NO343949B1 - Formulering med immunstimulerende/adjuvans aktivitet og anvendelse som vaksiner for virveldyr - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsens formål er å tilveiebringe en formulering som inneholder et aktivt prinsipp med immunstimulerende/adjuvante aktiviteter oppnådd fra det harpiksaktige eksudatet fra plantearten Heliotropium huascoense, og som er nyttig hos salmonidarter for å øke immunogenisiteten til et antigen og/eller komponentene fra en vaksine.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Lakseindustri og helseutfordringer:

I løpet av de siste årene har Chile utviklet en svært viktig industri med akvakultur av laks. I 1994 økte eksporten av lakseprodukter til US$ 349 millioner. Etter et tiår var dette tallet sju ganger høyere, og i 2007 nådde det US$ 2207 milliarder. I dag er laks en av de viktigste eksportindustriene i Chile, med en kvote på 10,8 % for eksport. Denne industrien utgjør et viktig element for diversifikasjonen av nasjonal økonomi, og er en av grunnpilarene i strategien for å gjøre Chile til en betydningsfull matprodusent (SalmonChile, 2010).

Generelt er fiskeoppdrett konstant utsatt for angrep fra flere infeksiøse sykdommer på grunn av de ekstreme produksjonsforholdene, som forårsaker at veksten av mikroorganismer enkelt sprer seg og representerer et problem som er vanskelig å kontrollere. Det er en rekke infeksiøse sykdommer som rammer fiskeoppdrett og representerer den viktigste dødsårsaken. Sykdommer kan forårsakes av virus, bakterier, parasitter og sopp, og forårsake betydelige produksjonstap hvert år. Nedgang i lakseeksport i 2009 var forårsaket av et utbrudd av virussykdommer. Ifølge den månedlige rapporten om utenrikshandel (Informe Mensual de Comercio Exterior) som utarbeides av det nasjonale tollvesenet (Servicio Nacional de Aduanas), gikk forsendelsene som utgjorde 55 % av fiske og akvakultur, ned med 17 % i 2009 (SalmonChile, 2010). For Chile, et land som i mange år har vært fritt for mange sykdommer som rammer dyreproduksjon, har globalisering av verdensmarkeder betydd at landet ikke lenger har denne fordelen, og landets mulighet for å oppnå høy konkurransedyktighet er satt i fare.

De mange sykdommene som har rammet og spredd seg i oppdrettslaks sør i Chile, som i noen tilfeller har blitt endemiske patologier, inkluderer bakteriell nyresyke (BKD), salmonid rickettsialsyndrom (SRS) og Enteric Red Mouth Disease (ERM). Disse patologiene har sannsynligvis kommet til dette landet gjennom eggimport, som Chile var nesten utelukkende avhengig av tidligere, da kravene til innslipp ikke var så strenge (Pinto, 2003). I løpet av de siste årene har det dukket opp andre sykdommer hovedsakelig forårsaket av bakterier, slik som vibriose, streptokokkinfeksjon og atypisk furunkulose, og av parasitter slik som Diphyllobothrium sp., som gir amøbegjellesykdom (Torres, 2000) og Caligus, en parasitt som forårsaker sår og stress hos fisken, svekker forsvaret deres og gjør dem utsatt for angrep av andre patogene mikroorganismer slik som bakterier og virus. Blant de virale infeksiøse agensene som påvirker salmonider, er infeksiøs pankreas nekrose-viruset (IPNV), som er et birnavirus (Birnaviridae-familien) (Dobos et al., 1979), og det viruset med flest tilfeller verden over (Wolf, 1988). Viruset er detektert i majoriteten av lakseproduksjonssentre verden over, inkludert Chile (Wolf, 1988;. Hill, og Way, 1995). IPNV rammer hovedsakelig ung fisk (yngel og småfisk) og forårsaker stor grad av dødelighet (Wolf, 1988, Imajoh et al., 2005), selv om den også infiserer mer utviklet fisk. Utbruddet av infeksiøse sykdommer hos laks er et av hovedproblemene til fiskeoppdrettssentere, siden de ikke har lukkede, kontrollerte rom som gjør det mulig å hindre at patogener enkelt sprer seg i innsjøer og havet.

På grunn av den miljømessige og økonomiske betydningen er det lagt mye innsats i studier assosiert med infeksiøs pankreas nekrose-viruset (IPNV), og søket etter antivirale forbindelser (Saint-Jean et al., 2003). Nå finnes det vaksiner som bidrar til å hindre smitte av IPN-viruset (Christie, 2004; Salgado Miranda, 2006), men inokulasjonen av småfisk gir ikke de forventede resultatene siden immunsystemet deres er umodent. På den andre siden finnes det noen antivirale forbindelser som hemmer replikeringen av cellekulturer, for eksempel ribavirin og 5-etynyl-1-β-D-ribofuransulimidazol-4-karboksamid (EICAR) (Migus og Dobos, 1980; Jashes et al., 1996; Jashes et al., 2000). Ribavirin har imidlertid ikke hatt gode resultater i forsøk utført in vivo (Somogyi og Dobos, 1980), og fisks dødelighet reduseres med EICAR, men den er ikke stabil i vann (Moya et al., 2000).

En annen infeksiøs sykdom som rammer laksefarmer i betydelig grad, forårsakes av infeksiøs lakseanemi-viruset (ISA-viruset), oppdaget i Norge i 1984 (Thorud og Djupvik, 1988). Denne agensen har vært et problem for lakseakvakultur på den nordlige halvkule, inkludert Norge, Canada, Skottland, Færøyene og USA, og de høye dødsratene inkluderte nesten hele produksjonen i tilfellet med Norge (Mjaaland et al., 1997). I Chile ble ISA-virus registrert første gang i 2001, men i motsetning til tilfellet i landene på den nordlige halvkule, var det ikke assosiert med høy dødelighet og tap med en gang (Kibenge et al., 2001). I 2007 begynte imidlertid ISA-viruset å ødelegge den chilenske laksen opptil et tap på 40 % av den nasjonale produksjonen.

I dag hindres sykdommer som rammer laks, hovedsakelig gjennom helseforvaltningspraksis, anvendelsen av autoriserte vaksiner og/eller utvalg av frisk avlsfisk. Anvendte behandlinger må være forskrevet av en veterinær, og bare legemidlene som er registrert for anvendelse hos akvatiske arter, kan anvendes (Sandoval, 2004). De store tapene som forårsakes av denne typen infeksiøse sykdommer, fører til leting etter løsninger som kan regulere deres utvikling på en eller annen måte. På den andre siden anvendes en profylaktisk behandling med antibiotika med det mål å hindre bakterielle infeksjoner hos svært mottakelig fisk. Behandling med antibiotika i lakseakvakultur utføres ved immersjon med legemidler og medisinert mat. I begge tilfeller finnes det mulighet for at antibiotika går ut i omgivelsene og forårsaker virkninger hos dyrelivet. Det er flere bekymringer når det gjelder den omfattende bruken av antibiotika i lakseakvakultur, og blant dem er veksten av antibiotikaresistente bakterier i floraen og de normale patogenene i pooler, virkningene som forårsakes av disse legemidlenes persistens, og antibiotikarestene som er funnet i sedimenter og i vannsøylen. Disse antibiotikaene fremmer veksten av frie antibiotikaresistente bakterier, en prosess som endrer sammensetningen av normal bakterieflora i fersk- og saltvann. Data indikerer at disse antibiotikaresistente organismene i marint miljø i sin tur vil overføre sine antibiotikaresistente gener til andre bakterier, inkludert menneske- og dyrepatogener. Antibiotika kan også påvirke sammensetningen av fytoplanktonsamfunnet, zooplanktonsamfunnet, og til og med mangfoldet av større dyrepopulasjoner. Følgelig kan de mulige endringene i det marine mikrobiotamangfoldet forårsaket av antibiotikaene endre homeostasen til marine miljøer og ramme komplekse livsformer, inkludert fisk, bløtdyr, marine pattedyr og mennesker. I tilfellet med oksytetrasyklin er det for eksempel vist lav absorpsjon i fiskens tarmkanal, derfor utsondres mye av legemiddelet uten endringer til det akvatiske miljøet, der det distribueres mellom sedimentet og vannsøylen, eller konsumeres av det marine dyrelivet (Paone, 2001). Oppsummert er behandlinger som anvendes nå for å regulere infeksiøse sykdommer hos salmonider, basert på anvendelsen av kjemikalier og vaksiner som ikke har en god effektivitetsprosent. På den andre siden gir mange av disse kjemikaliene bivirkninger eller er forbudte stoffer i andre land.

I tillegg påvirkes laksens livssyklus av flere faktorer indusert av menneskelig intervensjon, slik som fisketrykk, forurensing, geografiske barrierer og akvakulturfarmer. Disse faktorene har stor innvirkning på deres overlevelse, spesielt på deres evne til å tåle stress, slik som å utsettes for et innesperret kultursystem. Dette har skapt en signifikant nedgang i deres forsvarssystem som kan utnyttes av de infeksiøse mikroorganismene som forårsaker sykdom og død i laksepopulasjoner, eller asymptomatiske infeksjoner som fører til inntreden av asymptomatiske bærere som kan overføre mikroorganismer over lang tid og lange avstander. Uheldige scenarier i kultur, og hovedsakelig eksponeringen for patogene mikroorganismer, krever en god immunologisk tilstand hos laksen for at den skal møte sin livssyklus på en sunn måte.

Immunsystemet til teleoster, slik som laks, har likhetstrekk med det til høyere virveldyr. Det er kjent at pattedyr og teleoster har veldefinert lymfoid vev, slik som tymus, milt, nyre, og vev assosiert med hud og gjeller (Press, Evensen et al. Fisk har imidlertid ikke benmarg, lymfesystem eller Peyers plakk slik som pattedyr har (Rombout, Huttenhuis et al. 2005). Laksens immunsystem er karakteristisk for teleoster (Penagos et al., 2008) idet det er identifisert (i) immunsystem med medfødt respons, som samsvarer med den fylogenetiske eller nedarvede mekanismen som kan fjerne ethvert fremmedlegeme, hovedsakelig ved å aktivere et sett med reseptorer for rekognosering av patogenassosiert molekylært mønster (PAMP), og (ii) den adaptive immunresponsen som, avhengig av lymfocyttene, kan gjenkjenne og eliminere eksterne angripere. På tross av denne klassifikasjonen samvirker mekanismene i medfødt og adaptiv immunitet og opererer sammen mot et eksternt angrep. Leukocytter involvert i fiskeimmunitet er B-lymfocytter (IgM+- og IgT+-celler) og T-lymfocytter. Eksistensen av T-hjelperlymfocytter (CD4+ T-celler) er bevist indirekte i fisk, inkludert laks og ørret, på grunn av tilstedeværelsen av gener som er homologe med CD4, TCR og CD3e, blant andre (Suetake, Araki et al 2004; Laing, Zou et al 2006; Nakanishi et al., 2011), og nylig, ved hjelp av immunmagnetisk isolering og karakterisering av CD4 -celler (Imarai et al., upublisert). I tillegg er cytotoksiske T-lymfocytter (CD8+ T) isolert, og deres funksjon in vitro er demonstrert (Fischer, Utke et al 2006; Sato and Okamoto 2008; Utke, Kock et al 2008). På lignende vis synes antigeninntredenen å skje som hos pattedyr på grunn av tilstedeværelsen av MHC klasse I-, TAP- og LMP-gener.

Antigenpresenterende celler, slik som makrofager, er rikelig i fisk, og celler som ligner dendrittiske celler, er nylig identifisert i fisk (Ohta, Landis et al.2004; Yoder og Litman, 2000). Sammen støtter bevisene eksistensen av en adaptiv immunrespons hos teleoster, inkludert salmonider.

Immunresponsen påvirkes av flere faktorer som avhenger av verten, inkludert alder, fysiologisk tilstand eller stress, egenskaper ved det akvatiske miljøet, slik som vanntemperaturer eller tilstedeværelsen av toksiner deri, og for det tredje av organismen som er involvert (Penagos et al., 2009). Den høye dødeligheten forårsaket av infeksiøse sykdommer som nå er observert i lakseindustrien, indikerer at det haster med å utvikle nye farmakologiske verktøy for å stimulere den beskyttende immunresponsen hos salmonider.

Slekten Heliotropium:

Forskernes interesse for medisinske planter som naturlig kilde for mange aktive komponenter har økt betraktelig de siste to tiårene. I den forstand er det i altfor lang tid blitt isolert og karakterisert sekundære metabolitter oppnådd fra de harpiksaktige eksudatene av plantene i slekten Heliotropium (familien Heliotropiaceae) som vokser nord i Chile. Arten Heliotropium vokser i tørre regioner under ekstreme miljøforhold, og er karakterisert ved at den produserer et harpiksaktig eksudat gjennom kjertelaktige trikomer som dekker deres bladoverflate og stamme. Fytokemisk forskning avslørte at harpiksen hovedsakelig består av flavonoider og aromatiske geranilerte derivater, i mindre mengder (Torres et al., 1994, 1996; Urzúa et al., 1993, 1998, 2000, 2001;

Modak et al., 2003, 2007, 2009). Under leting etter en forklaring på rollen til harpiksaktige eksudater har det blitt foreslått at de kan utgjøre den første beskyttelsesbarrieren mot rovdyr. Denne beskyttelsen kan skyldes en mekanisk virkning assosiert med dens klebrige karakter som gjør at rovdyr setter seg fast (Eigenbrode et al., 1996), samt en kjemisk beskyttelse på grunn av tilstedeværelsen av sekundære metabolitter med antimikrobielle, antioksidante og cytotoksiske egenskaper (Hoffman et al., 1983). Videre har den overveiende tilstedeværelsen av harpiksaktig eksudat i planter som vokser i tørre og halvtørre soner, blitt forklart med de ekstreme miljøforholdene (Downum et al., 1988), og spesielt den økte oksidative belastningen de utsettes for (González -Coloma et al., 1987). Det er også foreslått at tilstedeværelsen av antioksidantflavonoider i eksudatene kan hindre oksidativ nedbrytning av harpiksens andre komponenter, hvilket kan føre til tap av dens kjemofysiske egenskaper (Urzúa og Mendoza, 1993).

Det er studier av sammensetningen av resin fra ulike arter av slekten Heliotropium, samt visse biologiske og kjemiske aktiviteter hos slike eksudatet og deres komponenter (Modak et al., 2004 og 2010). Spesielt har pinocembrin, 3-O-metilgalangine, 3,7-O-dimetilgalangine, alpinone og carrizal-syre (eng.: carrizaloic acid) blitt isolert fra Heliotropium huascoense (Urzúa et al., 2000;.Villarroel et al., 2001). Generelt viser studier utført med flavonoider isolert fra arten Heliotropium at de presenterer hovedsakelig antioksidantaktivitet (Lissi et al., 1999; Modak et al., 2003; Modak et al., 2007, Modak et al., 2009; Choudhary et al., 2008).

Vaksiner for fisk:

Under naturlige forhold er sykdom et fenomen som er iboende for alle levende vesener, og som styrkes når individet utsettes for stressende forhold, inkludert innesperret kultur. Den intensive dyreproduksjonen legger forholdene til rette for endring av balansen mellom miljø, patogen og vert, hvilket fører til sykdom og dødelighet. Derfor løser den inngitte oppfinnelsen dette tekniske problemet på en svært annerledes måte enn det som er beskrevet i teknikkens stand.

For å hindre infeksiøse sykdommer er vaksinering ett av de mest verdifulle verktøyene i akvakultur idet det sikrer et rent produkt som ikke endrer miljøet. På tross av at noen forfattere tror at i akvakultur er kun én vaksinasjon nok til å indusere beskyttelse inntil fisken samles inn (Heppell og Davis, 2000; Bowden et al., 2003), og denne kan ha gyldighet etter immuniseringene intraperitonealt, krever vaksinasjon av populasjoner på hundretusenvis av individer massive immuniseringsmetoder (immersjon og oral), som i de fleste tilfeller krever revaksinasjon (Romalde et al., 2004; Vandenberg, 2004). Hos noen fisk oppnås egnede beskyttelsesnivåer først når modifiserte levende vaksiner anvendes, slik det er tilfellet med vaksinen mot Edwardsiella ictaluri hos steinbitakvakulturer i USA. På tross av den åpenbare sikkerheten ved bakteriner, fikk fiskevaksinasjoner et varsel i 2001, da tilsynekomsten av en isotype med høyere virulens, med modifikasjoner i membranproteinene, og som kunne infisere og drepe vaksinert fisk, ble introdusert ved anvendelsen av et bakterin mot streptokokker (Bachrach et al., 2001) i en regnbueørret (Onchorhynkus mykiss)-farm i Israel. I tillegg har noen ekstracellulære produkter (ECP-er) fra bakterier blitt testet med tvilsomme resultater i vaksinasjonen av fisk mot streptokokker. Klesius et al.,2000, og Evans et al., 2004 sammenlignet i tilapia (Oreochromisniloticus) den beskyttende virkningen til konvensjonelle bakteriner og bakteriner tilsatt ECP-er mot Streptococcus iniae og Streptococcus agalactiae, og egnede beskyttelsesnivåer ble bare funnet når konsentrerte ECP-er ble tilsatt i vaksinene. DNA-vaksiner er i sin tur ansett som de mest effektive i å indusere beskyttelse og respons fra immunsystemet til fisken ved å trigge iboende og adaptive immunmekanismer) hvilket også sikrer effektive responser humoralt og cellulært (Heppell og Davis, 2000). På den andre siden er det til dags dato ingen inaktivert vaksine tilgjengelig som er svært effektiv mot IPNV-viruset (Salgado-Miranda, 2006). Virusbehandlingen med formalin eller β-propiolakton for anvendelse i vaksiner inaktiverte viruset fullstendig, men reduserte antigenisiteten opptil 50 % (Dixon, 1983). En aktiv vaksine som inkluderte en ikke-patogen stamme av IPNV-viruset, følsomt for normalt ørretserum, overførte heller ingen beskyttelse til forsøksutfordringen (Dorson, 1977). Inaktiverte og rekombinante vaksiner anvendes også. Derfor inneholder den rekombinante vaksinen, den første med lisens for å administreres til fisk, det strukturelle proteinet VP2 produsert i Escherichia coli, og induserer produksjonen av spesifikke antistoffer mot IPNV-viruset (Christie, 2004).

Adjuvanser av veterinær kvalitet:

Konvensjonelle veterinærvaksiner består hovedsakelig av svekkede levende patogener, inaktiverte organismer eller inaktiverte bakterielle toksiner (Chang et al., 1998). Selv om attenuerte former for patogener anvendes som veterinærvaksiner, er det bekymring med hensyn til dette, siden det av og til returnerer til den virulente formen eller uønskede virkninger observeres hos immunsvekkede dyr. Anvendelsen av døde organismer eller deler derav er et alternativ, selv om den lavere effekten er tydelig.

Som et resultat av disse begrensningene er det utviklet nye vaksiner med betydelige fordeler i forhold til de tidligere. De inkluderer underenheter av rekombinante proteiner og DNA (Rankin et al., 2002). Selv om disse nye alternativene kan være gunstige, er et vanlig problem at, innen veterinærmedisin er de ofte immunogenisk svake (Bahenmann et al., 1987; Loehr et al., 2001). Tradisjonelle vaksiner inneholder ofte komponenter som kan bidra til modningen av T-celler og fungerer som adjuvanser, for eksempel det bakterielle DNA, eller LPS. Disse komponentene er imidlertid eliminert fra de nye vaksinegenerasjonene, derfor øker behovet for å identifisere adjuvanser som skal styrke og drive den nødvendige immunresponsen.

Immunadjuvansene ble opprinnelig beskrevet av Ramon (1924) som "stoffer anvendt i kombinasjon med et spesifikt antigen som produserer en mer robust immunrespons enn antigenet alene". Denne definisjonen inkluderer en rekke materialer. En omfattende vurdering av adjuvanser anvendt av nærings- og legemiddeletaten (eng.: Food and Drug Administration) hos mennesker begrenset imidlertid anvendelsen av aluminiumsalter. Disse saltene viser et godt sikkerhetsresultat, men komparative studier av dyr viser at det er en god adjuvans for å indusere antistoffer i vaksiner med rekombinante proteiner, og induserer en type-Th2-respons, mer enn den ønskede type-Th1-responsen (Gupta, 1998), som er mer effektiv i å beskytte mot intracellulære patogener. I tillegg er toksisitet et nøkkelelement i studiet av adjuvanser. I løpet av de første 50 årene henviste følgelig tillatte adjuvanser til aluminiumsaltene.

For profylaktisk immunisering hos dyr kan bare adjuvanser som gir minimale uønskede virkninger, lokalt og systemisk, aksepteres. Viktige spørsmål i utviklingen adjuvanser er reaksjonen på injeksjonsstedet, elimineringen eller den biologiske nedbrytningen av adjuvansen, og varigheten og retensjonen på injeksjonsstedet. Typene adjuvanser som anvendes hos dyr, er oppsummert nedenfor (Singh og O’Hagan, 2003):

● Mineralsalter: Aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat.

● Immunstimulerende adjuvanser: Cytokiner, saponiner, bakterielt DNA, LPS (lipopolysakkarid), lipopeptider.

● Lipidpartikler: Emulsioner av Freud, ISA 25, 51, 206, SAF, MF59, liposom. ● Adjuvansslim: Mutanttoksiner, inkludert LTK63 og LTR72, mikropartikler, polymeriserte liposomer, kitosan.

Mineralsalter, særlig de av aluminium, stimulerer produksjonen av antistoffer ved en Th2-respons. De har imidlertid den ulempen at de produserer en lav innvirkning i indusering av en cellulær immunrespons. Disse adjuvansene er også kjent for å indusere immunitet på kort sikt, noe som impliserer anvendelsen av injeksjoner med flere påfyllinger. I tillegg er det ikke uvanlig å observere granulose på injeksjonsstedet (Nicklas, 1992).

Freud-adjuvansen har blitt anvendt i mer enn 50 år, spesielt når begrensede mengder antigen er tilgjengelig. Dens toksisitet har imidlertid vært kjent i lang tid, og med den økende interessen for forsøksdyrs velvære, finnes det et betydelig press for å begrense deres bruk (Morris et al., 1999). I veterinærbransjen er de bredere anvendte adjuvansene i veterinærvaksiner mineraloljeemulsjoner (olje-i-vann eller vann-i-olje), slik som ISA 25,51, 206, MF59. MF59 er den olje-i-vann-emulsjonen som har blitt mest vurdert med hensyn til dens anvendelse som adjuvans. Det er en mikrofluidisert emulsjon som inneholder et terpenisk derivat, skvalen, sammen med to surfaktanter: Tween 80, og Span-85, i natriumsitratbuffer. Skvalen er en naturlig forbindelse oppnådd fra planter og dyr. Det er ikke en adjuvans i seg selv, men skvalenemulsjonene med surfaktanter forbedrer immunresponsen til mennesker og dyr. Et eksempel er MF59 (US-patent 6.299.884 B) som er en adjuvans fremstilt av Novartis Lab, og tilsettes i

influensavaksinen.

Saponiner er en annen type adjuvans som anvendes. Disse kommer fra det chilenske treet Quillaja saponaria Molina, og består av terpenoide derivater, som er anvendt på mennesker og dyr. Det ubearbeidede ekstraktet fra dette treet kalles saponin. Quil A, og spikoside er delvis rensede blandinger, og QS21 er en fraksjon. Quil A er bredt anvendt i veterinærmedisin, og har blitt anvendt i bruksdyr-, grise-, heste, hunde- og kattevaksiner, inkludert FeLV-vaksine for hesteinfluensaviruset, parvovirus. QS21 anvendes i FeLV-vaksinene, og hundevaksinen for Lyme-sykdom (Kim et al., 2006).

WO 2012178118 A1 beskriver farmasøytiske formuleringer omfattende en kombinasjon as utvalgte bærere, vitaminer, tanniner og flavonoider som antigen spesifikke immunmodulatorer.

WO 2010078556 A1 beskriver adjuvnasformuleringer og anvendelser av slike.

WO 0010600 A2 beskriver aktivering og beskyttelse av T-celler (CD4+ og CD8+) ved bruk av en H2-reseptor agonist og andre T-celle aktiveringsmidler.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelsens formål er å tilveiebringe en formulering som inneholder et aktivt prinsipp med immunstimulerende/adjuvante aktiviteter oppnådd fra det harpiksaktige eksudatet fra plantearten Heliotropium huascoense, og som er nyttig hos salmonidarter for å øke immunogenisiteten til et antigen og/eller komponentene fra en vaksine.

Foreliggende oppfinnelse frembringer en formulering med immunstimulerende/adjuvant aktivitet, omfattende:

a) (-)-alpinone, hvis strukturelle formel er:

der R1er OH, og R2er OCH3, med en optisk aktivitet på [ α]25ºD= -28,1 (c.0.215,CHCl3), og en S-konfigurasjon av karbon 2 og 3;

b) dimetylsulfoksid; og

c) saltløsning.

Formuleringen omfatter fortrinnsvis a) (-)-alpinone: 0,05 % vekt/volum til 0,5 % vekt/volum

b) DMSO: 0,8 til 8,0 % vekt/volum, og

c) Saltløsning: Nødvendig mengde for å fullføre 100 % volum.

Foreliggende oppfinnelse frembringer videre en formulering med immunstimulerende /adjuvant aktivitet ifølge opppfinnelse, for anvendelse som en vaksine for virveldyr.

Fortrinnsvis er nevnte virveldyr en salmonid art.

Formuleringens aktive prinsipp er flavonoidet (-)-alpinone, og den viser ingen toksisitet hos behandlede individer, tvert i mot gir den en forbedring av det generelle utseendet, sannsynligvis på grunn av dens antioksidant- og stresskontrollerende egenskaper hos individer som gjennomgår behandling.

Dette aktive prinsippet har egenskapen med å indusere modning i dendrittiske celler, som samsvarer med de første stadiene av induksjon av immunresponsen hos høyere virveldyr.

Det aktive prinsippet i formuleringen ifølge den foreliggende oppfinnelsen er flavonoidet 3,5-dihydroksy-7-O-metoksyflavanon (Alpinone). Formuleringen ifølge den foreliggende oppfinnelsen skiller seg fra andre tidligere patenterte ved at den er en formulering der den aktive agensen er et naturlig flavonoid oppnådd fra vegetabilske arter, og derfor er biologisk nedbrytbar, siden den ikke påvirker miljøet. I den foreliggende oppfinnelsen er det utviklet en formulering ifølge hvilken visse mengder av en aktiv agens, det vil si en fenolisk forbindelse (flavonoid), er tilgjengelig, der posisjon 3 og 5 er hydroksylert, posisjon 7 er metoksylert, og i posisjon 4 er det et karbonyl. Den har to stereogene sentre, der konfigurasjonen av karbon 2 og 3 må være "S". I formuleringen ifølge den foreliggende søknaden er flavonoidet i forening med farmakologisk aksepterte fortynningsmidler, inkludert, men ikke begrenset til, dimetylsulfoksid, og saltløsning.

Spesifikt består formuleringen ifølge den foreliggende immunstimulerende/adjuvante oppfinnelsen for fisk av:

DMSO: 8 % vekt/volum

(-)-alpinone: 0,5 % vekt/volum (alpinone må presentere en "S"-konfigurasjon i sine stereogene sentre).

Saltløsning: 91,5 % vekt/volum

Formuleringen har som en aktiv ingrediens flavonoidet med generell formel:

der R1må være OH, og R2må være OCH3. I tillegg må den ha en optisk aktivitet på [ α]25ºD= -28,1 (c.0.215,CHCl3), og en "S"-konfigurasjon av karbon 2 og 3.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en immunstimulerende formulering som ikke er spesifikt rettet mot et utvalgt patogen, eller en gruppering av utvalgte patogene agenser.

Formålet med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe en immunstimulerende/adjuvant formulering som kan administreres intramuskulært for å trigge immunresponsen hos salmonidarter og/eller forbedre responsen på de eksisterende vaksinene.

Den foreliggende oppfinnelsen har fordelen i forhold til andre adjuvanser av markedskvalitet, inkludert, men ikke begrenset til, Montanide, der formuleringens aktive prinsipp anvendes i lave doser, og i sonen der den injiseres, observeres ingen nekrose eller skade rundt vevet. I stedet genererer adjuvansen av markedskvalitet, Montanide, granulomer på injeksjonsstedet (Mutoloki et al., 2004). Videre krever den injiserbare løsningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen en mindre mengde aktivt prinsipp, i motsetning til adjuvansene av markedskvalitet.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1. Analyse av uttrykkelsen av MHCII i muse-dendrittiske celler ved strømningscytometri.

Figur 2. Nivåer av cytokin mRNA i SHK-1-celler stimulert med potensielle immunstimulerende forbindelser.

Figur 3. Nivåer av cytokintranskripter i nyren til fisk behandlet med immunstimulerende forbindelser.

Figur 4. Analyse av den humorale responsen hos fisk immunisert med ovalbumin.

Figur 5. Deteksjon av viralt RNA ved RT-PCR.

Eksempel

Eksempel 1: Det aktive prinsippets virkning på modningen av muse-dendrittiske celler

Den immunstimulerende evnen til formuleringens aktive prinsipp fra den foreliggende oppfinnelsen i den primære kulturen av muse-dendrittiske celler (DC) ble testet. For dette forsøket ble dendrittiske celler oppnådd fra musens benmarg dyrket i 6 dager i et RPMI-1640-medium supplementert med 10 % kalvefosterserum (SFB), 4 mM L-Glutamin (Hyclone), penicillin/streptomycin (Hyclone), og 10 ng/ml GM-CSF. Etter denne tiden ble cellene inkubert med 5 ug av formuleringens aktive prinsipp i 6 h ved 37 ºC. Celletriggingstilstanden ble evaluert ved uttrykkelsne av klasse II MHC på overflaten av muse-DC ved å anvende et spesifikt antistoff (FITC-antimus IAd, BD, USA) for å detektere det molekylet ved strømningscytometri. De observerte resultatene i dette forsøket (figur 1) indikerer at det aktive prinsippet øker uttrykkelsen av klasse II MHC-molekyl i dendrittiske celler. Dette indikerer at forbindelsen induserer modning av de dendrittiske cellene, som er en egenskap ved forbindelser anvendt som immunstimulanter eller adjuvanser. Som konklusjon har formuleringens aktive prinsipp immunstimulerende aktivitet, nærmere bestemt produserer trigging av muse-dentrittiske celler.

Eksempel 2: Det aktive prinsippets virkning på cytokinuttrykkelse i SHK-1-cellelinjen

Evalueringen av den immunstimulerende evnen ble utført også i SHK-1-cellelinjen som samsvarer med celler utledet fra en beriket kultur av makrofager oppnådd fra atlanterhavslaksens bakre nyre. Hvorledes immunstimulantene skal trigge uttrykkelsen av cytokiner som er vesentlige for å trigge immunresponsen hos individet, og dette skjer ved aktivering av gentranskripsjonen; økningen i uttrykkelsen av pro-inflammatoriske cytokingener, inkludert IL-1, IL-8, IL-10, IL12 og TNFα; anti-inflammatoriske cytokiner, inkludert TGFβ1; og det antivirale cytokinet IFNα ble kvantifisert. Cellene ble dyrket i 6-brønners plater i løpet av 3 dager inntil en konfluens på ca.90 % ble nådd; deretter ble de inkubert med 5 ug av formuleringens aktive prinsipp i 24 h ved 15 ºC i et L-15-medium supplementert med 10 % SFB, 4 mM L-Glutamin, 40 uM 2-merkaptoetanol, 50 ug/ml Gentamicin. For å oppnå RNA ble celler løsnet ved mekanisk aktivering av brønnene, konsentret ved sentrifugering, og homogenisert i 1 ml Trisure (Bioline, USA). Så ble 200 ul kloroform tilsatt hver prøve, og de ble blandet i en vortekser i 1 min. Suspensjonen ble sentrifugert ved 13200 x g i 15 min ved 4 ºC. Den vandige fasen ble innsamlet og overført til et annet rør som inneholder 500 ul kald isopropanol (Merck). Blandingen ble inkubert i 20 min ved -20 ºC, og ble sentrifugert på nytt ved 13200 x g i 10 min ved 4 ºC; supernatanten ble fjernet, og 1 ml 75 % kald etanol ble tilsatt i hvert rør. Rørene ble sentrifugert ved 6000 x g i 5 min ved 4 ºC, supernatanten ble kassert, og RNA-pelleten ble oppløst i 20 ul nukleasefritt vann (Invitrogen). RNA ble inkubert ved 65 ºC i 10 min, og ble lagret ved -20 ºC. Den kontaminerende DNA-spaltingen i prøven ble utført ved en behandling med DNAsa RQ1 (Promega).2 ug RNA ble behandlet i henhold til betingelsene fremsatt av produsenten. cDNA-syntese ble utført ved å anvende 200 U/ul omvendt transkriptaseenzym M-MLV (Promega), 500 ng/ul oligo dT (Promega), 1mM dNTPs (Bioline), og enzym 5X (Promega) buffer i et endelig volum på 25 ul. Blandingen ble inkubert i 60 min ved 42 ºC, og så ved 70 ºC i 15 min. Generert cDNA ble lagret ved -20 ºC.

Reaksjonen i kvantitativ sanntid (qRT-PCR) ble utført i 96-brønners plater (AXIGEN) dekket med optiske lokk på utstyret STRATAGENE 7300. Hver reaksjon ble utført i et endelig volum på 25 ul, ved anvendelse av 12,5 ul Quantace SYBR Green/ROX qPCR master mix (2X) (Bioline), 1,25 ul sens-starter (10 uM), 1,25 ul antisens-starter (10 uM), 8 ul ultrarent destillert vann (Invitrogen), 2 ul cDNA 1:2 fortynning. I alle reaksjoner ble det utført kontroller uten bråkjøling. Resultatene viser at formuleringens aktive prinsipp induserer en økning i uttrykkelsen av pro-inflammatoriske cytokiner, inkludert IL-1, IL-8, TNF-α; det antivirale cytokinet IFNα, samt cytokiner som er viktige i denne T-hjelper 1 (Th1)-typen respons, slik som IL-12 (fig. 2). R-forbindelsen som anvendes som positiv kontroll, øker uttrykkelsen av cytokiner, hovedsakelig av den pro-inflammatoriske typen, inkludert IL-1, IL-8 og IL-12 (figur 2). Disse resultatene viser at formuleringens aktive prinsipp kan indusere høye nivåer av proinflammatoriske, antivirale og Th1-responsinduserende cytokiner i SHK-1-cellelinjen til laks.

Som konklusjon er det fastslått at formuleringens aktive prinsipp kan anvendes som en immunstimulant/adjuvans for å trigge en tidlig antiviral respons og en type-Th1-respons.

Eksempel 3: Det aktive prinsippets virkning som en immunstimulant hos atlanterhavslaks

For analysen in vivo ble 15 atlanterhavslaks på 40–50 g anvendt, som ble injisert intramuskulært (IM) med doser på 100 ug av formuleringens aktive prinsipp i et endelig volum på 100 ul. Som kontroller ble fisk injisert med 8 % DMSO (formuleringskomponent) oppløst i 100 ul saltløsning, og med 5 mg kontrollforbindelse Ribomunyl oppløst i 100 ul saltløsning. Som kontrollgruppe ble en gruppe fisk bare injisert med 100 ul saltløsning, mens den andre ikke ble injisert. Etter 48 h ble fiskene avlivet med en benzokainoverdose, og deres nyre og milt ble tatt ut for etterfølgende analyse. For å oppnå RNA ble organer desintegrert i 1 ml Trisure ved anvendelse av en vevshomogeniserer. Deretter ble den samme protokollen som ble anvendt i RNA-oppnåelsesforsøket fra SHK-1-celler, utført. Som et resultat ble det observert at i nyren øker formuleringens aktive prinsipp uttrykkelsesnivåene for pro-inflammatoriske cytokiner IL-1 og IL-8, og for IL-12 (type-Th1-cytokin). I tillegg øker det nivåene av anti-inflammatorisk cytokin TGF-β1 og av antiviralt cytokin IFNα (figur 3).

Forbindelsen Ribomunyl, anvendt som kontroll for sine kjente virkninger på aktivering av museceller (Spisek et al., 2004), økte uttrykkelsen av IL-1, TNF-α, IL-12 og IFNα (fig. 3). Videre presenterer nyren fra kontrollen, DMSO, saltløsning og ubehandlet fisk ingen endringer i uttrykkelsen av slike cytokiner.

Som konklusjon har formuleringens aktive prinsipp ifølge den foreliggende søknaden immunstimulerende egenskaper i salmonid fisk.

Eksempel 4: Det aktive prinsippets virkning som adjuvans på vaksiner for salmonid

For å evaluere den adjuvante evnen til formuleringens aktive prinsipp fra den foreliggende oppfinnelsen ble det utført et antigenavhengig lymfocyttisk proliferasjonsforsøk ved å anvende ovalbumin som et immunogen. Det forsøket utføres i lymfocyttkulturer som prolifererer klonalt når de stimuleres med antigenet. Dette skjer bare når en tidligere immunisering med antigenet har skjedd. Et protein slik som ovalbumin krever en adjuvansforbindelse for at immuniseringen skal skje. Følgelig mottok grupper på 350 g-fisk (regnbueørret) to doser med formuleringen kombinert med proteinet ovalbumin (Sigma). Grupper i forsøket mottok den injiserbare løsningen (formulering ifølge den foreliggende søknaden) bestående av 100 ug kombinert forbindelse med 10 ug protein ovalbumin oppløst i 100 ul saltløsning (0,9 % NaCl). En positiv kontroll, Montanide ISA 763 a VG (Seppic, Francia), en oljeaktig adjuvans anvendt i veterinærvaksiner, ble anvendt, og den ble blandet med 10 ug ovalbumin. Fremstillingen av Montanide ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. På den andre siden ble to kontrollgrupper anvendt, som ble delt inn i fisk som mottok 10 ug protein ovalbumin oppløst i saltløsning, og fisk som ble injisert med 100 ul saltløsning. Dosen med ovalbumin ble bestemt i et tidligere forsøk i henhold til en protokoll utført av Joosten et al., 1997. Fisk ble holdt i akvarier med 30 l ferskvann, og en kontinuerlig tilførsel av oksygen til en biomasse på 10–12 kg/m3 ved 15 ºC. Til mating ble det brukt en pellet av markedskvalitet, og ble administrert i akvariene én gang per dag.

Temperatur-, pH-, oksygen- og ammoniumnivåer ble overvåket daglig for å opprettholde parameterne innenfor optimale områder. I tillegg ble akvarienes vann skiftet daglig.

Etter 5 dager ble miltene til behandlet fisk desintegrert i 100-mesh nett med RPMI-1640 (Gibco) medium supplementert med 10 % kalvefosterserum, 4 mM L-Glutamin (Hyclone), 40 uM 2-Merkaptoetanol (Gibco) og 50 ug/ml Gentamicin (USB Biological). Cellesuspensjonen ble sentrifugert ved 2600 x g i 5 min ved 4 ºC.

Cellepelletene ble resuspendert i supplementert RPMI-medium, og antallet celler ble fastslått i et hemocytometer, og levedyktigheten ved Trypan-blå-farging på et invertert fasekontrastmikroskop. For in vitro stimulering ble 1x106 celler seedet i 96-brønners plater med 100 ul RPMI/s medium pluss 50 ug ovalbumin (OVA). Etter 3 dager, 18 h før fullførelsen av forsøket, ble 1 ul tritiert tymidin (3H-Tymidin) tilsatt, 5 µCi/ml (PerkinElmer) i hver brønn. Så ble cellene resuspendert i 1 ml ultrarent vann, og suspensjonen ble overført til fiberglassfiltre som ble vakuumtørket. Filtrene ble anbrakt i scintilleringsvæske, og radioaktivitet ble kvantifisert i en scintilleringsteller (Tri-Carb 2100 TR; Packard). Forsøksdata ble uttrykt i tellinger per minutt (CPM).

Som et resultat observeres det at kulturene fra fisk immunisert med ovalbumin og Montanide (OVA+Montanide) presenterte høyere nivåer av inkorporert tymidin enn de fra cellene til kontrollfisk injisert med kun ovalbumin (OVA) (tabell 1), hvilket bekrefter kontrollforbindelsens adjuvansvirkning. Videre observeres det også en økning av tymidininnlemmelsen når formuleringen anvendes (tabell 1).

Eksempel 5: Analyse av spesifikke antistoffer

Immunisering med ovalbumin i en formel som inneholder det aktive prinsippet som en adjuvans, induserer også en bedre humoral respons. Spesifikt IgM ble kvantifisert for OVA ved ELISA i serum etter immuniseringen. I denne analysen ble det anvendt sera fra fisk behandlet med formuleringen (100 μg aktivt prinsipp, 8 % DMSO og 100 μl saltløsning). I forsøket ble Maxisorp (Nunc) 96-brønners plater aktivert med 10 μg av ovalbumin-proteinet anvendt ved 37 ºC hele natten. Neste dag ble 200 μl blokkeringsløsning (1 % BSA, 5 % sukrose i salt fosfatbuffer) tilsatt i hver brønn, og platene ble inkubert i 30 min ved 37 ºC. Så ble blokkeringsløsningen fjernet og 100 μl serum fra hver behandlede fisk ble tilsatt i hver brønn i triplikat, og platene ble inkubert i 1 h ved 25 ºC. Etter denne tiden ble brønnene vasket med 0,05 % Tween 20 i PBS. Deretter ble 100 ul ørret anti-IgM-antistoff tilsatt i brønnene, og så ble platene inkubert i 1 h ved 25 ºC. Igjen ble brønnene vasket og inkubert i 30 min med 100 ul muse antiimmunoglobulin-antistoff konjugert til alkalisk fosfatase (Sigma) fortynnet i 1:1000. Til slutt ble brønnene vasket, og 100 ul utviklende løsning (50 mM Na2CO3, 2 mM MgCl2, og 14 mg p-nitrofenylfosfat) ble tilsatt i hver brønn. Platene ble inkubert i 15 min ved 37 ºC og analysert i en ELISA-leser ved 405 nm.

Som et resultat ble det bemerket at det var en større mengde spesifikke antistoffer mot OVA i gruppen med fisk behandlet med adjuvansen Montanide (figur 4) i forhold til resten av kontrollgruppenene og fisk behandlet med formuleringen ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og formuleringen ifølge den foreliggende søknaden presenterer også en liten økning i nivåene med spesifikke antistoffer mot OVA i forhold til kontrollene som er statistisk signifikante (figur 4).

Eksempel 6: Antiviral virkning av formuleringens aktive prinsipp

Økningen av de transkriberte IFNα-nivåene i SHK-1-celler behandlet med det aktive prinsippet antyder at IFNα også kan utskilles til dyrkingsmediet. I dette tilfellet må også supernatanten til de behandlede cellene vise en antiviral virkning. For å verifisere denne hypotesen ble supernatantvirkningen på ISA-virusproliferasjonen i ASK-cellemonosjikt evaluert.

For å oppnå kondisjonerte supernatanter ble SHK-1-celler dyrket i 6-brønners plater ved 15 ºC i Leibovitz L-15-medium supplementert med 10 % SFB, 4 mM L-Glutamin, 40 uM 2-merkaptoetanol og 50 ug/ml Gentamicin inntil en konfluens på 90–100 % ble nådd, og de ble stimulert ved å tilsette 5 ug av formuleringens aktive prinsipp eller 20 ug/ml Poly I:C (Sigma) i hver brønn, anvendt som en kontroll. Platene ble inkubert i 24 h, og medium fra hver brønn ble samlet inn etterpå, og ble sentrifugert ved 3000 rpm i 5 min ved 4 ºC. Supernatantene ble lagret ved -80 ºC. Videre spredte ISA-viruset seg i monosjikt av SHK-1-celler med en 60 % konfluens, som ble inokulert med viruset i et infeksjonsmedium (MOI 0,1)( Leibovitz L-15-medium uten SFB, 4 mM L-Glutamine, 40 uM 2-Merkaptoetanol, 50 ug/ml Gentamicin). Protokollen beskrevet av Jensen et al., 2002, ble fulgt.

Til forsøket med antiviral aktivitet ble det anvendt ASK-celler. (Rivas–Aravena et al., 2011). Celler ble spredt i 48-brønners plater inntil en konfluens på 90–100 % ble nådd, deretter inkubert i 48 h med 1:100-fortynninger av hver supernatant fra både stimulerte og ikke-stimulerte SHK-1-celler. Så ble cellene infisert med ISAV ved en fortynning på 1/40 i L-15-medium. På dag 2, 4 og 7 etter infeksjon (PI) ble supernatanten samlet inn, og viralt RNA ble ekstrahert ved å anvende et Kit ifølge produsentens protokoll (Omega Biotek, E.N.Z.A).

Inhiberingen av den virale replikeringen ble bestemt ved RT-PCR, idet denne fremgangsmåten er mer spesifikk, mer sensitiv og raskere i å detektere og identifisere viruset. Til dette ble det anvendt spesifikke startere rettet mot fragment 8 av ISA-viruset. 10 ul av RNA-et oppnådd fra ekstraheringen ble inkubert med 1 ul sens-starter (10 uM), 1 ul antisens-starter (10 uM) (se tabell 1), 5 ul master mix (Kit one step Syber Green), og 3 ul ultrarent vann (Invitrogen). cDNA ble syntetisert, og PCR ble utført i Stratagene 7300-utstyret.

Tabell I: Sekvens av startere anvendt til detektering av ISA-viruset som er til stede i ASK-cellekulturer.

Som et resultat bemerket vi at supernatanten fra SHK-1-celler, stimulert med formuleringens aktive prinsipp, utsetter den virale replikeringen inntil dag 4 (figur 6), i motsetning til supernatanten oppnådd ved stimulering med Poly I:C. Resultatene indikerer at det er en forbindelse med antiviral aktivitet indusert av det aktive prinsippet ifølge den foreliggende oppfinnelsen i supernatanten fra stimulerte celler, som sannsynligvis samsvarer med en type-I IFN. Derfor vil formuleringens aktive prinsipp være nyttig i å trigge en tidlig antiviral respons.

Figur 1 viser middelfluorescensintensiteten (MFI) for uttrykkelse av MHCII i ubehandlet kontroll-DC, og DC behandlet med 0,5 eller 5 ug av formuleringens aktive prinsipp. R er en forbindelse anvendt som positiv kontroll. Som negativ kontroll ble det anvendt ubehandlet DC, samt DC behandlet med DMSO (0,02 %) som samsvarer med bæreren anvendt for å oppløse den studerte forbindelsen. Resultatene ble analysert med enveis ANOVA sammen med Bonferronis multiple sammenligning etter test (*P<0,05).

Figur 2 viser nivåene av cytokin mRNA i SHK-1-celler stimulert med potensielle immunstimulerende forbindelser. Til det ble SHK-1-celler inkubert med kontrollforbindelsen Ribomunil og med formuleringens aktive prinsipp, samt DMSO-løsemiddel i 24 h ved 15 ºC i supplementert L-15-medium. Uttrykkelsen av cytokintranskripter ble evaluert ved qRT-PCR. Grafen viser den normaliserte og relative uttrykkelsen. Normalisering ble utført i forbindelse med de ubehandlede kulturene og det konstitutivt uttrykte genet 18s. Statistiske forskjeller ble fastslått ved den ikkeparametriske t-testen (Mann-Whitney) blant de ubehandlede gruppene og forsøksgruppene (* P<0,05).

Figur 3 viser nivåene av cytokintranskripter i nyren til fisk behandlet med immunstimulerende forbindelser. Grupper med fisk (Salmo salar) ble injisert IM med 100 ug aktivt prinsipp i 100 ul saltløsning, med kontrollforbindelsen Ribomunil, 8 % DMSO, eller med saltløsning. Uttrykkelsen av cytokintranskripter ble evaluert ved qRT-PCR. Grafen viser den normaliserte og relative uttrykkelsen (NRE). Normalisering ble utført i forbindelse med nivåene av uttrykkelse i ubehandlet fisk og i forbindelse med den konstitutive uttrykkelsen av gen 18s. Statistisk signifikante forskjeller ble fastslått ved den ikke-parametriske t-testen (Mann-Whitney) blant ubehandlet fisk og forsøksfisk (* P<0,05).

Figur 4 viser analysen av humoral respons hos fisk immunisert med ovalbumin. ELISA-plater ble aktivert med 10 ug ovalbumin hele natten i fosfatbuffer.100 ul sera fra fisk behandlet med formuleringen pluss OVA, ISA763 pluss OVA, kun OVA, og ubehandlet ble tilsatt platene, og inkubert i 1 h ved romtemperatur. 100 ul ørret anti-IgM-antistoff ble tilsatt i hver brønn, og til slutt ble platene inkubert med et IgG antimuseantistoff. Resultatene ble analysert i en BIORAD-plateleser.

Figur 5 viser deteksjonen av viralt RNA ved RT-PCR. ASK-cellemonosjikt ble infisert med en 1:40-fortynning av ISA-viruset. På dag 2, 4 og 7 ble supernatanten samlet inn, og ekstraheringen av viralt RNA ble utført. Prøver ble analysert ved RT-PCR. Ct indikerer antallet sykluser der amplifikasjonen starter. (Jo høyere Ct, jo lavere viralt RNA er til stede i prøven).

Tabell 2. Proliferasjon av antigen spesifikt for regnbueørretsplenocyttene immunisert med ovalbumin (OVA).

Ovalbuminet (10 ug) ble injisert rent, med ISA 763 (Montanide OVA), og sammen med formuleringen. Etter ekstrahering av splenocyttene fra miltene ble de dyrket i 3 dager med 50 ug ovalbumin. Etter den tidsperioden ble tritiert tymidin tilsatt, og tilsetningen av tymidin ble kvantifisert 18 h senere i en scintilleringsteller. Hver verdi representerer gjennomsnittet av 1 forsøk i triplikat med 3 fisk i hver forsøksgruppe. Statistisk signifikante forskjeller ble fastslått ved enveis ANOVA sammen med en ikkeparametrisk t-test (Mann-Whitney) (* P<0,05).

Tabell III: Komparativt diagram mellom den foreslåtte oppfinnelsen og konkurransen (adjuvans av markedskvalitet Montanide).

HENVISNINGER

1. Bachrach G, Zlotkin A, Hurvitz A, Evans D, Eldar A. (2001). Recovery of Streptococcus iniae from Diseased Fish Previously Vaccinated with a Streptococcus Vaccine. Appl Envir Microbiol. 67,3756-3758.

2. Bahenmann. G, Mesquita. J (1987). Oil adjuvant vaccine against foot-and-mouth disease. Biol. Centr. Panam. Fiebre, 53, 25–30

3. Bogdan,C, Rollinghoff. M, Diefenbach. A. (2000), Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Curr Opin Immunol, 12, 64-76. Bowden T, Bricknell I, Ellis A. (2003). Fish Vaccination, an overview. Industry report IntraFish. 5-20.

4. Chang. J, Diveley. J, Savary. J, Jensen. F (1998). Adjuvant activity of incomplete Freund's adjuvant. Ad. Drug Del. Rev., 32 ,173–186.

5. Choudhary. M, Hareem. S, Siddiqui. H, Anjum. S, Ali. S, Atta-ur-Rahman, Zaidi. M (2008). A benzil and isoflavone from Iris tenuifolia. Phytochemistry., 69,1880-1885.

6. Christie. K, (2004). Immunization with viral antigens: infectious pancreatic necrosis. J. Virol.24, 13829-13838.

7. Dixon. P, Hill. B (1983). Inactivation of infectious pancreatic necrosis virus for vaccine use. Journal of Fish Diseases,6-399–409.

8. Dobos. P, Hill. B, Hallett. R, Kells. D, Becht. H, Teninges. D. (1979).

Biophysical and biochemical characterization of five animal viruses with bisegmented double-stranded RNA genomes. J Virol., 32, 593-605.

9. Dorson M. (1977). Vaccination trials of rainbow trout fry against infectious pancreatic necrosis. Bull Off Int Epizoot.87-405-406.

10. Downum. K, Dole. J, Rodríguez. E (1998) Nordihydroguaiaretic acid: inter- and intra population variation in the Sonoran Desert Creasote bush (Larrea tridentate, Zygophyllaceae). Biochem. Syst. Ecol., 15, 551-555.

11. Droge. W. (2002), Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev., 82, 47-95.

12. Eingenbrode. S, Trumble. J, White. K (1996). Trichome exudates and resistance to beet armyworm (Lepidoptera: Noctuidade) in Lycopersicum hirsutum f. typicum accessions. Environ. Entomol., 25, 90-95.

13. Evans. J, Klesius. P, Shoemaker. C (2004). Efficacy of Streptococcus agalactiae (group B) vaccine in tilapia (Oreochromis niloticus) by intraperitoneal and bath immersion administration. Vaccine,22, 3769–3773.

14. Fischer U, Utke K, Somamoto T, Kollner B, Ototake M, Nakanishi T. (2006). “ Cytotoxic activities of fish leucocytes”. Fish Shellfish Immunol. 20,209-26.

15. González-Coloma. A, Wisdom. C, Rundel. P (1987). Ozone impact on the antioxidant nordihydroguairetic acid content in the external leaf resin of Larrea tridentate. Biochem. Syst. Ecol., 16, 59-64.

16. Gupta. R (1998). Aluminum compounds as vaccine adjuvants. Adv. Drug Deliv. Rev., 32,155–172

17. Heppell J, Davis Hl. (2000), Application of DNA vaccine technology to aquaculture. Adv Drug Deliv Rev.,43,29-43.

18. Hill, B. J. and Way, K (1995) Serological classification of infectius pancreatic necrosis (IPN) virus and other birnaviruses. Annu. Rev. Fish. 5, 55-77.

19. Hoffman. J, Kingsolver. B, McLaughlin. S, Timmermann. B, (1983).

“Production of resins by arid adapted Astereae” in Recent Advances in Photochemistry Phytochemical Adaptations to stress. Edited by B. Timmermann, C. Steelink and F. Loewus. Plenum Press, USA.

20. Hsu. H.Y, Wen. M.H. (2002), Lipopolysaccharide-mediated reactive oxygen species and signal transduction in the regulation of interleukin-1 gene expression. J Biol Chem., 277, 22131-22139.

21. Imajoh M, Hiraya T, Oshima S (2005). Frequent occurrence of apoptosis is not associated with pathogenic infectius pancreatic necrosis virus (IPNV) during persistent infection. Fish Shellfish Immunol. 18, 163-177.

22. Jashes. M, González. M, López-Lastra. M, De Clerq. E, Sandino. A. (1996). Inhibitors of infectious pancreatic necrosis virus replication. Antiviral Res., 29, 309-312.

23. Jashes. M, Mlynarz. G, De Clerq. E, Sandino. A. (2000). Inhibitory effects of EICAR on infectious pancreatic necrosis virus replication. Antiviral Res., 45, 9-17. 24. Kibenge, F. S., Garate, O. N., Jonson, G., Arriagada, R., Kibenge, M. J., Wadowska, D. (2001) Isolation and identification of infectius salmon anemia virus (ISAV) from Coho salmon in Chile. Dis. Aquat. Organ.45, 9-18.

25. Kim. Y., Wang. P., Navarro-Villalobos. M., Rohde. B., Derrybery. J., Gin. D. (2006). Synthetic studies of complex immunostimulants from Quillaja saponaria: synthesis of the potent clinical immonoadjuvant Qs-21Aapi. J. Am. Chem. Soc., 128,11906-11915.

26. Klesius. P, Shoemaker. C, Evans. J (2000). Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolate vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia /Oreochromis niloticus/. Aquaculture 188, 237–246.

27. Laing KJ, Zou JJ, Purcell MK, Phillips R, Secombes CJ, Hansen JD. (2006). “Evolution of the CD4 family: teleost fish possess two divergent forms of CD4 in addition to lymphocyte activation gene-3”. J Immunol.177, 3939-51.

28. Lakhanpal. P, Rai. D., Internet Journal of Medical Update 2007 Jul-Dec;2(2): www.geocities.comm/agnihotrimed/paper05 jul-dec2007.htm, 2007.

29. Liu. T, Castro. S, Brasier. A. R, Jamaluddin. M, Garofalo. R. P, Casola, A., (2004). Reactive oxygen species mediate virus-induced STAT activation: role of tyrosine phosphatases. J Biol Chem., 279, 2461-2469.

30. Loehr. B, Rankin. R, Pontarollo. P, King. T, Wilson. L, Babiuk. L, Van-Drunnen. H (2001). Suppository-mediated DNA immunization induces mucosal immunity against bovine herpes virus-1 in cattle. Virology, 289, 327–333.

31. Lissi. E, Modak. B, Torres. R, Escobar. J, Urzúa, A. (1999). Total antioxidant potential of resinous exudates from Heliotropium species and a comparison of the ABTS and DPPH methods. FreeRad. Res., 30, 471- 477.

32. Londoño. J, Sierra. J.(2007). Efecto de la hesperidina sobre la captación de Hdl en células Hepáticas y evaluación de hesperidina liposomal sobre la oxidación de Ldl. Scientia et teccnica, 33, 63-66.

33. Middleton E Jr. (1998). Effect of plant flavonoids on immune and inflammatory cell function. Adv Exp Med Biol.1998;439:175-82.

34. Mjaaland, S., Rimstad, E., Falk, K., Dannevig, B. H. (1997). Genomic characterization of the virus causing infectius salmon anemia in Atlantic salmon (Salmo solar L): an orthomyxo-like virus in a teleost. J. Virol.71, 7681-7686.

35. Migus. D, Dobos. P. (1980). Effect of ribavirin on the replication of infectious pancreatic necrosis virus in fish cell cultures. J. Gen. Virol., 47, 47-57.

36. Modak. B, Torres. R, Lissi. E, Delle Monache F. (2003) Antioxidant capacity of flavonoids and a new arylphenol of the resinous exudate from Heliotropium sinuatum. Nat. Prod. Res., 17, 403-407.

37. Modak. B, Torres. R, Wilkens. M, Urzúa. A (2004) Antibacterial activity of compounds isolated of the resinous exudates from Heliotropium sinuatum on phytopathogenic bacteria. J. Chil. Chem. Soc., 49, 1-3.

38. Modak. B, Galeno. H, Torres. R (2004) Antiviral activity on Hantavirus and apoptosis of Vero cells of natural and semi-synthetic compounds from Heliotropium filifolium resin. J. Chil. Chem. Soc., 49,143-145.

39. Modak. B, Rojas. M, Torres. R, Rodilla. J, Luebert. F. (2007). Antioxidant activity of a new aromatic geranyl derivative of the resinous exudates from Heliotropium glutinosum Phil. Molecules, 12, 1057-1063.

40. Modak. B, Rojas. M, Torres. R. (2009). Chemical analysis of the resinous exudate isolated from Heliotropium taltalense and evaluation of the antioxidant activity of the phenolics components and the resin in homogeneous and heterogeneous systems. Molecules, 14, 1980-1989.

41. Modak. B, Salinas. M, Rodilla. J, Torres. R (2009) Study of the chemical composition of the resinous exudates isolated from Heliotropium sclerocarpum and evaluation of the antioxidant properties of the phenolic compounds and the resin.

Molecules, 14, 4625-4633.

42. Modak. B, Sandino. A, Torres. R. (2009). Composición veterinaria que comprende un éster senecionílico derivado de un alcohol espiránico aromático geranilado; y su uso para inhibir el desarrollo de los virus de la necrosis pancreática infecciosa y de la anemia infecciosa. Oppfinnelsespatent. Søknadsnummer 200900714. Oficina de Patentes Chilena, INAPI (CLPTO, det chilenske patentstyret).

43. Modak. B, Sandino. A, Arata. L, Cárdenas-Jirón. G, Torres. R (2010). Inhibitory effect of aromatic geranyl derivatives isolated from heliotropium filifolium on infectious pancreatic necrosis virus replication. Vet. Mic., 12, 53-58.

44. Moon, Y. J.; Wang, X.; Morris, M. E.(2006). Dietary flavonoids: Effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicology in Vitro, 20, 187-210

45. Morris. J, Martínez, C, Abdala. R, Campos. D, (1999). Adyuvantes Inmunológicos. Rev Cubana Invest Biomed.18, 130-7.

46. Moya. J, Pizarro. H, Jashes. M, De Clerq. E, Sandino. A. (2000). In vivo effect of EICAR (5-ethylnyl-1-β-D-ribofuranosylimidazole-carboxamide) on experimental infected rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and coho salmon (Oncorhynchus kisutch) fry with infectious necrosis virus. Antiviral Res., 48, 125-130.

47. Nakanishi, T., Toda, H., Shibasaki, Y. y Somamoto, T., (2011). Cytotoxic T cells in teleost fish. Dev. Comp. Immunol. 35, 1317-1323.

48. Nicklas, W. (1992). Aluminium salts. Research in Immunology. 143, 489.

49. Nijveldt RJ, van Nood E, van Hoorn DE, Boelens PG, van Norren K, van Leeuwen PA. (2001). Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. Am J Clin Nutr.74,418-25.

50. Ohta Y, Landis E, Boulay T, Phillips RB, Collet B, Secombes CJ, (2004).

“Homologs of CD83 from elasmobranch and teleost fish”. J Immunol.173, 4553-60. 51. Paone S. (2001). Farmed and Dangerous. Human Health Risks Associated with Salmon Farming. Friends of Clayoquot Sound, Tofino, British Columbia.

52. Penagos. G, Barato. P, Iregui. C (2009) Sistema immune y vacunación de peces. Acta Biol. Colomb., 14, 3-24.

53. Pinto. J. (2003). Proyecto FIP 2001-2008 “Riesgos de introducción de enfermedades infectocontagiosas en salmonidos”. Informe de Resultados.

54. Press CM, Evensen O, Reitan LJ, Landsverk T. (1996). “Retention of furunculosis vaccine components in Atlantic salmon, Salmo salar L, following different routes of vaccine administration”. Journal of Fish Diseases. 19, 215-24.

55. Ramon. G. (1924). Sur la toxine et surranatoxine diphtheriques. Ann. Inst.

Pasteur, 38, 1.

56. Rankin. R, Pontarollo. R, Gomis. S, Karvonen. B, Willson. P, Loehr. B, Godson. D, Babiuk. L, Hecker. R, Van Drunen Littel-van den Hurk. (2002). CpG-containing oligodeoxynucleotides augment and switch the immune responses of cattle to bovine herpesvirus-1 glycoprotein D. Vaccine, 20 ,3014–3022.

57. Romalde J, Luzardo-Alvárez A, Ravelo C, Toranzo A, Blancoméndez J. (2004). Oral immunization using alginate microparticles as a useful strategy for booster vaccination against fish lactoccocosis. Aquaculture.236:119-129.

58. Rombout JH, Huttenhuis HB, Picchietti S, Scapigliati G. (2005).” Phylogeny and ontogeny of fish leucocytes”. Fish Shellfish Immunol.19, 441-55.

59. Sadasaiv, E. (1995) Immunological and pathological responses of salmonids to infectius pancreatic necrosis virus (IPNV). Annu.Rev. Fish Dis. 5, 209-223

60. Saint-Jean. S, Borrego. J, Pérez-Prieto, S. (2003) Infectious pancreatic necrosis virus : biology, phatogenesis and diagnostic methods. Adv. Virus Res.62, 113-165. 61. Salgado-Miranda. C. (2006). Infectious pancreatic necrosis: an emerging disease in the Mexican trout culture. Vet. Mex.37, 467-477.

62. Salmón Chile (2010) www.salmonchile.cl

63. Sandoval. F. (2004). “Estatus ambiental y sanitario de la acuicultura chilena”. Presentation of the Undersecretary of Fishing, Chile. Aquavision, Noruega.

64. Sato A, Okamoto N. (2008). “Characterization of the cell-mediated cytotoxic responses of isogeneic ginbuna crucian carp induced by oral immunisation with haptenmodified cellular antigens”. Fish Shellfish Immunol. 24, 684-92.

65. Singh. M, O'Hagan. T (2003). Vaccines in the 21st Century: Expanding the Boundaries of Human and Veterinary Medicine. International Journal for Parasitology.

33, 469–478.

66. Somogyi. P, Dobos. P (1980). Virus-specific RNA synthesis in cells infected by infectious pancreatic necrosis virus. J. Virol., 33, 129-139.

67. Suetake H, Araki K, Suzuki Y. (2004). “Cloning, expression, and characterization of fugu CD4, the first ectothermic animal CD4”. Immunogenetics. 56,368-74.

68. Thorud, K. and Djupvik H. (1988). Infectius anemia in Atlantic salmon (salmo solar L).. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol.8, 109-111.

69. Torres. R, Villarroel. L, Urzúa. A, Delle Monache. F, Delle Monache. G, Gacsbaitz. E., (1994), Filifolinol a rearranged geranyl aromatic derivative from the resinous exudates of Heliotropium filifolium. Phytochem., 36, 249-256.

70. Torres. R, Modak. B, Urzúa. A, Villarroel. L, Delle Monache. F, Sánchez-Ferrando. F. (1996), Flavonoides del exudado resinoso de Heliotropium sinuatum. Bol. Soc. Chil. Quim., 41, 195-197.

71. Torre. R, Galeno. H, Modak. B. (2007). Effect on Hantavirus replication of resins from Heliotropium species and other selected compounds. Natural Product Communications, 3, 525-528.

72. Torres. P, Aedo. E, Figueroa. L, Siegmund. I, Silva. R, Navarrete. N, Puga. S, Marín. F y Aedo. E (2000). “Infección por helmintos parásitos en salmón coho, Oncorhynchus kisutch, durante su retorno al río Simpson, Chile”. Bol. Chil. Parasitol., 55, Nº 1-2.

73. Urzúa. A, Mendoza. L (1993), Composición química del exudado resinoso de Haplopappus velutinus. Bol. Soc. Chil. Quim., 38, 89-93.

74. Urzúa. A, Villarroel. L, Torres. R, Teillier. S. (1993), Flavonoids of the resinous exudate of chilean Heliotropium species from Cochranea section. Bioch. Sist. Ecol., 21, 744-749.

75. Urzúa. A, Modak. B, Villarroel. L Torres. R, Andrade. L (1998), Comparative flavanoid composition of the resinous exudates from Heliotropium chenopodiaceum var. chenopodiaceum and H. chenopodiaceum var. ericoideum. Bioch. Sist. Ecol.,26, 127-130.

76. Urzúa. A, Modak. B, Villarroel. L, Torres. R, Andrade. L, Mendza. L, Wilkens. M (2000), External flavonoids from Heliotropium megalanthum and H. Huascoense (Boraginaceae). Chemotaxonomic considerations. Bol. Soc. Chil. Quim., 45, 23-29. 77. Urzúa. A, Modak. B, Torres. R (2001). Identification of a new aromatic geranyl derivative in the resinous exudates of Heliotropium filifolium (Boraginaceae). Bol. Soc. Chil. Quim., 46, 175-178.

78. Utke K, Kock H, Schuetze H, Bergmann SM, Lorenzen N, Einer-Jensen K. (2008). “Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus”. Dev Comp Immunol.32,239-52.

79. Vandenberg. G (2004). Oral vaccine for finfish: academic theory or commercial reality?. Anim Health Res Rev.5,301-304.

80. Villarroel. L, Torres. R, Urzúa. A, Reina. M, Cabrera. R, González-Coloma. A (2001). Heliotropium huascoense resin exudate: Chemical Constituents and Defensive Properties, 64, 1123-1126.

81. Wolf, K. (1988) Infectius pancreatic necrosis. En Comstock Publishing Associate (ed) Fish Viruses and Fish Diseases, Cornell University Press.115-157. 82. Yoder, J, Litman G. (2000). The zebrafish fth1, slc3a2, men1, pc, fgf3, andcycd1 genes define two regions of conserved synteny between linkage group 7 and human chromosome 11q13. Gene, 261,235-242.

83. Yoshida. Y, Maruyama. M, Fujita. T, Arai. N, Hayashi. R, Araya. J, Matsui. S, Yamashita. N, Sugiyama. E, Kobayashi. M. (1999). Reactive oxygen intermediates stimulate interleukin-6 production in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol., 276, L900-908.

84. Zhang. B, Hirahashi. J, Cullere. X, Mayadas. T. (2003). Elucidation of molecular events leading to neutrophil apoptosis following phagocytosis: cross-talk between caspase 8, reactive oxygen species, and MAPK/ERK activation. J Biol Chem., 278, 28443-28454.

Claims (4)

1. P a t e n t k r a v 1. Formulering med immunstimulerende/adjuvant aktivitet, der den omfatter: a) (-)-alpinone, hvis strukturelle formel er:

   der R1er OH, og R2er OCH3, med en optisk aktivitet på [ α]25ºD= -28,1 (c.0.215,CHCl3), og en S-konfigurasjon av karbon 2 og 3; b) dimetylsulfoksid; og c) saltløsning.
2. 2. Formulering ifølge krav 1, der den omfatter: a) (-)-alpinone: 0,05 % vekt/volum til 0,5 % vekt/volum b) DMSO: 0,8 til 8,0 % vekt/volum, og c) Saltløsning: Nødvendig mengde for å fullføre 100 % volum.
3. 3. Formulering med immunstimulerende/adjuvant aktivitet ifølge krav 1 eller 2, for anvendelse som en vaksine for virveldyr.
4. 4. Formulering ifølge krav 3, der nevnte virveldyre er en salmonid art.