BRPI0618913B1 - Método para aumentar a produtividade de um cultivo de peixes ou crustáceos e uso de um neuropeptídeo pacap - Google Patents
Método para aumentar a produtividade de um cultivo de peixes ou crustáceos e uso de um neuropeptídeo pacap Download PDFInfo
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Description
“MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUTIVIDADE DF UM CULTIVO
DE PEIXES OU CRUSTÁCEOS E USO DE UM NEUROPEPTÍDEO
PACAP
CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção relaciona-se com o campo da biotecnologia agropecuária, especificamente com a utilização do Peptídeo Ativador da Adenilato Ciclase da Pituitária. Quando sc aplica o peptídeo por imersão, por injeção ou como aditivo na dieta alimentícia, obtém-se um aumento no apetite destes organismos, uma maior taxa de crescimento e de sobrevida, uma atividade imune superior e um aumento da liberação da prolactina.
ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR O Peptídeo Ativador da adenilato ciclase da Pituitária (em inglês Pituitary Adenylate cyclase Activating peptide, abreviado PACAP) foi isolado pela primeira vez no ano de 1989, a partir do hipotálamo bovino, e demonstrou-se que sua capacidade de estimular a secreção do hormônio do crescimento (em inglês growth hormone, abreviado GH) é através da ativação da enzima adenilato ciclase [Miyata e colaboradores (1989) Isolation of a novel 38 residue hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 567-574]. O PACAP pertence à família dos peptídeos que inclui a seeretina, o glucagon e o peptídeo intestinal vasoativo [Arimura e Shioda (1995) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors: Neuroendocrine and endocrine interaction. Front. Neuroendocrinol. 16: 53-88]. Os precursores do PACAP e do hormônio liberador do hormônio de crescimento (em inglês “growth hormone releasing hormone”, abreviado GHRH), nos mamíferos, são codificados poi uois genes distingos [Hosoya e colaboradores (1992) Structure of the human pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) gen. Biochim. Biophys. Acta. 1129: 199-206], enquanto em todas as espécies submamíferas estudadas até à data (aves, répteis e peixes), os peptídeos do GHRH e do PACAP são codificados por um mesmo gene e se acham contidos em um mesmo precursor [Montero e colaboradores (2000) Molecular evolution of the growth hormone-releasing hormone/pituitary adenyíate cyclase-activating polypeptide gene family. Functional implication in the regulation of growth hormone secretion. Journal of Molec. Endocrinol. 25: 157-168]. O PACAP é expresso fundamentalmente no sistema nervoso central e periférico, nas fibras nervosas que enervam os olhos, no trato respiratório, nas glândulas salivares, no trato gastrintestinal, nos órgãos do sistema reprodutivo, no pâncreas e no trato urinário. Também é sintetizado nas glândulas adrenais, nas gônadas e nas células imunes [Sherwood e colaboradores (2000) The origin and function of the Pituitary Adenyíate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily. Endocrine Review 21: 619-670]. Apresenta diferentes funções biológicas, o que é consistente com sua diferente distribuição nos diferentes tecidos e com sua atividade hipofisiotrófica, neurotransmissora, neuromoduladora e vasorreguladora (Chatterjee e colaboradores (1997) Genomic organization of the rat pituitary adenyíate cyclase-activating polypeptide receptor gene.
Altemative splicing withín the 59-untranslated region. J. Biol. Chem. 272: 12122-12131). Acha-se envolvido na regulação da divisão celular, da diferenciação e da morte celular [Sherwood e colaboradores (2000) The origm and function of the Pituitary Adenyíate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily. Endocrine Rewiew 21: 619-670]. O PACAP estimula a liberação do hormônio de crescimento. O efeito do peptídeo sobre a liberação do GH foi demonstrado, in vitro, em várias espécies de mamíferos, em aves, em anfíbios [Hu e colaboradores (2000) Characterizaíion anu messenger ribonucíeic acid distribution of a cloned pituitary adenyíate cyclase-activating polypeptide type T receptor in the frog Xenopus laevis brain. Endocrinol. 141: 657-665] e em peixes [Anderson, L. L. e colaboradores (2004) Growth Hormone Secretiori: Molecular and Cellular Mechanisms and In vivo Approaches. Society for Experim. Bioi. and Med. 229: 291-302]. Os estudos realizados sobre o papel do PACAP na secreção e liberação do GH, in vivo, são escassos. Até a presente data sabe-se que o peptídeo aumenta, in vivo, os níveis de GH no plasma de ratazanas [Jarr e colaboradores (1992) Contrasting effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on in vivo and in vitro prolactin and growth hormone release in male rats. Life Sei. 51: 823- 830] e de bovinos [Radcliff e colaboradores (2001) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide induces secretion of growth hormone in cattle.
Domestic. Animal. Endocrinol. 21: 187-196], enquanto nas ovelhas [Sawangjaroen e Curlewis (1994) Effects or pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and vasoactíve intestinal polypeptide (VIP) on prolactin, luteinizing hormone and growth hormone secretion in the ewe. J.
Neuroendocrinol. 6: 549-555] e nos seres humanos [Chiodera e colaboradores (1996) Effects of intravenously infused pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on adenohypophyseal hormone secretion innormal men. Clin.
Neuroendocrinol. 64: 242-246] não produz este efeito. Estas descobertas sugerem que o efeito do peptídeo sobre a secreção do GH, nos mamíferos, varia de espécie para espécie [Anderson e colaboradores (2004) Growth Hormone Secretion: Molecular and Cellular Mechanisms and In vivo Approaches. Society for Experim. Biol. and Med. 229: 291-302], Nos peixes, até o presente, não existem estudos, in vivo, que mostrem o papel do PACAP na regulação do GH, e nem existem antecedentes do uso deste peptídeo como estimulador do apetite nos organismos aquáticos. Nos crustáceos não existem evidências, até o presente, da presença deste peptídeo, e não se tem conhecimento da casuala de sinais que reguiem o crescimento nestes organismos. O PACAP estimula, ademais, a liberação da prolactina nos mamíferos pelas células da glândula pituitária [Ortmann e colaboradores (1999) Interactions of ovarian steroids with pituitary adenylate cyclase- activating polypeptide and GnRH in anterior pituitary cells. Eur. J.
Endocrinol. 140: 207-214], Promove a liberação do hormônio estimulante dos melanócitos (em inglês: “melanotropin α-melanocyte-stimulating hormone”, abreviado MSH) pelas células melanotróficas da pituitária anterior [Vaudry e colaboradores (2000) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to fimctions. Pharmacol. Rev.s 52: 269-364], Nos peixes não existem estudos, até o presente, que mostrem a atividade deste peptídeo como liberador da prolactina in vivo, nem observações acerca de seu efeito no desenvolvimento da coloração nos peixes.
Nos mamíferos se acha muito bem caracterizada a função do PACAP sobre o sistema imune e existem várias patentes que descrevem seu uso nos seres humanos como modulador da resposta imunológica. Até o presente, não existem antecedentes na literatura que expliquem o papel do PACAP sobre o sistema imune em organismos aquáticos. O gene que codifica para o PACAP foi clonado de várias espécies de vertebrados e de um protocordado (tunicado). Nos peixes, foi isolado o de algumas espécies de salmão e de peixe-gato [Sherwood e colaboradores (2000) The Origin and Function of the Pituitary Adenylate Cvclase-Activating polypeptide (PACAT)/Glucagon Superfamily Endocrine Reviews 21(6): 619-670], peixinho dourado [Leung e colaboradores (1999) Molecular cloning and tissue distribution of in pituitary adenylate cyclase- activating polypeptide (PACAP) the goldfish. Rec. Progr. Mol. Comp.
Endocrinol. 338-388], peixe-zebra [Fradinger e Sherwood (2000) Characterization of the gene encoding both growth hormone-releasing hormone (GRF) anu pituiiary adenylate cyclase-activating polypeptide. Mol. and Cell. Endocrinol. 165: 211-219], truta [Krueckl e Sherwood. (2001) Developmental expressão, altemative splicing and gene copy number for the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and growth hormone-releasing hormone (GRE) gene in rainbow trout. Molec. and Cell.
Endoerinoí. 182: 99-108). Na patente U.S. 5.695.954 são protegidos o isolamento e a purificação das seqüências nucleotídicas de genes que codificam para o polipeptídeo GHRH-PACAP de peixes, assim como vetores e hospedeiros que expressem referidas seqüências com o objetivo de serem usados para incrementar o crescimento nos peixes, através da transgênese, introduzindo-se as construções genéticas mencionadas em ovos de peixes fertilizados. É protegido, além disso, um método para detectar peixes transgênicos que contenham estas seqüências. Nesta patente são relatadas especificamente as seqüências dos genes que codificam para o polipeptídeo GHRH-PACAP das espécies Oncorhynchus Nerka, Ciaria macrocephalus e Acispenser transmontanus.
Na presente invenção, são empregadas variantes da sequência aminoacídica exata do PACAP, obtida em nosso laboratório para as espécies Ciaria gariepinus e Oreochromis niloticus, com modificações no extremo do terminal amino. Estas variantes são utilizadas como estimuladores do crescimento por via não transgênica, mediante sua administração por imersão, expressas no sobrenadante de cultivo de E. coli e de P. pastoris, sem sua purificação prévia. Inesperadamente, ainda observamos que estas variantes são capazes, nestas condições, de promover um aumento significativo da atividade imunológica nestes organismos e da concentração da prolactina no soro. Estas propriedades do peptídeo não haviam sido descritas até o presente, para organismos aquáticos. Vários autores relataram um efeito estimulador do crescimento em peixes pela administração através da imersão do hormônio de crescimento reccmbinante. Não obstante, na prática, o uso direto do hormônio de crescimento está sujeito a muitos requisitos reguladores, e o mesmo acontece com o uso de peixes transgênicos que sobrexpressam o hormônio de crescimento ou um fator liberador deste. Na presente invenção é descrita uma metodologia não mediada pela transgênese, para aumentar o crescimento e melhorar o sistema imune de organismos aquáticos, incluindo os invertebrados.
Os organismos aquáticos são atualmente uma fonte importante de proteínas, porém sua captura de forma natural encontra-se no limite máximo de sua exploração, motivo por que, para se aumentar sua produção, toma-se necessário seu cultivo (Pullin e colaboradores; Conference Proceeding 7, 432 p. International Center for living Aqua tic Resources Management, Manila, Filipinas. 1982, ISSN 0115-4389). Aumentar a eficiência do cultivo destes organismos mediante o estímulo do crescimento, 0 aumento da sobrevida e a melhora da qualidade das larvas, é considerado um problema importante a ser resolvido na aqüicultura.
EXPLANAÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção resolve o problema anteriormente mencionado, proporcionando variantes do Peptídeo Ativador da Adenilato Ciclase da Pituitária com as seqüências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, que aumentam a taxa de crescimento de organismos aquáticos, incluindo organismos invertebrados, em um curto período de tempo, o qual é de vital importância para a aqüicultura, estes peptídeos aumentam, além disso, a sobrevida quando aplicados por imersão ou como aditivo na dieta das larvas de peixes e crustáceos de interesse comercial, estimulam a atividade imune nestes organismos, assim como o apetite, o desenvolvimento da coloração da pele e a liberação da prolactina.
Em uma forma de realização preferida da presente invenção, as variantes do neuropeptídeo PACAP são aplicadas aos peixes ou crustáceos mediante injeções periódicas com intervalos de 3 dias, em uma concentração de 0,1 pg/g de peso do animal, mediante banhos de imersão com intervalos de 1 a 4 dias em água doce ou em água do mar tendo uma concentração de peptídeo entre 100 a 200 pg por litro de água, e como alimento formulado em uma concentração de 5 mg/kg de alimento seco. Obtém-se, em todos os casos, um aumento significativo do crescimento destes organismos e uma atividade imune superior. O uso das variantes do neuropeptídeo PACAP oferece vantagens por ser em pequenas quantidades da ordem aproximada dos 5 KDa, motivo pelo qual é mais bem absorvido através da pele e das mucosas dos organismos, quando aplicado por imersão, que é uma via de administração com as vantagens do custo e da manipulação para a aqüícultura, e com baixos índices de contaminação, e além disso seu mecanismo de transdução de sinais é iniciado pela ativação de uma enzima (adenilato ciclase) e não através da ativação de um hormônio, e sua atividade liberadora de hormônio de crescimento nos mamíferos, incluindo os seres humanos, é fraca, motivo por que sua utilização apresenta melhor percepção pública e menos exigências reguladoras. Outras vantagens é a de estimular a atividade imune inata e adaptativa em peixes, e de aumentar a resistência a infecções por agentes patógenos.
Em uma materialização da invenção, as variantes do PACAP são subministradas a espécies de organismos aquáticos como à tilápia Orechromis sp, ao peixe-gato Ciaria sp, ao salmão Salmon sp e aos camarões do gênero Penaus sp.
Em outra forma de realização preferida da presente invenção, as variantes do PACAP são administradas aos peixes ou crustáceos para prevenir ou tratar de infecções por agentes patógenos.
Como resultado deste trabalho, uma materialização da presente invenção descreve a preparação de uma composição para tratar de peixes ou crustáceos em cultivo para estimular seu crescimento e para incrementar sua resistência contra enfermidades, assim como para o tratamento preventivo ou terapêutico de uma infecção por agentes patógenos, tudo isto com o objetivo de melhorar a produtividade.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Estratégia da clonagem do peptídeo de interesse nos vetores de expressão nas bactérias (Figura 1 A) e na levedura (Figura 1B).
Figura 2. Experiência de estímulo do crescimento em jovens de Ciaria gariepinus mediante a injeção intraperitoneal do PACAP recombinante purificado por cromatografia de afinidade, na dose de 0,1 pg por grama de peso do animal. O gráfico representa a média do peso corporal do grupo tratado com o PACAP, em comparação com o grupo tratado com o placebo no transcurso da experiência.
Figura 3. Experiência de estímulo do crescimento em jovens de Ciaria gariepinus mediante a injeção intraperitoneal do PACAP recombinante purificado por cromatografia de afinidade, na dose de 0,1 pg por grama de peso do animal. O gráfico representa a média dos valores do índice hepatossomático e do peso seco do músculo do grupo tratado com o PACAP em comparação com o grupo tratado com o placebo.
Figura 4. Experiência de estímulo do crescimento em larvas de tilápia, mediante a aplicação através de imersão do PACAP recombinante contido no sobrenadante de ruptura de E. coli, na dose de 100 pg por litro de água. Os gráficos 4A e 4B mostram a média dos valores do peso em gramas e o comprimento em centímetros dos peixes do grupo tratado com o PACAP em relação ao grupo tratado com o placebo, no transcurso da experiência.
Figura 5. Experiência de estímulo do crescimento em larvas de tilápia, mediante a aplicação através de imersão do PACAP recombinante contido no sobrenadante de ruptura de E. coli, na dose de 100 pg por litro de água. Os gráficos 4A e 4B representam o peso em gramas dos peixes tratados com o PACAP e dos peixes tratados com o placebo, nos 22 dias do início dos tratamentos.
Figura 6. Experiência de estímulo do crescimento em larvas de tilápia, mediante a aplicação através de imersão do PAG AP recombinante contido no sobrenadante de ruptura de E. coli, na dose de 100 pg por litro de água. A fotografia mostra a diferença no comprimento nos 30 dias, depois do último banho de imersão, dos peixes tratados com o PACAP (A e C) em relação ao grupo tratado com o placebo (B).
Figura 7. Experiência de estímulo do crescimento em larvas de tilápia, mediante a aplicação através de imersão do PACAP recombinante contido no sobrenadante de ruptura de E. coli, na dose de 100 pg por litro de água. A fotografia mostra maior precocidade no desenvolvimento da coloração dos peixes tratados com o PACAP (A e B) em relação ao grupo de placebo (C).
Figura 8. Experiência para avaliar o efeito do PACAP recombinante purificado por cromatografia de afinidade, sobre o apetite, em tilápias jovens da espécie Orechromis niloticus, quando aplicado na dose de 0,5 pg por grama de peso do animal. O gráfico mostra a quantidade média de alimento ingerido pelos peixes de ambos os grupos 6 horas e 22 horas após o início dos tratamentos.
EXPOSIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE
REALIZAÇÃO / EXEMPLOS
EXEMPLO 1. CONSTRUÇÃO DE VETORES PARA A
EXPRESSÃO DO PACAP DE MODO INTRACELULAR EM E. Coli E DE MODO EXTRACELULAR NO SOBRENADANTE DE CULTIVO DE P. pastoris. O gene que codifica para o PACAP de Ciaria gariepinus foi isolado mediante a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (em inglês, Polymerase Chain Reaction, abreviado PCR) a partir da seqüência anteriomientc obliua por RT-PCR (em inglês, Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) para o gene que codifica para o neuropeptídeo GEORH-PACAP desta espécie. Foram utilizados os oligonucleotídeos específicos de SEQ ID ΝΌ: 1 e SEQ ID NO: 2 para se obter a seqüência completa do gene que codifica para o polipeptídeo GEIRG-PACAP incluindo a seqüência de sinaf e os oligonucleotídeos específicos das SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 para amplificar o gene exato do PACAP com os sítios de restrição enzimatica necessários para sua clonagem em um vetor de expressão em E. coli. O PACAP de tilápia foi isolado de igual forma, utilizando-se os oligonucleotídeos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. A presente invenção constitui o primeiro relato do isolamento deste gene na tilápia. O gene que codifica para o PACAP foi clonado no vetor de expressão em E. coli pAR 3040, utilizando-se os sítios de restrição Ndel / BamHI (Figura IA). Foi selecionado um dos clones recombinantes para transformar a cepa de E. coli BL21D3 e induzir a expressão do gene segundo a regulação do promotor T7, utilizando-se como indutor IPTG 0,5 mM. A expressão do gene foi realizada em 28 °C durante 5 horas. A expressão do PACAP recombinante e sua integridade foram confrontados mediante a Espectrometria de Massas.
Para a construção dos vetores de expressão do PACAP em P. pastoris, foram utilizados os vetores de expressão pPS9 e pPSIO. Foram utilizados os oligonucleotídeos de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 6 para a clonagem em pPS9 e os oligonucleotídeos de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 para a clonagem em pPSIO. Para a clonagem no vetor pPS7 foram utilizados os sítios de restrição Ncol / Spel, esta estratégia de clonagem adiciona à proteína de interesse no extremo amino terminal, uma metionina e uma glicina. Para a clonagem no vetor pPSIO foram utilizados os sítios Nael e Spel; esta estratégia de clonagem não adiciona aminoácidos à proteína de interesse (Figura 1B).
Os plasmídeos foram iinearizados antes de se transformar a cepa de MP36 de P. pastoris. A transformação foi realizada por eletroporação. A cepa de MP36 é um mutante auxotrófico his3, o qual adquire um fenótipo His depois da transformação.
Os clones transform antes foram identificados mediante Manchas-Pontos. Utilizando-se a técnica de Southern Blot determinou-se em quais a integração havia ocorrido mediante substituição do gene AOX1 de P. pastoris pelo cassete de expressão do plasmídeo recombinante, o qual corresponde a um fenótipo Muts (baixa utilização de metanol) e His". P. pastoris secreta baixos níveis de proteínas próprias, e seu meio de cultivo não necessita suplementos protéicos, pelo que se pode esperar que uma proteína heteróloga que é secretada no meio extracelular constitua a maioria do total de proteínas no meio (mais de 80 %) [Tschopp e colaboradores (1987) Bio/Technology, 5: 1305-1308). A expressão do PACAP em P. pastoris foi realizada em fermentadores de 5 litros, mediante a adição de metanol ao meio de cultivo.
EXEMPLO 2. EXPERIÊNCIA DE ESTÍMULO DO
CRESCIMENTO EM JOVENS DE Ciaria gariepinus, E DETERMINAÇÃO
DO ÍNDICE HEP ATOS SOMÁTICO E DOPESO SECO DO MÚSCULO DOS PEIXES.
Foram utilizados 18 exemplares da espécie Ciaria gariepinus sem distinção de sexo, aproximadamente da mesma idade e com um peso de 30 a 40 gramas.
Foram ajustados dois grupos experimentais de nove indivíduos cada um. Os grupos foram aclimatados em tanques separados, com recirculação constante de água, a uma temperatura de 28 °C e com um fotoperíodo constante de 14 horas de luz e 10 horas de obscuridade. Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, com rações equivalentes a 5 % do peso corporal total em cada tanque. Cada exemplar foi identificado antes de se iniciar a experiência. Um dos grupos experimentais foi tratado com o peptídeo PACAP previamente semipurificado (70 % de pureza) SEQ ID NO: 13, enquanto o outro grupo, utilizado como placebo, foi tratado com proteínas de E. coli contidas em PBS IX (proteínas de F. coli obtidas mediante o mesmo procedimento de purificação do peptídeo de interesse, equivalentes à quantidade de contaminantes presentes na amostra purificada do PACAP). Os peixes tratados com o PACAP foram injetados por via intraperitoneal, com uma dose de 0,1 pg do peptídeo por grama de peso corporal do animal, 2 vezes por semana. O grupo de placebo foi injetado de igual forma com a amostra de placebo. Aos 22 dias do início da experiência apresentaram um aumento em gramas do peso corporal significativamente maior (p < 0,05) em relação aos animais que receberam a injeção com o placebo (Figura 2). Foram medidos os valores do índice hepatossomático e do peso seco do músculo, para demonstrar que o aumento no peso corporal observado não se deu por causa nem do aumento do tamanho dos órgãos, nem do aumento do conteúdo de água no músculo. Não foram observadas diferenças significativas entre os valores do índice hepatossomático nem entre os valores do peso seco do músculo dos grupos experimentais (Figura 3).
Resultados semelhantes foram obtidos quando se aplicou o PACAP recombinante de seqüência SEQ ID NO: 12.
EXEMPLO 3. EXPERIÊNCIA DE ESTIMULAÇÃO DO
CRESCIMENTO, DA RESISTÊNCIA A AGENTES PATÓGENOS E DA LIBERAÇÃO DA PROLACTINA, EM LARVAS DE TILÁPIA, MEDIANTE A APLICAÇÃO ATRAVÉS DE IMERSÃO DO PACAP
RECOMBINANTE CONTIDO NO SOBRENADANTE DE RUPTURA DE E. Coli.
Realizamos uma experiência para avaliar o papel do PACAP de Ciaria gariepinus recombinante contido no sobrenadante de ruptura de E. coli sobre o crescimento nas larvas de tilápia. Foram constituídos dois grupos experimentais de 60 iarvas em cada grupo, um grupo tratado com o PACAP de seqüência SEQ ID NO: 13 e um grupo de placebo. As larvas pertencentes a cada grupo foram aclimatadas em canaletas independentes de 80 litros, a uma temperatura de 28 °C e com um fotoperíodo constante de 14 horas de luz e 10 horas de obscuridade, e foram alimentadas com uma quantidade de alimento seco de acordo com a fórmula: Quantidade de alimento = n~ de animais X peso médio (g) X 40 % / 100. Os tratamentos foram realizados por imersão em um volume de 2 litros, três vezes por semana, durante 20 dias. Foram aplicados aproximadamente 200 pg do PACAP por banho de imersão, de uma hora de duração. Foram obtidos como resultado que, nos 10 dias de início da experiência, o grupo tratado com o PACAP apresentou um aumento no peso corporal e no comprimento estatisticamente superior em relação ao grupo de placebo (p < 0,01), nos 15 dias de início da experiência, a diferença entre os tratamentos era altamente significativa (p < 0,001) (Tabela 1 e Figura 4A e 4B). Nos 20 dias da aplicação dos banhos de imersão, as diferenças entre o grupo tratado com o PACAP e o grupo de placebo continuaram sendo altamente significativas (p < 0,001) (Figura 5).
TABELA 1: PESO E COMPRIMENTO DAS LARVAS DE
TILÁPIAS AOS 10 DIAS E AOS 15 DIAS DO INÍCIO DOS TRATAMENTOS. O peso e o comprimento são dados como a média + o desvio padrão.
Observou-se que o efeito sobre o crescimento foi mantido no tempo, tendo em vista que 30 dias após o último banho de imersão (realizado a 20 dias do início da experiência), as diferenças no peso corporal e no comprimento entre os animais dos grupos experimentais eram muito significativas (p <0,01) (Figura 6). Foi observado que os peixes tratados com o peptídeo desenvolveram a pigmentação da pele com maior precocidade (Figura 7).
Nesta mesma experiência, foi estudada a presença do protozoário cutâneo do tipo Trichodina sp.. para o que foram escolhidos de forma aleatória 20 animais de cada grupo de experimentação, aos 30 dias do início dos tratamentos, e foi determinada a intensidade da invasão por este agente patogênico. Os valores da intensidade da invasão foram determinados segundo a fórmula: I: n- total de parasitas por peixe) I = Σ N/n-F0 e E = n-F0 x 100/n onde: I: (intensidade média da invasão) E: (n- de peixes do total parasitado) ΣΝ: (total de parasitas encontrados) Fo:(número de peixes não parasitados) n: (número de peixes apresentados) O resultado obtido foi que os animais tratados com o PACAP apresentaram uma intensidade da invasão pelo protozoário Trichodinas sp significativamente menor (um valor médio de I = 2,20) em relação ao grupo tratado com o placebo, que apresentou um valor médio de I = 5,56 (p = 0,01).
Aos 45 dias de iniciados os tratamentos, os peixes foram tratados mediante banhos de imersão nas condições anteriormente descritas, e colheu-se seu sangue 24 horas após realizados os tratamentos. Foi medida a concentração da prolactina no soro em cada peixe (amostra de 10 animais por grupo tratado) mediante Western blot e mediante ELISA (em inglês: Enzyme- Linked Immunosorbent Assay). Para estas experiências, foi utilizado um anticorpo policlonal anti-prolactina de tilápia. Foi obtido como resultado que os peixes do grupo tratado com o peptídeo apresentavam concentrações de prolactina no soro estatisticamente superior em relação ao grupo de placebo p < 0,01 (Tabela 2). Este resultado é muito atrativo para aqueles organismos aquáticos de interesse comercial, como é o caso dos salmões, que realizam seu ciclo de vida em água doce e em água do mar, nas quais a prolactina desempenha uma função importante na osmorregulação. TABELA 2: CONCENTRAÇÃO DA PROLACTINA (ng/ml) NO SORO DOS PEIXES, 45 DIAS APÓS INICIADA A EXPERIÊNCIA A concentração é apresentada como a média ± o desvio padrão EXEMPLO 4. EXPERIÊNCIA PARA AVALIAR O EFEITO
DO PACAP RECOMBINANTE SOBRE O APETITE EM TILÁPIAS JOVENS DA ESPÉCIE Orechromis niloticus.
Os efeitos biológicos do PACAP sobre o apetite, nos peixes,não haviam sido estudados até o presente. De forma geral, nos organismos vertebrados submamíferos, a atividade destes peptídeos sobre o apetite foi pouco caracterizada. (Jensen, 2001, Regulatory peptides and control of food intake in non mammalian vertebrates. Comp. Biochem. And Phisiol. PartA 128:471-479).
Para avaliar o efeito do PACAP sobre o apetite nos peixes, foram utilizadas tilápias jovens da espécie Oreochromis niloticus, selecionadas aleatoriamente sem distinção de sexo nem idade, e com aproximadamente o mesmo peso corporal. Foram formados três grupos experimentais, com três réplicas cada um (3 tilápias por réplica). As tilápias foram colocadas em canaletas de 80 litros, e foram mantidas em 28 °C, com um fotoperíodo de luz-obscuridade (14 horas de luz - 10 horas de obscuridade) e recirculação constante da água. O primeiro grupo foi tratado com o PACAP (previamente obtido em nosso laboratório, com 87 % de pureza) de seqüência SEQ ID NO: 13, mediante injeção intraperitoneal (0,5 ug/grama do animal). O segundo grupo foi tratado com o GHRP-6 (Lipotec, S.A. Barcelona, Espanha), utilizando-se o mesmo método de administração na dose de 0,1 pg/grama de peso do animal. O grupo de placebo foi tratado com proteínas de E. coli contidas em PBS IX (proteínas de F coli obtidas mediante o mesmo procedimento de purificação do PACAP, equivalentes à quantidade de contaminantes presentes na amostra purificada do PACAP).
Logo após a aplicação dos tratamentos por injeção, acrescentou-se a mesma quantidade de alimento aos três grupos experimentais, recolhendo-se às 6 horas o alimento não ingerido e acrescentando-se novamente alimento. Voltou-se a monitorar o apetite 22 horas após iniciada a experiência. O alimento coletado do fundo de cada canaleta em cada monitoração foi secado no forno a 100 °C durante 20 horas, e foi pesado em uma balança analítica. Foi calculado o alimento ingerido, determinando-se a diferença entre o alimento acrescentado aos tanques (100 gramas, com 20 % de umidade) e o alimento não ingerido pelos peixes.
As tilápias que receberam a injeção com o PACAP por via intraperitoneal, na dose de 0,5 pg/grama de peso do animal, e as que receberam a injeção com o peptídeo GHRP-6, por esta mesma via de administração, porém na dose de 0,1 pg/grama de peso do animal, apresentaram um aumento significativo (p < 0,05) do apetite em relação às tilápias do grupo de placebo (Figura 8).
EXEMPLO 5. EXPERIÊNCIA DE AVALIAÇÃO DO
EFEITO DO PACAP RECOMBINANTE SOBRE O SISTEMA IMUNE NOS PEIXES.
Foram utilizados jovens de Ciaria gariepinus. Foram formados dois grupos compostos de 10 animais em cada grupo. Os grupos foram aclimatados em tanques separados, com recirculação constante de água, em uma temperatura de 28 °C e com um fotoperíodo constante de 14 horas de luz e 10 horas de obscuridade. Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, com rações equivalentes a 5 % do peso corporal total em cada tanque. O peptídeo de seqüência SEQ ID NO: 13 foi aplicado por injeção intraperitoneal 2 vezes por semana na dose de 04 pg/grama de peso do animal. Foi colhido sangue dos animais após 20 dias do início da experiência para avaliação dos níveis de lisozima e de lectinas no soro sangüíneo. A atividade da lisozima no soro foi determinada mediante um método turbidimétrico, com base na lise de Micrococcus lysodeikticus.
Utilizou-se lisozima de clara de ovo de galinha como padrão de referência. Os padrões de lisozima foram preparados nas concentrações de 0, 1, 2, 4 e 8 pg/ml em tampão de fosfato (NaHP04 0,05 M, 12LLO, pH 6,2). O microorganismo foi preparado segundo uma concentração de 3 mg/ml em tampão de fosfato. Foram acrescentados 100 μΐ das soluções padrão em placas de 96 reservatórios de fundo plano, e a realização foi feita em duplicata, e foram acrescentados 100 μΐ de soro mediante sextuplicação. A cada um destes reservatórios foram acrescentados 100 μΐ da suspensão do microorganismo até um volume final de 200 μΐ em cada reservatório. Foi efetuada a leitura da densidade óptica (DO) imediatamente após a adição do microorganismo, em λ = 450 nm, em uma leitora de placas de 96 reservatórios aos 0, 2, 3, 5, 10, 15, 25, 35 e 45 minutos. As reações transcorreram em aproximadamente 22 °C. Considerou-se como uma Unidade (U) de lisozima: a variação de 0,001 unidade de DO em um minuto. As unidades de lisozima dos padrões e das amostras foram calculadas da seguinte forma: dividindo-se a inclinação da curva AD045() nm versus t (minutos) (no seu intervalo linear) entre 0,001. Foi feita a curva padrão de UijS0Zíma versus pg/ml de lisozima, em que foram interpoladas as unidades de atividade enzimática das amostras para se achar a sua concentração.
Como resultado da experiência, obteve-se que os peixes tratados com o PACAP apresentaram um aumento nos níveis de lisozima no soro, estatisticamente muito significativo (p < 0,01) em relação ao grupo de placebo (Tabela 3).
TABELA 3: CONCENTRAÇÃO DE LISOZIMA (pg/ml) NO
SORO DOS PEIXES, 20 DIAS APÓS O INÍCIO DA EXPERIÊNCIA Λ concentração foi apresentada como a média ± desvio padrão * teste de Student. Denota diferenças significativas (p < 0,01) Para se determinar a presença de lectinas no soro sanguíneo, foi realizado um ensaio de hemaglutinação. Foram realizadas diluições em série em PBS 1X pH 7,2, iniciando-se com 100 μ] do soro em uma placa de 96 reservatórios, com fundo em U. Acrescentou-se igual quantidade de uma solução de eritrócitos de coelho a 2 %. As placas foram incubadas por 1 hora na temperatura ambiente, e fez-se a leitura do título de hemaglutinação visualmente. A atividade das lectinas foi expressa como a recíproca da diluição mais elevada que havia apresentado hemaglutinação completa.
Os peixes tratados com o peptídeo apresentaram um aumento estatisticamente significativo nos níveis das lectinas, em relação ao grupo de placebo (p < 0,05) (Tabela 4).
TABELA 4: TÍTULO DE HEMAGLUTINAÇÃO (A
RECÍPROCA DA DILUIÇÃO MAIS ELEVADA QUE HAVIA
APRESENTADO HEMAGLUTINAÇÃO COMPLETA) NO SORO DOS PEIXES, 45 DIAS APÓS INICIADA A EXPERIÊNCIA. * teste de Student. Denota diferenças significativas (p < 0,05) EXEMPLO 6. EXPERIÊNCIA DE ESTIMULAÇÃO DO
CRESCIMENTO EM LARVAS DE TILÁPIA, MEDIANTE A
APLICAÇÃO DO PACAP RECOMBINANTE CONTIDO NO SOBRENADANTE DE CULTIVO DE P. pastoris.
Foi realizada uma experiência para avaliar o efeito do PACAP de Ciaria gariepinus recombinante contido no sobrenadante de cultivo de P. pastoris de sequência SEQ ID NO: 14, sobre o crescimento nas larvas de tilápia. Foram formados três grupos experimentais de 50 larvas cada grupo, um grupo tratado com o PACAP, um grupo tratado com o hormônio de crescimento da tilápia, e um grupo placebo. As larvas pertencentes a cada grupo foram aclimatadas em canaletas independentes de 80 litros, a uma temperatura de 28 °C e com um fotoperíodo constante de 14 horas de luz e 10 horas de obscuridade, e foram alimentadas com uma quantidade de alimento seco de acordo com a fórmula: Quantidade de alimento = n° de animais X peso médio (g) X 40 % / 100. Os tratamentos foram realizados por imersão em uma hora e meia em um volume de 20 litros de água, três vezes por semana durante 30 dias. Foram aplicados aproximadamente 100 pg do peptídeo / litro de água.
Foi obtido como resultado que, nas 5 semanas do início da experiência (35 dias, o grupo tratado com o PACAP apresentou um aumento significativo do peso corporal médio em relação ao grupo de placebo (p < 0,01). O grupo tratado com o hormônio de crescimento da tilápia expresso no sobrenadante de cultivo de P. pastoris apresentou também um aumento do peso corporal médio estatisticamente significativo em relação ao grupo de placebo (p < 0,05) (Tabela 5).
TABELA 5: PESO DAS LARVAS DE TILÁPIA EM
GRAMAS
Os dados são apresentados como a média do peso ± desvio padrão.
EXEMPLO 7. EXPERIÊNCIA DE ESTIMULAÇÃO DO
CRESCIMENTO E DA QUALIDADE DAS LARVAS DE CAMARÕES DA
FSPÉCIA Fitopenaeus schmitti TRATADOS COM O PACAP
RECOMBINANTE CONTIDO NO SOBRENADANTE DE CULTIVO DE P. pastoris.
Foram utilizadas larvas de camarões da espécie L. schmitti.
Foram utilizados dois grupos experimentais, um grupo tratado com o peptideo recombinante contido no sobrenadante de cultivo de P. pastoris de seqüência SEQ ID NO: 14 e um grupo tratado com o placebo (P. pastoris sem transformação).
As larvas foram cultivadas em tanques de fibra de vidro com a capacidade de 100 litros. A alimentação baseou-se em diatomáceas (Chaetoceros gracilis), a alga flagelada (Tetraselmis suecica), e náuplios de Artemia frescos (Aquatic Eco-Systems Inc.). Os fatores abióticos de crescimento foram os seguintes: Iluminação (24:00 L/O) Arejamento constante.
Salinidade de 34 ppm.
Oxigênio dissolvido 5,2 ± 0,5 no ciclo larval.
Recâmbio depois de PZm 80 % Foram aplicados aos dois grupos experimentais quatro banhos de imersão, um a cada três dias, de uma hora de duração.
Como resultado, o grupo tratado com o peptideo apresentou um aumento no peso corporal médio estatisticamente significativo, em relação ao grupo de placebo (p < 0,001) (Tabela 6).
TABELA 6: PESO DAS LARVAS DE CAMARÃO EM
MILIGRAMAS
Os dados são apresentados como a média do peso ± o desvio padrão.
Foi observada maior homogeneidade no comprimento dos camarões, o que é de vital importância para a cultura de camarões e melhor qualidade das larvas (maior número de pares de ramificações branquiais e de modificações rostrais). A diferença na sobrevida no estado de PL9 foi de 40 % maior no caso do grupo tratado com PACAP.
EXEMPLO 8. ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO EM
JOVENS DE Ciaria gariepinus PELA FORMULAÇÃO DO PACAP RECOMBINANTE NA DIETA DOS PEIXES. O PACAP recombinante contido no sobrenadante do cultivo de P. pastoris de seqüência SEQ ID NO: 14 foi concentrado e formulado na dieta alimentícia dos peixes, em uma concentração de aproximadamente 5 mg/kg de alimento seco. O controle negativo consistiu na dieta formulada com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris sem ser transformado. Foram utilizados 2 grupos experimentais de 100 larvas, com um peso médio de 0,1 g.
Um grupo foi alimentado com alimento seco formulado com o sobrenadante de P. pastoris contendo o PACAP, e o outro grupo o foi com alimento seco formulado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris, sem transformação. A experiência transcorreu durante 30 dias O PACAP recombinante incluído na dieta produziu um aumento no peso corporal dos peixes de aproximadamente 30 % em relação ao grupo de placebo, o que denota diferenças significativas entre os grupos (p <0,01).
Claims (23)
1. Método para aumentar a produtividade de um cultivo de peixes ou crustáceos, o método caracterizado pelo fato de que compreende a alimentação ou a administração do neuropeptídeo PACAP, de acordo com as seqüências SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, aos peixes ou crustáceos em cultivo, em uma quantidade eficaz para estimular seu crescimento ou incrementar sua resistência contra doenças, ou ambos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é empregado para aumentar a liberação da prolactína e melhorar a osmorregulação em peixes.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é empregado para regular o apetite em organismos aquáticos.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é empregado para favorecer o desenvolvimento da coloração em peixes ornamentais e em crustáceos.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido neuropeptídeo PACAP é obtido por síntese química.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é obtido por via recombinante.
7. Método de acordo com areivirrdicação 6, caracterizado pêlo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é empregado sem purificação, contido no sobrenadante da ruptura de E. coli.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é empregado sem purificação, contido no sobrenadante de cultivo de P. pastoris.
9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é empregado purificado a partir de sistemas de produção recombinantes.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é fornecido aos peixes ou crustáceos mediante injeções periódicas com intervalos de 3 dias, em uma concentração de 0,1 pg/g de peso do animal.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido neuropeptídeo PACAP é subministrado aos peixes ou crustáceos mediante banhos de imersão, com intervalos de 1 a 4 dias, em água doce ou água do mar, tendo uma concentração de peptídeo entre 100 e 200 pg/litro de água.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido neuropeptídeo PACAP é subministrado aos peixes ou crustáceos no alimento formulado, em uma concentração de 5 mg/kg de porção seca.
13. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que referido neuropeptídeo PACAP é subministrado à tilápia Orechromis sp.
14. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que referido neuropeptídeo PACAP é subministrado ao peixe-gato Ciaria sp.
15. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é subministrado ao salmão Salmon sp.
16. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que referido neuropeptídeo PACAP é subministrado aos camarões Penaus sp.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido neuropeptídeo PACAP é subministrado aos peixes ou crustáceos para prevenir ou tratar de infecção por agentes patógenos.
18. Uso de um neuropeptídeo PACAP de acordo com as sequências SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, o uso caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para tratar de peixes ou crustáceos em cultivo, para estimular seu crescimento.
19. Uso de um neuropeptídeo PACAP de acordo com as sequências SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, o uso caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para tratar de peixes ou crustáceos em cultivo, para aumentar sua resistência contra doenças.
20. Uso de um neuropeptídeo PACAP de acordo com as seqüências SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, o uso caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para tratamento preventivo ou terapêutico de uma infecção por agentes patógenos em peixes ou crustáceos em cultivo.
21. Uso de um neuropeptídeo PACAP de acordo com as seqüências SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, o uso caracterizado pelo fato de ser para estimular o crescimento de peixes e crustáceos em cultivo, para melhorar a produtividade.
22. Uso de um neuropeptídeo PACAP de acordo com as seqüências SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, o uso caracterizado pelo fato de ser para aumentar a resistência a doenças de peixes e crustáceos em cultivo, para melhorar a produtividade.
23. Uso de um neuropeptídeo PACAP de acordo com as seqüências SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, o uso caracterizado pelo fato de ser para a prevenção ou tratamento de infecções por agentes patógenos de peixes e crustáceos em cultivo, para melhorar a produtividade.
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