NO342748B1 - Faktor IX del-polymer konjugater med en utløsbar binding - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer faktor IX-gruppe-polymerkonjugater som haren frigjørbar binding. Det tilveiebringes også metoder for fremstilling av konjugater og metoder for administrering av konjugater.

Description

FAKTOR IX-GRUPPE-POLYMER-KONJUGATER MED EN FRIGJØRBAR BINDING.

OPPFINNELSENS OMRÅDE.

Foreliggende oppfinnelse angår generelt polymer-aktivt middel-konjugater som har en frigjørbar binding for derved å frigjøre det aktive midlet in vivo. I tillegg angår oppfinnelsen, blant annet, metoder for syntetisering av konjugatene, metoder for rensning av konjugatene, og så videre.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN.

Forskere og klinikere står overfor flere utfordringer i sine forsøk på å utvikle aktive midler til former som er egnet for levering til en pasient. Aktive midler som er polypeptider, for eksempel, blir ofte levert via injeksjon fremfor oralt. På denne måten blir polypeptidet innført i den systemiske sirkulasjon uten eksponering for det proteolytiske miljøet i maven. Injeksjon av polypeptider har imidlertid mange ulemper. For eksempel har mange polypeptider en relativt kort halveringstid som derved nødvendiggjør gjentatte injeksjoner, noe som ofte er uhensiktsmessig og smertefullt. Videre kan noen polypeptider bevirke én eller flere immunresponser, med den konsekvens at pasientens immunsystem forsøker å ødelegge eller på annen måte nøytralisere det immunogene polypeptid. Selvfølgelig kan polypeptidet, straks polypeptidet er blitt ødelagt eller på annen måte nøytralisert, ikke utøve sin tilsiktede farmakodynamiske aktivitet. Således er levering av aktive midler, så som polypeptider, ofte problematisk, selv når disse midler blir administrert ved injeksjon.

Noe suksess er oppnådd når det gjelder problemene med levering av aktive midler via injeksjon. For eksempel har konjugering av det aktive midlet til en vann-oppløselig polymer resultert i et polymer-aktivt middel-konjugat som har redusert immunogenisitet og antigenisitet. I tillegg har disse polymer-aktivt middel-konjugatene ofte en sterkt øket halveringstid sammenlignet med sine ukonjugerte mots-tykker, som et resultat av redusert utskilling gjennom nyrene og/eller redusert enzymatisk nedbrytning i den systemiske sirkulasjon. Som et resultat av å ha en lengre halveringstid, krever polymer-aktivt middel-konjugatet mindre hyppig dosering, noe som i sin tur reduserer det totale antall av smertefulle injeksjoner og uhensiktsmessige besøk hos en yrkesutøver i helsevesenet. Videre oppviser aktive midler som bare var marginalt oppløselige en betydelig økning av vannopp-løselighet når konjugert til en vann-oppløselig polymer.

På grunn av dens dokumenterte sikkerhet, så vel som dens godkjennelse av FDA for både topisk og innvortes anvendelse, har polyetylenglykol blitt konjugert til aktive midler. Når et aktivt middel er konjugert til en polymer i polyetylenglykol, eller "PEG", blir det konjugerte, aktive middel konvensjonelt referert til som "PEGylert." Den kommersielle suksess til PEGylerte, aktive midler, så som PEGASYS<®>PEGylert interferon alfa-2a (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), PEG-INTRON<®>PEGylert interferon alfa-2b (Schering Corp., Kennilworth, NJ) og NEULASTA™ PEG-filgrastim (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), viser at administrering av en konjugert form av et aktivt middel kan ha betydelige fordeler i forhold til det ukonjugerte motstykke. Små molekyler, så som distearoylfosfatidyl-etanolamin (Zalipsky (1993), Bioconjug. Chem. 4(4):296-299) og fluoruracil (Ouchi et al. (1992), Drug Des. Discov, 9(1):93-105), har også blitt PEGylert. Harris et al. har gitt en oversikt over virkningene av PEGylering på farmasøytiske midler. Harris et al. (2003), Nat. Rev. Drug Discov. 2(3):214-221.

Til tross for disse suksessene, er konjugering av en polymer til et aktivt middel, hvilket resulterer i et kommersielt relevant medikament, ofte en utfordring. For eksempel kan konjugering resultere i at polymeren blir tilknyttet på eller nær et sete på det aktive midlet som er nødvendig for farmakologisk aktivitet (for eksempel på eller nær et bindingssete). Slike konjugater kan derfor ha uakseptabelt lav aktivitet på grunn av for eksempel de steriske effektene tilført med polymeren. Forsøk på å avhjelpe konjugater som har uakseptabelt lav aktivitet kan kullkastes når det aktive midlet har få eller ingen andre seter egnet for binding til en polymer. Således er ytterligere PEGylerings-alternativer ønsket.

Én tilnærmingsmåte foreslått for å løse dette og andre problemer, er "reversibel PEGylering", hvor det native aktive middel (eller en gruppe som har øket aktivitet sammenlignet med det PEGylerte aktive middel) blir frigjort. For eksempel er reversibel PEGylering beskrevet på området kjemoterapi ved kreft. Se Greenwald (1997), Exp. Opin. Ther. Patents 7(6):601-609. US-patentsøknad, publ. nr. 2005/0079155, beskriver konjugater hvor det anvendes reversible bindinger. Som beskrevet i denne publikasjon, kan reversible bindinger bevirkes gjennom

anvendelse av en enzym-substratgruppe. Det er imidlertid blitt påpekt at tilnærmingsmåter som setter sin lit til enzymatisk aktivitet er avhengig av tilgjengelighet til enzymer. Se Peleg-Schulman (2004), J. Med. Chem. 47:4897-4904. Variabili-tet hos pasientene med hensyn til mengden og aktiviteten til disse enzymene, kan gi varierende ytelse av konjugatet i forskjellige populasjoner. Således er ytterligere tilnærmingsmåter, som ikke setter sin lit til enzymatiske prosesser for nedbrytning, blitt angitt å være ønskelig.

En annen tilnærmingsmåte for reversibel PEGylering er beskrevet i US-patent nr. 7.060.259, som (blant annet) beskriver vann-oppløselige promedika-menter hvor et biologisk aktivt middel er bundet til en vann-oppløselig, ikke-immunogen polymer med en hydrolyserbar karbamatbinding. Som beskrevet deri, kan det biologisk aktive middel lett frigjøres ved hydrolyse av karbamatbindingen in vivo, uten behov for tilsetning av enzymer eller katalytisk materialer.

En annen tilnærmingsmåte for reversibel PEGylering er beskrevet i Peleg-Schulman (2004), J. Med. Chem. 47:4897-4904, WO 2004/089280 og US-patentsøknad, publ. nr. 2006/0171920. Selv om denne tilnærmingsmåten har vært be-nyttet for et begrenset antall aktive midler, overser disse referansene andre aktive midler som reversibel PEGylering ville være spesielt egnet for. Enda en annen tilnærmingsmåte for frigjøring er beskrevet i US-patentsøknad, publ. nr. 2006/0293499.

På området blødningsforstyrrelser kan proteiner (så som for eksempel faktor IX) noen ganger administreres til en pasient for å rette seg mot eller på annen måte forbedre blødningsforstyrrelsen. På grunn av den relativt korte halveringstiden til faktor IX og beslektede proteiner, ville det vært fordelaktig å øke halveringstiden in vivo til disse proteinene, for eksempel ved reversibel PEGylering. Således søker foreliggende oppfinnelse å løse dette og andre behov på fagområdet.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN.

I én eller flere utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, tilveiebringes det et konjugat med følgende formel:

hvor:

POLY<1>er en første, vann-oppløselig polymer; POLY<2>er en andre, vann-oppløselig polymer; X<1>er en første rom-gruppe; X<2>er en andre rom-gruppe; Ha er et ioniserbart hydrogenatom; R<1>er H eller en organisk rest; R<2>er H eller en organisk rest; (a) er enten null eller én; (b) er enten null eller én;

R<e1>, når til stede, er en første elektron-endringsgruppe;

R<e2>, når til stede, er en andre elektron-endringsgruppe; og

Y<1>er O eller S;

Y<2>er O eller S; og

F9 er en rest i en amin-inneholdende faktor IX-gruppe.

I én eller flere utførelsesformer ifølge oppfinnelsen tilveiebringes det metoder for fremstilling av konjugater.

I én eller flere utførelsesformer ifølge oppfinnelsen tilveiebringes det farma-søytiske preparater omfattende konjugatene.

Oppfinnelsen tilveiebringer også preparatet definert over for anvendelse i terapi.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE.

Figur 1 er en tid-konsentrasjonskurve for konjugater ifølge oppfinnelsen. Ytterligere informasjon angående denne figuren er gitt i eksempel 3. Figur 2 viser koaguleringsaktiviteten til konjugater ifølge oppfinnelsen. Ytterligere informasjon angående denne figuren er gitt i eksempel 4.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN.

Før foreliggende oppfinnelse blir beskrevet i detalj, skal det forstås at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til spesielle polymerer, synteseteknikker, aktive midler og lignende, siden disse kan variere.

Det skal bemerkes at entallsformene "en", "ei", "et" og "det", "den", slik de er anvendt i denne beskrivelsen og kravene, omfatter flertallsformene hvis ikke sammenhengen klart tilsier noe annet. Således omfatter for eksempel referanse til en "polymer" én enkelt polymer så vel som to eller flere av samme eller forskjellige polymerer, referanse til et "konjugat" angir ett enkelt konjugat så vel som to eller flere av samme eller forskjellige konjugater, referanse til et "tilsetningsmiddel" omfatter ett enkelt tilsetningsmiddel så vel som to eller flere av samme eller forskjellige tilsetningsmidler, og lignende.

I foreliggende oppfinnelses beskrivelse og krav vil følgende terminologi bli anvendt i overensstemmelse med definisjonene beskrevet nedenfor.

"PEG," "polyetylenglykol" og "poly(etylenglykol)", som anvendt her, er ment å omfatte et hvilket som helst vann-oppløselig poly(etylenoksid). Typisk omfatter PEG'er for anvendelse i henhold til oppfinnelsen følgende struktur, "-0(CH2CH20)m-", hvor (m) er 2 til 4.000. Som anvendt her, omfatter PEG også "-CH2CH2-0(CH2CH20)m-CH2CH2-" og "-(ChbChbOJm-," avhengig av om de terminale oksygener er blitt fortrengt eller ikke. Når PEG videre omfatter en rom-gruppe (som vil bli beskrevet mer detaljert nedenfor), resulterer atomene som omfatter rom-gruppen, når kovalent bundet til et vann-oppløselig polymersegment, ikke i dannelse av en oksygen-oksygen-binding (dvs. en "-0-0-"- eller peroksid-binding). Gjennom hele beskrivelsen og kravene skal det huskes på at betegnelsen "PEG"

omfatter strukturer som har forskjellige terminal- eller "ende-avslutnings-" grupper, og så videre. Betegnelsen "PEG" betyr også en polymer som inneholder en større del, det vil si, mer enn 50%, av -ChbChteO-monomere under-enheter. Med hensyn

til spesifikke former, kan PEG ha en hvilken som helst av en rekke molekylvekter, så vel som strukturer eller geometri, så som "forgrenet," "lineær," "gaffelformig," "multifunksjonell," som vil bli beskrevet mer detaljert nedenfor.

Betegnelsene "ende-avsluttet" eller "terminalt avsluttet" er her anvendt om hverandre for å referere til en terminal-gruppe eller en ende-gruppe på en polymer som har en ende-avsluttende gruppe. Typisk omfatter den ende-avsluttende gruppen, selv om den ikke nødvendigvis gjør det, en hydroksy- eller Ci-20-alkoksy-gruppe. Således omfatter eksempler på ende-avsluttende grupper alkoksy (for eksempel metoksy, etoksy og benzyloksy), så vel som aryl, heteroaryl, cyklo, heterocyklo og lignende. I tillegg omfattes mettede, umettede, substituerte og usubstituerte former av hver av de foregående. Videre kan den ende-avsluttende gruppen også være et silan. Den ende-avsluttende gruppen kan også fordelaktig omfatte et detekterbart merke. Når polymeren har en ende-avsluttende gruppe omfattende et detekterbart merke, kan mengden eller lokaliseringen av polymeren og/eller gruppen (for eksempel aktivt middel) av interesse som polymeren er kob-let til, bestemmes ved anvendelse av en egnet detektor. Slike merker omfatter, uten begrensning, fluorescerende, kjemiluminescerende, grupper anvendt i en-zymmerking, kolorimetriske (for eksempel fargemidler), metallioner, radioaktive grupper og lignende. Egnede detektorer omfatter fotometere, filmer, spektromete-re og lignende.

"Ikke-naturlig forekommende", med hensyn til en polymer eller en vann-opp-løselig polymer, betyr en polymer som i sin helhet ikke finnes i naturen. En ikke-naturlig forekommende polymer eller en vann-oppløselig polymer kan imidlertid inneholde én eller flere under-enheter eller deler av en under-enhet som er naturlig forekommende, så lenge den totale polymerstrukturen ikke finnes i naturen.

Betegnelsen "vann-oppløselig polymer", er en hvilken som helst polymer som er oppløselig i vann ved romtemperatur. Typisk vil en vann-oppløselig polymer transmittere minst ca. 75%, mer foretrukket minst ca. 95%, lys, transmittert av samme løsning etter filtering. På vektbasis vil en vann-oppløselig polymer fortrinnsvis være minst ca. 35% (etter vekt) oppløselig i vann, mer foretrukket minst ca. 50% (etter vekt) oppløselig i vann, enda mer foretrukket ca. 70% (etter vekt) oppløselig i vann, og enda mer foretrukket ca. 85% (etter vekt) oppløselig i vann. Det er imidlertid enda mer foretrukket at den vann-oppløselige polymeren er ca.

95% (etter vekt) oppløselig i vann, og mest foretrukket at den vann-oppløselige polymeren er fullstendig oppløselig i vann.

Molekylvekt i sammenheng med en vann-oppløselig polymer ifølge oppfinnelsen, så som PEG, kan enten uttrykkes som en antallsmidlere molekylvekt eller som en vektmidlere molekylvekt. Hvis ikke annet er angitt, refererer alle referan-ser til molekylvekt her til den vektmidlere molekylvekten. Både antallsmidlere og vektmidlere bestemmelse av molekylvekt kan måles ved anvendelse av gelper-measjons-kromatografi eller andre væskekromatografiteknikker. Andre metoder for å måle molekylvektverdier kan også anvendes, så som anvendelse av ende-gruppe-analyse eller måling av kolligative egenskaper (for eksempel senkning av frysepunktet, forhøyelse av kokepunket eller osmotisk trykk) for å bestemme antallsmidlere molekylvekt, eller anvendelse av lysspredningsteknikker, ultrasentrifu-gering eller viskometri for å bestemme vektmidlere molekylvekt. Polymerene ifølge oppfinnelsen er typisk polydisperse (dvs. at antallsmidlere molekylvekt og vektmidlere molekylvekt av polymerene er ikke lik), har lave polydispersitetsverdier på fortrinnsvis mindre enn ca. 1,2, mer foretrukket mindre enn ca. 1,15, enda mer foretrukket mindre enn ca. 1,10, enda mer foretrukket igjen mindre enn ca. 1,05, og mest foretrukket mindre enn ca. 1,03.

Som anvendt her, er betegnelsen "karboksylsyre" en gruppe som har en

O

-C-OH-funksjonell gruppe (også vist som "-COOH" eller -C(O)OH), så vel som grupper som er derivater av en karboksylsyre, idet slike derivater omfatter for eksempel beskyttede karboksylsyrer. Således omfatter betegnelsen karboksylsyre, hvis ikke sammenhengen klart tilsier noe annet, ikke bare syreformen, men tilsvarende estere og beskyttede former også. Med hensyn til beskyttelsesgrupper egnet for en karboksylsyre og en hvilken som helst annen funksjonell gruppe beskrevet her, refereres det til Greene et al., "Protective Grou<p>s in Organic S<y>nthesis" 3. utgave, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999.

Betegnelsene "reaktiv" og "aktivert", når anvendt sammen med en spesiell funksjonell gruppe, refererer til en reaktiv, funksjonell gruppe som lett reagerer med en elektrofil eller en nukleofil på et annet molekyl. Dette i motsetning til slike grupper som krever sterke katalysatorer eller meget upraktiske reaksjonsbetingelser for å reagere (dvs. en "ikke-reaktiv" eller "inert" gruppe).

Betegnelsene "beskyttet", "beskyttelsesgruppe" og "beskyttende gruppe", refererer til tilstedeværelse av en gruppe (dvs. beskyttelsesgruppen) som forhind-rer eller blokkerer omsetning av en spesiell, kjemisk reaktiv, funksjonell gruppe i et molekyl under visse reaksjonsbetingelser. Beskyttelsesgruppen vil variere, avhengig av typen kjemisk reaktiv, funksjonell gruppe som blir beskyttet, så vel som reaksjonsbetingelsene som kan anvendes og tilstedeværelse av ytterligere reaktive eller beskyttende grupper i molekylet, om noen. Beskyttelsesgrupper kjent på området er å finne i Greene et al., ovenfor.

Som anvendt her, er betegnelsen "funksjonell gruppe", eller et hvilket som helst synonym for denne, ment å omfatte beskyttede former derav.

Betegnelsene "spacer", eller "rom-gruppe", blir anvendt her for å referere til et atom eller en samling av atomer som eventuelt befinner seg mellom én gruppe og en annen. Rom-gruppene kan være hydrolytisk stabile, eller kan omfatte én eller flere fysiologisk hydrolyserbare eller enzymatisk frigjørbare bindinger.

En "organisk rest", som anvendt her, omfatter for eksempel alkyl, substituert alkyl, alkenyl, substituert alkenyl, alkynyl, substituert alkynyl, aryl og substituert aryl.

"Alkyl" angir en hydrokarbonkjede, typisk i området fra ca. 1 til 20 atomer i lengde. Slike hydrokarbonkjeder er fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, mettet, og kan være forgrenet eller lineær, selv om lineær typisk er foretrukket. Eksempler på alkylgrupper omfatter metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, 1-metylbutyl, 1-etyl-propyl, 3-metylpentyl og lignende. Som anvendt her, omfatter "alkyl" cykloalkyl når tre eller flere karbonatomer er angitt til, og lavere alkyl.

"Lavere alkyl" angir en alkylgruppe inneholdende fra 1 til 6 karbonatomer, og kan være lineær eller forgrenet, som eksemplifisert ved metyl, etyl, n-butyl, iso-butyl og tert-butyl.

"Cykloalkyl" angir en mettet eller umettet, cyklisk hydrokarbonkjede, omfattende brodannede, kondenserte eller spiro-cykliske forbindelser, som fortrinnsvis utgjøres av opptil 3 til ca. 12 karbonatomer, mer foretrukket 3 til ca. 8 karbonatomer.

"Ikke-påvirkende substituenter" er slike grupper som, når de er til stede i et molekyl, typisk er ikke-reaktive med andre funksjonelle grupper som finnes i molekylet.

Betegnelsen "substituert", som for eksempel i "substituert alkyl," angir en gruppe (for eksempel en alkylgruppe) substituert med én eller flere ikke-påvirkende substituenter, så som, men ikke begrenset til: C3-C8-cykloalkyl, for eksempel cyklopropyl, cyklobutyl og lignende; halogen, for eksempel fluor, klor, brom og jod; cyano; alkoksy, lavere fenyl; substituert fenyl; og lignende, for ett eller flere hydro-genatomer. "Substituert aryl" er aryl som har én eller flere ikke-påvirkende grupper som substituent. For substitusjoner på en fenylring kan substituentene være i en hvilken som helst orientering (dvs. orto, meta eller para). "Substituert ammonium" er ammonium som har én eller flere ikke-påvirkende grupper (for eksempel en organisk rest) som substituent.

"Alkoksy" angir en -O-R-gruppe, hvor R er alkyl eller substituert alkyl, fortrinnsvis Ci-C2o-alkyl (for eksempel metoksy, etoksy, propyloksy, benzyl etc), mer foretrukket Ci-Cz-alkyl.

Som anvendt her, angir "alkenyl" en forgrenet eller uforgrenet hydrokarbongruppe med en lengde på 2 til 15 atomer, inneholdende minst én dobbeltbinding. Eksempler på alkenyl omfatter (uten begrensning) etenyl, n-propenyl, isopropenyl, n-butenyl, iso-butenyl, oktenyl, decenyl, tetradecenyl og lignende.

Betegnelsen "alkynyl", som anvendt her, angir en forgrenet eller uforgrenet hydrokarbongruppe med en lengde på 2 til 15 atomer, inneholdende minst én trippelbinding. Eksempler på alkynyl omfatter (uten begrensning) etynyl, n-butynyl, iso-pentynyl, oktynyl, decynyl og så videre.

"Aryl" betyr én eller flere aromatiske ringer, hver med 5 eller 6 kjerne-karbonatomer. Aryl omfatter flerfoldige arylringer som kan være kondensert, som i naftyl, eller ukondensert, som i bifenyl. Arylringer kan også være kondensert eller ukondensert med én eller flere cykliske hydrokarbonringer, heteroarylringer eller heterocykliske ringer. Som anvendt her, omfatter "aryl" heteroaryl. En aromatisk ring-inneholdende gruppe (for eksempel Ar<1>, Ar<2>og så videre), betyr en struktur inneholdende aryl.

"Heteroaryl" er en arylgruppe inneholdende fra ett til fire heteroatomer, fortrinnsvis N, O eller S, eller en kombinasjon derav. Heteroarylringer kan også være kondensert med én eller flere cykliske hydrokarbonringer, heterocykliske ringer, aryl- eller heteroarylringer.

"Heterocyklisk gruppe", eller "heterocyklisk", betyr én eller flere ringer med 5-12 atomer, fortrinnsvis 5-7 atomer, med eller uten umetning eller aromatisk ka-rakter, og som har minst ett ringatom som ikke er et karbon. Foretrukne heteroatomer omfatter svovel, oksygen og nitrogen.

"Substituert heteroaryl" er heteroaryl som har én eller flere ikke-påvirkende grupper som substituenter.

"Substituert heterocyklisk gruppe" er en heterocyklisk gruppe som har én eller flere sidekjeder dannet av ikke-påvirkende substituenter.

"Elektrofil" angir et ion eller atom eller en samling av atomer som kan være ioniske som har et elektrofilt senter, dvs. et senter som er elektron-søkende, som er i stand til å reagere med en nukleofil.

"Nukleofil" angir et ion eller atom eller en samling av atomer som kan være ioniske som har et nukleofilt senter, dvs. et senter som søker et elektrofilt senter eller med en elektrofil.

En "fysiologisk spaltbar", så vel som en "hydrolyserbar", binding, er en relativt svak binding som reagerer med vann (dvs. blir hydrolysert) under fysiologiske betingelser. Tendensen som en binding har til å hydrolyseres i vann vil avhenge ikke bare av den generelle type binding som forbinder to sentrale atomer, men også av substituentene bundet til disse sentrale atomene. Eksempler på hydrolyserbare bindinger omfatter, men er ikke begrenset til, karboksylatester, fosfatester, anhydrid, acetal, ketal, acyloksyalkyleter, imin og orto-estere.

En "frigjørbar binding" omfatter, men er ikke begrenset til, en fysiologisk spaltbar binding, en hydrolyserbar binding og en enzymatisk nedbrytbar binding. Således er en "frigjørbar binding" en binding som kan gjennomgå enten hydrolyse eller spaltning ved en annen mekanisme (for eksempel enzym-katalysert, syre-katalysert, base-katalysert og så videre) under fysiologiske betingelser. For eksempel kan en "frigjørbar binding" involvere en elimineringsreaksjon som har en base-abstraksjon av et proton (for eksempel et ioniserbart hydrogenatom, Ha), som drivkraft. For formål her, er en "frigjørbar binding" synonymt med en "nedbrytbar binding."

En "enzymatisk frigjørbar binding" betyr en binding som utsettes for nedbrytning av ett eller flere enzymer.

En "hydrolytisk stabil" tilknytning eller binding angir en kjemisk binding, typisk en kovalent binding, som er hovedsakelig stabil i vann, det vil si at den ikke gjennomgår hydrolyse under fysiologiske betingelser i noen merkbar grad over en forlenget tidsperiode. Eksempler på hydrolytisk stabile bindinger omfatter, men er ikke begrenset til, følgende: karbon-karbon-bindinger (for eksempel i alifatiske kjeder), etere, amider og lignende. Generelt er en hydrolytisk stabil binding en som oppviser en hydrolyseringsgrad på mindre enn ca. 1-2% pr. dag under fysiologiske betingelser. Hydrolysegraden for representative kjemiske bindinger er å finne i de fleste standard lærebøker i kjemi. Det må påpekes at noen bindinger kan være hydrolytisk stabile eller hydrolyserbare, avhengig (for eksempel) av nabostilte og nærliggende atomer og omgivelsesbetingelser. En fagmann på området kan bestemme hvorvidt en gitt tilknytning eller binding er hydrolytisk stabil eller hydrolyserbar i en gitt sammenheng, for eksempel ved å plassere et molekyl som inneholder en binding av interesse under betingelser av interesse, og å teste med henblikk på bevis for hydrolyse (for eksempel tilstedeværelse og mengde av to molekyler som er et resultat av spaltningen av ett enkelt molekyl). Andre tilnærmingsmåter kjent for fagfolk på området for å bestemme hvorvidt en gitt tilknytning eller binding er hydrolytisk stabil eller hydrolyserbar, kan også anvendes.

Betegnelsene "aktivt middel", "biologisk aktivt middel" og "farmakologisk aktivt middel" blir anvendt om hverandre her, og er definert å omfatte et hvilket som helst middel, medikament, forbindelse, sammensetning av materiale eller blanding som tilveiebringer noe farmakologisk, ofte fordelaktig, effekt som kan demonstre-res in vivo eller in vitro. Dette omfatter kosttilskudd, næringsstoffer, nutrasøytiske midler, medikamenter, proteiner, vaksiner, antistoffer, vitaminer og andre fordelaktige midler. Som anvendt her, omdatter disse betegnelsene videre en hvilken som helst fysiologisk eller farmakologisk aktiv substans som gir en lokalisert eller sys-temisk effekt hos en pasient.

"Farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel" eller "farmasøytisk akseptabel bærer" angir et tilsetningsmiddel som kan innbefattes i preparatene ifølge oppfinnelsen, og som ikke forårsaker noen betydelige, ugunstige toksikologiske effekter hos pasienten.

"Farmakologisk effektiv mengde", "fysiologisk effektiv mengde" og "terapeutisk effektiv mengde" blir anvendt om hverandre her, og skal bety mengden av et

polymer-aktivt middel konjugat - typisk til stede i et farmasøytisk preparat - som er nødvendig for å gi et ønsket nivå av aktivt middel og/eller konjugat i blodstrømmen eller i et mål-vev. Den nøyaktige mengde vil avhenge av en rekke faktorer, for eksempel det spesielle aktive middel, komponentene og de fysiske karakteristika til det farmasøytiske preparatet, tilsiktet pasientpopulasjon, vurdering av pasienten og lignende, og kan lett bestemmes av en fagmann på området, basert på infor-masjonen gitt her og tilgjengelig i den relevante litteratur.

"Multifunksjonell" i sammenheng med en polymer, betyr en polymer som inneholder 3 eller flere funksjonelle grupper, hvor de funksjonelle gruppene kan være like eller forskjellige. Multifunksjonelle polymerer vil typisk inneholde ca. 3-100 funksjonelle grupper, eller 3-50 funksjonelle grupper, eller 3-25 funksjonelle grupper, eller 3-15 funksjonelle grupper, eller fra 3 til 10 funksjonelle grupper, eller vil inneholde 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 funksjonelle grupper i polymeren. En "di-funksjonell" polymer betyr en polymer som inneholder to funksjonelle grupper, enten like (dvs. homodifunksjonell) eller forskjellige (dvs. heterodifunksjonell).

"Forgrenet", med referanse til geometrien eller den totale strukturen til en polymer, angir polymer som har 2 eller flere polymer-"armer". En forgrenet polymer kan ha 2 polymer-armer, 3 polymer-armer, 4 polymer-armer, 6 polymer-armer, 8 polymer-armer, eller mer. Én spesiell type av sterkt forgrenet polymer er en dendrittisk polymer eller dendrimer, som, for formålene ifølge oppfinnelsen, er ansett å ha en struktur forskjellig fra den til en forgrenet polymer.

En "dendrimer", eller dendrittisk polymer, er en globulær, størrelses-mono-dispers polymer hvor alle bindingene strekker seg radialt ut fra et sentralt fokalt

punkt eller kjerne med et regelmessig forgreningsmønster og med gjentatte enheter som hver bidrar med et forgreningspunkt. Dendrimerer oppviser visse dendrit-tiske tilstands-egenskaper, så som kjerneinnkapsling, som gjør dem unike i forhold til andre typer av polymerer.

En basisk eller sur reaktant beskrevet her, omfatter nøytrale, ladede, og eventuelle tilsvarende saltformer derav.

Betegnelsen "pasient" angir en levende organisme som lider av, eller har tilbøyelighet til, en lidelse som kan forhindres eller behandles ved administrering av et konjugat som angitt her, og omfatter både mennesker og dyr.

Som anvendt her, betyr "medikament-frigjøringshastighet" den hastigheten (angitt som halveringstid) som halvparten av den totale mengden av polymer-aktivt middel-konjugatene i et system vil spaltes til det aktive middel og en polymer-rest med.

"Eventuell" og "eventuelt" betyr at den deretter beskrevne omstendighet kan forekomme eller ikke, slik at beskrivelsen omfatter tilfeller hvor omstendigheten forekommer og tilfeller hvor den ikke gjør det.

Som anvendt her, blir "halogen"-betegnelsen (for eksempel fluor, klor, jod, brom og så videre) generelt anvendt når halogenet er bundet til et molekyl, mens endelsen "id" (for eksempel fluorid, klorid, jodid, bromid og så videre) blir anvendt når halogenet eksisterer i sin uavhengige ioniske form (for eksempel så som når en utgående gruppe spaltes av fra et molekyl).

Betegnelsen "faktor IX-gruppe", som anvendt her, angir en gruppe som har faktor IX-aktivitet. Faktor IX-gruppen vil også ha minst en amingruppe egnet for

omsetning med et polymert reagens. Typisk, selv om ikke nødvendigvis, er faktor IX-gruppen et protein. I tillegg omfatter betegnelsen "faktor IX-gruppe" både faktor IX-gruppen før konjugering, så vel som faktor IX-gruppe-residuet etter konjugering. Slik det vil bli forklart mer detaljert nedenfor, kan en fagmann på området bestemme hvorvidt en hvilken som helst gitt gruppe har faktor IX-aktivitet. Som anvendt her, omfatter betegnelsen "faktor IX-gruppe" proteiner modifisert med hensikt, som for eksempel ved setedirigert mutagenese, eller tilfeldigvis ved muta-sjoner. Betegnelsen "faktor IX-gruppe" omfatter også derivater som har fra 1 til 6 ytterligere glykosyleringsseter, derivater som har minst én ytterligere aminosyre på den karboksy-terminale ende av proteinet, hvor den ytterligere aminosyre(r) omfatter minst ett glykosyleringssete, og derivater som har en aminosyresekvens som omfatter minst ett glykosyleringssete.

I sammenheng med foreliggende omtale, skal det forstås at definisjonen av en variabel tilveiebragt med hensyn til én struktur eller formel, gjelder for den samme variabelen gjentatt i en forskjellig struktur, hvis ikke sammenhengen tilsier noe annet.

Som tidligere angitt, omfatter foreliggende oppfinnelse (blant annet) konjugater som har en frigjørbar binding.

Før eksempler på konjugater ifølge oppfinnelsen skal beskrives, vil utførel-sesformer av en vann-oppløselig polymer og en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding, så som en karbamatbinding, bli beskrevet.

Med hensyn til en gitt vann-oppløselig polymer, kan hver vann-oppløselige polymer (for eksempel POLY, POLY<1>og POLY<2>) omfatte en hvilken som helst polymer, så lenge polymeren er vann-oppløselig og ikke-peptidisk. Selv om det fortrinnsvis er en poly(etylenglykol), kan en vann-oppløselig polymer for anvendelse herfor eksempel være andre vann-oppløselige polymerer, så som andre poly-(alkylenglykoler) (også referert til som "poly(alkylenoksider)"), så som poly-(propylenglykol) ("PPG"), kopolymerer av etylenglykol og propylenglykol og lignende, poly(olefinisk alkohol), poly(vinylpyrrolidon), poly(hydroksyalkyl-metakryl-amid), poly(hydroksyalkyl-metakrylat), poly(sakkarider), poly(a-hydroksysyre), poly(vinylalkohol), polyfosfazen, polyoksazolin, poly(N-akryloylmorfolin), så som beskrevet i US-patent nr. 5.629.384. Den vann-oppløselige polymeren kan være en homopolymer, kopolymer, terpolymer, ikke-tilfeldig blokkpolymer og tilfeldig blokkpolymer av en hvilken som helst av de foregående. I tillegg kan en vann-oppløselig polymer være lineær, men kan også være i andre former (for eksempel forgrenet, gaffelformig og lignende), slik det vil bli beskrevet mer detaljert nedenfor. I sammenheng med det å være til stede i en total struktur, har en vann-opp-løselig polymer fra 1 til ca. 300 termini.

I tilfeller hvor det polymere reagenset omfatter to eller flere vann-oppløse-lige polymerer, kan hver vann-oppløselige polymer i den totale strukturen være like eller forskjellige. Det er imidlertid foretrukket at alle vann-oppløselige polymerer i den totale strukturen er av samme type. For eksempel er det foretrukket at alle vann-oppløselige polymerer i en gitt struktur er poly(etylenglykol)polymerer.

Selv om den vektmidlere molekylvekten av en hvilken som helst individuell vann-oppløselig polymer kan variere, vil den vektmidlere molekylvekten av en hvilken som helst gitt vann-oppløselig polymer typisk være i følgende område: 100 Dalton til ca. 150.000 Dalton. Eksempler på områder omfatter imidlertid vektmidlere molekylvekter i følgende områder: i området fra ca. 880 Dalton til ca. 5.000 Dalton; i området høyere enn 5.000 Dalton til ca. 100.000 Dalton; i området fra ca. 6.000 Dalton til ca. 90.000 Dalton; i området fra ca. 10.000 Dalton til ca. 85.000 Dalton; i området høyere enn 10.000 Dalton til ca. 85.000 Dalton; i området fra ca. 20.000 Dalton til ca. 85.000 Dalton; i området fra ca. 53.000 Dalton til ca. 85.000 Dalton; i området fra ca. 25.000 Dalton til ca. 120.000 Dalton; i området fra ca. 29.000 Dalton til ca. 120.000 Dalton; i området fra ca. 35.000 Dalton til ca.

120.000 Dalton; i området fra ca. 880 Dalton til ca. 60.000 Dalton; i området fra ca. 440 Dalton til ca. 40.000 Dalton; i området fra ca. 440 Dalton til ca. 30.000 Dalton; og i området fra ca. 40.000 Dalton til ca. 120.000 Dalton. For en hvilken som helst gitt vann-oppløselig polymer, er PECer som har en molekylvekt i ett eller flere av disse områdene foretrukket.

Eksempler på vektmidlere molekylvekter for den vann-oppløselige polymeren omfatter ca. 100 Dalton, ca. 200 Dalton, ca. 300 Dalton, ca. 400 Dalton, ca. 440 Dalton, ca. 500 Dalton, ca. 600 Dalton, ca. 700 Dalton, ca. 750 Dalton, ca. 800 Dalton, ca. 900 Dalton, ca. 1.000 Dalton, ca. 1.500 Dalton, ca. 2.000 Dalton, ca. 2.200 Dalton, ca. 2.500 Dalton, ca. 3.000 Dalton, ca. 4.000 Dalton, ca. 4.400 Dalton, ca. 4.500 Dalton, ca. 5.000 Dalton, ca. 5.500 Dalton, ca. 6.000 Dalton, ca. 7.000 Dalton, ca. 7.500 Dalton, ca. 8.000 Dalton, ca. 9.000 Dalton, ca. 10.000 Dalton, ca. 11.000 Dalton, ca. 12.000 Dalton, ca. 13.000 Dalton, ca. 14.000 Dalton, ca. 15.000 Dalton, ca. 16.000 Dalton, ca. 17.000 Dalton, ca. 18.000 Dalton, ca. 19.000 Dalton, ca. 20.000 Dalton, ca. 22.500 Dalton, ca. 25.000 Dalton, ca. 30.000 Dalton, ca. 35.000 Dalton, ca. 40.000 Dalton, ca. 45.000 Dalton, ca. 50.000 Dalton, ca. 55.000 Dalton, ca. 60.000 Dalton, ca. 65.000 Dalton, ca. 70.000 Dalton og ca. 75.000 Dalton. Forgrenede versjoner av den vann-oppløselige polymeren (for eksempel en forgrenet, 40.000 Dalton vann-oppløselig polymer bestående av to 20.000 Dalton-polymerer) som har en total vektmidlere molekylvekt som en hvilken som helst av de foregående, kan også anvendes.

De polymerene reagensene anvendt for å fremstille konjugatet, vil omfatte minst én vann-oppløselig polymer som har en total størrelse i området egnet for den ønskede frigjøringshastighet av konjugatet dannet av det. For eksempel kan et konjugat som har en relativt lang frigjøringshastighet fremstilles av et polymert reagens som har en størrelse egnet for (a) forlenget sirkulasjon før frigjøring av det aktive midlet fra konjugatet, og (b) moderat rask in vivo-utskilling av forbindel-sene frigjort fra konjugatet ved frigjøring fra konjugatet. Likeledes, når konjugatet har en relativt høy frigjøringshastighet, så vil det polymere reagenset typisk ha en lavere molekylvekt.

Når en PEG blir anvendt som den vann-oppløselige polymeren(e) i det polymere reagenset, omfatter PEG'en typisk flere (OCH2CH2)monomerer (eller (CH2CH20)monomerer, avhengig av hvordan PEG'en er definert). Som anvendt gjennom hele beskrivelsen, blir antallet repeterende enheter identifisert ved det indekserte tallet "n" i "(OChbChtey. Således faller verdien av det indekserte tallet (n) typisk innen ett eller flere av de følgende områder: fra 2 til ca. 3400, fra ca. 4 til ca. 1500, fra ca. 100 til ca. 2300, fra ca. 100 til ca. 2270, fra ca. 136 til ca. 2050, fra ca. 225 til ca. 1930, fra ca. 450 til ca. 1930, fra ca. 1200 til ca. 1930, fra ca. 568 til ca. 2727, fra ca. 660 til ca. 2730, fra ca. 795 til ca. 2730, fra ca. 795 til ca. 2730, fra ca. 909 til ca. 2730 og fra ca. 1.200 til ca. 1.900. For en hvilken som helst gitt polymer hvor molekylvekten er kjent, er det mulig å bestemme antallet repeterende enheter (dvs. "n") ved å dividere den totale vektmidlere molekylvekt av polymeren med molekylvekten til den repeterende monomer.

Hver vann-oppløselige polymer er typisk biokompatibel og ikke-immunogen. Med hensyn til biokompatibilitet, er en substans ansett som biokompatibel hvis de fordelaktige effektene forbundet med anvendelse av substansen, alene eller med en annen substans (for eksempel et aktivt middel), i forbindelse med levende vev (for eksempel administrering til en pasient), oppveier eventuelle skadelige effekter som evaluert av en kliniker, for eksempel en lege. Med hensyn til ikke-immunogenisitet, er en substans ansett som ikke-immunogen hvis anvendelse av substansen, alene eller med en annen substans, i forbindelse med levende vev, ikke gir en immunrespons (for eksempel dannelsen av antistoffer), eller, hvis en immunrespons blir skapt, at en slik respons ikke blir ansett som klinisk betydelig eller viktig, som evaluert av en kliniker. Det er spesielt foretrukket at de vann-oppløse-lige polymerene beskrevet her, så vel som konjugater av aktive midler, og polymerene, er biokompatible og ikke-immunogene.

I én form som er anvendelig, er fri eller ikke-bundet PEG en lineær polymer avsluttet på hver ende med hydroksylgrupper:

hvor (m') typisk er i området fra null til ca. 4.000, fortrinnsvis fra ca. 20 til ca. 1.000.

Ovennevnte polymer, alfa,omega-dihydroksylpoly(etylenglykol), kan i kort-form benevnes HO-PEG-OH, hvor det vil forstås at -PEG-symbolet kan bety føl-gende strukturelle enhet:

hvor (rn') er som definert som ovenfor.

En annen type av fri eller ikke-bundet PEG som er anvendelig i foreliggende oppfinnelse, er metoksy-PEG-OH, eller mPEG som kortversjon, hvor én terminus er den relativt inerte metoksygruppen, mens den andre terminus er en hydroksylgruppe. Strukturen til mPEG er angitt nedenfor.

hvor (m') er som beskrevet ovenfor.

Mange-armede eller forgrenede PEG-molekyler, så som dem beskrevet i US-patent nr. 5.932.462, kan også anvendes som PEG-polymer. For eksempel kan PEG ha strukturen:

hvor:

polya og polyber PEG-ryggrader (enten like eller forskjellige), så som metoksy-poly(etylenglykol);

R" er en ikke-reaktiv gruppe, så som H, metyl eller en PEG-ryggrad; og

P og Q er ikke-reaktive bindinger. I en foretrukket utførelsesform er den forgrenede PEG-polymeren metoksy-poly(etylenglykol)-disubstituert lysin.

I tillegg kan PEG omfatte en gaffelformig PEG. Et eksempel på en fri eller ikke-bundet, gaffelformig PEG er vist med følgende formel:

hvor X er en rom-gruppe og hver Z er en aktivert terminal-gruppe bundet til CH med en kjede av atomer med definert lengde. Kjeden av atomer som binder de Z-funksjonelle gruppene til det forgrenede karbonatomet fungerer som bindings-gruppe, og kan for eksempel omfatte alkylkjeder, eterkjeder, esterkjeder, amidkje-der og kombinasjoner derav. US-patent nr. 6.362.254 beskriver forskjellige gaffel-formige PEG-strukturer som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse.

PEG-polymeren kan omfatte et utstikkende PEG-molekyl som har reaktive grupper, så som karboksyl, kovalent tilknyttet langs lengden av PEG heller enn på slutten av PEG-kjeden. De utstikkende, reaktive gruppene kan være bundet til PEG direkte eller gjennom en rom-gruppe, så som en alkylengruppe.

I tillegg til de ovenfor beskrevne former av PEG, kan hver vann-oppløselige polymer i det polymere reagenset også fremstilles med én eller flere svake eller frigjørbare bindinger i polymeren, omfattende en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne polymerer. For eksempel kan PEG fremstilles med esterbindinger i polymeren som gjennomgår hydrolyse. Som vist nedenfor, resulterer denne hy-drolysen i spaltning av polymeren til fragmenter med lavere molekylvekt:

Andre hydrolytisk nedbrytbare bindinger som er anvendelige som en nedbrytbar binding i en polymer-ryggrad, omfatter karbonatbindinger; iminbindinger, som for eksempel er et resultat av omsetning av et amin og et aldehyd (se for eksempel Ouchi et al. (1997), Polymer Preprints 38(1):582-3); fosfatesterbindinger, for eksempel dannet ved omsetning av en alkohol med en fosfatgruppe; hydrazon-bindinger, som typisk dannes ved omsetning av et hydrazid og et aldehyd; acetal-bindinger, som typisk blir dannet ved reaksjon mellom et aldehyd og en alkohol; orto-esterbindinger, som for eksempel blir dannet ved reaksjon mellom et formiat og en alkohol; amidbindinger dannet av en amingruppe, for eksempel på slutten av en polymer, så som PEG, og en karboksylgruppe i en annen PEG-kjede; uretanbindinger dannet ved omsetning av for eksempel en PEG med en terminal isocyanatgruppe og en PEG-alkohol; peptidbindinger dannet av en amingruppe, for eksempel på slutten av en polymer, så som PEG, og en karboksylgruppe med et peptid; og oligonukleotidbindinger dannet av for eksempel en fosforamiditt-gruppe, for eksempel på slutten av en polymer, og en 5'-hydroksylgruppe i et oli-ognukleotid.

Det forstås av fagfolk på området at betegnelsen poly(etylenglykol), eller PEG, representerer eller omfatter alle de ovennevnte formene av PEG.

Fagfolk på området vil forstå at foregående omtale angående hovedsakelig vann-oppløselige polymerer ikke på noen måte er uttømmende og bare er illustre-rende, og at alle polymere materialer som har kvalitetene beskrevet ovenfor er omfattet. Som anvendt her, refererer betegnelsen "vann-oppløselig polymer" både til et molekyl så vel som til residuet av en vann-oppløselig polymer som har vært bundet til en annen gruppe. Følgende beskrivelse av en vann-oppløselig polymer gjelder ikke bare det polymere reagenset, men også de tilsvarende konjugater dannet ved anvendelse av de beskrevne polymere reagenser.

Den funksjonelle gruppen i det polymere reagenset anvendt for å danne konjugatene beskrevet her, er en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding, så som en karbamatbinding. Oppfinnelsen er ikke begrenset med hensyn til den spesifikke funksjonelle gruppen, så lenge den funksjonelle gruppen er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding, så som en karbamatbinding. Eksempler på funksjonelle grupper som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel, omfatter de funksjonelle gruppene valgt fra gruppen bestående av aktive karbonater, så som N-suksinimidyl, 1-benzotriazolyl, imidazol, karbonathalogenider (så som karbonatklorid og karbonatbromid), fenola-ter (så som p-nitrofenolat) og så videre. Hvis det aktive midlet er tilgjengelig med den aktive amingruppen omdannet til et isocyanat eller en isotiocyanatgruppe, så kan den funksjonelle gruppen i det polymere reagenset også, som et spesielt tilfelle, være hydroksyl, siden omsetning av disse komponentene gir en frigjørbar karbamatbinding.

Eksempler på polymere reagenser vil nå bli beskrevet mer detaljert. Det må huskes at selv om stereokjemi ikke spesifikt er vist i noen formler eller strukturer (enten det er for et polymert reagens, konjugat eller en hvilken som helst annen formel eller struktur), omfatter de tilveiebragte formlene og strukturene både enantiomerer så vel som preparater omfattende blandinger av hver enantiomer i like mengder (dvs. en racemisk blanding) og ulike mengder.

Et eksempel på et polymert reagens har følgende struktur:

hvor:

POLY<1>er en første vann-oppløselig polymer; POLY<2>er en andre vann-oppløselig polymer; X<1>er en første rom-gruppe; X<2>er en andre rom-gruppe; Ha er et ioniserbart hydrogenatom; R<1>er H eller en organisk rest; R<2>er H eller en organisk rest; (a) er enten null eller én; (b) er enten null eller én;

R<e1>, når til stede, er en første elektron-endringsgruppe;

R<e2>, når til stede, er en andre elektron-endringsgruppe; og

(FG) er en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding, så som en karbamatbinding.

Eksempler på polymere reagenser faller innenfor følgende formel:

hvor, i hvert tilfelle: (FG) er en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding, så som en karbamatbinding; R<1>er H eller en organisk rest; og R<2>er H eller en organisk rest;

Ytterligere andre eksempler på polymere reagenser har strukturen:

hvor hver av POLY<1>,POLY<2>, X<1>, X<2>, R<1>, R<2>, Ha og (FG) er som tidligere definert og R<e1>er en første elektron-endringsgruppe; og R<e2>er en andre elektron-endringsgruppe.

Ytterligere andre eksempler på polymere reagenser faller innenfor følgende strukturer:

hvor, for hver struktur og i hvert tilfelle, (n), uavhengig, er et helt tall fra 4 til 1500.

De polymerene reagensene kan fremstilles på en hvilken som helst måte. Følgelig er syntese av det polymere reagenset ikke begrenset til den spesifikke teknikken eller tilnærmingsmåten anvendt for fremstilling av dem.

I én metode for fremstilling av et polymert reagens som er anvendelig ved fremstilling av konjugatene beskrevet her, omfatter metoden: (a) tilveiebringelse av en aromatisk ring-inneholdende gruppe som har et første bindingssete, et andre bindingssete og et eventuelt tredje bindingssete; (b) omsetning av et funksjonell gruppe-reagens med det første bindingssete, hvilket resulterer i at det første bindingssete får en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og resulterer i en frigjørbar binding, så som et karbamat; og (c) omsetning av en vann-oppløselig polymer som har en reaktiv gruppe med det andre bindingssetet, og, når til stede, det eventuelt tredje bindingssete, hvilket resulterer i: (i) at det andre bindingssete får en vann-oppløselig polymer gjennom en rom-gruppe, og (ii) det eventuelt tredje bindingssete, når til stede, som får en andre vann-oppløselig polymer gjennom en rom-gruppe. I noen tilfeller blir (b) utført før trinn (c), mens i andre tilfeller (c) blir utført før trinn (b).

Således er det, i denne metoden for fremstilling av et polymert reagens, et

nødvendig trinn (a) å tilveiebringe en aromatisk ring-inneholdende gruppe som har et første bindingssete, et andre bindingssete og et eventuelt tredje bindingssete. I sammenheng med en syntetisk fremstilling, vil det forstås at "tilveiebringelse" av et materiale betyr å oppnå materialet (for eksempel ved syntetisering av det eller anskaffe det kommersielt). Et eksempel på en aromatisk ring-inneholdende gruppe, for det formål å illustrere, er 9-hydroksymetyl-2,7-diaminofluoren, som vist nedenfor.

Denne aromatisk ring-inneholdende gruppe, 9-hydroksymetyl-2,7-diamino-fluoren, er et eksempel på en aromatisk ring-inneholdende gruppe som har tre bindingsseter: en hydroksylgruppe i 9-stilling og aminogrupper i hver av 2- og 7-stillingene. Den aromatisk ring-inneholdende gruppe kan tilveiebringes i base-eller saltform. Med hensyn til 9-hydroksymetyl-2,7-diaminofluoren, er det mulig å anvende dihydrokloridformen. Andre aromatisk ring-inneholdende grupper kan tilveiebringes via syntetisk fremstilling og/eller innkjøp fra en kommersiell leveran-dør.

Etter å ha tilveiebragt den aromatisk ring-inneholdende gruppe, omfatter et annet trinn ved metoden, i vid forstand, trinnet med omsetning av en vann-opp-løselig polymer som har en reaktiv gruppe med bindingssetet/bindingssetene på den aromatisk ring-inneholdende gruppe. Her kan en hvilken som helst tilnærmingsmåte kjent på fagområdet for binding av en vann-oppløselig polymer til ett eller flere bindingsseter på den aromatisk ring-inneholdende gruppe anvendes, og metoden er ikke begrenset til den spesifikke tilnærmingsmåten. For eksempel kan en amin-reaktiv PEG (så som en N-suksinimidylester-avsluttet mPEG, dannet for eksempel ved omsetning av N-hydroksysuksinimid og CH30-CH2CH2-(OCH2CH2)-OCH2CH2-OCH2COOH med dicykloheksyl-karbodiimid (DCC) eller diisopropyl-karbodiimid (DIC) som kondenseringsmiddel og eventuelt i nærvær av en base) omsettes med et amin som bærer aromatisk ring-inneholdende gruppe, så som 9-hydroksymetyl-2,7-diaminofluoren.

I noen tilfeller vil omsetning av den vann-oppløselige polymeren som har en reaktiv gruppe med den aromatisk ring-inneholdende gruppen resultere i at alle mulige bindingsseter har en vann-oppløselig polymer tilknyttet. Under slike om-stendigheter er det nødvendig å fjerne minst én vann-oppløselig polymer, slik at et bindingssete blir gjort tilgjengelig for omsetning med et funksjonell gruppe-reagens. Således resulterer for eksempel omsetning av den N-suksinimidylester-avsluttede mPEG beskrevet i foregående avsnitt med 9-hydroksymetyl-2,7-diaminofluoren i en blanding omfattende: (a) en forbindelse som har to vann-opp-løselige polymerer, én på hvert av de to aminsetene, og (b) en forbindelse som har tre vann-oppløselige polymerer, én på hvert av de to aminsetene og én på hydroksylsetet. Her er det mulig å fjerne og oppsamle høymolekylære forbindelser ved anvendelse av størrelses-eksklusjonskromatografi. I tillegg er det mulig å behandle blandingen til høy pH (for eksempel ved å behandle blandingen med litiumhydroksid (LiOH), natriumhydroksid (NaOH), kaliumhydroksid (KOH)), fulgt av ionebytting-kromatografi (IEC). I ethvert tilfelle er resultatet et preparat som for det meste inneholder 9-hydroksymetyl-2,7-diaminofluoren som har to vann-opp- løselige polymerer, én på hvert av de to aminsetene. Et tredje hydroksylsete er derved tilgjengelig for omsetning med et funksjonell gruppe-reagens.

Det endelige trinn er omsetning av et reaktivt sete i den aromatisk ring-inneholdende gruppe med et funksjonell gruppe-reagens. En foretrukket tilnærmingsmåte er å omsette det hydroksyl-inneholdende 9-hydroksymetyl-2,7-diamino-fluoren som har to vann-oppløselige polymerer, én på hvert av de to aminsetene, med trifosgen, fulgt av behandling med N-hydroksysuksinimid. På denne måten blir en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding, så som en karbamatbinding (i dette tilfelle et "aktivert karbonat") dannet på det hydroksyl-inneholdende, reaktive sete.

Uansett hvilken tilnærmingsmåte som blir anvendt, finner trinnene i syntese-metoden sted i et passende løsningsmiddel. En fagmann på området kan bestemme hvorvidt et hvilket som helst spesifikt løsningsmiddel er passende for en hvilken som helst gitt reaksjon. Det er imidlertid typisk at løsningsmidlet fortrinnsvis er et ikke-polart løsningsmiddel eller et polart, aprotisk løsningsmiddel. Ikke-begrensende eksempler på ikke-polare løsningsmidler omfatter benzen, xylen, dioksan, tetrahydrofuran (THF), t-butylalkohol og toluen. Spesielt foretrukne, ikke-polare løsningsmidler omfatter toluen, xylen, dioksan, tetra hyd rof uran og t-butylalkohol. Eksempler på polare, aprotiske løsningsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, DMSO (dimetylsulfoksid), HMPA (heksametylfosforamid), DMF (dimetylformamid), DMA (dimetylacetamid), NMP (N-metylpyrrolidinon).

Så snart det er fremstilt, kan de polymere reagensene isoleres. Kjente metoder kan anvendes for å isolere det polymere reagenset, men det er spesielt foretrukket å anvende kromatografi, for eksempel størrelses-eksklusjonskromatografi. Alternativt, eller i tillegg, omfatter metoden trinnet med rensning av det polymere reagenset så snart det er dannet. Igjen kan standard rensemetoder kjent på fagområdet anvendes for å rense det polymere reagenset.

De polymere reagensene er følsomme for fuktighet og oksygen, og blir, idéelt sett, lagret under inert atmosfære, så som under argon eller under nitrogen, og ved lav temperatur. På denne måten blir potensielt nedbrytende prosesser forbundet med for eksempel atmosfærisk oksygen, redusert eller fullstendig unngått. I noen tilfeller kan antioksidanter, så som butylert hydroksyltoluen (BHT), tilsettes til det polymere reagenset før lagring for å unngå oksidativ nedbrytning. I tillegg er det foretrukket å minimalisere mengden av fuktighet forbundet med lag-ringsbetingelsene for å redusere potensielt skadende reaksjoner forbundet med vann, for eksempel hydrolyse av den aktive ester. Videre er det foretrukket å holde mørke lagringsbetingelser for å forhindre visse nedbrytende prosesser som involverer lys. Således omfatter foretrukne lagringsbetingelser én eller flere av de følgende: lagring under tørr argon eller en annen tørr, inert gass; lagring ved temperaturer under ca. -15 °C; lagring i fravær av lys; og lagring med en egnet mengde (for eksempel ca. 50 til ca. 500 deler pr. million) av en antioksidant, så som

BHT.

De ovenfor beskrevne polymere reagenser er anvendelige for konjugering til biologisk aktive midler. For eksempel vil en aminogruppe (for eksempel primært amin) i et aktivt middel reagere med den funksjonelle gruppen som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding, så som en karbamatbinding.

Eksempler på konjugater har følgende struktur:

hvor:

POLY1 er en første vann-oppløselig polymer; POLY<2>er en andre vann-oppløselig polymer; X<1>er en første rom-gruppe; X<2>er en andre rom-gruppe; Ha er et ioniserbart hydrogenatom; R<1>er H eller en organisk rest; R2 er H eller en organisk rest; (a) er enten null eller én; (b) er enten null eller én;

R<e1>, når til stede, er en første elektron-endringsgruppe;

R<e2>, når til stede, er en andre elektron-endringsgruppe;

Y<1>er O eller S;

Y<2>er O eller S; og

F9 er en rest av en amin-inneholdende faktor IX-gruppe. Eksempler på konjugater omfatter dem med følgende formel:

1

hvor, for hver struktur og i hvert tilfelle, (n), uavhengig, er et helt tall fra 4 til 1500 og F9 er en rest av en amin-inneholdende faktor IX-gruppe.

Det biologisk aktive middel som et polymert reagens som beskrevet her kan være konjugert til, er et amin-inneholdende, biologisk aktivt middel. Typisk vil det biologisk aktive middel være et makromolekyl, så som et polypeptid, som har en molekylvekt høyere enn ca. 3.500 Dalton. Farmakologisk aktive polypeptider representerer en foretrukket type av biologisk aktivt middel. Det skal forstås at for formål i foreliggende omtale, vil betegnelsen "polypeptid" være generisk for olig-opeptider og proteiner. Med hensyn til polypeptider, kan aminet som det polymere reagenset kobles til være på N-terminus eller en amin-inneholdende sidekjede til en aminosyre (så som lysin) i polypeptidet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en metode for fremstilling av et konjugat,

som omfatter trinnet å kontakte et polymert reagens med et biologisk aktivt middel under betingelser egnet for å danne en kovalent binding mellom polymeren og det biologisk aktive middel. Typisk blir polymeren tilsatt til det aktive middel eller over-flate i en ekvimolar mengde (med hensyn til det ønskede antall grupper egnet for omsetning med den reaktive gruppe), eller i et molart overskudd. For eksempel kan det polymere reagenset tilsettes til det aktive middel som er målet i et molart forhold på ca. 1:1 (polymere reagens:aktivt middel), 1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1 eller 10:1. Konjugeringsreaksjonen får forløpe inntil hovedsakelig ingen ytterligere konjugering skjer, noe som generelt kan bestemmes ved overvåkning av forløpet av reaksjonen over tid. Forløpet av reaksjonen kan overvåkes ved å ta ut alikvoter fra reaksjonsblandingen på forskjellige tidspunkter og analysere reaksjonsblandingen ved hjelp av SDS-PAGE- eller MALDI-TOF-massespektrometri, eller en hvilken som helst annen egnet analysemetode. Så snart et platå er opp-

nådd med hensyn til mengden av konjugat dannet eller mengden av gjenværende ukonjugert polymer, er reaksjonen antatt å være fullført. Typisk tar konjugeringsreaksjonen hvor lang tid som helst, fra minutter til mange timer (for eksempel fra 5 minutter til 24 timer eller mer). Den resulterende produktblandingen blir fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, renset for å skille ut overskudd av reagenser, ukonjugerte reaktanter (for eksempel aktivt middel), uønskede multi-konjugerte forbindelser og fri eller uomsatt polymer. De resulterende konjugater kan deretter karakte-riseres ytterligere ved anvendelse av analysemetoder så som MALDI, kapillær elektroforese, gel-elektroforese og/eller kromatografi.

Med hensyn til polymer-aktivt middel-konjugater, kan konjugatene renses for å oppnå/isolere forskjellige konjugerte forbindelser. Alternativt, og mer foretrukket for polymerer med lavere molekylvekt (for eksempel mindre enn ca. 20 kiloDalton, mer foretrukket mindre enn ca. 10 kiloDalton), kan produktblandingen renses for å oppnå distribusjonen av vann-oppløselig polymer-segmenter pr. aktivt middel. For eksempel kan produktblandingen renses for å oppnå et gjennomsnitt på hva som helst fra én til fem PEG'er pr. aktivt middel (for eksempel polypeptid). Strategien for rensning av den endelige konjugatreaksjonsblandingen vil avhenge av flere faktorer, omfattende, for eksempel, molekylvekten til polymeren anvendt, det spesielle aktive middel, det ønskede doseringsregime og rest-aktiviteten og in vivo-egenskapene til det enkelte konjugat(er).

Om ønsket kan konjugater som har forskjellig molekylvekt isoleres ved anvendelse av gelfiltreringskromatografi. Det vil si at gelfiltreringskromatografi blir anvendt for å fraksjonere forskjellig antallsbenevnt polymer-til-aktivt middel-forhold (for eksempel 1-mer, 2-mer, 3-mer og så videre, hvor "1-mer" indikerer 1 polymer til aktivt middel, "2-mer" indikerer to polymerer til aktivt middel og så videre) på basis av deres forskjellige molekylvekter (hvor forskjellen i det vesentlige tilsvarer den gjennomsnittlige molekylvekten til vann-oppløselig polymer-segmentene). For eksempel i et eksempel på en reaksjon hvor et 100 kDa protein blir tilfeldig konjugert til et polymert reagens som har en molekylvekt på ca. 20 kDa, vil den resulterende reaksjonsblandingen sannsynligvis inneholde umodifisert protein (MW 100 kDa), mono-PEGylert protein (MW 120 kDa), di-PEGylert protein (MW 140 kDa) og så videre. Mens denne tilnærmingsmåten kan anvendes for å separere PEG og andre polymer-konjugater som har forskjellig molekylvekt, er denne tilnær mingsmåten generelt ineffektiv for separering av posisjonelle isomerer som har forskjellige polymer-bindingsseter i proteinet. For eksempel kan gelfiltreringskromatografi anvendes for å skille fra hverandre blandinger av PEG 1-merer, 2-merer, 3-merer og så videre, selv om hver av de gjenvundne PEG-mer-preparatene kan inneholde PEG'er bundet til forskjellige reaktive aminogrupper (for eksempel lysin-rester) i det aktive midlet.

Gelfiltreringskolonner egnet for å utføre denne type av separering, omfatter Superdex™- og Sephadex™-kolonner tilgjengelig fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Valg av en spesiell kolonne vil avhenge av det ønskede frak-sjoneringsområde ønsket. Eluering blir generelt utført ved anvendelse av en egnet buffer, så som fosfat, acetat eller lignende. De oppsamlede fraksjoner kan analyseres ved flere forskjellig metoder, for eksempel (i) optisk densitet (OD) ved 280 nm med tanke på proteininnhold, (ii) bovint serumalbumin- (BSA) protein analyse, (iii) jodtesting med tanke på PEG-innhold (Sims et al. (1980), Anal. Bio-chem, 107:60-63) og (iv) natrium-dodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS PAGE), fulgt av merking med bariumjodid.

Separering av posisjonelle isomerer blir utført ved reversert fase-kromatografi, ved anvendelse av en reversert fase-høy-ytelses-væskekromatografi- (RP-HPLC) C18 kolonne (Amersham Biosciences eller Vydac), eller ved ionebytte-kromatografi ved anvendelse av en ionebytter-kolonne, for eksempel en Sepharo-se™ ionebytter-kolonne tilgjengelig fra Amersham Biosciences. Hver tilnærmingsmåte kan anvendes for å separere polymer-aktivt middel-isomerer som har samme molekylvekt (posisjonelle isomerer).

Med hensyn til faktor IX-gruppen, omfatter faktor IX-gruppen anvendelig for foreliggende oppfinnelse et hvilket som helst protein som har samme aktivitet (selv om det ikke nødvendigvis er samme grad av aktivitet) som nativ, human faktor IX.

Som tidligere angitt, skal betegnelsen "faktor IX-gruppe" omfatte faktor IX-gruppen før konjugering så vel som faktor IX-gruppen etter binding til en vann-oppløselig polymer. Det forstås, imidlertid, at når faktor IX-gruppen er bundet til en ikke-peptidisk, vann-oppløselig polymer, er faktor IX-gruppen noe endret på grunn av tilstedeværelse av én eller flere kovalente bindinger forbundet med binding til polymeren (eller rom-gruppe som er bundet til polymeren ). Ofte blir denne noe endrede formen av faktor IX-gruppen bundet til et annet molekyl referert til som en "rest" av faktor IX-gruppen.

Faktor IX-gruppen kan avledes ved enten ikke-rekombinante metoder eller ved rekombinante metoder, og oppfinnelsen er ikke begrenset i denne henseende. I tillegg kan faktor IX-gruppen avledes fra human kilder eller fra dyrekilder.

Faktor IX-gruppen kan avledes ikke-rekombinant. For eksempel kan faktor IX-gruppen oppnås fra kilder som stammer far blod. Spesielt kan faktor IX fraksjoneres fra humant plasma ved anvendelse av utfellings- og sentrifugeringsteknikker kjent for fagfolk på området. Se for eksempel Wickerhauser (1976), Transfusjon 16(4):345-350, og Slichter et al. (1976), Transfusjon 16(6):616-626. Faktor IX kan også isoleres fra humane granulocytter. Se Szmitkoski et al. (1977), Haematologia (Budap.) 11 (1-2):177-187.

Faktor IX-gruppen kan avledes ved rekombinante metoder. For eksempel blir cDNA'et som koder for nativ faktor IX, som er en faktor IX-gruppe, isolert,karakterisertog klonet inn i ekspresjonsvektorer. Se for eksempel Choo et al.

(1982), "Molecular Cloning of the Gene for Human Anti-hemophilic Factor IX," Nature, bind 299: 178-180, og Kurachi et al. (1982), "Isolation and Characteriza-tion of a cDNA Coding for Human Factor IX," Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., bind 79: 6461-65.

Så snart den er uttrykt, er nativ faktor IX et enkelt-kjedet glykoprotein på ca. 55.000 Dalton. Det kan strukturelt anses å ha fire domener: det Gla- eller gamma-karboksyglutamat-rike domene; de EGF-lignende områder; aktiveringspeptidet; og det aktive sete.

Med hensyn til faktor IX-gruppene, kan biologisk aktive fragmenter, dele-sjonsvarianter, substitusjonsvarianter eller tilsetningsvarianter av hvilke som helst av de foregående som opprettholder i det minste noen grad av den ønskede faktor IX-aktivitet, også anvendes.

Det aktive middel kan fordelaktig modifiseres til å omfatte én eller flere aminosyrerester, så som for eksempel lysin, cystein og/eller arginin, for å gi lettere binding av polymeren til et atom i sidekjeden til aminosyren. Teknikker for tilsetning av aminosyrerester er velkjent for fagfolk på området. Det refereres til J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactios Mechanisms and Structure, 4. utg.

(New York: Wiley-lnterscience, 1992).

Det aktive midlet kan oppnås fra kilder som stammer fra blod. For eksempel kan faktor VIII fraksjoneres fra humant plasma ved anvendelse av utfellings-og sentrifugeringsteknikker kjent for fagfolk på området. Se for eksempel Wickerhauser (1976), Transfusjon 16(4):345-350, og Slichter et al. (1976), Transfusjon 16(6):616-626. Faktor VIII kan også isoleres fra humane granulocytter. Se Szmitkoski et al. (1977), Haematologia (Budap.) 11(1-2):177-187.

I tillegg kan det aktive middel også oppnås ved rekombinante metoder. Kort fortalt innebærer rekombinante metoder konstruering av nukleinsyren som

koder for det ønskede polypeptid eller fragment, kloning av nukleinsyren i en eks-presjonsvektor, transformering av en vertscelle (for eksempel bakterier, gjær eller en pattedyrcelle, så som Chinese hamster-eggstokkcelle eller baby hamster-nyre-celle), og ekspresjon av nukleinsyren for å produsere det ønskede polypeptid eller fragment. Metoder for å produsere og uttrykke rekombinante polypeptider in vitro og i prokaryote og eukaryote vertsceller, er kjent for fagfolk på området. Se for eksempel US-patent nr. 4.868.122.

Eksemplene ovenfor på biologisk aktive midler er ment, når det er mulig, å omfatte analoger, agonister, antagonister, hemmere, isomerer og farmasøytisk akseptable saltformer derav. Når det refereres til peptider og proteiner, skal oppfinnelsen omfatte syntetiske, rekombinante, native, glykosylerte og ikke-glykosylerte former, så vel som biologisk aktive fragmenter derav. I tillegg skal betegnelsen "aktivt middel" omfatte det aktive middel før konjugering, så vel som "resten" av det aktive middel etter konjugering.

For en hvilken som helst gitt gruppe er det mulig å bestemme hvorvidt denne gruppen har faktor IX-aktivitet. For eksempel har mange dyrelinjer med hensikt blitt avlet med den genetiske mutasjonen for hemofili, slik at et dyr produsert fra en slik linje har meget lave og utilstrekkelige nivåer av faktor IX. Slike linjer er tilgjengelig fra en rekke kilder så som, uten begrensning, Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, NY, og Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, NC. Begge disse kildene leverer for eksempel hunder som lider av hunde-hemofili B. For å teste faktor IX-aktiviteten til en hvilken som helst gitt, aktuell gruppe, blir gruppen injisert i det syke dyret, et lite kutt gjort og blødningstid sammenlignet med et behandlet sykt dyr som kontroll. En annen metode som er anvendelig for å bestemme faktor IX-aktivitet, er å bestemme kofaktor- og prokoagulerende aktivitet. Se for eksempel Mertens et al. (1993), Brit. J. Haematol. 85:133-42. Andre metoder kjent for fagfolk på området kan også anvendes for å bestemme hvorvidt en gitt gruppe har faktor IX-aktivitet. Slike metoder er anvendelige for å bestemme faktor IX-aktiviteten til både en foreslått faktor IX-gruppe så vel som det tilsvarende polymer-og-faktor IX-gruppe-konjugat.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også farmasøytiske preparater omfattende et konjugat som angitt her, i kombinasjon med et farmasøytisk tilsetningsmiddel. Generelt vil konjugatet selv være i en faststoff-form (for eksempel et pre-sipitat) som kan kombineres med et egnet farmasøytisk tilsetningsmiddel, som kan være i enten fast eller flytende form.

Eksempler på tilsetningsmidler omfatter, uten begrensning, dem valgt fra gruppen bestående av karbohydrater, uorganiske salter, antimikrobielle midler, antioksidanter, overflateaktive midler, buffere, syrer, baser og kombinasjoner derav.

Et karbohydrat, så som et sukker, et derivatisert sukker, så som en alditol, aldonsyre, et forestret sukker og/eller en sukkerpolymer, kan være til stede som tilsetningsmiddel. Spesifikke karbohydrat-tilsetningsmidler omfatter for eksempel monosakkarider, så som fruktose, maltose, galaktose, glukose, D-mannose, sor-bose og lignende; disakkarider, så som laktose, sukrose, trehalose, cellobiose og lignende; polysakkarider, så som raffinose, melezitose, maltodekstriner, dekstra-ner, stivelser og lignende; og alditoler, så som mannitol, xylitol, maltitol, lactitol, xylitol, sorbitol (glucitol), pyranosyl-sorbitol, myoinositol og lignende.

Tilsetningsmidlet kan også omfatte et uorganisk salt eller buffer, så som sitronsyre, natriumklorid, kaliumklorid, natriumsulfat, kaliumnitrat, monobasisk natriumfosfat, dibasisk natriumfosfat og kombinasjoner derav.

Fremstillingen kan også omfatte et antimikrobielt middel for forhindring eller beskyttelse mot mikrobiell vekst. Ikke-begrensende eksempler på antimikrobielle midler egnet for foreliggende oppfinnelse, omfatter benzalkoniumklorid, benzeto-niumklorid, benzylalkohol, cetylpyridiniumklorid, klorbutanol, fenol, fenyletylalkohol, fenylkvikksølv(ll)nitrat, timersol og kombinasjoner derav.

En antioksidant kan også være til stede ved fremstillingen. Antioksidanter blir anvendt for å forhindre oksidasjon, og derved forhindre forringelse av konjuga tet eller andre komponenter ved fremstillingen. Egnede antioksidanter for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel ascorbylpalmitat, butylert hydroksyanisol, butylert hydroksytoluen, hypofosforsyrling, monotioglycerol, pro-pylgallat, natriumbisulfitt, natriumformaldehydsulfoksylat, natrium-metabisulfitt og kombinasjoner derav.

Et overflateaktivt middel kan være til stede som tilsetningsmiddel. Eksempler på overflateaktive midler omfatter: polysorbater, så som "Tween 20" og "Tween 80," og "pluronics", så som F68 og F88 (som begge er tilgjengelig fra BASF, Mount Olive, New Jersey); sorbitenestere; lipider, så som fosfolipider, så som lecitin og andre fosfatidylkoliner, fosfatidyletanolaminer (selv om de fortrinnsvis ikke er i liposomal form), fettsyrer og fettsyreestere; steroider, så som kolesterol; og chelaterende midler, så som EDTA, sink og andre slike egnede kationer.

Syrer eller baser kan være til stede som tilsetningsmiddel ved fremstillingen. Ikke-begrensende eksempler på syrer som kan anvendes, omfatter syrene valgt fra gruppen bestående av saltsyre, eddiksyre, fosforsyre, sitronsyre, eplesy-re, melkesyre, maursyre, trikloreddiksyre, salpetersyre, perklorsyre, fosforsyre, svovelsyre, fumarsyre og kombinasjoner derav. Eksempler på egnede baser omfatter, uten begrensning, baser valgt fra gruppen bestående av natriumhydroksid, natriumacetat, ammoniumhydroksid, kaliumhydroksid, ammoniumacetat, ka-liumacetat, natriumfosfat, kaliumfosfat, natriumcitrat, natriumformiat, natriumsulfat, kaliumsulfat, kaliumfumerat og kombinasjoner derav.

De farmasøytiske preparatene omfatter alle typer av formuleringer, og spesielt dem som er egnet for injeksjon, for eksempel pulvere som kan rekonstitueres, så vel som suspensjoner og løsninger. Mengden av konjugatet (dvs. konjugatet dannet mellom det aktive midlet og polymeren beskrevet her) i preparatet vil variere, avhengig av flere faktorer, men vil optimalt være en terapeutisk effektiv dose når preparatet blir lagret i en enhetsdosebeholder (for eksempel et medisinglass).

I tillegg kan det farmasøytiske preparatet være fylt i en sprøyte. En terapeutisk effektiv dose kan bestemmes eksperimentelt, ved gjentatt administrering av øken-de mengder av konjugatet for å bestemme hvilken mengde som gir et klinisk ønsket resultat.

Mengden av et eventuelt individuelt tilsetningsmiddel i preparatet vil variere, avhengig av aktiviteten til tilsetningsmidlet og spesielle ønsker for preparatet. Typisk blir den optimale mengde av et eventuelt individuelt tilsetningsmiddel bestemt gjennom rutinemessig eksperimentering, dvs. ved å fremstille preparater inneholdende varierende mengder av tilsetningsmiddel (i området fra lav til høy), undersøkelse av stabiliteten og andre parametere, og deretter bestemmelse av det område der optimal ytelse blir oppnådd uten betydelige ugunstige effekter.

Generelt vil imidlertid tilsetningsmidlet være til stede i preparatet i en mengde på ca. 1% til ca. 99 vekt%, fortrinnsvis fra ca. 5%-98 vekt%, mer foretrukket fra ca. 15-95 vekt%, av tilsetningsmidlet, med konsentrasjoner lavere enn 30 vekt% mest foretrukket.

Disse ovennevnte farmasøytiske tilsetningsmidler er, sammen med andre tilsetningsmidler, beskrevet i "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19. utg., Williams & Williams, (1995), "Physician's Desk Reference", 52. utg., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), og Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. utgave, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.

De farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse blir typisk, selv om ikke nødvendigvis, administrert via injeksjon, og er derfor generelt flytende løsninger eller suspensjoner umiddelbart før administrering. Det farmasøytiske preparatet kan også ha en annen form, så som siruper, kremer, salver, tabletter, pulvere og lignende. Andre administreringsmetoder er også omfattet, så som pulmonalt, rektalt, transdermalt, transmukosalt, oralt, intratekalt, subkutant, intra-arterielt og så videre.

Som tidligere beskrevet kan konjugatene administreres parenteralt ved in-travenøs injeksjon eller, mindre foretrukket, ved intramuskulær eller subkutan injeksjon. Egnede formuleringstyper for parenteral administrering omfatter løs-ninger som er klar for injeksjon, tørre pulvere for kombinasjon med et løsnings-middel før anvendelse, suspensjoner klar for injeksjon, tørre, uoppløselige preparater for kombinasjon med en konstituent før anvendelse, og emulsjoner og flytende konsentrater for fortynning før administrering, blant annet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en metode for administrering av et konjugat som angitt her, til en pasient som har en lidelse som er mottagelig for behandling med konjugat. Metoden omfatter administrering, generelt via injeksjon, av en terapeutisk effektiv mengde av konjugatet (fortrinnsvis til stede som del av et far- masøytisk preparat). Administreringsmetoden kan anvendes for å behandle en hvilken som helst lidelse som kan være avhjelpes eller forhindres ved administrering av det spesielle konjugatet. Fagfolk på området vet hvilke lidelser et spesifikt konjugat effektivt kan behandle. Den aktuelle dose som skal administreres vil variere, avhenge av alderen, vekten og den generelle tilstanden til individet, så vel som alvorlighetsgraden av lidelsen som behandles, bedømmelsen til en yrkesut-øver i helsevesenet og konjugatet som blir administrert. Terapeutisk effektive mengder er kjent for fagfolk på området, og/eller er beskrevet i de relevante refe-ransetekster og litteratur. Generelt vil en terapeutisk effektiv mengde være i området fra ca. 0,001 mg til 100 mg, fortrinnsvis i doser fra 0,01 mg/dag til 75 mg/dag, og mer foretrukket i doser fra 0,10 mg/dag til 50 mg/dag.

Enhetsdosen av et hvilket som helst gitt konjugat (igjen, fortrinnsvis til stede som del av et farmasøytisk preparat) kan administreres i henhold til en rekke doseringsplaner, avhengig av klinikerens bedømmelse, pasientens behov og så videre. Den spesifikke doseringsplan vil være kjent for fagfolk på området, eller kan bestemmes eksperimentelt ved anvendelse av rutinemessige metoder. Eksempler på doseringsplaner omfatter, uten begrensning, administrering fem ganger pr. dag, fire ganger pr. dag, tre ganger pr. dag, to ganger pr. dag, én gang pr. dag, tre ganger ukentlig, to ganger ukentlig, én gang ukentlig, to ganger pr. måned, én gang pr. måned, og en hvilken som helst kombinasjon derav. Så snart det kliniske resultatet er oppnådd, blir dosering av preparatet stanset.

EKSPERIMENTELL DEL.

Utøvelse av oppfinnelsen vil, hvis ikke annet er angitt, gjøre anvendelse av konvensjonelle teknikker innen organisk syntese og lignende, som forstås av en fagmann på området og er forklart i litteraturen. I de følgende eksempler er det gjort anstrengelser for å sikre nøyaktighet med hensyn til tall anvendt (for eksempel mengder, temperaturer og så videre), men noen eksperimentelle feil og avvik bør det tas høyde for. Hvis ikke annet er angitt er temperaturer angitt som grader Celsius, og trykk er ved eller nær atmosfærisk trykk ved havnivå. Alle reagenser ble anskaffet kommersielt hvis ikke annet er angitt. All frembragt NMR ble oppnådd med et 300 eller 400 MHz NMR-spektrometer fremstilt av Bruker (Billerica, MA). All bearbeiding blir utført i glass eller glassforede kar, og kontakt med me-tallholdig kar eller utstyr blir unngått.

Følgende forkortelser vil bli anvendt:

HPLC høytrykks-væskekromatografi

SDS-PAGE natrium-dodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektroforese

Faktor IX anvendt i følgende eksempler blir isolert fra det kommersielt til-gjengelige preparatet markedsført under BENEFIX<®->merket av rekombinant faktor IX (Wyeth, Madison NJ). Den isolerte proteinløsningen blir lagret ved redusert temperatur.

Polymere reagenser ble dannet i overensstemmelse med de basiske til-nærmingsmåtene beskrevet i US-patentsøknad, publ. nr. 2006/0293499, og hadde følgende strukturer:

Eksempel 1

Fremstilling av faktor IX- konjugat

( 20. 000 Da total vektmidlere polvmer- molekvlvekt),

(" kort frigjøring").

Et medisinglass med Benefix<®>faktor IX (5,5 mg faktor IX, Wyeth) ble tatt fra lagring ved 4°C og fikk oppvarmes til romtemperatur. Det lyofiliserte pulveret ble resuspendert som beskrevet i pakningsvedlegget (10 ml sterilt vann pr. medisinglass). Mens faktor IX-løsningen ble resolubilisert på en vugge- ("rocker") plate, ble polymert reagens A tatt fra lagring ved -20°C og oppvarmet til romtemperatur. Den resuspenderte Benefix<®->væsken ble buffer-utbyttet ("buffer exchanged") i 1 x PBS + 1% sukrose + 0,005 % Tween 20, pH 7,3, ved anvendelse av en 16/10 HiPrep DeSalt-kolonne fra GE for å fjerne glycinet i formuleringen. Proteinfraksjonene ble oppsamlet og samlet i 50 ml koniske rør for polymert reagens-konjugeringsreaksjonen. Et 9,34 overskudd av molart forhold (i forhold til faktor IX) av polymert reagens A, som har en total vektmidlere polymer-molekylvekt (dvs. summen av den vektmidlere molekylvekten av hver polymer-"arm") på ca. 40.000 Da, som ble frisk oppløst i 2 mM HCI, ble langsomt pipettert i faktor IX-løsningen. En rørestav ble anvendt i reaksjonen og løsningen omrørt ved lav hastighet i den tre timer lange konjugeringsprosessen. Reaksjonen ble deretter stanset ved tilsetning av 1M glycin i vann, 1:100, som fikk riste forsiktig på et risteapparat ved romtemperatur i 30 minutter til. Det antas at tilsetning av glycin bør skje innen 24 timer. Løsningen ble fortynnet med en 3:1 (volum) tilsetning av 20 15 mM Bis-tris pH 7,5 + 1% sukrose + 10 mM Histidin + 0,005 % Tween 20. Løsningen ble godt blandet ved forsiktig virvelrøring og det ubundne polymere reagens A i løsningen deretter fjernet ved ionebytter-kromatografi. Konjugert faktor IX ble eluert med en NaCI-gradient. Et faktor IX-konjugat med "kort frigjøring" ble derved fremstilt.

Den basiske prosedyren ble gjentatt, bortsett fra at polymert reagens A, som har en total vektmidlere polymer-molekylvekt på ca. 40.000 Da, og 640,64 mg av det polymere reagenset, ble anvendt.

Eksempel 2

Fremstilling av faktor IX- konjugat

( 20. 000 Da total vektmidlere polymer- molekylvekt),

(" lang frigjøring").

Et medisinglass av Benefix<®>faktor IX (5,5 mg faktor IX, Wyeth) ble tatt fra lagring ved 4°C og fikk oppvarmes til romtemperatur. Det lyofiliserte pulveret ble resuspendert som beskrevet i pakningsvedlegget (10 ml sterilt vann pr. medisinglass). Mens faktor IX-løsningen ble resolubilisert på en vugge-plate, ble det polymere reagens B tatt fra lagring ved -20°C og oppvarmet til romtemperatur. Den resuspenderte Benefix<®->væsken ble buffer-vekslet i 1 x PBS + 1 % sukrose + 0,005 % Tween 20, pH 7,3, ved anvendelse av en 16/10 HiPrep DeSalt-kolonne fra GE, for å fjerne glycinet i formuleringen. Proteinfraksjonene ble oppsamlet og samlet i 50 ml koniske rør for polymert reagens-konjugeringreaksjonen. Et 9,34 overskudd av molart forhold (i forhold til faktor IX) av polymert reagens B som har en total vektmidlere polymer-molekylvekt (dvs. summen av den vektmidlere molekylvekten av hver polymer-"arm") på ca. 40.000 Da, som ble frisk oppløst i 2 mM HCI, ble langsomt pipettert i faktor IX-løsningen. En rørestav ble anvendt i reaksjonen og løsningen omrørt ved lav hastighet i den tre timer lange konjugeringsprosessen. Reaksjonen ble deretter stanset ved tilsetning av 1 M glycin i vann, 1:100, som fikk riste forsiktig på et risteapparat ved romtemperatur i 30 minutter til. Det antas at tilsetning av glycinet bør skje innen 24 timer. Løsningen ble fortynnet med en 3:1 (volum) tilsetning av 20 15 mM Bis-tris pH 7,5 + 1% sukrose + 10 mM Histidin + 0,005 % Tween 20. Løsningen ble godt blandet ved forsiktig virvelrøring og det ubundne polymere reagens B i løsningen deretter fjernet ved ionebytter-kromatografi. Konjugert faktor IX ble eluert ved en NaCI-gradient. Et faktor IX-konjugat med "lang frigjøring" ble derved fremstilt.

Den basiske prosedyren ble gjentatt, bortsett fra at polymert reagens B, som har en total vektmidlere polymer-molekylvekt på ca. 40.000 Da, og 400,4 mg det polymere reagenset, ble anvendt.

Eksempel 3

Farmakokinetikk.

Farmakokinetikken til konjugater fremstilt i henhold til eksempler 1 og 2, hver har en total vektmidlere polymer-molekylvekt på 20.000 Da (sammen med faktor IX som en kontroll), ble bestemt ved anvendelse av konvensjonelle teknikker. Kort fortalt ble SD-rotter av hankjønn anvendt (180-220 gram; 6-7 uker gam-le) og gitt én 100 ul iv-injeksjon. Fire dyr pr. gruppe ble anvendt og blodplasma tatt ut på forskjellige tidspunkter (for eksempel 0, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72 timer) etter injeksjon.

Resultatene er angitt i tabell 1 nedenfor, hvor V er fordelingsvolum, CL er total plasmautskilling, AUC er område under plasma-konsentrasjon-tid-kurven, og Ti/2beta er halveringstiden i den avsluttende elimineringsfasen. En konsentrasjon-tid-kurve kurve ble også satt opp, og er vist på figur 1.

Eksempel 4

Koaguleringsaktivitet.

Koaguleringsaktiviteten in vitro for konjugater fremstilt i henhold til eksempler 1 og 2, hver har en total vektmidlere polymer-molekylvekt på 20.000 Da (sammen med faktor IX som kontroll), ble bestemt ved anvendelse av konvensjonelle teknikker. Resultater er vist på figur 2.

Claims (15)

1. Forbindelse som har følgende struktur:

hvor: POLY<1>er en første vann-oppløselig polymer; POLY<2>er en andre vann-oppløselig polymer; X<1>er en første rom-gruppe; X<2>er en andre rom-gruppe; Ha er et ioniserbart hydrogenatom; R<1>er H eller en organisk rest; R<2>er H eller en organisk rest; (a) er enten null eller én; (b) er enten null eller én; R<e1>, når til stede, er en første elektron-endringsgruppe; R<e2>, når til stede, er en andre elektron-endringsgruppe;Y<1>er O eller S; Y<2>er O eller s; og (F9) er en rest av en amin-inneholdende faktor IX-gruppe.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvor den amin-inneholdende faktor IX-gruppe er rekombinant faktor IX.

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvor rekombinant faktor IX er human rekombinant faktor IX.

4. Forbindelse ifølge krav 1, hvor den første vann-oppløselige polymer er et poly(alkylenoksid) og den andre vann-oppløselige polymer er et poly(alkylen-oksid).

5. Forbindelse ifølge krav 1, hvor den første vann-oppløselige polymer har en vektmidlere molekylvekt på mellom 10.000 Dalton og 85.000 Dalton, og den andre vann-oppløselige polymer har en vektmidlere molekylvekt på mellom 10.000 Dalton og 85.000 Dalton.

6. Forbindelse ifølge krav 1, som har en struktur valgt fra gruppen bestående av:

hvor, for hver struktur og i hvert tilfelle, (n), uavhengig, er et helt tall fra 4 til 1500, og (F9) er en rest av en amin-inneholdende faktor IX-gruppe.

7. Forbindelse ifølge krav 1, som har følgende struktur:

hvor (F9) er en rest av en amin-inneholdende faktor IX-gruppe og (n), i hvert tilfelle, uavhengig, er fra 4 til 1500.

8. Forbindelse ifølge krav 1, som har følgende struktur:

hvor (F9) er en rest av en amin-inneholdende faktor IX-gruppe og (n), i hvert tilfelle, uavhengig, er fra 4 til 1500.

9. Forbindelse ifølge ett av kravene 7 og 8, hvor faktor IX-gruppen er human rekombinant faktor IX.

10. Metode som omfatter å kontakte et polymert reagens med en amin-inneholdende faktor IX-gruppe under betingelser egnet for å danne en kovalent binding mellom det polymere reagenset og det biologisk aktive middel, hvor det polymere reagenset har følgende struktur:

hvor: POLY<1>er en første vann-oppløselig polymer; POLY<2>er en andre vann-oppløselig polymer; X<1>er en første rom-gruppe; X<2>er en andre rom-gruppe; Ha er et ioniserbart hydrogenatom; R<1>er H eller en organisk rest; R<2>er H eller en organisk rest; (a) er enten null eller én; (b) er enten null eller én; R<e1>, når til stede, er en første elektron-endringsgruppe; R<e2>, når til stede, er en andre elektron-endringsgruppe; og (FG) er en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med en aminogruppe i et aktivt middel og danne en frigjørbar binding.

11. Metode ifølge krav 10, hvor den frigjørbare bindingen er en karbamatbinding.

12. Metode ifølge krav 10, hvor det polymere reagenset har en struktur valgt fra gruppen bestående av:

hvor, for hver struktur og i hvert tilfelle, (n), uavhengig, er et helt tall fra 4 til 1500.

13. Metode ifølge krav 12, hvor faktor IX-gruppen er human rekombinant faktor IX.

14. Preparat som omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, og et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel.

15. Preparat ifølge krav 14 for anvendelse i terapi.