현 벡터 pPS10을 제한 엔도누클레아제 Nae I로 효소 절단시키고 알칼리성 포스파타제로 처리하여 말단을 탈인산화시켰다. 대상 폴리펩티드 및 tiGH에 대해 코딩하는 유전자를 T4 DNA 리가제를 사용하여 발현 벡터내로 결합시켰다(도 1).
형질전환 전에, 플라스미드를 효소 SphI로 선형화시켰다. 피치아 파스토리스 MP36 균주를 재조합 발현 벡터와 함께 전기천공법을 사용하여 형질전환시켰다. 이 균주는 형질전환 후 His+ 표현형을 취득하게 되는 영양요구성 돌연변이체이다.
도트 블롯(Dot Blot)에 의해 확인된, 형질전환체를 또한 재조합 플라스미드의 발현 카세트(cassette)에 대한 피치아 파스토리스의 유전자 AOX1의 치환에 의해 삽입이 이루어지는 것을 증명하기 위해 서던 블롯(Southern blot)으로 분석하였다. 이러한 삽입 이벤트는 MutS(메탄올 이용의 저수준) 및 His+ 표현형을 생성한다. AOX1의 유전적 치환은 벡터 및 게놈에서 프로모터 영역 AOX1 및 3'AOX1 사이의 재조합에 의해 발생한다. 재조합의 결과로서, AOX1에 대한 코딩 영역에서 결실이 발생한다. MutS 표현형을 갖는 재조합 균주는 AOX2 유전자에서 알콜 옥시다제 생성을 지속시키며 이들은 메탄올에서 낮은 성장률을 갖는다
대상 폴리펩티드 및 틸라피아 성장 호르몬을 코딩하는 유전자는 메탄올에 의해 유도될 수 있는 AOX1 프로모터의 조절하에 있으며 이들은 시그널 펩티드를 갖는 다. 피치아 파스토리스는 낮은 수준으로 자신의 단백질을 분비하며 이의 배양 배지는 보충물로서 단백질을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 분비된 이종의 단백질은 배지에서 총 단백질 중 높은 비율을 차지할 것이다(80% 이상)(Tschopp y col.; Bio/Technology 1987, 5: 1305-1308; Barr 등의; Pharm. Eng. 1992, 12: 48-51). 본 발명에서 설명된 재조합 단백질의 생성은 배지에 메탄올을 첨가한 5L의 생물반응기에서 이루어진다. 도 2에 나타난 바와 같이, 틸라피아 GH에 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 배양 상청액에서 단백질의 발현을 확인하기 위해 사용하였다.
실시예 2: 대상 폴리펩티드를 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 액침함에 의한 틸라피아에서의 성장 실험. 면역계에서의 효과.
실험은 일주일에 3회 90분간 액침하여 이루어졌다. 투여량은 물 ℓ당 0.1㎎의 목표 단백질이다. 실험군은 다음과 같다:
1. 폴리펩티드 1을 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 군(처리 1).
2. 폴리펩티드 2를 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 군(처리 2).
3. 틸리피아 GH를 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 군(처리 3).
4. 비-형질전환된 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 음성 대조(음성 대조).
5. 비-처리군.
실험 시작 후 45일에, 폴리펩티드 SEQ ID No.7을 처리한 유생은 비처리군, 음성 대조 및 tiGH 처리군에 비해 각각 3.6, 2.1 및 1.6배 높은 체중 증가를 나타낸다. 반면, 폴리펩티드 SEQ ID No.8을 처리한 유생은 비처리군에 비해 3.2배, 음성 대조에 비해 1.9배 및 tiGH 처리군에 비해 1.4배 높은 체중 증가를 나타낸다(표 1, 표1.1, 도3).
| 음성대조 | 성장 호르몬 | 비처리군 | 폴리펩티드 SEQ ID No .7 | 폴리펩티드 SEQ ID No .8 | |
| 3주 | 0.055±0.037 | 0.084±0.042 | 0.033±0.020 | 0.099±0.058 | 0.092±0.055 |
| 6주 | 0.120±0.046 | 0.159±0.067 | 0.071±0.026 | 0.254±0.093 | 0.227±0.082 |
질량은 평균±S.D로서 나타냈다.
표 1.1
실험 시작 후 45일에서의 통계학적 분석
| 터키 다중 비교 테스트 | P 값 |
| 음성 대조 대 성장 호르몬 | P > 0.05 |
| 음성대조 대 폴리펩티드 SEQ ID No.8 | P < 0.001 |
| 음성 대조 대 폴리펩티드 SEQ ID No.7 | P < 0.001 |
| 음성 대조 대 비처리군 | P < 0.05 |
| 성장 호르몬 대 폴리펩티드 SEQ ID No.8 | P < 0.01 |
| 성장 호르몬 대 폴리펩티드 SEQ ID No.7 | P < 0.001 |
| 성장 호르몬 대 비처리군 | P < 0.001 |
| 폴리펩티드 SEQ ID No.8 대 폴리펩티드 SEQ ID No.7 | P > 0.05 |
| 폴리펩티드 SEQ ID No.8 대 비처리군 | P < 0.001 |
| 폴리펩티드 SEQ ID No.7 대 비처리군 | P < 0.001 |
이는 경제적으로 중요한 어류의 초기 발생 단계에서 성장 촉진이 배양 생산성을 증가시키기 위해 결정적인 생존율 증가를 이끌어내므로 매우 중요한 결과이다.
면역계에 대한 효과를 분석하기 위해, 군 당 20마리 동물을 실험 시작 후 21일 및 45일에 포획하였다. 유생을 균질화시키고 산화 스트레스의 다른 파라미터를 측정하였다: GSH, SOD, 총 기관 과산화물, 카탈라제, 과산화 잠재성 및 단백질 산화.
실험 시작 후 21일에 음성 대조에 비해 처리군간의 과산화 잠재성에서 차이가 발견되었다. 실험 시작 후 45일에 유생 추출물에서 리소자임 활성을 측정하였다. 시료(유생 균질액)의 리소자임 활성을 박테리아 마이크로콕커스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)를 용해시키기 위해 리소자임의 활성에 기초한 방법을 사용하여 측정하였다. 96-웰 마이크로플레이트에, 인산염 완충용액에 42배 계열희석한 시료 100μL를 마이크로콕커스 리소데이크티쿠스(시그마)의 3㎎/㎖ 현탁액 100μL와 혼합하였다. 마이크로플레이트를 22℃에서 항온하고 450nm에서 O.D.를 0, 15, 30 및 60분에 판독하였다. 양성 대조에 대해 유생 균질액을 닭의 달걀 화이트 리소자임(hen egg white lysozyme)(8㎍/㎖에서 시작하는 계열 희석)으로 대체하고, 음성 대조에 대해 완충용액을 유생 균질액으로 대체하였다. 리소자임 활성의 유닛은 0.001분-1의 O.D. 판독에서 감소를 유발하는 유생 균질액의 양으로서 규정하였다. 비처리군에 비해 폴리펩티드 SEQ ID No. 7 및 SEQ ID No. 8을 갖는 처리군간의 통계학적 유의차가 발견되었다(표 2).
유생 균질액에서 렉틴을 측정하기 위해 혈구응집 검정을 또한 실시하였다. 유생 추출물의 2배 계열 희석을 새로 제조한 2% 적혈구 현탁액(PBS 내 토끼)의 동일 부피를 첨가한 U자형 바닥 마이크로플레이트(96 웰, 그레이너, 아이그로론)에 pH 7.2인 PBS를 사용하여 실행하였다. 웰을 1시간 동안 실온에서 항온하고 역가를 시각적으로 판독하고 응집을 보이기 위해 마지막 웰에서의 희석을 동일하게 하였다(모든 웰 바닥에서의 세포의 고르게 분배된 층에 의해 명백해진 바와 같다). 시료의 혈구응집 활성을 시험하고 각 역가 수치를 수득하였다. 활성을 역가로서, 즉 완전한 응집을 나타내는 가장 높은 희석의 역수로서 표현하였다.
비처리군에 비해 폴리펩티드 SEQ ID No. 7 및 SEQ ID No.8을 갖는 처리군간에 통계학적 유의차를 관찰하였다(표 3).
| 폴리펩티드 SEQ ID No .7 | 폴리펩티드 SEQ ID No .8 | 성장 호르몬 | 음성 대조 | 비처리군 |
| 2.596±0.425* | 2.598±0.430* | 2.250±0.162 | 2.246±0.160 | 1.404±0.700 |
농도는 평균±S.D로서 나타내었다.
ANOVA, 터키 테스트; *는 유의차 P<0.05를 나타낸다.
| 폴리펩티드 SEQ ID No .7 | 폴리펩티드 SEQ ID No .8 | 성장 호르몬 | 음성 대조 | 비처리군 | |
| 타이틀 | 4* | 4* | 2 | 2 | 1 |
ANOVA, 터키 테스트; *는 유의차 P<0.05를 나타낸다.
실시예 3: 성장 자극 실험 및 대상 폴리펩티드를 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액을 갖는 액침 배스에 의해 금붕어에서의 유생의 질 개선.
4개의 실험군을 계획하였다. 일주일에 3회 90분간 액침 배스에 의해 처리하였다. 투여량은 물 ℓ당 0.1㎎의 목표 단백질이다. 실험군은 다음과 같다:
1. 폴리펩티드 1을 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 군(처리 1).
2. 폴리펩티드 2를 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 군(처리 2).
3. 틸리피아 GH를 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 군(처리 3).
4. 비-형질전환된 피치아 파스토리스 배양 상청액으로 처리한 음성 대조(음성 대조).
실험 시작 후 45일에, 처리 1 및 2는 처리 3 및 4에 비해 상당한 무게 증가를 보여준다.
75일에, 폴리펩티드 SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.8로 처리한 유생은 음성 대조 2배, tiGH 처리군에 비해 1.5배 높은 무게 증가를 나타낸다(표 4; 표 4.1; 도 4). 게다가, 처리 1, 2 및 3은 음성 대조에 비해 높은 생존율을 나타낸다(도 5).
관상어의 색은 상업화의 매우 중요한 파라미터이다. 이 실험에서, 처리 1 및 2에서의 유생이 음성 대조에 비해 이른 발달 단계에서 색을 나타냄을 발견하였다. 실험 시작 후 75일에 이들은 좀더 선명한 색을 갖는다(도 6).
| 폴리펩티드 SEQ ID No .7 | 폴리펩티드 SEQ ID No .8 | 성장 호르몬 | 음성 대조 | |
| 45 일 | 0.132±0.083 | 0.137±0.088 | 0.087±0.099 | 0.042±0.024 |
| 75 일 | 0.613±0.198 | 0.625±0.184 | 0.405±0.156 | 0.307±0.169 |
질량은 평균±S.D로서 나타냈다.
표 4.1
실험 시작 후 75일에 통계적 분석
| 터키 다중 비교 테스트 | P 값 |
| 음성 대조 대 성장 호르몬 | P > 0.05 |
| 음성 대조 대 폴리펩티드 SEQ ID No.8 | P < 0.001 |
| 음성 대조 대 폴리펩티드 SEQ ID No.7 | P < 0.001 |
| 성장 호르몬 대 폴리펩티드 SEQ ID No.8 | P < 0.001 |
| 성장 호르몬 대 폴리펩티드 SEQ ID No.7 | P < 0.001 |
| 폴리펩티드 SEQ ID No.8 대 폴리펩티드 SEQ ID No.7 | P > 0.05 |
실시예
4: 다른 투여량의 폴리펩티드 1을 갖는
액침
배스에 의한 잉어의 성장 실험.
잉어 유생의 성장에 대한 다른 투여량의 폴리펩티드 1의 효과를 실험하였다. 4개의 실험군을 다음과 같이 계획하였다:
1. 물 리터당 0.02mg의 폴리펩티드 투여량에서 폴리펩티드 SEQ ID 7을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액을 처리한 군(처리 1).
2. 물 리터당 0.1mg의 폴리펩티드 투여량에서 폴리펩티드 SEQ ID 7을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액을 처리한 군(처리 2).
3. 물 리터당 0.5mg의 폴리펩티드 투여량에서 폴리펩티드 SEQ ID 7을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액을 처리한 군(처리 3).
4. 비처리군.
실험 시작 후 30일에 물 리터당 0.5mg의 폴리펩티드 SEQ ID 7의 투여량을 처리한 유생은 비처리군에 비해 2.75배 많은 무게를 갖는다. 반면에 물 리터당 0.1mg의 폴리펩티드 SEQ ID 7의 투여량을 처리한 유생은 비처리군에 비해 1.8배 많은 무게를 갖는다. 비처리군 및 최소 투여량 사이에 통계학적 차이는 없었다(표 5; 표 5.1; 도 7).
| 비처리군 | 투여량 0.5 mg /L | 투여량 0.1 mg /L | 투여량 0.02 mg /L | |
| 30 일 | 0.094±0.055 | 0.258±0.127 | 0.169±0.080 | 0.108±0.059 |
질량은 평균±S.D로서 나타냈다.
표 5.1
실험 시작 후 30일에 통계학적 분석
| 터키 다중 비교 테스트 | P 값 |
| 0.5mg/l 대 0.1mg/l | P < 0.01 |
| 0.5mg/l 대 0.02mg/l | P < 0.001 |
| 0.5mg/l 대 control | P < 0.001 |
| 0.1mg/l 대 0.02mg/l | P < 0.05 |
| 0.1mg/l 대 음성 | P < 0.01 |
| 0.02mg/l 대 음성 | P > 0.05 |
실시예
5: 대상 폴리펩티드를 포함하는
피치아
파스토리스
배양
상청액에
액
침시킨 새우
리토페나에우스
쉬미티
(
Litopenaeus
schmitti
) 유생의 성장 실험.
3개의 실험군을 계획하였다. 일주일에 3회 1시간 30분 동안 액침 배스에 의해 처리하였다. 투여량은 물 리터당 0.1mg의 대상 단백질이다:
1. 폴리펩티드 SEQ ID 7을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액을 처리한 군(처리 1).
2. 폴리펩티드 SEQ ID 8을 포함하는 피치아 파스토리스 배양 상청액을 처리한 군(처리 2).
3. 비-형질전환된 피치아 파스토리스 배양 상청액을 처리한 음성 대조군(음성 대조).
실험 결과로서, 대상 폴리펩티드를 처리한 새우에서 유생의 질이 개선되었다. 폴리펩티드 SEQ ID No. 7 및 SEQ ID No.8을 처리한 유생은 음성 대조에 비해 2.3배 높은 체중 증가율을 나타내며 좀더 많은 분지 형성 및 부리 변이를 나타낸다. 상응하는 통계 테스트를 각 파라미터에 대해 실시하고 통계학적 유의차를 도든 경우에서 발견하였다.
실시예
6: 다른 투여량에서
폴리펩트드
SEQ
ID
7의 먹이 투여에 의한
틸라피
아의 성장 실험.
72.99±3.25g의 초기 무게를 갖는 미숙한 틸라피아의 성장에 대한 두 투여량의 폴리펩티드 SEQ ID No. 7의 효과를 측정하였다. 시험된 투여량은 먹이 Kg 당 4.8mg의 폴리펩티드 SEQ ID No. 7 및 먹이 Kg 당 38.4mgmg의 폴리펩티드 SEQ ID No. 7이다. 경구 제형은 기초 사료 내에 대상 폴리펩티드를 함유하는 피치아 파스토리스 배양 상청액을 첨가하여 제조된다. 음성 대조는 비-형질전환된 피치아 파스토리스 배양 상청액이 풍부한 기초 사료를 갖는 틸라피아 먹이이다. 실험 기간 동안 동물들에게 6주간 체중의 5%에 상응하는 먹이를 하루에 2회 공급하였다.
먹이 Kg 당 4.8mg의 폴리펩티드 SEQ ID No.7의 투여량으로 사료에 포함되는 폴리펩티드 SEQ ID No. 7은 대조군에 비해 성장률을 22% 증가시키며 높은 통계학적 유의차를 갖는다(표 6; 표 6.1; 도 8).
| 음성 대조 | 투여량 4.8 mg / Kg | 투여량 38.4 mg / Kg | |
| 45 일 | 99.06±0.27 | 121.82±0.35 | 101.54±0.39 |
질량은 평균±S.D로서 나타냈다.
표 6.1
실험 시작 후 45일에 통계학적 분석
| 터키 다중 비교 테스트 | P 값 |
| 4.8mg/kg 대 38.4mg/kg | P < 0.001 |
| 4.8mg/kg 대 음성 | P < 0.001 |
| 38.4mg/kg 대 음성 | P > 0.05 |
오늘날에는, 수생 생물은 단백질의 중요한 원천이나, 이의 자연환경에서의 포획은 완전히 개발되었다. 이러한 이유에 있어서, 생산을 증가시키기 위해 이러한 수생종의 포획이 필수적이다. 대부분의 생물에ㅎ서 호르몬 투여, 유전자 변이 등에 의해 성장 조절을 가능하게 하는 광범위한 범위가 존재한다(Pullin y col.; Conference Proceeding 7, 432 p. International Center for living Aquatic Resources Monagement. Manila, Philippines. 1982, ISSN 0115-4389).
본원에 기재된 폴리펩티드는 종-특이적이지 않으므로 증가된 성장, 생존율 및 유생의 질과 같은 여러 기능에 대해 다른 수생 생물에 적용될 수 있으며 면역 반응에 관해 다른 파라미터를 증강시키는 장점을 갖는다. 게다가,성장 호르몬에 비해 상당히 높은 성장 효과를 갖는다. 다른 한편으로, 이러한 폴리펩티드들은 인간에서 생물학적 활성을 갖지 않아 인간이 소비하는 동물에 적용할 수 있어 불편함을 줄인다. 게다가, 관상어에서의 이러한 폴리펩티드의 사용은 성장 촉진의 결과로서 양식 시간을 감소시킬 뿐만 아니라 물고기의 색에 대한 효과도 가지므로 매우 효과적이다.
서열목록제출서에 첨부하여 제출
Claims (7)
- 서열 SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.8 중 하나에 포함되는 아미노산 서열인 폴리펩티드
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 수득된 것임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 어류 및 갑각류의 성장을 촉진시키기 위한, 제1항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
- 먹이 Kg 당 4.8mg의 폴리펩티드의 효과적인 투여량으로 어류 및 갑각류의 성장을 촉진하고 질병을 저해하기 위한 먹이 제형에서의 제1항의 폴리펩티드를 함유한 피치아 파스토리스 배양 상청액을 포함한 조성물.
- 물 리터당 0.05 및 0.5mg 사이의 폴리펩티드의 농도로 어류 및 갑각류의 성장, 생존율 및 유생의 질을 촉진시키기 위한 제1항의 폴리펩티드를 함유한 액침 처리용 피치아 파스토리스 배양 상청액을 포함한 조성물
- 어류 및 갑각류의 체액성 선천성 면역계를 자극하기 위한 제1항의 폴리펩티 드를 포함하는 조성물.
- 제1항의 폴리펩티드를 포함하는 관상어 처리용 조성물.
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