NO342192B1 - Sensor for påvisning av karbohydrater - Google Patents

Abstract

En sensor for påvisning eller måling av karbohydratanalytt (så som glukose) i væske innbefatter bestanddeler av et konkurransebindingsassay hvis avlesning er et påvisbart eller målbart optisk signal (så som et FRET-assay) innesluttet i et materiale som tillater diffusjon av analytt, men ikke av assaybestanddelene, idet assaybestanddelene innbefatter: et dyrelektin; og en analyttanalog som har evnen til å konkurrere med analytten om binding til lektinet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en sensor og en fremgangsmåte for fremstilling av sensoren.

Sensoren kan brukes ved måling eller overvåking av karbohydrater i væske, for eksempel glukose i kroppsvæske, ved bruk av optiske teknikker.

Sensoren er spesielt godt egnet for bruk i situasjoner hvor glukosenivået må overvåkes nøye og/eller hvor glukosemålinger må utføres gjentatte ganger, så som i styring av diabetes.

Ved styring av diabetes, er en regelmessig måling av glukose i blodet vesentlig for å sikre riktig insulindosering. Videre er det blitt demonstrert at i langtidspleien av diabetespasienten, kan en bedre regulering av blodglukosenivået sinke, hvis ikke forhindre, inntreden av retinopati, blodomløpsproblemer og andre degenerative sykdommer som ofte forbindes med diabetes. Dermed finnes det et behov for pålitelig og nøyaktig egenovervåking av blodglukosenivået hos diabetespasienter.

Det er ønskelig å måle blodglukosen over konsentrasjonsområdene som kan forekomme i en diabetespasient, dvs. fra 0 til 35 mM eller enda høyere.

For tiden overvåkes blodglukosen hos diabetespasienter ved bruk av handelstilgjengelige kolorimetriske teststrimler eller elektrokjemiske biosensorer (f.eks. enzymelektroder), som begge krever en regelmessig anvendelse av et instrument av lansetttype for å trekke ut en passende mengde blod hver gang en måling utføres. Gjennomsnittlig vil hovedparten av diabetespasientene bruke slike instrumenter to ganger daglig for å utføre en måling av blodglukosen. Imidlertid har US National Institute of Health anbefalt at blodglukosetestingen utføres minst fire ganger daglig, en anbefaling som er blitt støttet av American Diabetes Association. Denne økte hyppighet av blodglukosetestingen utgjør en betraktelig belastning for diabetespasienten, både økonomisk og hva angår smerte og ubehag, spesielt i langtidsdiabetikeren som regelmessig må benytte seg av en lansett for å trekke ut blod fra fingertuppene. Dermed finnes det et klart behov for et bedre langtids glukoseovervåkingssystem som ikke innbefatter å trekke ut blod fra pasienten.

Det har funnets mange forslag til glukosemålingsteknikker som ikke krever at det trekkes ut blod fra pasienten.

Man har observert at konsentrasjonen av analytter i subkutan væske korrelerer med konsentrasjonen av disse analytter i blodet, og derfor er det flere ganger blitt rapportert bruk av glukoseovervåkingsanordninger som er plassert i en subkutan plassering. Bruk av konkurransebindingsassayer for glukose som kan fjernavspørres, er spesielt interessante.

En fremgangsmåte for å teste en konkurrerende binding er å bruke et nærhetsbasert signalgenererende/modulerende enhetspar (diskutert i US 6232120), som typisk er et energioverførings-donor/mottaker-par (innbefattende en energidonorenhet og en energimottakerenhet). Energidonorenheten er fotoluminescerende (vanligvis fluorescerende).

I slike metoder bringes et energioverførings-donor/mottaker-par i berøring med prøven (så som subkutan væske) som skal analyseres. Prøven belyses deretter og den dannede emisjon påvises. Enten energidonorenheten eller energimottakerenheten av donor/mottaker-paret er bundet til en reseptorbærer, mens den andre del av donor/mottaker-paret (bundet til en ligandbærer) og enhver analytt som foreligger, konkurrerer om bindingsseter på reseptorbæreren. Energioverføring finner sted mellom donorene og mottakerne når de bringes sammen, hvilket resulterer i en påvisbar endring av livstiden (reduksjon) av fluorescensen av energidonorenheten. Dessuten slukkes en andel av det fluorescerende signal som utstråles av energidonorenheten.

Endringen av livstiden reduseres eller elimineres helt av analyttens kompetitive binding. Ved å måle den tilsynelatende luminescenslivstid, for eksempel ved fasemodulasjonsfluorometri eller tidsoppløst fluorometri (se Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, 1983, kapittel 3), kan man bestemme mengden analytt i prøven.

Det bør bemerkes at effekten av energioverføringen avhenger av kvantumutbyttet av donoren, overlappingen av emisjonsspektret av donoren og absorpsjonsspektret av mottakeren, og den relative avstand og orientering mellom donoren og mottakeren.

I EP 0561 653 beskrives en fremgangsmåte for å avspørre en reseptor og en ligand slik som det ble beskrevet ovenfor.

Et eksempel på donor/mottaker-energioverføring er fluorescensresonansenergioverføring (Förster-resonansenergioverføring, FRET), som er en ikke-strålende over føring av eksitasjonstilstandsenergien fra den i utgangspunktet eksiterte donor (D) til en mottaker (A). Donoren emitterer typisk ved kortere bølgelengder, og dens emisjonsspektrum overlapper absorpsjonsspektret av mottakeren. Energioverføring finner sted uten opptreden av et foton og er resultatet av langdistanse dipol/dipol-vekselvirkninger mellom donoren og mottakeren.

Begrepet resonansenergioverføring (RET) er riktigere ettersom FRET-prosessen ikke innbefatter opptreden av et foton. Imidlertid brukes FRET og RET ofte om hverandre.

Et viktig kjennetegn av FRET er at det finner sted over avstander som er sammenlignbare med størrelsen av biologiske makromolekyler. Avstanden hvor FRET er 50% effektiv, benevnt Förster-avstanden, er typisk i området fra 20-60 Å. Förster-avstander varierende fra 20 til 90 Å er passende for konkurransebindingsstudier.

Merking av en analyttbindende enhet med en donor (D) og en analyttanalog med en mottaker (A), eller omvendt, ville danne et assay som har evnen til å generere en målbar respons basert på avstanden mellom donoren og mottakeren. Dermed fører en binding av D: "analyttbindende enhet" til A: "analyttanalog" til en nedsatt donorintensitet eller -livstid. Analytten i prøven konkurrerer om de analyttbindende enheter på D: "analyttbindende enhet" og frigir D: "analyttbindende enhet" fra mottakeren (A). Intensitetsnedbrytningstiden og fasevinklene av donoren forventes dermed å øke med økende glukosekonsentrasjon.

Disse prinsipper er blitt brukt i glukosepåvisning ved energioverføring.

WO 91/09312 beskriver en subkutan metode og anordning som benytter seg av et affinitetsassay basert på glukose (som innlemmer et energioverførings-donor/mottaker-par) som fjernavspørres med optiske midler. Eksempelvis WO 97/19188, WO 00/02048, WO 03/006992 og WO 02/30275 beskriver hver glukosepåvisning ved energioverføring, som produserer et optisk signal som kan fjernavleses.

En person med kunnskaper innen faget vil forstå at mottakeren kunne være et fluorofor. Ethvert fluorescerende signal som emitteres av energimottakerenheten, etter eksitasjon med en stråle av innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energimottakerenheten, er upåvirket av FRET-prosessen. Det er derfor mulig å bruke intensiteten av det fluorescerende signal som emitteres av energimottakerenheten, som et internt referansesignal, for eksempel ved kontinuerlig kalibrering av sensoren eller for å overvåke i hvilket omfang sensoren er oppbrukt og dermed angi behovet for å implantere eller injisere en fersk sensor. Når dette signal faller under et akseptabelt basisnivå, vil dette tyde på at det er nødvendig å implantere eller injisere en fersk sensor.

Energimottakerenheten kan imidlertid være et ikke-fluorescerende fargestoff. I dette tilfelle brukes en forbindelse med fluorescensslukkende evne istedenfor den spesifikke energimottakerenhet. Et eksempel på en kraftig og ikke-spesifikk fluorescensslukker gis av Tyagi et al. Nature Biotechnology (1998) 18: s.49.

Systemene som ble diskutert ovenfor, avhenger av Concanavalin A (Con A) som glukosebindende enhet. Concanavalin A er et lektin. Begrepet "lektin" innbefatter ethvert karbohydratbindende protein som ikke åpenbart er involvert i karbohydratmetabolismen og som ikke tilhører noen av hovedklassene av immunoglobuliner. Lektiner oppviser selektiv binding til karbohydrater via karbohydratgjenkjenningsdomener (CRD'er). Lektiner forekommer naturlig i både monomere og multimere former, idet sistnevnte ofte innbefatter et antall delenheter som hver bærer flere CRD'er.

Concanavalin A er ikke stabilt over lengre tidsrom under assaybetingelser. Eksperimenter utført av oppfinnerne (se eksempel 8), tyder på at Concanavalin A er stabilt ved kroppstemperatur i mindre enn 20 dager.

Dessuten er Concanavalin A toksisk og potensielt immunogent (imidlertid brukes det i glukoseassayer i små mengder som antas å være sikre i menneskets kropp).

Det er også blitt forslått at sukkerert- og linselektiner kunne brukes som glukosebindende enheter i slike systemer ("A Potentially Implantable Fluorescent Glucose Sensor Based on Molecular Recognition in Poly(ethylene glycol) Hydrogels", Ryan J. Russell et al., presentert for American Institute of Chemical Engineers). Imidlertid forventes disse lektiner å ha lignende ulemper som Con A.

US 6232 130 beskriver et assay hvor det brukes lavvalens-lektiner ("karbohydratbindende ligander"). Disse har 3 eller færre CRD'er. Assayet benytter seg av en analyttanalog ("glykokonjugat") innbefattende et karbohydrat, en markør (f.eks. en FRET-bestanddel) og et bærermolekyl. Bærermolekylet kan være et protein (f.eks. bovint serumalbumin, BSA) eller en syntetisk polymer.

US 6146 849 beskriver en familie av C-type-lektiner fra virveldyr. Det beskrives et assay som innbefatter: Ca2+ eller EDTA som analytter, en kolonne som tillater diffusjon av analytten og binding av melbiose og lektin, hvor lektinet er fra Xenopus laevis, og melbiose er analyttanalog.

Foreliggende oppfinnere har innsett at det finnes et behov for å finne karbohydratbindende enheter som har god stabilitet og som ikke har ulempene forbundet med Con A. De har undersøkt bruk av alternative karbohydratbindende enheter. De har overraskende funnet at dyrelektiner, medregnet humane lektiner, kan brukes som karbohydratbindende enheter.

I et første trekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse følgelig en sensor for påvisning eller måling av karbohydratanalytt i væske, idet sensoren innbefatter bestanddeler av et konkurransebindingsassay hvis avlesning er et påvisbart eller målbart optisk signal, innesluttet i et materiale som tillater diffusjon av karbohydratanalytt, men ikke av assaybestanddelene, idet assaybestanddelene innbefatter:

et dyrelektin, hvor dyrelektinet er et pattedyrlektin og/eller er et kollektin valgt fra mannosebindende lektin, et pulmonæroverflateprotein, konglutinin eller kollektin-43; og

en analyttanalog som har evnen til å konkurrere med karbohydratanalytt om binding til lektinet, hvor analyttanalogen innbefatter et flertall karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter.

Fortrinnsvis er karbohydratanalytten et monosakkarid. I en foretrukket utførelse er karbohydratanalytten glukose.

Fortrinnsvis er sensoren egnet for påvisning eller måling av glukose i kroppsvæske, for eksempel subkutan væske. Det er ønskelig at sensoren er egnet for bruk in vivo, og dette skal diskuteres i større detalj nedenfor.

Fortrinnsvis har analyttanalogen evnen til å konkurrere med glukose ved fysiologisk kalsiumkonsentrasjon. Typiske fysiologiske kalsiumkonsentrasjoner er i området 1,15 til 1,29 mM.

Påvisning

Egnede påvisningsteknikker innbefatter FRET, fluorescensenergioverføring, fluorescenspolarisasjon, fluorescensslukking, fosforescens, luminescensforsterkning, luminescensslukking, diffraksjon eller plasmonresonans.

Bindingsassayet som genererer det optiske signal, bør fortrinnsvis være reversibelt slik at det kan oppnås en kontinuerlig overvåking av fluktuerende nivåer av analytt. Denne reversibilitet en spesiell fordel ved bruk av et bindingsassayformat hvor bestanddelene av assayet ikke brukes opp.

Fortrinnsvis genereres det påvisbare eller målbare optiske signal ved bruk av et nærhetsbasert signalgenererende/modulerende enhetspar. Et signal genereres eller moduleres når et første medlem av paret bringes i tett nærhet med et andre medlem av paret.

Fortrinnsvis er det nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enhetspar et energidonorenhets- og energimottakerenhetspar. Energidonorenheter og energimottakerenheter benevnes også henholdsvis donor- og mottakerkromoforer. En energimottaker som ikke emitterer fluorescens, benevnes en slukkende enhet.

I dette tilfelle merkes lektinet med ett medlem av et energidonor- og energimottakerenhetspar, og analyttanalogen merkes med det andre medlem av energidonor- og energimottakerenhetsparet.

Den mest foretrukne utførelse av sensoren ifølge oppfinnelsen innlemmer et assay som genererer en optisk avlesning ved bruk av FRET-teknikken.

Når assayet skal brukes in vivo, er det ønskelig at donorer fluorescerer ved 550 til rundt 700 nm og at mottakere absorberer lys ved rundt 650 nm. Dette unngår overlapping mellom donorfluorescensen og in vivo-autofluorescens ved kortere bølgelengder.

Alexa Fluor 594™ (f.eks. som suksinimidylester) er en energidonorenhet med et egnet emisjonsspektrum for bruk in vivo. Dette fargestoff absorberer ved 594 nm og fluorescerer ved 620 nm.

HMCV-fargestoffene som beskrives i WO 05/059037, er egnede energimottakerenheter for bruk ifølge oppfinnelsen. Disse fargestoffer er stabiliserte karbeniumioner. Et eksempel er Hexa-Methoksy-Crystal Violet-suksinimidylester (HMCV-1).

Alternativt kan QSY21™ brukes som energimottakerenhet med Alexa Fluor 594™ som energidonorenhet.

Fluorescenslivstids- eller fluorescensintensitetsmålinger kan utføres. Fluorescenslivstid kan måles ved bruk av fasemodulasjonsteknikker (diskutert nedenfor).

I en foretrukket utførelse merkes lektinet med AlexaFluor 594 som energidonorenhet, analyttanalogen merkes med HMCV-1 som energimottakerenhet, og fluorescenslivstiden måles ved bruk av fasemodulasjonsteknikker.

De materialbevarende assaybestanddeler tilveiebringer fortrinnsvis tilstrekkelig rom til at energidonor- og energimottakerenhetenene kan atskilles når de ikke er bundet til hverandre, slik at energioverføringen kan opphøre.

Lektin

Fortrinnsvis tilveiebringer lektinet et stabilt signal i assayet i minst 10 dager, mer foretrukket minst 14 dager. Det er spesielt til å foretrekke at det tilveiebringes et stabilt signal når sensoren er implantert i et menneskes kropp.

Foreliggende oppfinnere har overraskende funnet at MBL var stabilt i et glukoseassay i minst 17 dager (se eksempel 8). Tidligere rapporter beskrev en biologisk halveringstid for MBL fra 4-7 dager (Kilpatrick (2002) Transfus. Med.12, 335).

Fortrinnsvis er lektinet et lektin av C-type (kalsiumavhengig).

Fortrinnsvis er dyrelektinet et virveldyrlektin, for eksempel et pattedyrlektin, mer foretrukket et humant eller humanisert lektin. Imidlertid kan det alternativt være et fuglelektin, fiskelektin eller et lektin fra et virvelløst dyr så som et insektlektin.

Med fordel er lektinet et humant lektin avledet fra menneskets kropp. Alternativt kan lektinet være et rekombinant fremstilt lektin.

Som ytterligere alternativ kan lektinet være et humanisert dyrelektin, for eksempel et humanisert bovint lektin. Dette gjelder når det finnes et tilsvarende humant lektin. Lektinet kan humaniseres på analog måte som antistoffer.

Med fordel er lektinet i multimer form. Multimere lektiner kan avledes fra et menneskes eller dyrs kropp. Alternativt kan lektinet foreligge i monomer form. Monomere lektiner kan dannes ved bruk av rekombinante metoder, eller ved å sprenge bindingen mellom delenheter i et naturlig multimert lektin avledet fra et menneskes eller dyrs kropp.

Eksempler på dette er slik som det beskrives i US 6232 130.

Fortrinnsvis har lektinet tre eller flere CRD'er. Mer foretrukket har lektinet 6 eller flere CRD'er.

Fortrinnsvis er lektinet et kollektin (kollagenlignende lektin). Dette er dyrelektiner av C-type som har kollagenlignende sekvenser (Gly-Xaa-Yaa-triplett). MBL er et kollektin av C-type, mens Concanavalin A er et lektin av C-type. Monomere kollektin-CRD'er kan fremstilles ved innvirkning av kollagenase.

Fortrinnsvis er lektinet mannosebindende lektin, konglutinin eller kollektin-43 (f.eks. bovint CL-43) (alle disse er serumkollektiner) eller et pulmonæroverflateprotein ("pulmonary surfactant protein") (lungekollektiner).

Mannosebindende lektin (også benevnt mannanbindende lektin eller mannanbindende protein, MBL, MBP), for eksempel humant MBL, har vist seg å være spesielt interessant. MBL er et kollagenlignende forsvarsmolekyl som innbefatter flere (typisk 3 til 4 (MALDI-MS), selv om fordelinger av 1 til 6 også gjerne kan forekomme (SDS-PAGE)) delenheter i en "bukett"-anordning som hver består av tre identiske polypeptider. Hver delenhet har en molekylvekt rundt 75 kDa, og kan valgfritt være kompleksert med ett eller flere MBL-assosierte serinproteaser (MASP'er). Hvert polypeptid inneholder en CRD. Dermed presenterer hver delenhet tre karbohydratbindingsseter. Trimere MBL og tetramere MBL (som er hovedformene som foreligger i humant serum, Teillet et al., Journal of Immunology, 2005, side 2870-2877) presenterer henholdsvis ni og tolv karbohydratbindingsseter.

MBL forekommer naturlig i kroppen som en del av det iboende immunsystem hvor det binder mannoseenheter som dekker overflaten av bakterier. Humant MBL er ikke tok sisk og er ikke-immunogent for mennesker. MBL fra andre arter forventes å være immunogent, men ikke toksisk for mennesker.

Humant MBL er handelstilgjengelig både i en form avledet fra menneskets kropp og i en rekombinant fremstilt form. Det brukes som erstatningsterapi ved behandling av MBL-manglende pasienter som antas å ha en hevet mottakelighet for smittesykdommer.

Med fordel er lektinet MBL i det vesentlig i trimer og/eller tetramer form. Slik som det ble beskrevet ovenfor, antas trimere MBL og tetramere MBL å være de overveiende naturlig forekommende multimere former i humant serum.

Alternativt kan lektinet være et pulmonæroverflateprotein valgt fra SP-A og SP-D. Disse proteiner ligner på MBL. De er vannløselige kollektiner som fungerer som kalsiumavhengige karbohydratbindende proteiner i iboende vertsforsvarsfunksjoner. SP-D binder også lipider. SP-A har en "bukett"-struktur som ligner strukturen av MBL (Kilpatrick DC (2000) Handbook of Animal Lectins, s.37, J Appl Physiol 51, 1-8, Am J Respir Cell Nol Biol 4, 88-94). SP-D har en tetramer "X"-struktur med CRD'er i hver ende av "X"-et.

Andre egnede dyrelektiner er de som er oppført i den følgende opplisting:

- PC-lektin (US 20030216300, US 20040265898)

- CTL-1 (US 179528/10)

- Keratinocyttmembranlektiner (Parfuemerie und Kosmetik 74, 164-80)

- CD94 (Eur J Immunol 25, 2433-7)

- P35 (synonym: humant L-ficolin, en gruppe lektiner) (Immunol Lett 67, 109-12) - ERGIC-53 (synonym: MR60) (Mol Biol Cell, 7, 483-93)

- HIP/PAP (Eur J Biochem 267, 1665-71)

- CLECSF8 (Eur J Immunol 34, 210-20)

- DCL (gruppe av lektiner) (søknad nr.00231996/US)

- protein fra GLUT-familien, spesielt GLUT1, GLUT4 og GLUT11 (PNAS 97, 1125-30)

Andre egnede dyrelektiner nevnes i Appendix A, B og C av "Handbook of Animal Lectins: Properties and Biomedical Applications", David C. Kilpatrick, Wiley 2000.

Lektinet er fortrinnsvis merket slik som det ble diskutert ovenfor. Mer foretrukket er lektinet merket med en energidonorenhet.

Analyttanalog

Analyttanalogen innbefatter et flertall karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter som bindes til bindingsseter av lektinet. Begrepet "karbohydrat" innbefatter sukkere.

Egnede karbohydratmimetiske enheter innbefatter peptider så som keratinpeptid (SFGSGFGGGY), som etterligner N-acetylglukosamin. Det er blitt vist at keratinpeptid kan inhibere MBL (Mantacto et al.2001 J. Immunol. 166, 4148-4153).

Oppfinnerne har funnet at affiniteten av vanlige karbohydratenheter for MBL er som følger:

D-Mannose, N-acetyl-D-mannosamin, D-fruktose, D-leukrose, erlose, N-acetyl-D-glukosamin, L-Fukose > myo-inositol, D-glukose, D-arabinose, D-palatinose, D-turanose, D-sorbitol, D-ribose, D-tagatose > D-lyksose > laktose, L-arabinose, D-galaktose.

Selv om de ikke ønsker å binde seg til denne teori, tror oppfinnerne at sterk binding til MBL og andre lektiner er resultatet av binding på et antall seter. Bindingen ved hvert sete er relativt svak (lav affinitet), men den kumulative effekt er sterk binding (høy grådighet). Dermed kan en analyttanalog som ikke binder alle bindingensseter, lettere forskyves av analytt som binder alle bindingensseter, enn en analyttanalog som binder alle bindingensseter. Dette forklarer hvorfor en analyttanalog inneholdende mannose, som har en høyere affinitet for MBL enn glukose har, kan forskyves av glukose.

Parametrene som påvirker grådigheten av en analyttanalog for et gitt lektin, er:

- antall karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter;

- affinitet av de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter for lektinet; - kalsiumkonsentrasjon (minst for MBL); og

- fleksibilitet av analyttanalogen.

Den fysiologiske kalsiumkonsentrasjon kan ikke reguleres. Imidlertid kan de øvrige parametere velges for å gi en analyttanalog med et egnet måleområde. Virkningen av analyttanalogens fleksibilitet på assayytelsen er ikke blitt identifisert eller beskrevet tidligere.

Tidligere beskrevne analyttanaloger (f.eks. de som finnes i US 6 232130) har innbefattet globulære proteiner som karbohydrat og energidonor- eller energimottakerenheter konjugeres med. I slike molekyler har karbohydrat og energidonor- eller energimottakerenheter faste posisjoner. Dette betyr at analyttanalogene ikke nødvendigvis kan anta en konformasjon som tillater binding av et flertall karbohydratenheter til lektin-CRD'er.

Den relative plassering av karbohydrat og energidonor- eller energimottakerenheter i slike analyttanaloger tillater dessuten kanskje ikke noen optimal vekselvirkning mellom energidonor- og mottakerenheter når analyttanalogen og lektinet er bundet. Dette vil påvirke FRET og svekke det optiske signal.

Til slutt bindes disse analyttanaloger ofte ikke til lektiner ved fysiologisk kalsiumkonsentrasjon. Kalsiumkonsentrasjonen som kreves for optimal binding av mannoseglykokonjugater til MBL, har vist seg å være rundt 20 mM.

Denne innsikt er blitt brukt av oppfinnerne til å utvikle forskjellige analyttanaloger som har forskjellig grådighet for samme lektin, og som derfor kan brukes til å måle karbohydratkonsentrasjonen over forskjellige områder.

Fortrinnsvis har assayet evnen til å måle blodglukosen for konsentrasjoner over i det minste en del av området fra 0 til 35 mM glukose, for eksempel over området fra 0 til 25 mM glukose. Med fordel er IC50-verdien rundt 15 mM glukose. Mer foretrukket har assayet evnen til å måle glukosekonsentrasjoner over området fra 2 til 10 mM glukose. En doseresponskurve som er så nært som mulig lineær innen dette område, er ønskelig.

Tre forskjellige typer struktur for analyttanalogen er av spesiell interesse.

Karbohydrat/protein-konjugat eller karbohydrat/dendrimer-konjugat

For det første kan analyttanalogen være et karbohydrat/protein-konjugat eller et karbohydrat/dendrimer-konjugat. I hvert av disse tilfeller kan karbohydratmimetiske enheter brukes istedenfor eller i tillegg til karbohydratenheter.

Eksempler på egnede karbohydrater for bruk i slike konjugater er monosakkarider og oligosakkarider.

Egnede monosakkarider er valgfritt derivatiserte tetroser, pentoser, heksoser, heptoser eller høyere aldose- eller ketosehomologer, for eksempel valgfritt derivatisert D-glukose, D-mannose, N-acetyl-D-glukosamin, L-fukose, D-fruktose, D-tagatose eller D-sorbitol.

Egnede oligomerer kan være rettkjedede eller forgrenede homooligomerer eller blandede oligomerer, for eksempel inneholdende fra 2 til 50 karbohydratenheter.

Den foretrukne glykosylasjon er 1→6 eller 1→2, ettersom 1→3 og 1→4-glykosylasjon forventes å forstyrre MBL-bindingen. For eksempel forventes nona(1→6)-α-glukose (dekstran 1500 Da) å ha sterkere grådighet for MBL enn 1,3-β-D-glukoser (f.eks. laminanariheksaose). Egnede oligosakkarider innbefatter pannose, maltose, maltotriose, isomaltotriose, D-leukrose, erlose, D-palatinose, D-turanose eller 1 til 250 kDa dekstran (fortrinnsvis 1 til 40 kDa dekstran, for eksempel 1 kda, 1,5 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 25 kDa eller 40 kDa dekstran).

Fortrinnsvis innbefatter analyttanalogen minst én karbohydratenhet valgt fra D-fruktose, D-leukrose, N-acetylglukosamin, D-mannose, L-fukose, N-acetylmannosamin, D-arabinose, myo-inositol, D-tagatose, erlose, D-glukose, D-palatinose, D-turanose, D-ribose, D-sorbitol.

Mer foretrukket innbefatter analyttanalogen minst én glukoseenhet og/eller minst én N-acetylglukosaminenhet og/eller minst én mannoseenhet, ettersom disse har en høy affinitet for MBL og andre dyrelektiner. Man tror at disse enheter bindes til bindingsseter av lektinet via sine C3- og C4-hydroksylgrupper.

Eksempler på et syntetisk forgrenet sakkarid er dendrimer-"kiler" som brukes til å konstruere dendrimerer (f.eks. TRIS-avledet trisakkarid med et aminbindeledd, vist nedenfor). Slike "kiler" kunne konjugeres på et protein så som HSA (humant serumalbumin), for eksempel via et bifunksjonelt aminbindeledd.

Foretrukne proteiner for bruk i konjugatet er humane proteiner som har en molekylvekt på minst 10 kDa, fortrinnsvis minst 20 kDa. Fortrinnsvis har proteinet en ikke-globulær samlet tertiær struktur. Man tror at dette fremmer bindingen på flere enn ett bindingssete, hvilket fører til stor grådighet. Monoklonale antistoffer så som herceptin og Remicade™ (et immunoglobulin som har flere globulære domener med en ikke-globulær "Y"-formet samlet tertiær struktur) er egnet. Andre alternative egnede proteiner er humant trombin, humant laktoferrin og Faktor XIII.

Som et annet eksempel på et karbohydrat/protein-konjugat kan proteinet være et lektinavledet protein, for eksempel et lektin hvor CRD'ene er fjernet.

Med fordel kan konjugatet være et karbohydrat/albumin-konjugat. For eksempel kan konjugatet være et mannose/HSA-konjugat eller et mannose/BSA (bovint serumalbumin)-konjugat. Imidlertid er konjugater av denne type ikke foretrukne ettersom, slik som det ble nevnt ovenfor, binding til MBL har vist seg å være avhengig av kalsiumkonsentrasjonen. Ved fysiologisk kalsiumkonsentrasjon viste det seg at et 70 kD mannose/HSA-konjugat med 20 mannoseresiduer ikke bandt seg til MBL. Avhengigheten av kalsiumkonsentrasjonen synker med økende mannosylasjon.

En fagperson vil være kjent med syntetiske ruter til konjugater av denne type. Som eksempel kan N-isotiocyanat-4-aminofenyl-O-α-D-mannopyranosid (Man-ITC) konjugeres på HSA.

Dendrimerer for bruk ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis amin-funksjonaliserte, karboksylsyre-funksjonaliserte eller hydroksyl-funksjonaliserte overflater. Fortrinnsvis er dendrimerene av type polyamidoamin (PAMAM) eller polypropylenimin (DAB). Fortrinnsvis er molekylvekten mindre enn 60 kDa, for eksempel rundt 2 til 10 kDa. Slike dendrimerer kan klarnes av nyrene (Kobayashi et al., 2004, J. Mag. Reson. Imaging 20(3) 512-518).

Polysakkarid

For det andre kan analyttanalogen være en valgfritt derivatisert polymer av karbohydratog/eller karbohydratmimetiske enheter (begge innbefattet i begrepet "polysakkarid" som brukes heri). Dekstran (en glukosepolymer, poly(1→6)-α-glukose) bindes sterkt til MBL og lignende lektiner. Oppfinnerne tror at dette er et resultat av det store antallet glukoseresiduer (ca. 430 residuer i 70 kDa dekstran) og fleksibiliteten av dekstran. Konsentrasjonen av glukose som er nødvendig for å forskyve dekstran fra MBL, er derfor stor.

Et glukoseassay basert på dekstran og MBL kan optimalt måle glukosekonsentrasjoner rundt 30 mM. Dette er mye mer enn den normale 5 mM glukosekonsentrasjon i blod. Et slikt assay kan måle glukosekonsentrasjoner fra 0 til 10 mM med en følsomhet på kun ca. en tredjedel av den samlede faserespons (0,25º faseforskyvning per mM Glc, se eksempel 7).

Foreliggende oppfinnere lette derfor etter alternative analyttanaloger som ville binde MBL og lignende lektiner mindre sterkt, slik at mer enn én tredjedel av den samlede faserespons ville være tilgjengelig i glukoseområdet fra 0 til 10 mM.

Oppfinnerne oppdaget at behandling av dekstran med perjodat (som oksidativt spalter glukosepyranoseringen mellom karbonene 2 og 3 eller 3 og 4 for å danne et dialdehyd) kan brukes for å redusere grådigheten av dekstran for MBL og lignende lektiner. Dette virker å skyldes at MBL bindes til de 3 og 4 ekvatoriale hydroksyler av glukose slik som det ble beskrevet ovenfor. De 3 og 4 hydroksylgrupper kunne inaktiveres på andre måter (for eksempel ved oksidasjon, reduksjon, alkylering, substitusjon, glykosylasjon eller forestring).

Meget overraskende fant oppfinnerne at perjodatbehandlet dekstran/MBL-binding ikke forhindres av fysiologiske kalsiumkonsentrasjoner. Dette stod i motsetning til mannose/HSA-konjugat-MBL-binding slik som det ble diskutert ovenfor. Det ville ha vært å forvente at perjodat-behandlet dekstran/MBL-binding ble forhindret av fysiologiske kalsiumkonsentrasjoner, spesielt ettersom glukoseenhetene av dekstran har lavere affinitet for MBL enn mannoseenheter har.

Teoretisk kunne det inntas to ekvivalenter perjodat per glukoseenhet (én per diol). Imidlertid har man funnet at 1 til 100 ekvivalenter perjodat er egnet for 70 kDa dekstran.

Behandling av dialdehydet med ammoniakk eller et amin fulgt av reduksjon (f.eks. med natriumcyanoborhydrid) kan brukes for å gi et aminert dekstran. Det kan også brukes en fremgangsmåte hvor dialdehydet amineres, fulgt av valgfri katalytisk hydrogenering for å gi det frie amin. Benzylamin er et nyttig amin i denne sammenheng idet mellomproduktet før hydrogenering er et dekstranderivat med lipofile enheter. Dessuten kan et benzylaminavledet aminert dekstran brukes til å bedømme graden av perjodatspaltning, ved bruk av spektrofotometriske teknikker. Hvis benzylgruppen fjernes ved katalytisk hydrogenering, kan energidonor- eller energimottakerenheter kobles til det gjenværende amin.

Alternativt kan det syntetiseres en polysakkarid-basert analyttanalog som bærer forskjellige karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter med forskjellig affinitet for MBL og lignende lektiner. Derivatisering av dekstran med mannoseenheter for å justere glukosepåvisningsområdet i et Concanavalin A-FRET-assay beskrives i Ballerstadt et al., Diabetes Technology & Therapeutics, vol.6, no.2, 2004.

Galaktose bindes til MBL med meget lav affinitet. Derfor har en analyttanalog som inneholder galaktoseenheter (for eksempel galaktose-derivatisert dekstran) lavere grådighet for MBL enn den uderivatiserte analyttanalog.

N-acetylglukosamin har høy affinitet for MBL. Derfor ville en analyttanalog som inneholder N-acetylglukosaminenheter (for eksempel GlcNAc-derivatisert amylose) ha høyere grådighet for MBL enn den uderivatiserte analyttanalog.

I denne utførelse er fortrinnsvis analyttanalogen valgt fra valgfritt derivatisert dekstran, mannan, amylose, amylopektin, glykogen, hyaluronat, kondroitin, heparin, dekstrin, inulin, xylan, fruktan og kitin. Ettersom galaktose har meget lav affinitet for MBL, er en ikke-derivatisert polymer av galaktose så som agarose ikke foretrukket som analyttanalog.

En fagperson vil være kjent med måter som et polysakkarid kan derivatiseres på med karbohydratenheter. Som eksempel kan amin-funksjonaliserte polysakkarider (for eksempel aminodekstran, som er handelstilgjengelig fra KarboMer, San Diego, Califor nia, USA, katalognr. 5-00060 eller Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA, katalognr. D1862) eller de aminerte dekstraner som ble nevnt ovenfor, bekvemt derivatiseres. Alternativt kan alkoholgrupper i polysakkarid- og amingruppene i karbohydrat- eller de karbohydratmimetiske enheter kobles ved bruk av divinylsulfon. Metoder for å derivatisere dekstran beskrives i EP 594772.

Eksempler på egnede karbohydratenheter for derivatisering av polysakkarider er de som er oppført i sammenheng med karbohydrat/protein- og karbohydrat/dendrimer-konjugatene ovenfor.

Syntetisk polymer

For det tredje kan analyttanalogen være en syntetisk polymer.

Syntese av en kunstig polymer heller enn derivatisering av et protein eller polysakkarid gjør det mulig å lett styre parametrene av polymeren (for eksempel molekylfleksibilitet, vannløselighet, molekylvekt, naturen av karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter, antallet karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter, antallet nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter) for å forbedre assayytelsen. Sammenlignet med et polysakkarid, har en syntetisk polymer den fordel at antallet karbohydratenheter kan styres uavhengig av lengden av polymeren. Videre gir bruk av ikke-ringholdige monomerer så som 2-hydroksyetylakrylat (HEA) i polymeren en økt molekylær rotasjonell fleksibilitet sammenlignet med dekstran.

Uten at de ønsker å binde seg til denne teori, tror oppfinnerne at det er viktig at nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter er nær bindingsenheten for å generere et sterkt signal. Globulære ligander konsentrerer bindingsenheter og nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter på en sfærisk flate slik at de er nære hverandre. I dekstran, som er rettkjedet, består grunnstrukturen av bindingsenheter, og det er derfor ikke mulig å styre om bindingen er nær eller fjernt fra en nærhetsbasert signalgenererende/modulerende enhet. Dette kan styres i den syntetiske polymer ved å plassere bindingsenhetene nære de nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter.

I denne utførelse er fortrinnsvis analyttanalogen en ikke-sakkarid, fleksibel vannløselig polymer som bærer påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter.

Begrepet "fleksibel" innbefatter polymerer som har evnen til betraktelig intermonomer rotasjon. Fortrinnsvis inneholder polymerene ikke store grupper (for eksempel ringstrukturer, tert-butylgrupper eller andre sterisk store grupper) i tillegg til de påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter og nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter. Fortrinnsvis har slike polymerer meget få dobbeltbindinger i grunnstrukturen (for eksempel færre enn 10%). Med fordel har slike polymerer ikke noen globulær tertiær struktur, selv om de kan ha en slik struktur.

Fortrinnsvis er polymeren uforgrenet (til forskjell fra dendrimerene som ble diskutert ovenfor). Dette forbedrer fleksibilitet av polymeren. Imidlertid kan polymeren være forgrenet eller fornettet i noen grad, forutsatt at dette ikke fører til dannelse av en hydrogel. For eksempel er 1 til 5 forgreninger i en polymer med en samlet molekylvekt rundt 100 kDa akseptabel.

Begrepet "vannløselig" innbefatter polymerer som har en vannløselighet ved romtemperatur på minst 4 mg/ml, fortrinnsvis minst 25 mg/ml, mer foretrukket minst 50 mg/ml, for eksempel minst 100 mg/ml. Løseligheten vil være høyere ved kroppstemperatur. Det er viktig at polymeren er vannløselig slik at den vil løse seg opp i interstitiell væske når den brukes i en sensor i kroppen slik som det skal diskuteres i det følgende. Polymeren bør være vannløselig selv når den er bundet til et karbohydratbindende molekyl så som MBL.

Fortrinnsvis innbefatter polymeren ikke flere enn 1 til 5 typer monomerenheter, mer foretrukket ikke flere enn 3 monomerenheter.

Med fordel er polymeren en kopolymer innbefattende første monomerenhetsresiduer som bærer påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter og andre monomerenhetsresiduer som bærer påhengende nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter. Alternativt eller i tillegg kan ett enkelt monomerenhetsresidum som bærer både påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter og påhengende nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter, brukes. Bruk av første og andre monomerenheter er å foretrekke, ettersom mengden karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enheter og nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter da kan reguleres uavhengig.

Fortrinnsvis er kopolymeren en tilfeldig kopolymer. Imidlertid kan den også være en alternerende kopolymer. Bruk av en blokkopolymer med store blokker er ikke å foretrekke. Imidlertid kan det brukes en blokkopolymer med blokker med lav molekylvekt (for eksempel 1 til 3 kDa).

Når den brukes i et assay med MBL som karbohydratbindende molekyl, bindes polymeren fortrinnsvis til MBL ved 0 mM glukose minst 50% så sterkt som aminodekstran, mer foretrukket minst så sterkt som aminodekstran, men er lettere å inhibere. Det er spesielt ønskelig at polymeren lett inhiberes (stor andel av den samlede faserespons) over området fra 0 til 35 mM glukose, og spesielt over området fra 2 til 15 mM. Dette gir et assay over glukosekonsentrasjoner som fysiologisk sett er spesielt interessante, som er mer følsomt enn et lignende assay ved bruk av aminodekstran som glukoseanalog.

Flere enn én type monomerenhetsresiduum som bærer karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter, kan foreligge. De karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kan være forskjellige, med forskjellige affiniteter for MBL og lignende lektiner.

Med fordel er hver av de første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) et dobbeltbinding-holdig derivat av en karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enhet. Imidlertid kan hver av de første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) være et dobbeltbinding-holdig molekyl som inneholder en funksjonell gruppe som de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kan kobles til, med fordel etter polymerisasjon.

Fortrinnsvis er det dobbeltbinding-holdige derivat av de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter et allyl- eller vinylholdig derivat av en karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enhet. Andre egnede dobbeltbinding-holdige derivater av karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter innbefatter homologer av allylderivater, for eksempel 3-butenyl- eller 4-pentenylderivater, eller styrenderivater med den karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enhet i 4-posisjon. Ytterligere egnede dobbeltbinding-holdige derivater av karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter innbefatter HEA-, 2-hydroksyetylmetakrylat (HEMA)- eller vinylalkohol (VA)-baserte derivater.

De karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kan kobles til amin-, syre-, alkohol- og/eller sulfonfunksjonelle grupper av den første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter). For eksempel kan alkoholgrupper i monomerenhetene og amingrupper i de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kobles ved bruk av divinylsulfon. Når karbohydratet er mannose, bør koblingen ikke skje via C3-OH- eller C4-OH-gruppene, ettersom disse er viktige ved binding til MBL. I dette tilfelle kan divinylsulfonkobling være uegnet.

Aminoderivatiserte karbohydratenheter kan fremstilles ved reduktiv aminering av disakkarider. Dette gjør det mulig for karbohydratenheten å kobles i sin anomere posisjon (C1).

De karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter kunne kobles til alkoholgrupper (f.eks. i HEA) ved Fischer-glykosidasjon.

Det er ikke nødvendig at de første monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) inneholder dobbeltbindinger.

Eksempler på egnede karbohydrater for bruk i kopolymerene er de som ble diskutert i sammenheng med karbohydrat/protein-konjugatene ovenfor.

Med fordel er hver av de andre monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) et dobbeltbinding-inneholdende molekyl som inneholder en funksjonell gruppe som den nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enhet kan kobles til, med fordel etter polymerisasjon. Egnede funksjonelle grupper innbefatter syre, alkohol og/eller sulfon. Kobling etter polymerisering hjelper å minimere tap av de dyre nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter.

Imidlertid kan de andre monomerenheter (eller enkelte monomerenheter) inneholde de nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter. I dette tilfelle gjelder diskusjonen ovenfor av egnede polymeriserbare grupper og koblinger.

I en foretrukket utførelse er hver av de andre monomerenheter N-(3-aminopropyl)metakrylamid eller et derivat derav.

I en foretrukket utførelse er hver av de enkle monomerenheter et dobbeltbinding-inneholdende, karbohydrat- eller karbohydratmimetisk enhet-inneholdende derivat av lysin. Et eksempel er vist nedenfor (flertrinns reaksjonsskjema):

Utgangsmaterialet i dette reaksjonsskjema er metakryloyl-L-lysin, tilgjengelig via PolysSciences Europe (Eppelheim, Tyskland). Etter polymerisering kunne alfa-amingruppen kobles til den nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enhet.

Fortrinnsvis inneholder polymeren dessuten tredje monomerenhetsresiduer som ikke bærer påhengende karbohydrat- eller karbohydratmimetiske eller nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter. Dette hjelper med å heve fleksibiliteten.

Fleksibiliteten heves ved bruk av tredje monomerenheter som er sterisk uhindret, så som HEA. Fleksibiliteten heves også ved bruk av tredje monomerenheter som er uladede. En polymer som ikke inneholder noen tredje monomerenheter, ville ha et stort antall positivt ladede ammoniumgrupper som ville måtte inaktiveres for å minimere en senket fleksibilitet som skyldes elektrostatisk avstøtning.

Flere enn én type tredje monomer kan innlemmes i polymeren.

Fortrinnsvis er hver av de tredje monomerenheter et dobbeltbinding-inneholdende molekyl inneholdende en hydrofil gruppe, for eksempel en hydroksylgruppe. Det er ikke foretrukket at de tredje monomerenheter er et lipofilt dobbeltbinding-inneholdende molekyl, for eksempel styren.

I en foretrukket utførelse er hver av de tredje monomerenheter HEA, vinylpyrrolidon, MMA, HEMA, vinylalkohol og/eller etylenglykol. Imidlertid vil en fagperson forstå at det finnes mange andre dobbeltbinding-inneholdende molekyler inneholdende hydrofile grupper som kunne brukes.

Med fordel omsettes monomerenhetene ved tilsetningspolymerisering. Tilsetningspolymeriseringen kan initieres av frie radikaler, for eksempel ved bruk av kaliumperoksodisulfat (PPS) eller en annen peroksidforbindelse.

Andre muligheter er kondensasjonspolymerisering (for eksempel ionisk kondensasjonspolymerisering), ringåpningspolymerisering og atomoverføringsradikalpolymerisering (ATRP). En fagperson vil forstå at naturen av monomerenhetene vil avhenge av den ønskede polymeriseringsmetode (for eksempel er dobbeltbinding-inneholdende monomerenheter ikke nødvendig for kondensasjonspolymerisering).

Med fordel blandes monomerenhetene før initiatoren tilsettes.

Fortrinnsvis tar polymerisasjonsreaksjonen mindre enn to dager. Varigheten av polymerisasjonen kan brukes til å regulere molekylvekten av kopolymerproduktet.

Med fordel finner polymerisasjonsreaksjonen sted under oksygenfrie betingelser.

Med fordel utføres polymerisasjonsreaksjonen ved romtemperatur.

Når det ikke brukes én enkelt monomerenhet, foreligger den første monomerenhet fortrinnsvis i reaksjonsblandingen i en mengde fra 20 til 70 vekt%, mer foretrukket i en mengde fra 30 til 50 vekt%.

Når det brukes tredje monomerenheter, foreligger de fortrinnsvis i reaksjonsblandingen i en mengde fra 5 til 15 vekt%.

Det vil være underforstått at sammensetningen av polymeren ikke nøyaktig gjenspeiler mengden av monomerenheter som foreligger i reaksjonsblandingen. Dette skyldes innvirkningen av andre faktorer (for eksempel sterisk hindring og løselighet).

Det bør også noteres at analyttanalogen kan bestå av to eller flere atskilte helheter som sammen virker som analyttanalog. Spesielt kan analyttanalogen bestå av en første helhet med minst to analyttanalogenheter og en andre helhet som er et analyttbindende molekyl så som et lektin. For eksempel kan merket mottaker-MBL og merket donor-MBL brukes sammen med umerket dekstran eller umerket syntetisk polymer som sjablong for å bringe det merkede donor-MBL og det merkede mottaker-MBL i nærheten av hverandre slik at det finner sted FRET (et eksempel som benytter seg av Con A, gis av Gestwicki et al. (2002) Chemistry and Biology 9, s.163).

Analyttanalogen er fortrinnsvis merket med én eller flere nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter slik som det ble diskutert ovenfor. Fortrinnsvis innbefatter analyttanalogen én eller flere energimottakerenheter (for eksempel HMCV-1 eller Alexa Fluor 594™, som ble diskutert ovenfor). Imidlertid kan den også innbefatte én eller flere energidonorenheter.

De nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter kan festes på analyttanalogen slik som det ble diskutert i sammenheng med de karbohydrat- eller karbohydratmimetiske enheter ovenfor. For eksempel kan merking av dekstran oppnås ved direkte divinylsulfonkobling eller ved aminering (slik som det ble beskrevet ovenfor) fulgt av kobling. Når det brukes et aminderivatisert dekstran som analyttanalog, må man være nøye med å unngå fornetning under påfestingen av de nærhetsbaserte signalgenererende/modulerende enheter, ettersom dette kunne føre til uønsket felling. Metoder for å derivatisere dekstran med DVS for å minimere fornetning, diskuteres i EP 594772.

Analyttanalogen bør ha en tilstrekkelig høy molekylvekt til å forhindre at den slipper ut fra sensoren, men tilstrekkelig lav til at det ikke finner sted felling når analyttanalogen bindes til lektinet. Analyttanaloger som har en vekt i området 25 til 250 kDa, mer foretrukket 40 til 250 kDa, enda mer foretrukket 70 til 150 kDa, sterkt foretrukket 100 til 120 kDa, for eksempel 110 kDa, er å foretrekke. Analyttanaloger basert på 110 kDa dekstran er spesielt foretrukne.

Valgfritt er analyttanalogen og lektinet forankret sammen.

Sensorkonstruksjon

Fortrinnsvis holdes bestanddelene av assayet fast av et materiale som har en porestørrelse som tillater diffusjon av analytt, men ikke av assaybestanddelene. Imidlertid kan denne selektivitet oppnås på andre måter, for eksempel ved bruk av et materiale som tillater diffusjon av uladede materialer.

Fortrinnsvis holdes bestanddelene av assayet fast av et skall- eller matriksmateriale. Analyttanalogen og/eller lektin kan podes på dette materiale. Mer foretrukket er materialet biologisk nedbrytbart, slik som det beskrives i WO 00/02048. Valgfritt kan sensoren innbefatte små partikler som holdes fast i et skall av biologisk nedbrytbart materiale, slik som det beskrives i WO 03/006992.

I en foretrukket utførelse holdes bestanddelene av assayet fast av et skall av biologisk nedbrytbart materiale som innkapsler assaybestanddelene mens det lar glukose komme i berøring med assaybestanddelene, og det biologisk nedbrytbare materiale innbefatter en kopolymer som har hydrofobe og hydrofile enheter, slik som det beskrives i WO2005/110207.

Ett eller flere assaybestanddelrom kan foreligge i skallet.

Fortrinnsvis er kopolymeren en tilfeldig kopolymer.

Fortrinnsvis har kopolymeren en permeabilitet på minst 5,0 x 10-10 cm2/s.

Ordet "permeabilitet" brukes for å vise til den samlede permeabilitet av analytt (glukose) gjennom hydrert kopolymer som kan måles eksperimentelt.

Fortrinnsvis degraderes kopolymeren når den vel er blitt implantert i kroppen, i løpet av et tidsrom på én uke til ett år, for eksempel 30 dager. For en typisk polymertykkelse på 5 µm tilsvarer dette en degraderingsrate på 0,17 µm/dag.

Fortrinnsvis, for mobiliteten av glukose, har det biologisk nedbrytbare materiale en avskjæringsgrense for molekylvekten på ikke mer enn 25.000 Da. Mer foretrukket har det biologisk nedbrytbare materiale en avskjæringsgrense for molekylvekten på ikke mer enn 10.000 Da.

Fortrinnsvis er vektandelen av de hydrofobe enheter fra 10 til 90% av kopolymeren, mer foretrukket fra 10 til 50% av kopolymeren.

Fortrinnsvis er molekylvekten av hver hydrofile enhet fra 200 til 10.000 Da, mer foretrukket fra 400 til 4.000 Da.

Fortrinnsvis innbefatter hver av de hydrofile enheter av kopolymeren en ester av polyetylenglykol og en disyre. Som et alternativ til polyetylenglykol kan det brukes en blandet polymer av etylenglykol og propylenglykol, og/eller polyetergrunnstrukturen kan være substituert med hydrofobe og/eller hydrofile grupper. Som ytterligere alternativ til polyetylenglykol kan poly-tetrahydrofuran (poly-THF) brukes.

Fortrinnsvis innbefatter de hydrofile enheter tereftalsyre og/eller ravsyre som disyrer. Andre egnede disyrer er oksalsyre, vinsyre, ftalsyre, asparaginsyre, malonsyre og oligomere eller polymere disyrer, for eksempel poly(dimersyre-"sebacic acid"). I en foretrukket utførelse er disyren kun tereftalsyre. I en alternativ foretrukket utførelse er det molare forhold mellom tereftalsyre og ravsyre 1:2 til 2:1, med fordel 1:1.

Alternativt kan de hydrofile enheter av kopolymeren innbefatte oligomerer. Egnede oligomerer er oligomerer av hydroksyetylmetakrylat (HEMA), vinylpyrrolidon, vinylalkohol, karbohydrater, etylenoksid og/eller 2-akrylamido-2-metylpropansulfonsyre. Når de hydrofile enheter innbefatter HEMA, tilveiebringes det biologisk nedbrytbare koblinger (for eksempel esterkoblinger så som tereftalatkoblinger) i polymeren for å forbedre den biologiske nedbrytbarhet.

Fortrinnsvis er molekylvekten av hver hydrofobe enhet fra 400 til 5.000 Da.

Fortrinnsvis innbefatter de hydrofobe enheter av kopolymeren en ester av butan-1,4-diol og en disyre. Som et alternativ til butan-1,4-diol kan pentan-1,5-diol eller heksan-1,6-diol brukes.

Fortrinnsvis innbefatter de hydrofobe enheter tereftalsyre og/eller ravsyre som disyrer. I en foretrukket utførelse er det molare forhold mellom tereftalsyre og ravsyre 1:2 til 2:1, med fordel 1:1. Alternativt innbefatter de hydrofobe enheter kun tereftalsyre som disyre. Andre egnede disyrer ble angitt ovenfor.

Alternativt kan de hydrofobe enheter av kopolymeren innbefatte oligomerer av metylmetakrylat (MMA), polyuretan og/eller amider (for eksempel Nylon-6, oligo-N-tertiært butylakrylamid eller oligo-N-isopropylakrylamid). Når de hydrofobe enheter innbefatter MMA, tilveiebringes det biologisk nedbrytbare koblinger (for eksempel esterkoblinger så som tereftalatkoblinger) i polymeren for å forbedre den biologiske nedbrytbarhet.

Foretrukne polymerer har den generelle formel aPEG(T/S)bPB(T/S)c hvor "a" betyr molekylvekten av PEG-kjeden, "b" vektandelen av PEG(T/S) (polyetylenglykoltereftalat/suksinylat) i den dannede polymer og "c" vektandelen av PB(T/S) (polybutylentereftalat/suksinylat) i den dannede polymer. Eksempler på slike polymerer er 600PEGT80PBT20, 1000PEGT80PBT20, 2000PEGT80PBT20, 4.000PEGT80PBT20, 1000PEGT50PBT50 og 1000PEG(T/S)60PB(T/S)40(T/S 50%). Polymerene er biologisk nedbrytbare, har høy glukosepermeabilitet og har molekylvektavskjæringsegenskaper rundt 25.000 Da.

Enkelte av disse polymerer beskrives i US 6383 220 og EP 1247 522.

Kopolymeromhyllingen har fortrinnsvis en tykkelse fra 1 til 50 µm.

I et andre trinn vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en sensor slik som den beskrives heri. Kjemiske metoder for fremstilling av polymermikrokapsler innbefatter faseseparasjon (koaservasjon), løsemiddelfordampning og/eller ekstraksjon.

Egnede fysikalske metoder for fremstilling av polymermikrokapsler innbefatter sprøytetørking, sprøytebelegning, sprøytekjøling, rotasjonsplateforstøvning, belegning i fluidisert sjikt, koekstrudering (for eksempel koekstrudering med stasjonær dyse, sentrifugalhodekoekstrudering eller koekstrudering med nedsenket dyse) og belegning i panne.

Sensoranvendelse

En fremgangsmåte for å påvise glukose ved bruk av en sensor slik som den beskrives heri, innbefattende implantasjon av sensoren inn i huden av et pattedyr, påvisning eller måling av glukose ved bruk av eksterne optiske anordninger er beskrevet.

En fremgangsmåte for å påvise glukose ved bruk av en sensor slik som den ble beskrevet ovenfor, innbefattende påvisning eller måling av glukose ved bruk av eksterne optiske anordninger ved belysning av en slik sensor som foreligger i eller under huden av et pattedyr er også beskrevet.

Fortrinnsvis innbefatter fremgangsmåten ytterligere spaltning av biologisk nedbrytbart materiale i sensoren.

Sensoren kan innføres i huden ved injeksjon, fortrinnsvis ved bruk av en sprøyte, eller ved bruk av andre metoder, spesielt ved bruk av en hvilken som helst metode som beskrives i WO 00/02048. Sensoren er fortrinnsvis av en størrelse som er egnet for injeksjon gjennom en nål med trangt gaugetall for å minimere ubehaget for pasienten. Fortrinnsvis har sensoren en maksimal størrelse fra 20 µm til 1 mm. Imidlertid kan det brukes en stavformet sensor som har en større maksimal dimensjon.

Sensoren kan innføres i tykkelsen av dermis eller subdermalt, eller kan innføres i epidermis, selv om den i sistnevnte tilfelle antakelig ville utstøtes fra huden ved utvekst av epidermalsjiktene, eventuelt før det biologisk nedbrytbare materiale er spaltet.

Ettersom sensoren er plassert i huden, påvises et optisk signal som genereres i sensoren, fortrinnsvis transkutant (dvs. gjennom det eller de ytre sjikt av huden), hvilket vil fjerne behovet for noen direkte forbindelse mellom sensoren og det eksterne miljø som kunne føre til infeksjon.

Imidlertid kan påvisning alternativt finne sted via en hul eller transparent anordning (for eksempel en nål eller optisk fiber) som tillater belysning av sensoren med eksterne optiske anordninger uten å føre lys gjennom huden.

Når sensoren er på plass på en kutan plassering, kan det utføres glukosemålinger så ofte som nødvendig uten ugunstige virkninger. Dette er en spesiell fordel i sammenheng med langtidspleien av diabetespasienter ettersom det hvis det utføres hyppigere glukosemålinger, kan holdes tettere styring av glukosenivået i blodet og faren for å utvikle tilstander forbundet med dårlig regulert blodglukose, så som retinopati, nefropati, nevropati, generell mikro- og makrovaskulær skade og dårlig sirkulasjon, vil reduseres.

Ettersom sensoren ifølge oppfinnelsen i og for seg ikke inneholder noen av de optiske bestanddeler som er nødvendige for å avspørre avlesningen av assayet (idet disse fortrinnsvis tilveiebringes atskilt og plassert utenfor kroppen), kan sensoren lett tilveiebringes i en form som er injiserbar med minimalt ubehag for pasienten.

Sensorer som innlemmer et assay som benytter seg av FRET-teknikken, kan avspørres ved å tilføre innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energidonorenheten, og måle intensiteten av den emitterte fluorescens eller livstiden av den eksiterte tilstand. Allment kjente metoder er:

1. Stabil tilstandsmåling

2. Tidsdomene-livstidsmåling

a. Enkeltfotontelling

b. Stripekamera

c. Portforsynt påvisning (pulsesampling)

d. Oppkonversjon

3. Frekvensdomene-livstidsmåling

a. Fasemodulasjonsfluorometri (heterodyn påvisning)

b. Fasefølsom påvisning (homodyn påvisning)

Nærmere beskrivelse av prinsippene finnes i Lakowicz, J. R. "Principles of Fluorescence Spectroscopy", 2. utgave, 1999.

Den foretrukne metode for å avspørre assayet er fasemodulasjonsfluorimetri.

Et egnet optisk oppsett for å avspørre assayet (fig. 6) består av en lysemitterende diode (LED) 11, som emitterer lys innen emisjonsspektret av energidonorenheten. LED'en drives av en driverkrets 13, som modulerer LED'en ved en frekvens som gir en tilstrekkelig faseforskyvning, fortrinnsvis i området 45°. For et fluorofor med en livstid på 3 ns er den foretrukne frekvens 50 MHz. Lyset som emitteres av LED'en, filtreres av et eksitasjonsfilter 15 og rettes mot sensoren 16 av en dikroisk strålesplitter 17 og fokuseres på sensoren/huden over den injiserte sensor 16 av en linse 19. Fluorescensen som emitteres av sensoren, samles av linsen 19. Lyset passerer gjennom den dikroiske strålesplitter og filtreres gjennom et emisjonsfilter 21. Det filtrerte lys fokuseres av en linse 23 på detektoren 25, i dette tilfelle en lavinefotodiode (APD). ADP'en reversforspennes av en APD-forspenningstilførsel 27, som styres av en signalprosesserings- og styreenhet 29. Signalet fra ADP'en forsterkes av en transimpedansforsterker 31, filtreres av et båndpassfilter 33 og prøves ("is sampled") av en første analog-til-digital-konverterer (ADC) 35. På tilsvarende måte prøves det modulerte drivsignal til LED'en av en andre ADC 37. Signalet som prøves på den første ADC 35, er:

Y1(t)=A1*sin(2* π*f*t+ φfl+ φ1)

A1er amplituden av det påviste signal fra assayet, f er modulasjonsfrekvensen, φfler faseforskyvningen som innføres av donorfluoroforet, og φ1er en fast faseforskyvning som innføres av det elektroniske og optiske oppsett.

Signalet som prøves på den andre ADC 37, er:

Y2(t)=A2*sin(2* π*f*t+ φ2)

A2er amplituden av det modulerte drivsignal til LED'en og φ2er en fast faseforskyvning som innføres av det elektroniske oppsett.

Signalprosesserings- og styringsenheten avleder faseforskyvningen φflsom innføres av energidonorenheten, ved å sammenligne de to prøvde signaler og kompensere for de faste og kjente faseforskyvninger som innføres av elektronikken og optikken.

Det tas målinger ved å holde fluorometeret nær huden og linjestilt med sensoren. Faseforskyvningen omvandles til analyttkonsentrasjon ved bruk av en fase-til-analytt-kalibreringsfunksjon, så som

analyttkonsentrasjon = A+Bx/(k+x),

hvor A er fasen hvor det ikke forekommer analytt, B er fasen ved maksimal respons, x er den målte fase, og k er dissosiasjonskonstanten mellom reseptoren og analyttanalogen.

En alternativ målingsteknikk er måling av fluorescensintensiteten.

I dette tilfelle bør den optiske anordning tilføre en første stråle av innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energidonorenheten, og fortrinnsvis en andre stråle av innfallende stråling ved en bølgelengde innen absorpsjonsspektret av energimottakerenheten (dette gjelder når energimottakerenheten også er et fluorofor). I tillegg bør den optiske anordning fortrinnsvis ha evnen til å måle optiske signaler som genereres i sensoren, ved to forskjellige bølgelengder; bølgelengde 1 innen emisjonsspektret av energidonorenheten (signalet som genereres i sammenheng med målingen av analytt) og bølgelengde 2 i emisjonsspektret av energimottakerenheten (som kunne være analyttsignalet eller det interne referanse- eller kalibreringssignal).

Fluorometeret måler de følgende parametere hver for seg:

Ved bølgelengde 1 (energidonorenhet)

Eksitasjonslysintensitet, I(1,0)

Omgivelseslysintensitet, I(1,1)

Kombinert intensitet av fluorescerende og omgivelseslys, I(1,2)

Ved bølgelengde 2 (energimottakerenhet)

Eksitasjonslysintensitet, I(2,0)

Omgivelseslysintensitet, I(2,1)

Kombinert intensitet av fluorescerende og omgivelseslys, I(2,2)

Det tas igjen målinger ved å holde fluorometeret nær huden og linjestilt med sensoren. Når det tas transkutane målinger av de fluorescerende signaler som genereres i sensoren, er det nødvendig å ta høyde for hudens absorpsjon av signal. Absorptiviteten av menneskehud har i eksperimenter vist seg å være lavest i området fra 400 nm til 900 nm. Det endelige resultat som tilveiebringes, er det normaliserte forhold mellom den fluorescerende intensitet fra de to fluoroforer, definert ved det følgende forhold (ligning 1):

Endelig resultat = (I(1,2)-I(1,1))*I(2,0)/(I(2,2)-I(2,1))*I(1,0) (1)

Det endelige resultat fra den optiske anordning (f.eks. fluorometeret) som gis av ligning 1 ovenfor, omvandles til analyttkonsentrasjon fortrinnsvis ved hjelp av en datamaskin ved bruk av kalibreringsdata som kan innhentes basert på prinsippene som beskrives i WO 00/02048.

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere under henvisning til eksempler, og til figurene hvor:

Fig. 1 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og dekstranassaysystem for forskjellige dekstranmolekylvekter (eksempel 6).

Fig. 2 viser glukosedoseresponsen fra (a) et humant MBL- og 110 kDa dekstranassaysystem og (b) et Con A- og 110 kDa dekstranassaysystem (eksempel 8).

Fig. 3 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og HSA-mannose-ELLA-assaysystem (eksempel 11);

Fig. 4 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og perjodat-behandlet dekstran-ELLA-assaysystem (eksempel 11);

Fig. 5 viser glukosedoseresponsen fra et humant MBL- og 70 kDa dekstranassaysystem (eksempel 15).

Fig. 6 viser et egnet optisk oppsett for å avspørre assayet.

Eksempler

Generelt

De følgende materialer ble brukt:

p-Aminofenyl- α-D-mannopyranosylisotiocyanat, bovint serumalbumin- α-D-mannopyranosylisotiocyanat (23 eq Man pr. BSA), humant serumalbumin, natriumperjodat, biotin-N-hydroksysuksinimid, o-fenylendihydroklorid, benzylamin, ammoniakk, natriumcyanoborhydrid (Sigma-Aldrich).

Nunc F96 MaxiSorp-plate (Nunc, Danmark).

PD-10-kolonner, Streptavidin-HRP (Amersham Bioscience).

Dekstran (Pharmacosmos, Danmark).

Mannanbindende lektin (tilgjengelig fra flere kilder, f.eks. Statens Serum Institute, København, Danmark).

Dialyserør Spectra/Por (Spectrum Laboratories Inc., California, USA). Float-A-Lyzer™ 25.000 MWCO dialyserør var fra Spectrum Laboratories Europe (Breda, Nederland).

Sorbitanmonooleat (Span® 80), azodiisobutyrodinitril (AIBN) og 2-hydroksyetylakrylat var fra Sigma-Aldrich. N-(3-aminopropyl)metakrylamidhydroklorid var fra Polys-Sciences Europe (Eppelheim, Tyskland).2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydroklorid (VA-044) var fra Wako GmbH (Neuss, Tyskland).

Allyl- α-D-glukopyranosid og allyl-2-acetamido-2-deoksy- α-D-glukopyranosid var fra Glycon Biochemicals, Tyskland. Allyl- α-D-galaktopyranosid var fra Sigma-Aldrich.

PBS er 20 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,4, og TBS er 20 mM TRIS, 150 mM NaCl, 1,25 mM CaCl2, pH 7,4 hvis intet annet er nevnt.

Forkortelser: MBL: mannanbindende lektin; PBS: fosfatbufret salin; TBS: TRIS-bufret salin; ELLA: "Enzyme Linked Lectine Assay".

Eksempel 1: Flekking av MBL

Humant MBL ble bufferskiftet (ved dialyse) til en 10 mM NaHCO3-buffer inneholdende 150 mM NaCl og 1,25 mM Ca2+ , pH 8,7. Fargestoffet som ble brukt for flekking, var Alexa Fluor™ 594-suksinimidylester (AF594-SE) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Fargestoffet ble løst opp i tørt DMSO og tilsatt langsomt (10 min.) til MBL'en i bikarbonatbuffer. Reaksjon fikk finne sted i 1 time. Flekkingen ble utført med 15 ganger molart overskudd (med hensyn til polypeptidenheten) av fargestoff. Rensing ble utført ved dialyse mot 10 mM TRIS-buffer pH 7,4, 150 mM NaCl og 1,25 mM Ca2+ . Den erholdte merkingsgrad av det flekkede protein ble bestemt ved UV-spektroskopi å være 2,3 fargestoffer per delenhet of MBL.

Eksempel 2: Fremstilling av dekstran

150 kDa Dekstran (6,00 g, 0,4 μmol) ble løst opp i 250 mM K2HPO4pH 11,5 (600 mL). Natriumborhydrid (3 g, 0,08 mol) ble tilsatt, fulgt av tilsetningen av divinylsulfon (15 ml, 0,15 mol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 min ved romtemperatur, før nøytralisering til pH 7,2 med konsentrert HCl. Etter omrøring i 30 minutter, ble den dannede blanding dialysert (MWCO 10-12 kDa) i vann (3 x 25 L). Innholdet ble overført til en Erlenmeyer-kolbe og 24% ammoniakk (200 mL) ble tilsatt. Etter 2 timer, ble pH justert til 10,5, og reaksjonsblandingen ble omrørt over natten. Overflødig ammoniakk ble fjernet ved dialyse (MWCO 10-12k) i vann (8 x25 L), og hele innholdet ble lyofilisert for å gi aminodekstranet 5,75 g (78%, basert på en aminodekstranmolekylvekt på 185 kDa) som en hvit fnuggete substans. Elementanalyse ble brukt for å gi en grov bedømmelse av molekylvekten, amininnlemmelsen og mengden innlemmet divinylsulfon. (funnet C 39,86; H 6,26; N 0,16; S 3,08% Dekstran 150k, ~22 DVS-NH2, ~160 DVS-OH, og ~720 H2O krever C 39,55; H 6,60; N 0,16; S 3,07%).

Eksempel 3: Fremstilling av hexametoksy-Crystal Violet-suksinimidylester (HMCV-1)

Syntese av HMCV-1:

Skjema 1. I) 4-(N-metylamino)-butansyrehydroklorid (1 ekv.), diisopropyletylamin, i acetonitril, 20 ºC, 20 timer. II) Dimetylamin (overskudd). III) TSTU, diisopropyletylamin, i acetonitril, 20 ºC, 2 timer.

4a (BF -4): 4-(metylamino)smørsyrehydroklorid (1,36 g; 8,8 mmol), 1 (5,0 g; 8,3 mmol) og diisopropyletylamin (5 mL) ble løst opp i encetonitril (120 mL). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 30-35 ºC i en tørr nitrogenatmosfære i 22 timer. Vandig dimetylamin (40 mL av en 40% oppløsning) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt i fire dager til. Løsningsmidlet og overflødig dimetylamin ble fjernet under vakuum, og det gjenværende materiale ble løst opp i kloroform. Kloroformoppløsningen ble vasket to ganger med saltvann og tørket over MgSO4før inndamping av løsningsmidlet og felling av produktet fra CH2Cl2/eter. Utbytte: 4,4 g (70%) mørkeblått pulver.

MS (FAB+): m/z 624 (M+)

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,34 (1H, bs), 6,03 (2H, s), 5,83 (4H, s), 3,49 (2H, m), 3,46 (6H, s), 3,44 (12H, s), 3,12 (3H, s (maskert)), 3,08 (12H, s), 1,94 (2H, t), 1,70 (2H, m).

HMCV-1 (Cl-): TSTU (2-succinimido-1,1,3,3-tetrametyluroniumtetrafluorborat; 0,8 g, 2,6 mmol) ble tilsatt til en oppløsning av 4a (0,9 g, 1,26 mmol) og diisopropyletylamin (0,55 g, 4,5 mmol) i acetonitril (15 mL). Reaksjonsblandingen ble omrørt i en lukket kolbe i 2 timer, før den ble helt i en iskald nesten mettet NaCl-oppløsning (ca.150 mL) surgjort med vandig HCl (4 mL, 2 M). Den vandige fase ble ekstrahert med kloroform (2 x 150 mL). De samlede kloroformfaser ble vasket med saltvann (2 x 50 mL) og tørket over MgSO4. Inndamping av løsningsmidlet og gjenfelling fra CH2Cl2/eter gav et mørkeblått pulver (0,80 g, 84%).

MS (FAB+): m/z 721 (M+)

1H-NMR br.(400 MHz, DMSO-d6): δ 5,88 (2H,s), 5,85 (4H,s), 3,60 (2H, s), 3,46 (12H, s), 3,45 (6H, s), 3,15 (12H, s), 3,12 (3H, s), 2,85 (4H, s), 2,80 (2H, t), 1,95 (2H, m).

Eksempel 4: Flekking av dekstran

70 kDa aminodekstran (0,5 mmol NH2/g dekstran, dvs.35 mol amin per mol dekstran), fremstilt ved en metode som var analog med metoden i eksempel 2, ble flekket i 10 mM NaHCO3pH 8,5, 150 mM NaCl med HMCV-1 (eksempel 3). Fargestoffet ble løst opp i tørt DMSO og tilsatt langsomt (10 min.) til dekstranet i bikarbonatbuffer. Reaksjon fikk finne sted i 1 time. Flekkingen ble utført med 8 ganger molart overskudd av fargestoff. Rensing ble utført ved dialyse mot 10 mM TRIS-buffer pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,25 mM Ca2+ , 2 mM NaN3. Den erholdte merkingsgrad av det flekkede dekstran ble bestemt ved UV-spektroskopi å være 7,0 fargestoffer per dekstran.

Eksempel 5: Glukosemåling

AF594-flekket humant MBL (eksempel 1) og HMCV1-dekstran (eksempel 4) ble blandet i TBS-buffer (samme som ovenfor) til konsentrasjoner med 10 µM av begge bestanddeler (ved bruk av konsentrasjon av MBL-AF594-karbohydratgjenkjenningsdomener, CRD, hver med en molekylvekt rundt 25kDa). Assaykjemiblandingen ble sugd inn i en hul fiber (regenerert cellulose, diameter 0,2 mm).

Fluorescenslivstidmålinger (frekvensdomene) ble utført i et KOALA automatisert prøvetakingsrom (ISS, Champaign IL). Alle oppløsninger ble forhåndsoppvarmet til 34 ºC i et vannbad, og alle målinger i KOALA-instrumentet ble registrert ved 34 ºC. Fluorescenscellen som inneholdt fiberen og fiberholdesammenstillingen ble plassert i prøveholderen av KOALA, og fluorescenscellen ble fylt med buffer inneholdende glukose.

Den målte fase var et gjennomsnitt av minst førti fasevinkelregistreringer. Etter fullføring av en måling, ble fluorescenscellen tømt ved bruk av en pipette og fylt opp igjen med buffer inneholdende den neste konsentrasjon av glukose. En sinking på 20 minutter mellom målinger ble innført for å la assaykjemien nå likevekt.

For å generere en glukose-doseresponskurve ble fasen målt ved 0, 5, 10, 30, 100 og 500 mM glukose. Etter bestemmelse av fasevinkelen ved 500 mM glukose, ble fiberen vasket flere ganger med 10 mM TRIS-buffer over et tidsrom på 60 minutter. På dette tidspunkt oppnådde man den samme fasevinkel som for 0 mM Glukose. Dette demonstrerer reversibiliteten av assayet.

Tabell 1 Absolutte faseforskyvninger for AF594-MBL og HMCV1-Dex70. PMT-tellingene gjenspeiler intensitetsøkningen av systemet.

Eksempel 6: Virkning av HMCV1-Dekstranets molekylvekt

Eksempel 5 ble gjentatt ved bruk av HMCV1-dekstran med en molekylvekt varierende fra 20 kDa til 250 kDa (fremstilt på analog måte som HMCV1-dekstran som ble brukt i eksempel 5). Man fant at den sterkeste faseforskyvning ble oppnådd ved bruk av 110 kDa HMCV1-dekstran. Resultatene vises på fig.1.

Eksempel 7: Virkning av forholdet mellom flekket MBL og HMCV1-dekstran

Eksempel 5 ble gjentatt ved bruk av et område av forhold mellom flekket MBL og HMCV1-dekstran. Man oppdaget at et 1:4-forhold mellom flekket MBL og HMCV1-dekstran (5 μM konsentrasjon av MBL-AF594-karbohydratgjenkjenningsdomener, CRD, hver med en molekylvekt rundt 25kDa, og 20 μM HMCV1-dekstran, molekylvekt 110 kDa) gav en økt respons. Resultatene vises i tabell 2.

Tabell 2 Absolutte faseforskyvninger for AF594-MBL 1:4 HMCV1-Dex110.

Glukose, Repons,

mM faseforskyvning

0 0

5 1,4

10 2,6

30 4,8

100 7,5

500 8,1

Eksempel 8: Sammenligning av stabiliteten av MBL og Con A

Eksempel 5 ble gjentatt ved bruk av MBL-AF594 og ConA-AF594 som lektin med 110 kDa HMCV1-dekstran som analyttanalog i fysiologisk TRIS-buffer (pH 7,4, natrium, kalium og kalsium som foreligger i fysiologiske konsentrasjoner). Glukosekonsentrasjonen ble variert mellom 2,5, 5 mM, 25 mM og 50 mM i sykluser over 12 dager.

Målinger ble utført i 5-minutters intervaller ved bruk av et miniatyrisert tidsoppløst fluorometer. I eksperimentet med MBL-AF594, var fasemålingene ved hvert glukosenivå konstant over tid. En signifikant avdrivning ble observert i eksperimentet med Con A, og førte til mer enn 10% reduksjon av den målte fase etter 20 dager. Resultatene vises på fig.2.

Eksempel 9: Fremstilling av aminert perjodatoksidert dekstran

70 kDa dekstran (200 mg, 0,00286 mmol) ble løst opp i vann (2,8 mL) og tilsatt til en 100 mM oppløsning av natriumperjodat i vann (2,8 mL, 100 ganger molart overskudd). Blandingen ble omrørt i mørke i 1 time ved romtemperatur. Den dannede blanding ble overført til et dialyserør (MWCO 10-12 k) og dialysert over natten mot 5 L vann.

Etter dialyse ble volumet justert til 8 ml. Det perjodatoksiderte dekstran ble delt opp i to alikvoter (4 mL, 100 mg hver) og behandlet i en halv time med henholdsvis 28% vandig ammoniakk (200 μL) og benzylamin (300 μL). Imin- og iminiumderivatene ble deretter redusert med natriumcyanoborhydrid (45 mg) over natten ved romtemperatur, og pH rundt 10.

Reaksjonsblandingen ble dialysert mot 2 x 1 L 20 mM TBS den følgende dag.

Graden av amininnlemmelse i det perjodatoksiderte dekstran ble bestemt ved bruk av elementanalyse.

Eksempel 10: Fremstilling av mannosylert HSA

4 konjugater ble fremstilt på den følgende måte.

To 4 x 2 ml Eppendorf-kolber fikk hver tilsatt HSA (10 mg) oppløst i en 20 mM karbonatbuffer (0,4 mL, pH 9,2).

p-Aminofenyl- α-D-mannopyranosylisotiocyanat (Man-ITC) (1,6 mL) ble tilsatt i 15, 30, 60, og 120 molart overskudd, ved å fremstille fire oppløsninger slik som det skal forklares i det følgende.

Man-ITC (11,9 mg) ble løst opp i DMSO (0,1 mL) og 20 mM karbonatbuffer (3,9 mL, pH 9,2). En alikvot (1,6 mL) av denne oppløsning (som tilsvarer 120 ganger molart overskudd) ble tilsatt til en Eppendorf-kolbe inneholdende HSA (0,4 mL). Resten av Man-ITC-oppløsningen ble fortynnet til dobbelt volum, og fra det fortynnede volum, tilsatte man en alikvot (1,6 mL) til en annen Eppendorf-kolbe. Denne prosedyre ble gjentatt inntil de fire forskjellige HSA:Man-ITC-blandinger var blitt fremstilt.

De fire reaksjonsblandinger ble inkubert i en rysteanordning over natten ved romtemperatur. De dannede glykokonjugater ble renset på en PD-10-kolonne. Under rensingen ble bufferen byttet mot TBS.

Graden av konjugasjon ble bestemt ved bruk av MALDI-TOF-MS.

Tabell 3 Bestemmelse av konjugasjonsgraden ved bruk av MALDI-TOF-MS. Toppbreddebedømmelse ble målt ved rundt halv høyde. Antallet mannose bestemmes ved bruk av den følgende ligning: (Topp i MS-66500) / 313

m/z (MALDI-TOF) Antall mannose per HSA.

HSA-Mannose 1:15 67500-70000 3-11

HSA-Mannose 1:30 67700-70600 4-13

HSA-Mannose 1:60 68100-72300 5-18

HSA-Mannose 1:120 68600-73400 7-22

De forskjellige HSA-mannose-konjugater har forskjellig affinitet for MBL.

Eksempel 11: ELLA-assay

Fremstilling av biotinylert MBL

Biotin-NHS (20 μl, 7 mg/ml i DMSO, ~10-15 ekv. per MBL-monomer) ble tilsatt til en oppløsning av MBL (3 ml, 0,53 mg) i PBS (3 mL). Oppløsningen ble forsiktig omrørt i 2 timer, deretter overført til et dialyserør (MWCO 10-12K) og dialysert mot TBS (2 x 1 L) i løpet av 24 timer. Det dannede biotinylerte MBL (0,2 mg/ml) i TBS ble brukt uten ytterligere rensing.

MBL-ELLA-assay

TBS-bufferen som brukes i ELLA-assayet, er 20 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,4.20 mM CaCl2brukes, hvor antigenet er HSA-mannose og 1,25 mM CaCl2(som etterligner fysiologisk kalsiumkonsentrasjon) brukes hvor antigenaminert perjodat-behandlet dekstran.

En 96-brønners mikrotiterplate ble bestrøket, over natten ved 5°C, med to kolonner av hvert antigen (HSA-mannose fra eksempel 10, aminodekstran, benzylaminoperjodatbehandlet dekstran fra eksempel 9) (100 μL, 20 μg/mL) i TBS. Gjenværende bindingsseter ble blokkert ved tilsetning av 1% (vekt/vol) HSA i TBS (150 μL). Brønnene ble deretter vasket (2 x 200 μL TBS). Fortynninger av glukose (fra 100 mM til 0 mM) i biotinylert MBL fremstilt slik som det ble beskrevet ovenfor (2 μg/mL), ble tilsatt til det samlede volum 100 μL. Etter inkubasjon i 2 timer ble platen tømt og vasket (2 x 200 μL TBS). Streptavidin-HRP 0,1% (vol/vol) (100 μL) i TBS ble tilsatt. Etter 1 times inkubasjon ble platene tømt og vasket (3 x200 μl TBS). Nærværet av HRP ble visualisert ved tilsetning av substratoppløsning (1 mg o-fenylendihydroklorid) og stanset etter 2 minutter med 1 N svovelsyreoppløsning. Fargeutviklingen ble bestemt ved å avlese absorbansen ved 490 nm, med subtraksjon av bakgrunn ved 630 nm.

Resultatene vises på figurene 3 og 4.

Eksempel 12: Kopolymersyntese

En vannløselig 40% mannosekopolymer ble fremstilt ved emulsjonspolymerisasjon som følger.

Til en 250 ml tre-halset rundbunnet kolbe utstyrt med et mekanisk røreverk og et nitrogenrør tilsatte man Span80-surfaktant (5,7 g; HLB [hydrofil-lipofil-balanse] 4,3, 10% vekt/vekt basert på toluen), AIBN (30 mg) og toluen (57,3 g). Kolben ble forseglet, spylt med nitrogen, og holdt under en nitrogenatmosfære under hele polymerisasjonen. Allyl- α-D-mannopyranosid (3,52 g), 2-hydroksyetylakrylat (2,552 g), og N-(3-aminopropyl)metakrylamidhydroklorid (0,356 g) ble løst opp i vann (12,7 g) og filtrert for å fjerne uløselig materiale. Denne blanding ble tilsatt til den kraftig omrørte blanding i den rundbunnede kolbe gjennom en gummiseptum.

Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil det dannedes en stabil emulsjon (30 min), deretter ved 60°C i 4 timer En oppløsning av VA-044 (1 ml, 60 mg/ml) ble injisert gjennom septum, og polymerisasjonen fortsatte over natten (17 timer). Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, og emulsjonen ble sprengt ved tilsetning av aceton. Dette forårsaket felling av polymeren, som ble samlet, gjenoppløst i vann og felt ved tilsetning av aceton. Produktet ble tørket over natten under vakuum for å gi 3,2 g (50%) rå lysegul polymer. En del av råpolymeren (1,0 g) ble løst opp i vann (10 ml), og dialysert (MWCO [molekylvekt-avskjæringspunkt] 25.000) i vann for å fjerne materiale med lav molekylvekt. Frysetørking gav 0,46 g (46%) fnuggete hvit polymer.

Eksempel 13: Flekking av kopolymer

Generelt følger merkingen av kopolymeren beskrivelsen som gis av Molecular Probes (produktinformasjon MP00143, Rev. juni 2001).

Kopolymeren (eksempel 12) (88,6 mg) ble løst opp i 10 mM NaHCO3-oppløsning (3 ml; pH 8,5). Polymeroppløsningen ble delt likt i tre Eppendorf-kolber. HMCV-1 (eksempel 3) (19,6 mg; 26,1 μmol) ble løst opp i tørt DMSO (600 μl). Fargestoffet ble tilsatt til polymeroppløsningene i 10 μl alikvoter hvert 30. sekund, på en slik måte at den første kolbe fikk til sammen 100 μl, den andre kolbe fikk 200 μl og den tredje kolbe fikk 300 μl. Etter tilsetningen av den siste alikvot, ble kolbene forsiktig omrørt i én time før oppløsningene ble dialysert (MWCO 10-12.000) i 10 mM TRIS-buffer med flere bufferskifter og inntil ingen farge var synlig i dialysebufferen (vanligvis 6-8 bufferskifter på 500 ml og 72 timer).

Eksempel 14: FRET-assay

Assaykjemi innbefattende flekket kopolymeroppløsning (eksempel 13) (4 µL) og flekket MBL-oppløsning (eksempel 1) (8,5 µL) i 10 mM TRIS-buffer (12,5 µL) ble blandet og fikk stå i minst 1 time etter blanding. Assaykjemien ble deretter overført til en fiber slik som det ble beskrevet i eksempel 5, med en sprøyte. Fiberen ble montert i en skreddersydd fiberholder som passet i en standard fluorescenscelle (10 mm x 10 mm).

Målinger ble utført slik som det ble beskrevet i eksempel 5, og vises i tabell 4.

Tabell 4

Glukose, Respons,

mM faseforskyvning

0 0

2,5 1,3

5 2,5

10 4,7

30 9,2

100 12

500 12,5

Eksempel 15: Sensorformulering og implantasjon

Fibre ble fremstilt av 1000PEGT80PBT20 polymer (fremstilt slik som det ble beskrevet i S. Fakirov og T. Gogeva, Macromol. Chem.191 (1990) 603-614 med et mål på 80 vekt% hydrofilt segment og 20 vekt% hydrofobt segment) ved å dyppe en glasstav med diameter 700 µm i en 15% vekt/vekt oppløsning av polymer i diklormetan (DCM) og la den tørke ved romtemperatur. Dette gav hule fibre med den ytre diameter 900µm med en lumen med diameter 700 µm. Fiberen ble fylt med 5 µM med hensyn til CRD av AlexaFluor ™-flekket MBL (eksempel 1) og 20 µM of HMCV-1-flekket aminodekstran 150 kDa (fremstilt ved en metode som var analog med metoden i eksempel 4). Oppvarming av polymeren for å smelte den, lukket fiberen. Den støpte fiber ble testet for lekkasje før testing og innføring.

Glukoseresponsen som ble målt ved bruk av tidsoppløst fluorescensspektroskopi (frekvensdomene), var slik som det fremgår av fig.5.

Denne type fiber kan plasseres i toppsjiktet av huden ved bruk av en nål. En nål av egnet størrelse (tilstrekkelig stor til å romme den våte fiber) plasseres parallelt med hudens overflate, i en dybde på ca.1 mm idet nålen er synlig som en skygge gjennom huden. Fiberen (fortsatt våt) plasseres inni nålen, og nålen fjernes. Typisk observerer man ingen blødning på innføringssetet etter fullført innføringsprosedyre.

Når fiberen er på plass, plasseres avlesningsanordningen direkte ovenfor fiberen og målingene kan begynne.