NO326022B1 - Farmasoytisk kombinasjon til forsterkning av vaksine-effetiviteten hos immunodefekte dyr, samt anvedelse av vaksinen pa immunodefekte dyr - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår en farmasøytisk kombinasjon til forsterkning av vaksine-effektiviteten hos immunodefekte dyr som har evne til å produsere antistoffer, samt anvendelse av en vaksine som i et immunodefekt dyr kan stimulere produksjonen av antistoffer mot et sykdomsfremkallende middel som er fremmed for dyret.

Mennesker, buskap og kjæledyr vaksineres ofte for å for-hindre eller lindre sykdommer. Vaksinering resulterer i produksjon av antistoffer som er serumproteiner som kan bindes spesifikt til antigensubstanser som anvendes i vaksinen.

Denne kroppsvæske-responsen involverer valg av spesifikke linjer av B-lymfocytter og forøkning og differensiering av utvalgte celler for å frembringe kloner av antistoff-produserende plasmaceller.

Antistoff-produksjonen når en topp innen flere uker

etter immuniseringen og avtar siden gradvis. På grunn av en konstant omsetning av serumproteiner etterfølges minskningen av antistoff-produksjonen av en tilsvarende minskning i det sirkulerende nivået av antistoffer. Om imidlertid en pasient får samme antigen initieres en ny svarkurve raskere og mer intenst enn den første. Dette kalles et sekundært reaktiverings- eller anamnestisk svar som hos friske pasienter resulterer i meget høyere antistoffnivåer med høyere affinitet til antigenet enn den første eller primære immuniseringen. Den økede graden av antistoffsyntese er resultatet av et økt antall av antistoff-produserende plasmaceller. Disse celler er sjeldne i lymfekjertlene hos en ikke-vaksinert pasient som for det meste har små lymfocytter. Hos friske pasienter ut-gjør imidlertid plasmaceller opptil 3% av det totale antallet lymfekjertelceller etter en primær vaksinering og så meget som 30% av lymfekjertelcellene etter en andre vaksinering.

Det anses at den andre responsen skyldes immunologisk minne. Det vil si at den friske organismen kan "huske" den tidligere eksponeringen av antigenet og reagere mer øyeblik-kelig og effektivt den andre gangen, selv om mengden av spesifikke antistoffer i serumet har sunket til et meget lavt nivå under tiden.

Visse forhold såsom alder, feil mat, narkomani, alkoho-lisme og visse sykdommer såsom diabetes og AIDS, leder til immunodefekt hvorved mange immunsvar undertrykkes og vaksineringen har minsket effektivitet. Det eksisterer derfor et behov for forbedrede vaksineringsteknikker, særskilt hos eldre eller på annet vis immunodefisiente pasienter.

I Thorpe L.W. et al. Ann. N.Y.Acad. of Sei. (1990), vol. 594, s. 78-84 beskrives mekanismen bak lymfocytt-aktivering ved hjelp av NGF, og viser at NGF forårsaker utskillelse av interleukin 2 (IL-2) i rotte. IL-2 er en viktig faktor som forårsaker differensiering og aktivering av B- og T-celler. Nærmere bestemt beskriver artikkelen at i rotteceller vil NGF forsterke produksjonen av IL-2, men indikerer også at NGF-stimulering av IL-2-aktiviteten var "highly variable". Artikkelen omtaler også at NGF-reseptorer er tilstede på B-lymfocytter. Imidlertid gis det ingen antydning eller forslag om at NGF forbedrer vaksine-effektiviteten hos immunodefkte dyr eller forbedrer produksjonen av antistoffer i slike dyr, som svar på en vaksine.

Melamed I. et al. Eur. J. Immunol. (1996), vol. 26, s. 1985-1992 identifiserer gp 140<trk> på overflaten av humane B-celler som reseptor for NGF. Videre vises at tilsetting av NGF til humane B-celler forårsaker fosforylering av gp 140"<* >som forårsaker B-cellenes differensiering og vekst. Artikkelen viser at NGF er en overlevelsesfaktor for B-lymfocytter. Imidlertid gis det ingen antydning eller forslag om at NGF forsterker vaksine-effektiviteten hos immunodefekte dyr eller forbedrer produksjonen av antistoffer i slike dyr som respons på en vaksine.

Ifølge Torcia M et al. Cell (1996), vol. 85, s. 245-356 blir NGF uttrykket og utløst av normale humane B-lymfocytter som også konstitutivt uttrykker NGF reseptorer <p>75<æ>FR og Pl40trlc"A. Videre vises at endogen NGF fungerer på en autokrin måte og opprettholder viabiliteten av cellene med overflate fenotypen av "memory" B-celler og in vivo neutralisering av NGF fører til avskaffelse av den sekundære humorale immunresponsen. Her indikerer altså at NFG produseres av B-celler og at endogen NGF er en autokrin overlevelsesfaktor for minne-B-lymfocytter. Men det gis ingen antydning eller forslag om at NGF forsterker vaksine-effektiviteten hos immunodefekte dyr eller øker produksjonen av antistoffer i slike dyr som respons på en vaksine.

Patentpublikasjonen WO 95/05845 beskriver farmasøytisk fremstilling av NGF i vandig isotonisk løsning. NGF fremstilt på denne måten kan anvendes i behandling av nervesykdommer. Nærmere bestemt omtaler publikasjonen en stabil formulering av NGF som etter valg .omfatter en biologisk akseptabel, vannoppløselig bærer, dvs. HSA (se side 3, linjene 22-34 og side 5, linjene 36-38). I de vandige formuleringene ifølge publikasjonen representerer imidlertid HSA et middel i likhet med en vaksine fordi det er ikke-antigent for mennesker, som følge av det faktum at de har menneskelig opprinnelse.

Det er velkjent for fagfolk på området at de protein-komponentene som benyttes til å preparere vaksiner, bær være tilpasset sin mottager. Likeledes vil fagfolk på området forstå at ethvert serum-albumin som brukes for å stabilisere et protein-basert medikament eller vaksine, også vil være tilpasset mottageren for å unngå muligheten av at serum-albuminet ville være et antigen for det subjekt som skal vaksineres.

Mens forannevnte WO-publikasjon beskriver NGF-formuleringer som kan brukes til behandling av neuronale lidelser, inneholder den ingen antydning eller forslag om at NGF forsterker vaksine-effektiviteten hos immunodefekte dyr eller øker produksjonen av antistoffer i slike dyr, som respons på en vaksine.

Patentpublikasjonen WO 95/30436 omhandler bruk av cytokiner som vaksineadjuvans. Denne omfatter en kombinasjon av minst to cytokiner eller funksjonelle derivater av disse som virker i synergi, der cytokinene spesifikt utvelges fra IL-1S og TNFa eller IL-1S og GM-CSF, og første og andre cytokiner virker sammen for å forsterke en immunrespons for et antigen (se side 4, linje 9-15). Publikasjonen foreslår ikke at NGF, som har en annen funksjonell rolle i immunsystemet enn IL-IS, TNFa og GM-CSF, kan erstatte den kombinasjon av cytokiner som er omtalt, med sikte på å forsterke effektiviteten av vaksine.

Til forskjell fra de cytokiner som er omtalt i sistnevnte publikasjon, ble NGF opprinnelig oppdaget i forbindelse med dens neurotrofiske aktivitet. Dens rolle til regulering av immunresponsen begynte å bli forstått meget senere. Betegnelsen "cytokin" refererer til en voksende famile av forskjellige molekyler som er involvert i mange ulike nivåer av immunitet, betennelse og hemotopoiesis. En fagperson på området foreslår at forskjellige cytokiner virker på ulike nivåer i immunsystemet. Spesielt vil NGF bindes til spesifikke reseptorer eller spesielle typer av celler som skiller seg fra de reseptorer som bindes av de spesifikke cytokiner som omtales i sistnevnte WO-publikasjon. Denne inneholder ingen antydning eller forslag om at NGF forsterker vaksine-effektiviteten hos immunodefekte dyr eller øker produksjonen av antistoffer i slike dyr, som respons på en vaksine.

Ifølge oppfinnelsen består det nye og særegne ved den innledningsvis angitte farmasøytiske kombinasjon, i at den omfatter

en vaksine som i et dyr kan stimulere produksjonen av antistoffer mot et sykdomsfremkallende middel som er fremmed for dyret; og

en vaksine-effektivitetsforsterkende mengde av nervevekstfaktor (NGF) som forsterker produksjonen av antistoffene i dyret som svar på vaksinen.

Vaksinen og NGF kan administreres separat eller sammen. Ifølge et annet aspekt omfatter oppfinnelsen anvendelse av en vaksine som i et immunodefekt dyr kan stimulere produksjonen av antistoffer mot et sykdomsfremkallende middel som er fremmed for dyret; og en vaksine-effektivitetsforsterkende mengde av nervevekstfaktor (NGF) som forsterker produksjonen av antistoffene i dyret som respons på vaksinen; til preparering av en farmasøytisk kombinasjon beregnet for vaksinasjonen, i hvilken vaksinen og nevnte NGF kan administreres separat eller sammen, og i hvilken effektiviteten av vaksinen i dyret forsterkes gjennom nevnte

NGF.

Ytterligere nye og særegne trekk ved den farmasøytiske kombinasjonen og den nevnte anvendelse, fremgår av patentkravene.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 er et diagram som viser produksjonen av antistoffer i voksne mus som har blitt behandlet ifølge oppfinnelsen, jamført ved en kontroll. Fig. 2 er et diagram som viser en forsterket produksjon av antistoffer i gamle mus med anvendelse av foreliggende oppfinnelse, jamført med en kontroll. Fig. 3 er et diagram som viser antistoff-produksjon i unge

og gamle mus.

Fig. 4 er et diagram som viser forsterket produksjon av antistoffer i gamle mus ifølge den foreliggende oppfinnelse, etter tre måneder fra vaksineringen, jamført med en kontroll.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMENE

Det har uventet vist seg at nervetilvekstfaktorer ikke bare virker på nervesystemutvikiingen, men har en viktig rolle, i immunsystemsfysiologien. Minne-B-celler, lymfocytter som husker (minner) en organismes møte med en gitt kjemisk struktur (antigen), produserer og sekreterer NGF, binder den gjennom celleoverflatereseptorer og svarer på dens biologiske budskap (autokrin krets for produksjon og svar fra samme celle), forblir levende under mange år eller til og med hele livet for organismen i varians med resten av lymfoid-cellene som har et meget kortere liv.

Uten å være bundet av noen spesiell teori, tror man at foruten aktiviteten av NGF for å bibeholde overlevelse av

minne-B-celler, kan NGF også påvirke tilblivelsen av disse og på en positiv måte virke som forløpere for dem. Minne-cellen kan komme fra evnen til å produsere NGF, stokastisk ervervet av en progenitor-celle som ellers skulle dø av apoptosis (selvmord) noe som ville gi opphav til den autokrine kretsen som for opprettholding av differensieringen til stadiet for modne minne-celler og deretter overlevelse av disse. Administreringen av exogen NGF til dyr gir således opphav til høyere antall minne-celler. En større samling av minne-celler gir individet en større og mer varig beskyttelse mot antigenet. Forbedringen viser seg enda mer ved forhold som immuno-def ekter, f.eks. høy alder i hvilke mange immunresponser

undertrykkes. Ved å eske antall minne-B-celler forbedrer NGF immunsystemets evne til å kjenne igjen antigen i en meget lav konsentrasjon på grunn av den høyere affiniteten til overflaten på antistoffer på minne-B-celler.

Den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes på dyr som har evnen til å danne antistoffer i en immunreaksjon såsom pattedyr omfattende mennesker, buskap og kjæledyr, samt fugler såsom tamhøns.

Etter hvert som personer blir eldre, avtar deres immunrespons, og vaksinasjonens effektivitet reduseres på grunn av nærværet av en lav affinitet av antistoffrespons. Følgelig er oppfinnelsen særskilt anvendelig for anvendelse for mennesker over en alder av 45, særskilt de som er eldre enn 50 og mere.

Oppfinnelsen kan også anvendes til transplanterings-pasienter som er immunodefekte som et resultat av administrering av anti-avstøtningsmiddel, såsom cyklosporin.

Det antas at foreliggende oppfinnelse kan anvendes med hvilken som helst kjent vaksine og eksempel på slike omfatter influensavaksine, hemofilus-influensavaksine, hepatitt-A-virusvaksine, hepatitt-B-virusvaksine, hepatitt-C-virusvaksine, tuberkulosevaksine, herpes-zoster-virusvaksine, cytamegalovirusvaksine, pneumokokkal-pneumonisvaksine, meningokokkal-meningittvaksine, difterivaksine, tetanus-vaksine, rabiesvaksine, helicobakterpylorivaksine, polio-vaksine og koppevaksine.

Det antas også at oppfinnelsen kan anvendes i fremtidige vaksiner, såsom en vaksine som kan utvikles for vaksinering mot AIDS-virus.

I alminnelighet administreres vaksiner i mengder i området fra ca. lx 10"' g til ca. lx IO"<3> g og mere vanlig i et område av fra ca. lx 10"a g til ca. lx IO"<4> g.

Vaksine-effektforsterkende mengder av NGF administreres i alminnelighet i mengder i området av ca. 0,001-100 mg/kg kroppsvekt av mottageren, fortrinnsvis i mengder av ca. 0,1-10 mg/kg og mer ønsket ca. 0,3-3 mg/kg.

Ifølge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen kan NGF administreres før og/eller samtidig med administreringen av vaksinen.

Den foreliggende oppfinnelsen er særskilt effektiv ved administrering i samband med en sekundær (reaktiverings) vaksineringsdose. Sekundære eller reaktiveringsvaksinasjons-doser administreres vanligvis under en tidsperiode av ca. 1 uke til ca. 2 måneder etter administreringen av den første (primære) vaksineringsdosen, fortrinnsvis under ca. 10-45 døgn etter den første vaskineringsdosen, ennå mer fortrinnsvis under ca. 10-30 døgn etter administreringen av den første vaksineringsdosen og ifølge visse utføringsformer under ca. 10-20 døgn etter administreringen av den første vaksineringsdosen.

Ifølge en utførelsesform administreres en dose av NGF ca. 3-4 dager før administreringen av den sekundære (reaktiverings-) vaksineringsdosen. I særskilt foretrukne utfør-elsesformer administreres NGF også samtidig med administreringen av vaksinen.

Administreringen av NGF og vaksinen kan utføres på en eller annen passende måte såsom med hjelp av injeksjon, infusjon eller oralt. I særskilt foretrukne utførelsesformer skjer administreringen gjennom injeksjon.

Videre kan NGF administreres gjennom innføring i en mottagers myoblaster inkluderende en vektor som har et gen kodet for NGF, idet NGF fremstilles av myoblastene i mottageren for forsterkning av immunsystemets effektivitet.

Fordi en vaksine og NGF administreres samtidig kan de gis som en enkel komposisjon inkluderende vaksinen og NGF.

Sammensetninger inkluderende en vaksine og/eller NGF kan også inkludere en eller flere farmasøytisk akseptable bærere og eventuelt andre terapeutiske ingredienser. Formuleringer som er passende for injeksjon eller infusjon inkluderer sterile injeksjonsløsninger som inneholder vann eller er vannfrie, hvilke kan eventuelt inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostater og løste stoffer som gjør formuleringene isotoniske med blodet hos den tilsiktede mottageren og vannholdige og ikke-vannholdige sterile suspensjoner som kan inkludere suspensjonsstoffer og fortykningsmiddel. Formuleringene kan forekomme i enhetsdoser eller multidosebehold-ere, f.eks. forseglede ampuller og medisinflasker og kan lagres i en frysetørket (lyofilisert) tilstand hvilket krever bare tilsetning av den sterile væskebæreren, f.eks. vann for injeksjon umiddelbart før anvendelse.

NGF som anvendes tilpasses fortrinnsvis til mottageren,

f.eks. anvendes fortrinnsvis menneskelig NGF for en mottager som er et menneske. Den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes på native (f.eks. naturlige forekommende) NGF, samt synte-tisk NGF og rekombinant NGF som tilsvarer nativt NGF, med aminosyresekvensen for nativt NGF, biologisk aktive amino-syresekvenser som i hovedsak ligner dette eller en forkortet sekvensform derav og de biologisk aktive analogene med sub-stituerede strøkne, forlengede, erstattede eller på annen måte modifiserte sekvenser som har en bioaktivitet som hovedsakelig er lik den hos NGF.

Oppfinnelsen illustreres videre ved hjelp av eksempel 1, som ikke er tilsiktet å være begrensende.

EKSEMPEL 1

To grupper av ti gamle (> 5 måneder gamle) C57/BL6 mus av hunnkjønn ble vaksinert i.p. med 0,1 mg pr. mus av (4-hydroksy-5-iodo-3-nitro-fenyl)acetyl-bovinserum albumin (NIP-BSA) (Reth et al, 1978) i 0,1 ml fosfat-buffret saltløsning (PBS) som var resuspendert i 0,1 ml komplett Freunds adjuvans. Etter 21 dager ble dyr i en gruppe injisert med 50 (ig pr. dyr med musnervetilvekstfaktor (NGF) som hadde blitt renset fra submandibulære saliv-kjertler mens dyr i den andre gruppen ble behandlet med samme mengde av renset NGF som tidligere hadde blitt inaktivert ved hjelp av oppvarming (72°C i 20 min.). Etter ytterligere fire dager fikk dyret i de to gruppene samme NGF-behandling som ovenfor og alle musene ble reaktiverte med 0,1 mg NIP-BSA i ufullstendig Freunds adjuvans. Etter fire dager tok man 0,4 ml blod fra hvert dyr ved hjelp av retroorbitalpleksus utsugning, og anti-BSA-antistoffene ble nøytralisert ved hjelp av en tilsetning av BSA til serumprøvene. NIP-spesifikk IgG titer ble deretter undersøkt i ELISA. Platene belades med NIP-BSA (35 jig/ml i PBS) og etter metning med PBS inneholdende 1% BSA og skylling med PBS med 0,05% (vekt-%) ble tween-20 belagte skåler inkubert i 1 time ved 37°C med serieutspredning av musesera, hvorved en oppsamling av pre-immune musesera anvendes som en negativ kontroll. Bundet lg ble detektert ved hjelp av en tilsats av alkalisk fosfatkonjugert geit-antimus IgG. Sluttreaksjonen ble visualisert ved hjelp av inkubering med NPP (sigma) substratløsning og absorbansen ved 405 nm ble registrert. Resultatene vises i tabellen A nedenfor og på

fig. 1 og 2.

Fig. 1 og 2 viser at NGF-behandlingen øker dramatisk titeren av serum NIP-spesifikk IgG i eldre mus mens det ikke har noen effekt på svaret i yngre mus.

Affiniteten for den antigeniske determinanten (NIP-BSA) for den spesifikke IgG som produsertes i NGF-behandlede og i kontrollmus ble analysert på en BIAcore maskin med anvendelse av NIP-BSA koblet til dekstran som en sensorchip. Resultatene av disse eksperimentene indikerer at IgG affiniteten for antigenet er meget lavere i eldre mus enn hos unge mus, og indikerer en defekt hos gamle minne-celler. NGF-behandlingen av eldre mus kan imidlertid restaurere produksjonen av høy-affinitets-IgG og således modifisere ikke bare kvantiteten, men også kvaliteten av det humorale immunsvaret (data ikke vist).

For å forsikre om at denne enkle NGF-administrer-ingsmåten kunne vedlikeholde en høy titer av spesifikt IgG under en lengre periode etter vaksineringen, tok vi blodprøv-er fra den samme gruppen av eldre vaksinerte mus tre måneder etter reaktiveringen med NIP-BSA. Serumtiter av NIP-spesifikk IgG ble målt med ELISA. Fig. 4 viser at gruppen av NGF-behandlede dyr hadde en tydelig titer av NIP-spesifikt IgG til og med etter en lang periode fra reaktiveringsvaksi-neringen. Disse resultater indikerer at kvaliteten og kvantiteten av det humorale immunsvaret hos eldre mus kan rettes med selv en enkel NGF-administrering ved slutten av det primære svaret, da man vet at modning av minne-B-celler forekommer. NGF-behandlingen ved dette tidspunktet øker overlevelsen av minne-B-celler som hos eldre mus selv ikke kan produsere cytokin. I kontrast til dette er NGF-behandling ineffektiv hos normale unge dyr, hvis minne-lymfocytter kan produsere tilstrekkelig mengder av NGF og således overleve. Data indikerer dessuten at NGF-administreringen kan være til hjelp i nesten alle tilstandene av primær eller sekundær immunodefekt som karakteriseres av et svekket humoralt immunsvar (kreft, AIDS, kronisk inflammasjon, osv.).

Oppfinnelsen beskrives videre gjennom følgende eksempel 2 .

EKSEMPEL 2

OPPSUMMERING

Produksjon av nervetilvekstfaktor (NGF) ble utført i kulturer av menneskelige T- og B-lymfocytter og makrofager. NGF ble produsert vesentlig bare av B-celler som også hadde overflate pl40tr<k>"<A> og p75<NGFR->molekyler og som derfor bandt . effektivt og internaliserte cytokin. Nøytralisasjon av endogen NGF forårsaket forsvinning av bcl-2 protein og apoptotisk død av hvilende lymfocytter som hadde en overflate av IgG eller IgA, en populasjon som omfatter minne-celler, mens overflate IgM/IgD "virgin" B-lymfocytter ikke ble påvirket. In vivo-administrering av nøytraliserende anti-NGF antistoffer forårsaket sterk reduksjon i titeren av spesifikk IgG i mus som var vaksinert med tetanustoksoid, nitrofenol eller arsenat og forminsket antall overflate IgG eller IgA B-lymfocytter. NGF er således en autokrin overlevelsesfaktor for minne-B-lymfocytter.

INTRODUKSJON

Nervetilvekstfaktor (NGF), som ble beskrevet og karakterisert for nærmere tredve år siden (Levi-Montalcini, 1987; Cohen, 1960) som det første løselige signalet som overfører intercellulære kommunikasjoner, er et medlem av proteinfamilien som er kjent som neurotrofiner, som er kritiske for regulert utvikling og overlevelse av neuronceller (Barde, 1990). Dens rolle i vedlikeholdet av overlevelsen av neuroner fra sympatetisk og sensorisk ganglia har vært forstått i flere tiår (Levi-Montalcini og Angeletti, 1966, 1968). I de siste årene har disse første observasjonene blitt utvidet til andre populasjoner av sentrale nervesystem-neuroner inkluderende kolinergiske celler i den basale fremre hjernen (Johnson et al., 1986; Shelton og Reichardt, 1986). Det antas at NGF, i lihet med andre neurotrofiner, fremstilles i nervesystemet ved hjelp av hjelpeceller for eksempel glial-celler og oligodendrocytter (Ernfors et al., 1990, Hofer et al., 1990) som derfor regulerer differensierings-prosessen av neuroner i hovedsak gjennom utformningen av parakrine kretser.

Neurotrofinene, inkludert NGF, hjerneskapt neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofin-3(NT-3), og NT4/5, utøver sin virkning på cellemål via spesifikke overflatereseptorer som ved binding og internalisering av liganden utløser en kaskade av biokjemiske hendelser representerende det adaptive svaret (oversikt av Barde, 1990). To klasser av neurotroforbindende seter.kan identifiseres på målceller basert på lav (Kd 1 nM) og høy (Ka 20 pM) affinitet for ligander. Den molekylære naturen av disse reseptorene har nylig blitt karakterisert (Meakin and Shooter, 1992). Et 75 kDa glykoprotein som kalles p75<NGFR> overfører lavaffinitetsbinding av hvilken som helst neurotrofin med lignende affinitet (Chao, 1994). Proteiner som tilhører familien av trk-tyrosinkinase-reseptorer, som samvirker med neurotrofiner på en ytterst spesifikk måte, er ansvarlig for høyaf f initetsbinding. pl40<t>rk~A kombinerer med NGF, pl40<trk>"<B> med BDNF og pl40<trk>~<c> med NT-3 og NT-4/5 (Barbacid, 1994). Hver klasse av reseptorer leder sannsynligvis distinkte signaler til målcellen ettersom det ser ut til at p75<NGFR> og pl40<trk>"<A> ikke danner NGF-binding av heterodimerer (Jing et al., 1992). Det er interessant at p75<NFGR> viser strukturell homologi mot tumornekrosfaktorreseptorer I og II, lymfocyttoverflateantigenene CD30, CD40, 0X40 og Fas/Apo-1 overflateantigen, molekyler som er involvert i forhindring eller mediering av apoptosis (oversikt av Raffioni et al, 1993) .

Etter den første beskrivelsen av rensningen av NGF fra mus maksillære kjertelceller var det åpenbart at denne faktoren også ble produsert av flere ikke-nervecelletyper (Levi-Montalcini, 1987), inkluderende keratinocytter (Di Marco et al. 1993) og myke muskelceller (Ueyama et al, 1993). Likeledes har ekspresjon av trk-protoonkogen blitt rapportert gjennom immunceller såsom monocytter (Ehrard et al., 1993a) eller T-lymfocytter (Ehrard et al., 1993b). Det antas derfor at neurotrofiner, særskilt NFT, kan ha viktige roller utenom nervesystemet.

Disse to bevislinjene sammen med den strukturelle homologien av p75<NGFR> til en serie av overflatereseptorer omfattende dem for cytokiner og med de observerte forhøyde plasmanivåene av NGF i pasienter med visse autoimmune sykdommer (Dicou et al., 1993; Bracci-Laudiero et al., 1993; L.B.-L, L.A. , E.G., og G. Rasi, upublisert observasjon) førte en undersøkelse til om NGF og/eller dens reseptorer ble uttrykt av celler i immunsystemet. Her har det vist seg at NGF synte-tiseres og frigjøres under basale forhold av normale menneskelige B lymfocytter som også hovedsakelig uttrykker både p75 - og pl40 -reseptorkjeder. Dessuten fungerer endogen NGF på en autokrin måte for vedlikehold av levedyktigheten for celler med overflatefenotypen av minne-B-celler og dets nøytralisasjon in vivo opphever en sekundært humoral immunrespons .

RESULTATER

NGF-PRODUKSJON AV NORMALE MENNESKELIGE IMMUNOKOMPETENTE CELLER

I løpet av en studie for å bedømme plasmanivåer av NGF i forskjellige patologiske prøver la vi merke til at særskilt høye mengder av cytokin fantes i pasienter med kronisk lever-sykdom og andre autoimmune tilstander. For å bestemme hvilken celletype, om det fantes noen, blant immunokompetente celler som var ansvarlig for NGF-produksjonen, ble normale periferale blod- eller tonsilmononukleære celler (MNC) i T-fraksjonerte celler, B-celler og monocytter. Disse cellene ble dyrket i nærvær eller fravær av relevante stimuli og deretter testet for biokjemiske bevis av NGF-syntese og sekresjon. Bare B-lymfocytter produserte i hovedsak NGF og genereringen fra disse av NGF ble forsterket av stimulering med Staphylo-coccus Aureus av I Cowan-stammen (SAC) (a). Immunoblotting viste et stort bånd i B-lymfocyttkondisjonert medium med anti-NGF-antistoffer, men ikke med ikke-immum IgG (data ikke vist). Immunopreparasjon av metabolsk merkede B-celler i oversjiktet viste også et enkelt stort bånd med M, 13 kDa under reduserende forhold eller med M, 26 kDa under ikke-reduserende forhold, hvilket nærvær ble blokkert av inklusjon av et overskudd av ikke-merket NGF. Kinetiske studier av B-cellelysater og oversjikt viste ikke NGF-ansamling (data ikke vist). I kontrast til disse resultatene med B-celler ble ikke noen NGF-produksjon observert med T-lymfocytter eller monocytter, ikke engang etter stimulering. Selv om det ganske nylig har blitt rapportert at visse T-celle-kloner kan produsere NGF (Ehrard et al., 1993b) viser det seg at slike celler er svakt representert i en normal periferal blod- eller tonsilprøve (basert på analyse av cellepopulasjoner fra i det minste tyve forskjellige donerer) og B-celleproduksjonen kom derfor i fokus.

B-lymfocytter ble fraksjonert med tetthetsgradienter og fraksjoner med lav eller høy tetthet ble studert som repre-sentative for henholdsvis hvilende og in vivo-aktiverte celler. Begge B-cellepopulasjonene produserte og friga effektivt NGF (dette sistnevnte =60% mere enn det først-nevnte, data ikke vist). De hvilende B-cellene ble stimulert deretter med antistoffer mot den menneskelige immunoglobulin-kjeden med konstant region pluss interleukin-4 (anti-(i+IL-4) eller med SAC, to stimuli som er aktive på B-celler, den førstnevnte aktiverende bare overflate IgM<+->celler og den sistnevnte aktiverende alle B-lymfocytter (Romagnani et al., 1982). Det var klart at anti-|i+IL-4-stimuleringen var ineffektiv mens SAC forsterket kraftig NGF-syntesen og sekresjonen. Analyse av oversjikt av lignende kulturer gjennom ELISA bekreftet at anti-ji+lL-4-stimulerte celler og ustimulerte celler gradvis reduserte NGF-produksjonen, mens SAC-stimulerte celler økte denne sterkt. I kontrast til dette var begge stimuli effektive med hensyn til induksjon av proliferative stimuleringsindekser >10 og >20. Disse resultat viser at SAC, men ikke anti-(i+IL-4, utløste en metabolsk gangvei som ga NGF-produksjon. En alternativ forklaring var at lymfocytter som normalt gir respons på anti-p.+Il-4, det vil si de fleste virgo s|a.<+>8<+->celler ikke forandret NGF-produksjonen (eller eventuelt ikke kunne produsere den) fulgt av sig tverrbinding, mens de lymfocyttene som gir respons på SAC, en populasjon som også omfatter celler med sy<+> eller sa<+>(sy<+>/a<+>) av fenotype, gjorde, antyder at cytokinet var involvert i funksjonelle programmer som er spesifikke for den sistnevnte celletypen.

EKSPRESJON AV NGF-RESEPTORMOLEKYLER AV NORMALE MENNESKELIGE IMMUNOKOMPETENTE CELLER

Observasjonen at NGF ble produsert av B-lymfocytter ga anledning til en bestemmelse av om NGF-reseptorer også var nærværende og skulle gjøre det mulig med en autokrin tilbake-førsel. For å gjøre dette ble tonsil eller periferale blod-celler som T-celler, B-celler og monocytter studert på ekspresjon av de to NTG-bindingsmolekylene som vises av celler i nervesystemet, pl40<trk>"<A> (trk) og p75æFR. Western blot-. analyser av cellelysater ved anvendelse av spesifikke antistoffer viste at hver og en av celletypene som ble studert uttrykte trk-molekylen. Det var interessant at P75"0™ ble produsert bare av B-celler. Dessuten ble samme celler studert ved hjelp av FACS fulgt av merkning med antistoffer til p75<NGFR->kjeden og med Tmg 13,1, et nylig beskrevet monoklonal antistoff mot ekstra cellulær cytokinbindingsregion av trk-molekylet (Eager, 1991). I samsvar med den immunokjemiske undersøkelse ble det observert dobbel merking bare på B-celler,mens T-celler og monocytter var bare merket med Tmg 13,1 (data ikke vist).

Den samtidige ekspresjonen av begge reseptorkjedene av B-lymfocytter, en situasjon som er typisk for nerveceller, indikerer at disse cellene var i stand til å gi respons på hele området av signaler som kom fra cytokinen. B-celler ble derfor undersøkt med det målet for øyet at man skulle få data som er relevante for den funksjonelle rollen av NGF i lymfocytter .

For å demonstrere binding av cytokin, og for å analysere de funksjonelle effektene, ble tonsil B-lymfocytter separert i små og store celler og undersøkt på sin evne til å binde og internalisere NGF med anvendelse av eqvilibrium bindingsprøv-er. Både hvilende og in vivo aktiverte B-celler interngjorde effektivt <125>I-NGF (data ikke vist) . Metningskurver av en <125>i-NGF og deres Scatchard-transformasjoner som ble oppnådd med store og hvilende B-celler ble observert. Store celler uttrykte såsom ventet, to klasser av bindingsseter hvilket viste at Kd 30 pM (30.000 seter/celle) og Ka 1 nM (IO<6> bindingsseter/celle) overensstemte med de data som hadde blitt rapportert for nerveceller. Det var overraskende da den samme analysen ble utført på små hvilende B-celler at ingen met-ningsbar binding kunne observeres, ikke engang ved inkubasjon med meget høye <125>I-NGF-konsentrasjoner (data ikke vist) til tross for den åpenbare ekspresjonen av begge reseptorkjedene og den effektive interngjøringen av cytokin. Denne markerte uoverensstemmelsen indikerte muligheten for at den endogene liganden okkuperte reseptorsetene, en situasjon man ofte møtte da autokrine kretser virker (Cozzolino et al., 1989;

Cozzolino et al., 1990). Rensede små B-lymfocytter ble derfor i

kort (60 sekunder ved 4°C) behandlet med et kulturmedium som hadde blitt buffret til pH 3,0 og deretter vasket med et regulært medium før bindingsforsøket. Under disse forholdene kunne både høy- og lav-affinitets (Kd 17 0 pM og 1 nM) reseptorer med 90.000 og IO<6> bindingsseter pr. celle detekteres. For ytterligere å styrke hypotesen at disse seter virkelig hadde blitt okkupert av NGF på grunn av eksistensen av en autokrin sløyfe, ble de sure pH-eluatene (og de nøytrale pH-eluatene som kontroller) kjørt i SDS-PAGE, blottet, og merket med spesifikke anti-NFT-antistoffer. Cytokinen ble detektert bare i de sure eluatene. Disse resultatene bekrefter ekspresjonen av to klasser av fullt funksjonelle NRF-reseptorer av B-lymfocytter.

VIRKNING AV ENDOGEN NGF-NØYTRALISASJON I B-LYMFOCYTTER

De ovennevnte data som indikerer at B-celler produserte NGF og uttrykte høy- og lav-affinitetsreseptorer, underbygde hypotesen om en autokrin krets. For å forstå funksjonen som ble utøvd av denne kretsen, ble endogen NGF nøytralisert og dens virkning på egenskapene hos B-lymfocytter ble klargjort. For dette formål anvendes enten nøytraliserende antistoffer for NGF eller i utvalgte eksperiment NGF-antisensoligonukleo-tider. Anti-NGF-antistoffer ble først testet i konvensjonelle <3>H-tymidin inkorporeringsprøver under anvendelse av hvilende periferale blod eller tonsil B-lymfocytter som var stimulert med anti-n+Il-4 eller med SAC. Begge stimuleringene induserte et kraftig svar i nærvær av kontroll pre-immun antistoffer; i nærvær av anti-NGF-antistof f er, svaret på anti-|i+IL-4 var upåvirket, mens det for SAC minsket med 20-30% (Tabell 1), hvilket initial tydet på at NGF var involvert i det proliferative svaret på SAC. En tilsats av eksogen rekombinant NGF kunne imidlertid ikke øke <3>H-tymidin-inkorporasjonen (Tabell 1) selv i nærvær av suboptimale doser av stimuleringsmiddel (data ikke vist), hvilket isteden tyder på at cytokin ikke virket som en tilvekstfaktor. Spontan profilerasjon av in vivo pre-aktiverende B-celler med lav densitet ble ikke modulert av anti-NGF-antistoffer (data ikke vist). Disse stimuleringseksperiment med anti-(i+Il-4 eller SAC indikerte igjen at forskjellige cellerpopulasjoner ga respons på . mitogenene og at de kunne funksjonelt deles på basis av NGF-anvendelsen i tillegg til NGF-produksjonen. For å få støttte for dette konsept, ble hvilende tonsil B-lymfocytter separert ved vasking i s|T8<+->celler og sy<+> og scf-celler (syVa<+>) som deretter ble stimulert med SAC eller anti-jx+IL-4. Tabell 1 viser at proliferasjonen av sfT8<+->celler i svar til SAC ikke ble påvirket av nøytralisering av anti-NGF-antistoffer. Som man kunne vente seg var prolif eras jonen av syVo<f->celler til anti-|i+IL-4 meget svak (data ikke vist) , mens disse celler var meget responsive på SAC da stimuleringen ble utført i nærvær av anti-NGF-antistoffer, <3>H-tymidin-inkorporering ble redusert med >80% (p<0,0001). Dette resultatet jamføres med resultatene av eksperimentene på NGF-produksjon, tyder på at cytokinet var kritisk for syVof-celler og sannsynligvis dispensabelt for sjj.<+>8<+->celler.

Disse data førte til ytterligere utforskning av effektene av NGF på hvilende s|i<+>8<+->celler og syVa<+->celler. Tatt i betraktning at man mislyktes med å øke in vitro tilvekst av B-celler (tabell 1) og med tanke på den kjente egenskapen hos NGF med å bevare overlevelsen av neuronceller (i dens fravær gjennomgår disse cellene apoptosis), undret man om NGF kunne forsterke overlevelsen av hvilende sn<+>8<+->celler eller syVa<*->celler. De ovennevnte populasjonene renset fra tonsiler, ble dyrket i nærvær av anti-NGF antistoffer eller NGF antisen-soligonukleotider under varierende tidsintervaller og forholdet mellom fragmentert/intakt DNA, som et mål på den prosent av cellene som gjennomgår apoptosis, ble registrert.'. Da s|i<+>8<+->cellene ble analysert var like deler av cellene apoptotiske, både dem som ble behandlet med anti-NGF reagenser og dem med pre-immun IgG for kontroll (eller sensoligonukleotider). I kontrast til dette inneholdt kulturer av syVcf-celler som ble behandlet med anti-NGF antistoffer eller oligonukleotider inneholdt mere enn 60% apoptotiske celler etter 60 timer, mens kontrollkulturene hadde mindre enn 20% apoptotiske celler (p<0,0001); og det interessante var at kinetikken av apoptise var meget lavere i samsvar med den hos s|x<+>8<+->celler, hvilket indikerer en viktig forskjell i livspotensialet mellom de sistnevnte cellene og syVa+-celler in vitro.

Sett som en helhet viste denne rekken av eksperimenter at endogen NGF var en autokrin overlevelsesfaktor for sy*/ a-celler ettersom nøytralisasjonen utløste deres apoptotiske død, men ikke for s|<T>8<+->cellene hvilket indikerer at bare de førstnevnte cellene kunne utarbeide cytokin. For å teste dette konseptet ble rensede populasjoner analysert på NGF produksjon av ELISA. Det var åpenbart at sy<+>/a<+->celler ble produsert i det minste åtte ganger mere NGF enn s|<T>8<+->celler (409 19 pg/10<7> celler vs 51 4 pg/107 celler; n =9) .

For å sikkert avgjøre om den funksjonelle forskjellen mellom undersettene skyldtes anvendelse i steden for produksjon av NGF, ble en viktig determinant undersøkt på veien som leder til apoptos, bcl-2-proteinomsetning (Korsmeyer, 1992). Rensete hvilende sy*/ a og s|T8<+->populasjoner ble dyrket med anti-NGF eller kontrollantistoffer i 18 timer og deretter lyset for å kunne analysere deres intracellulære innhold av bcl-2-protein. Nøytralisasjon av endogen NGF forårsaket fullstendig forsvinning av bcl-2-protein fra syVcf-celler, mens berørte ikke bcl-2-protein-innholdet i sji<+>8<+->celler, hvilket avdekket en stor forskjell mellom subpopulasjonene i forhold til NGF-anvendelse.

ANTI-NGF-ANTISTOFFER TØMMER MINNE-B-CELLER IN VIVO

Ettersom sfj.<*>8<+->fenotyp idenfifiserer virgin B-celler mens celler med sy*/ a- f enotyp omfatter de lymfocytter som allerede har gjennomgått prosessen med lg konstant-region klasseskifte inkluderende minne-B-lymfocytter (Kishimoto og Hirano, 1989; Sprent, 1994), tenkte man at den autokrine NGF fungerte som en overlevelsesfaktor for minne-B-celler og man bestemte seg for å teste dette konsept med anvendelse av en in vivo-metode for analyse av de veldefinerte hapten-spesifikke systemer nitrofenol-BSA (NP) eller arsonate-KLH (Ars) eller det komplekse (mosaik) antigensystemet tetanustoksoid (TT). Først ble det vist at en vesentlig identitet mellom mennesket og murin B-celler med tanke på NGF-syntese (murin sy*/ a* og s(i<+>8<+->celler produserte hovedsakelig 234±21 og 28±3 pg/10<7> celler), NGF reseptorekspresjon (murin ikke-fraksjonert slg<+->celler uttrykte 4800 høyaffinitets (Kd= 135 pM) og =10<6> lavaffinitet (Kd=l,l nM) bindingsseter pr. celle) og den funksjonelle

. signifikansen av cytokin for celleoverlevelse in vitro (syVcT-celler viste ca. 70% DNA-fragmentering etter ekspo-nering før nøytralisering av anti-NGF-antistoffer). Grupper av tyve BALB/c eller C57BL/6 mus ble således vaksinert med det relevante antigenet og etter 40 døgn fikk en gruppe av ti dyr en enkel dose av nøytraliserende anti-NGF IgG, mens de andre ti musene ble injisert med ikke-immun IgG som kontroll. Etter ytterligere 48 timer fikk alle dyrene en forsterknings-dose av det respektive antigenet og fire døgn senere ble alle musene tatt av dage, og plasmakonsentrasjonene av antigen-spesifikk IgM og IgG ble bestemt ved hjelp av ELISA. Dyr som fikk anti-NGF-antistoffer viste nivåer av spesifikk IgG til immunogen merkbart lavere enn de hos kontroildyrene (p<0,001). I kontrast til dette ble det ikke observert noen forskjell i konsentrasjonen av antigen-spesifikk IgM indikerende at det antistoff-svaret som ble generert av de nylig skapte virgin-B-lymfocyttene som møtte immunogenet, og det andre "primær"-svaret ble ikke påvirket. For å ytterligere forsterke den sistnevnte konklusjonen ble to ytterligere grupper av mus først behandlet med anti-NGF IgG eller med

kontroll IgG hvoretter (48 timer senere) de ble immunisert med TT og etter en uke ble de ofret for bestemmelse av deres plasmanivå av TT-spesifikk IgM, hvilket ikke var statistisk forskjellig i to populasjoner (0,275±0,032 Abs 405 Arbitrary Units i behandlede dyr vs 0,284±0,041 i kontrolldyrene) (data ikke vist).

De ovennevnte resultatene antyder at i samsvar med in vitro-data induserer anti-NGF-antistoffer selvdød hos de mest isotypisk skiftete minne-B-celler således undertrykkende et sekundært humeralt svar. For å kunne oppnå direkte bevis som skulle støtte dette konsept ble to grupper av normale voksne mus behandlet med anti-NGF IgG eller med kontroll IgG og etter tre døgn ble miltceller isolert og proposjonene av B-celle subpopulasjoner ble bestemt ved hjelp av cytofluorimetri. Prosenten av syVcT-celler hadde blitt merkbart redusert i milten hos behandlede mus, jamført med kontrollene mens inten særskilt forskjell mellom de to gruppene kunne observeres i prosent av sji<+>8<+->celler. Totalt sett indikerte denne rekken eksperimenter at NGF også spiller en stor rolle in vivo for vedlikeholdet av minne-B-celler.

NGF ER IKKE EN SKIFTEFAKTOR FOR B-LYMFOCYTTER

Resultatet av de ovennevnte in vivo NGF nøytralisasjons-eksperimentene var forenlige med hypotesen at cytokin var en autokrin overlevelsesfaktor for minne-B-lymfocytter. De samme resultatene skulle imidlertid ha blitt observert om NGF hadde vært involvert i det maskineri som styrer IgMIgG-klasseskiftet, sammen med CD40-ligand (Aruffo et al., 1993). Om det imidlertid er på den måten, skulle en høyere andel av de IgM-produserende cellene sammen med en redusert mengde av IgG-eller igA-produserte celler, observeres alltid da en polyklonal populasjon av lymfocytter induseres for å differen-siere in vitro i nærvær av anti-NGF-antistoffer. Normale menneskelige mononukleære celler fra perifert blod ble derfor dyrket under ti dager med pokeweed-mitogen for stimulering av polyklonal differensiering (Kishimoto og Hirano, 1989) og med enten anti-NGF IgG eller ikke-immun IgG som negative kontroller eller med løselig CD40-pentamer, et genetisk fremstilt molekyl som forhindrer CD40-gp39 samvirke (Fanslow et al., 1992), som en positiv kontroll. Ig-målingen ved hjelp av ELISA viste at anti-NGF-antistoffer induserte en definitiv reduksjon i nivået av IgG og IgA i pokeweed mitogenstimulerte kulturer, men også IgM-nivåer som var 20% lavere enn dem hos kontrollkulturene (Tabell 2). I kontrast til dette forårsaket den løselige CD40 pentameren en depresjon av IgG og IgA sekresjon i forhold til kontrollene og en økning i graden av IgM-sekresjon (tabell 2).

Disse eksperimentene indikerer en klar differanse i mekanismen som sannsynligvis er ansvarlig for de observerte forandringene. Faktum er at den løselige CD40-pentameren forårsaket en blokk i Ig-klasseskiftefenomenet, induserende en "akkumulering" av celler i for-skiftet (f.eks. s<+>) området. I kontrast til dette forårsaket NGF antistoffer bare en sterk reduksjon av IgG- og IgA-produserende celler, et bevis for forsvinningen (døden) av de respektive forløperne, indusert gjennom anti-NGF-antistoffer. Disse data stemmer overens med resultatene av de ovennevnte in vivo eksperiment hvorved k . reduksjonen av s<+> eller s<+->celler ikke ble fulgt av en økning av s<+->celler. Disse resultat indikerer sterkt at NGF ikke virket som en "skiftefaktor" for normale menneskelige eller murine B-lymfocytter.

DISKUSJON

Evnen til å skille skarpt mellom en mengde kjemiske strukturer og beholde en rest av disse møtene - spesifisitet og minne - er det karakteristiske ved immunsystemet. Mens de molekylære basene av spesifisitet i stor utstrekning har blitt definert gjennom en ekstensiv karakterisering av bio-kjemi og genetikken av antigenreseptorene uttrykt med T- og B-lymfocytter, er kunnskapen om immun-minne fremdeles uklar. Særskilt gjenstår det å definere om en enkel minne-celle slik som de fleste lymfocytter har en bestemt og begrenset levetid i hvilende forhold eller om det er en celle med langt liv som varer i flere år, muligens under hele livet. Flere hypoteser har blitt foreslått og den mest dominerende er den at den lange virkningen av antigen i lymfoidorganer resulterer i en kontinuerlig sakte proliferasjon av immunceller som har immunologisk minne (Gray, 1993). Det er imidlertid vanskelig å forestille seg hvordan antigenet kan forbli umodifisert i årevis, særlig dersom det er et protein (Sprent, 1994) . Faktum er at bevis har blitt fremlagt at immunologisk minne kan beholdes under lange perioder av ikke-sykliske celler (Schittek og Rajewsky, 1990), selv om de molekylære mekanismene som gir dem deres overlevelse fremdeles er ukjente. \ Det nærværende beviset foreslår at minne-B-lymfocytter når de genereres kan gå gjennom den samme skjebne som Bizzozzero "pereniale" celler, hvis prototyp er neuroner på grunn av deres evne til å produsere en autokrin overlevelsesfaktor,

NGF.

Det tyngste argumentet foreslår at cytokin virker som et overlevelsesemne mer enn som en tilvekstfaktor som er basert på observasjonen at forhindring av NGF-reseptor-utløsing av rensete sy*/ a hvilende B-celler ved nøytralisering av anti-NGF-antistof f er forårsaket massiv celledød gjennom apoptosis. Dessuten fordi hvilende ikke-fraksjonerte B-celler ble stimulert med anti-|i-antistof f er + IL-4, som lokket frem en sterk. proliferativ respons, kunne de ikke øke NGF-produksjonshastigheten og proliferasjonen ble ikke hjulpet av eksogene rekombinante NGF, ei heller ble den påvirket av anti-NGF-antistof f er. Da SAC ble anvendt for stimulering av samme celler, ble dessuten økte mengder NGF avsondret, men ytterligere tilsats av eksogen cytokin mislyktes med å potensiere <3>H-tymidin-inkorporasjon, til og med etter at suboptimale doser av stimuleringsmiddel ble tilsatt. In vivo pre-aktiverte B-celler med lav densitet uttrykte i samsvar med dette en mer NGF, men metningsdoser av anti-NGF-antistoffer kunne ikke ta bort B-celleproliferasjonen som det kunne forventes dersom cytokin var en tilvekstfaktor. Til sammen pekte disse tankene heller mot at NGF var en overlevelsesfaktor.

Denne konklusjonen kunne vise seg å være i strid med rapporter som i de siste årene hadde foreslått en indre tilvekststimulerende aktvitet av NGF på lymfocytter (Otten et al., 1989; Brodie og Gelfand, 1992). Disse rapporter kan imidlertid bli tolket på nytt om man tar i betraktning at ifølge disse resultat kan en tilsats av eksogen NGF redusere antallet av noen celler som spontant dør in vitro (særskilt de som kommer fra IgA- og IgG4-avsondrende celler (Kimata et al., 1991)) på grunn av forholdene med lavdensitetskulturer som til slutt leder til en høyere basal proliferasjon i kul-turen. Distinksjon mellom tilvekst og overlevelsesfaktor kan dessuten være rent nominell slik som foreslått gjennom den observasjonen at IL-3 og stamcellefaktoren understøtter langtids overlevelse av hvilende, ikke-syklusunderkastete lymfohematopoietiske progenitorer i væskekulturer (Katayama et.al., 1993).

Oppdagelsen av spontan produksjon av NGF i B-celler gir dessuten støtte til beviser av en "flogistisk" rolle for NGF (Aloe et al., 1994) som sannsynligvis deltar på en parakrin måte til funksjonen av inflammatoriske celler, slike som makrofager, som er forsynt med det reseptormaskineriet som er nødvendig for å gi respons på cytokin (Ehrhard et al., 1993a), men som ikke kan produsere det (Santambrogio et al., 1994). Lignende betraktninger gjelder for T-lymfocytter. I denne studien har ikke noe forsøk blitt gjort for å karakterisere mere presist fra et fenotypisk eller

■ i'

funksjonelt standpunkt (sub)populasjonene av T-celler som uttrykket NGF-reseptorer og derfor sannsynligvis gi respons på den. NGF som kommer fra B-celler kan imidlertid ha viktige roller i den komplekse hendelsen av B-celleantigen-presentasjon til T-lymfocytter, særlig når en sekundær immunrespons må finne sted. Faktum er at sIgG<+> minne-B-celler uttrykker reseptorer med den høyeste affiniteten for antigen (Siekevitz et al., 1987; MacLennan og Gray, 1986) og er derfor privilegert i konkurransen for binding som opptrer når antigenet er nærværende i begrensede mengder. Evnen til å frigjøre NGF kan være essensiell for en korrekt aktivering av enten minne eller naive T-celler.

Et viktig punkt som har kommet frem fra denne studien er det samtidige uttrykket av begge kjeder som man vet binder NGF - trk-molekylet og p75<na£r->molekylet - gjennom B-lymfocytter, en karakteristikk som vanligvis presenteres av neuronceller. Selv om NGF var de første cytokinet som ble karakterisert vet man fremdeles relativt lite om de spesifikke metabolske baner som utløses gjennom interaksjonen med reseptorkjeden, ei heller er det klart om begge kjedene samvirker for binding av et enkelt molekyl på liganden ettersom forskjellige resultat på dette emnet har blitt rapportert (Jing et al., 1992; Benedetti et al., 1993; Huber og Chao, 1995) . Det har imidlertid vist seg at ekspresjonen av p75<nfl£r >induserte nervecellers død, hovedsakelig da proteinet ikke var bundet, mens dets binding til NGF eller med monoklonale antistoffer forhindret celledød (Rabizadeh et al., 1993) hvilket tyder på at det i og for seg er mulig å transmittere et biologisk signal som overensstemmer med den strukturelle homologien mellom p75<æFR> og en serie av reseptorkjeder, inkluderende TNFRI, TNFRII, fas/apo-1 og CD40, alle involvert i indusering eller forhindring av apoptosis i målceller (oversikt av Raffioni et al., 1993). Disse sistnevnte data stemmer helt med den oppdagelsen at nøytralisering av autokrint NGF, men ikke behandling med anti-p75<NGFR>, bestemmer B-celledøden

(manuskript under forberedelse), hvilket peker på denne reseptorkjeden som en mediator av signaler som virker på overlevelse/død-deling. På tross av denne strukturelle

honologi mellom P75"<0>™ og CD40 var. det klart at NGF ikke deltar i lg klasseskifteprosessen.

I noen celletyper såsom keratinocytter eller melanocytt-er (Yaar et al., 1994; Di Marco et al., 1993), overfører trk-signaler som potensielt stimulerer celleproliferasjon i kontrast til hva som hender i neuronceller hvorved NGF forhindrer apoptosis som følge av trk-engasjement, muligens via fosfatidyl-inositol-3-kinase-aktivering (Yao og Cooper,

1995). Denne diskrepans kan løses gjennom eksistansen av andre kjeder som kan delta i formasjonen av en multikjedes reseptor med trk og/eller P75<1*3>™ som vanligvis hender for de fleste cytokinreseptorene. Den sistnevnte hypotesen skulle også kunne forklare den begrensete men signifikante forskjellen vi observerte ved NGF-bindingsaffiniteter som viste seg ved store og hvilende B-cellepopulasjoner (« 3 0 pM vs = 170 pM).

Separasjon av normale hvilende B-lymfocytter på basis av overflate-Ig-isotype-ekspresjon identifiserer to funksjonelt forskjellige subpopulasjoner, det vil si sji<+>8<+> virgin og sy*/ a minneceller (Koshimoto og Hirano, 1989). Vi brukte denne idéen for å komme på rollen for NGF autokrinkretsen og observerte flere karakteristika som ledet til den idéen at cytokinet er en endogen overlevelsesfaktor for minneceller, både hos mennesker og hos mus. Mens først både virgin og minneceller uttrykte basis de samme nivåer av NGF reseptorer, produserte den sistnevte minst åtte ganger mere enn NGF protein enn den andre. En andre behandling med nøytralisering av anti-NGF-antistoffer induserte forsvinning av bcl-2-protein og følgelig derav massiv DNA-frakmentering i sy*/ a-celler, mens det var ubetydelig for s|T8<+->celler. For det tredje avskaffet in vivo administrering av anti-NGF-antistoffer sekundære antigenspesifikke immunresponser, men kunne ikke påvirke det primære IgM-svaret. Tilslutt forårsaket en enkel injeksjon med anti-NGF-antistoffer i normale dyr en markert reduksjon i prosent av isotypisk skiftete B-lymfocytter som omfatter minneceller. På andre siden reiser disse to oppdagelsene minst to viktige spørsmål, nemlig det modne stadiet ved hvilket NGF-genekspresjon skjer og forholdet mellom NGF og bcl-2.

Den lave, men detekterbare produksjonen av NGF av sn<+>8<+->celler skulle indikere en relativt tidlig start under B-celle ontogenien, hvis funksjonelle signifikant burde belyses ytterligere. Basert på kvantitative betraktninger av stør-relsen av forskjellige B-celle-subpopulasjoner foreslås det imidlertid at sjT-celler også omfatter minne-lymfocytter som er i stand til å skape celler som sekreterer lg i tillegg til IgM (Gray, 1993) . Om det er slik, kunne den s|T-celleskapte NGF som vi observerte produseres av de sistnevnte cellene, og i dette tilfellet, kunne NGF-genekspresjon bindes til og muligens reguleres av de samme molekylære mekanismene som påvirker Ig-klasseskiftet.

Lite er hittil kjent om den molekylære veien som hører til NGF-reseptorkjeder med bcl-2, et protein som kritisk regulerer overlevelsen både av neuroner og lymfoidceller, særlig i minne-B-celler (Batistatou a et al., 1993; Hawkins og Vaux, 1994; Nunez et al., 1991), som faktisk opphører fra hvilende sIgG<+-> eller slgA<+->celler som er behandlet med nøy-traliserende anti-NGF-antistoffer. Nylig har det fremkommet bevis på at reaktive oksygenspesis og mer generelt forandringer i det cellulære redokspotensialet kan være involvert (Greenlund et al., 1995). I denne forbindelse har det vist seg at den lave produksjonshastigheten av nitrogenoksid i EBV-infiserte B-lymfocytter, som i hovedsak uttrykker nitrogenoksidsyntase, forhindrer apoptose (Mannick et al., 1994) sannsynligvis virkende på flere nivåer av tiol-sensi-tive baner som også regulerer metabolismen av bcl-2, som er følsom for intracellulært redokspotensial og deltar i vedlikeholdet av det (Hockenbery et al., 1993). Det er interessant at Mosialos et al. (1995) ganske nylig viste at funksjonelle forhold eksisterer mellom proteiner som overfører signaler fra TNF/fas/NGF-reseptorfamilien, ettersom TNF induserer forandringer i cellulær redokslikevekt (Ishii et al., 1992), hvorved disse molekylene også kunne delta i det adaptive svaret som kom frem ved hjelp av NGF. Vi holder for tiden på med å undersøke den sistnevnte hypotesen for minne-B-celler som følger på NGF-nøytralisasjon.

Et slående delbevis som fortjener å betraktes er observasjonen at i lymfoidceller i det minste både apoptosis og celleoverlevelse reguleres ved hjelp av autokrine kretser hvorved de førstnevnte involverer Fas/Apo-1 og dets ligand

(Brunner et al., 1995; Dhein et al., 1995; Ju et al., 1995)

hvorved det sistnevnte involverer NGF ifølge våre data. Et slikt arrangement forsikrer at alle molekylære krav som behøves for å gi cellen en av banene er umiddelbart til-gjengelig og hjelper til å forstå hvordan lymfoidorganer er seter der komplekse funksjonelle forandringer kan oppstå på en ordnet måte. Beviset at den autokrine kretsen er vanlig - involverende utsondring av ligander og binding til ekstra-cellulære reseptorer, i stedet for å være private eller intrakrine - indikerer i høyeste grad at funksjon av begge systemene kan avpasses av enhver av reseptorene av antagonister eller løselige reseptorer fremkallende et komplekst nett av "sosiale" kontroller over skjebnen for en enkel lymfocytt. Det er interessant at den sistnevnte kompleksiteten kan gi opphav til flere muligheter for å interferere med slik dynamikk ved anvendelse av farmako-logiske løsninger.

EKSPERIMENTELLE PROSEDYRER

CELLEISOLASJON OG DYRKING

Menneskelige T-lymfocytter ble separert fra mononukleære celler i perifert blod eller fra tonsilceller ved hjelp av E-rosetting. Monocytter ble isolert ved hjelp av klistring på plastpetriskåler. B-lymfocytter ble ytterligere renset fra ikke-T-populasjonen ved anvendelse av CEl9-belagte magnetiske perler. Murin-B-lymfocytter som var fri for monocytter som ovenfor nevnt, ble isolert fra milt ved hjelp av to runder med negativ seleksjon med anvendelse av et anti-CE3e mono-klonalt antistoff (Boheringer Mannheim, Milano, Italia). Renheten i populasjonen var høyere enn 95%, hvilket ble bestemt gjennom flytecytometri. Menneskelige eller murin-B-celler ble ytterligere fraksjonert til hvilende (høy-densitet) og aktiverte (lav-densitet) celler ved hjelp av Percoll-tetthetsgradienter. Proporsjonene av sIgM<+->, sIgG<+-> og sIgA<+->celler i tonsilhvilende B-celler var respektive 65%, 25% og 10% såsom de ble bestemt ved hjelp av flytecytometri.

For proliferasjonsprøver ble det dyrket B-celler i 96-well-plater med en konsentrasjon på lOVml i RPMI 1640 medium (GIBCO, Milano), supplementert med 10 vekt % kalvefosterserum (FCS, Hyclone, Logan, UT), 72 timer i fuktig luft med 5% C02. Varmeinaktiverende Stafylokokkus Aureus av I Cowan-stammen (SAC, Boheringer Mannheim) ble anvendt ved den siste utsped-ningen av 1:10.000, menneskelig rIL-4 (R&D, Minneapolis, MN) ble anvendt ved 100 U/ml, kanin-anti-human-kjede ble anvendt med lg/ml. NGF (Boheringer Mannheim) ble anvendt ved 100 ng/ml, nøytraliserende geite-anti-NGF-antistoffer (R&D, ND50 = 10 |j,g/ml i IMR-32 neuroblas-celleproliferasjonsprøve (Janet et al., 1995) i svar på 100 ng/ml av NGF) eller pre-immun-geite-IgG ble anvendt ved 10 ng/ml. Celler ble pulset med 0,5 Ci av <3>H-tymidin i løpet av de siste 12 timene av dyrkingen og ble talt opp i en P-scintillasjonsopptellingsapparat.

For immunoglobulinproduksjon ble det dyrket mononukleære celler fra menneskelig perifert blod under 12 døgn i nærvær eller fravær av pokeweed-mitogen (GIBCO), 10 g/ml anti-NGF-antistoffer (10 g/ml), pre-immun-geit-IgG (10 g/ml), CD40-eller CD4-oversjikt (1:10 sluttfortynning). Oversjiktene ble oppsamlet og ble testet på IgG, IgA, igM-produksjon ved hjelp av ELISA.

For analyse av NGF-produksjon ble celler dyrket (2 x IO<7>) ved 10<7>/ml i serumfri RPMI-1640, supplementert med 10 vekt-% Nutridoma (Sigma) under forskjellige tider i nærvær eller fravær av SAC (1:10.000 sluttfortynning), fytohemoaggu-tinin (PHA-P, 1 g/ml, GIBCO), lipopolysakkarid (LPS, 10 g/ml, Sigma) og oversjikt ble bestemt av ELISA.

B-celle subpopulasjoner ble isolert ved hjelp av panning-prosedyrer ved hjelp av petriskåler av plast som var belagt med kanin-anti-menneskelig IgM og kanin-anti-menneskelig IgD (angitt som sji<+>8<+>) eller kanin-anti-menneskelig IgG pluss kanin-anti-menneskelig IgA (angitt som s7<*>) eller geite-anti-mus IgM og IgD eller IgG og IgA fremstilt som beskrevet (Wysocki et al., 1978). Renheten av den isolerte populasjonen var alltid større enn 90% som bestemt gjennom flytecytometri med anvendelse av spesifikk mAbs. For å klar-gjøre interferensen av aktiveringsprosessen som etterfulgte slg-reseptoraktiveringen, ble alle eksperimentene repetert med anvendelse av de resiproke ikke-vedhengende populasjonene (f.eks. s"-celler, for det meste omfattende sV<+->celler) som kom fram etter tre runder av vedhenging fra Ig-belagte plater.

BESTEMMELSE AV CELLEVIABILITET OG DNA-FRAGMENTERING

Menneskelige og murin-B-celle subpopulasjoner, dyrket ved 5 x lOVml med 10 [ ig/ ml anti-NGF IgG eller pre-immun IgG eller med 20 |iM 18-mer antisens- eller sens-oligonukleotider komplementære til nukleotidene 54-72 av NGF-kodingsregionen (Primm, Milano, Italia), ble fortynnet 1:1,5 med 5 mM tris, 20 mM EDTA og 0,5 vekt-% triton X-100, pH 8,0 og fikk lyse under 15 minutter på is før sentrifugering under 20 minutter ved 27.000 x g for å separere intakt kromatin (pellets) fra DNA-fragmenter (oversjikt). Pelletene ble resuspendert i 5 ml av en bufferløsning som inneholdt 10 mM tris og 1 mM EDTA, pH 8,0 og pelletene og oversjiktprøvene ble bestemt på DNA-innhold ved anvendelse av difenylaminreagensen (1,5% difenylamin i eddiksyre pluss 10% acetaldehyd) i 16 timer ved 30°C (Burton, 1956). Den optiske densiteten ved 600 nm ble målt for hver prøve. Prosentinnholdet av DNA-fragmentasjonen ble beregnet ifølge McConckey et al. (1989). Celleviabiliteten ble evaluert ved hjelp av trypanblå farge-eksklusjon.

STUDIER AV RADIOLIGAND-BINDINGER

For analyse av overflatereseptorer på NGF ble menneskelige hvilende tonsil- eller murinmil-B-lymfocytter syrebe-handlet med RPMI-1640 medium bufferet til pH 3,0 i 1 minutt på is og vasket med PBS. Syrebehandlete hvilende B-lymfocytter og in vivo aktiverte store B-lymfocytter ble deretter inkubert ved lOVml med forskjellige konsentrasjoner av <1>25I-NGF (Amersham, Milano, spesifikk aktivitet 50 Ci/g) i nærvær eller fravær av overskudd av ikke-merket menneskelig rNGF i 2 timer ved 4°C. Cellene ble vasket og bundet radioaktivt og ble opptalt i en y-teller. Spesifikk bindning ble beregnet for hvert eksperimentpunkt og data ble analysert ved hjel av et vitenskapelig program (fig. P, Biosoft, Cambridge, UK). For interngjøring av radioligander ble celler dyrket som sagt ovenfor med 0,5 nM 125I-NGF i nærvær eller fravær av overskudd av ikke-merket NGF, vasket og dyrket ved 37°C i 2 timer og deretter behandlet med en glysinbufferløsning (pH 2,8) og lyset. Membranbunden (surt eluat) og celleassosiert radioak-tivitet ble bestemt gjennom oppregning i en y-teller. Det nøytrale pH-vaskevannet og det sure pH eluatet fra IO<8> hvilende B-celler ble TCA-konsentrert, blottet på nitrocellulose og immunomerket med anti-NGF IgG eller med pre-immun IgG for deteksjon av den reseptorbundne endogene liganden.

IMMUNOKJEMISK ANALYSE

For westernblott-analyse (western blot analysis) ble oversjikt eller NP-40 (0,25% i PBS) lysater av 2 x 10<7> celler TCA-utfelt, vasket med etanol og fortynnet 1:1 i en 2-merkaptoetanol Laemmli-bufferløsning. Prøver ble kjørt i SDS-PAGE, det ble blottet mot nitrocellulosefiler og immunomerket med passende antistoffer (geite-anti-NGF, kanin-anti-trk (Genzyme, Boston, MA) , muse-anti-p75<n>°<£r> (Boheringer Mannheim) , muse-anti-bcl-2 (Santa Cruz Technology, Milano)) eller med pre-immun lg. Antigen-antistoff-kompleksene ble visualisert ved anvendelse av passende sekundære antistoffer og ECL-deteksjonssysternet som anbefalt av fabrikanten (Amersham). For endogen merking og immunoutfellingsstudier ble celler vasket tre ganger med cystein-fri RPMI-1640 (GIBCO) og dyrket ved 10<7>/ml i samme medium som var supplert med 5% dialysert FCS og 200 Ci av <35>S-cystein (Amersham, spesifikk aktivitet 800 Ci/mM) i 4 timer ved 37°C i 5% C02. Oversjikten ble tatt bort og cellene vasket i kald PBS og lyset i 0,25% NP-40 pluss 1 mM PMSF. Oversjiktene og cellelysatene ble immuno-utfelt som beskrevet (Cozzolino et al., 1990) i nærvær eller fravær av 100 jj,g/ml av menneskelig rNGF. Immunoutf ellingene ble vasket, eluert i en SDS-Laemmli-bufferløsning med eller uten 2-merkaptoetanol og ble kjørt på 15% SDS-PAGE slabs, som ble behandlet med Amplify (Amersham), tørket og eksponert på hyperfilm MP (Amersham) ved -70°C.

MUS-IMMUNISERING OG BEHANDLING

Ars-KLH ble preparert gjennom diazotering av p-aminofe-nylarsensyre og kopling til keyhole-limpet-hemocianin (KLH, Calbiochem) i et forhold på 40 mg hapten til 1 g protein

(Nisonoff, 1967). (4-hydroksy-5-jod-3-nitro-fenyl)acetyl (NIP, en generøs gave fra dr. D. Schilovich, HSR, Milano) ble koplet til bovinserum-eggehvite (NIP-BSA) ifølge Reth et al., 1978. To grupper av tyve Balb/c-mus av hunnkjønn, 6 uker gamle, ble injisert s.c. i nakken med 0,1 ml av en TT-løsning (15 ng/ml (Anatetal, Biocine-Sclavo, Siena, Italia)) eller i.p. med Ars-KLH (0,1 mg) og en gruppe av tyve C57BL/6-mus ble immunisert i.p. med 0,1 mg NIP-BSA. Førti dager etter den første injeksjonen ble ti mus i hver gruppe behandlet med geite-anti-NGF IgG (500 g/mus) de andre med pre-immun geite-IgG (500 g/mus) og 48 timer senere ble alle musene vaksinert igjen med samme dose av det relevante antigenet. Fire dager etter den andre immunvaksinasjonen tok man ut blok fra retro-orbital venus plexus. Andre grupper på ti mus ble immunisert med TT, NIP-BSA eller Ars-KLH ble anvendt for oppmåling av antigen-spesifikk IgG umiddelbart før den andre injeksjonen.

For FACS-analyse av splenocytter ble grupper på ti voksne BALB/c-mus behandlet med to injeksjoner i 72 timer (0,5 mg/mus) av anti-NGF-antistoffer eller geite-IgG. Etter ytterligere 72 timer ble musene ofret og splenocytter som var frie fra monocytter ble ivaretatt. Prosentinnholdet av overflate-IgG<+>, -IgA<+> eller -lgM<+> splenocytter ble bestemt ved cytofluorimetri med anvendelse av spesifikke antistoffer.

ELISA

NGF ELISA ble utført som beskrevet av Soderstrom et al.

(1990). For evaluering av tetanustoksoid (TT)-spesifikk IgG-eller IgM-titer ble plater belagt med 50 1 av TT (10 g/ml) i en 0,1 M boratbufferløsning, pH 8,6, over natten ved 4°C. For evaluering av NIP eller Ars-spesifikk IgG- eller IgM-titer, ble plater belagt med NIP-KLH eller Ars-BSA (35 ng/ml i PBS). Spesifikk IgG- og IgM-titer til de immuniserende kompleksene ble også evaluert ved belegning av plater med NIP-BSA eller Ars-KLH. Etter metning med PBS som inneholdt 1% BSA og skylling med PBS med 0,05 vekt % Tween 20 belagte fordypninger, ble inkubert under 1 time ved 37°C med seriefortynning av mus-sera, en samling av pre-immun mus-sera ble anvendt som negativ kontroll. Bundet lg ble detektert gjennom tilsats av alkalisk fosfatase-konjugert geite-anti-muse-IgG eller -IgM.

Den siste reaksjonen ble visualisert ved hjelp av inkubering med NPP (Sigma) substratløsning, og absorbansen ved 405 nm ble registrert.

Hvilende ufraksjonerte (UF)B-lymfocytter eller de indikerte rensete populasjonene ble dyrket i 48 timer og pulset med <3>H-tymidin de siste 12 timene. Data uttrykkes som gjennomsnittlig <3>H-tymidin-inkorporasjon av tre kulturer. SD var alltid mindre enn 10%. SAC ble anvendt ved den siste fortynningen av 1:10.000. Geite-anti-NGF-antistoffer eller pre-immun geite-IgG ble anvendt i konsentrasjoner på lOg/ml. Rekombinant menneskelig NGF ble brukt ved konsentrasjonen av 100 ng/ml. IL-4 ble brukt ved konsentrasjonen av 100 U/ml. Polyklonal kanin-anti- ble brukt ved konsentrasjonen 1 g/ml.

Menneskelig PBMNC ble dyrket i en konsentrasjon av 3 x 10s celler/ml i 12 dager i nærvær eller fravær av PWM (10 g/ml), geite-anti-NGF-antistoffer eller pre-immun geite-IgG (10 g/ml), CD40 eller CD4 oversjikt (1:10 sluttfortynning). Ved slutten av inkubasjonen ble oversjiktene oppsamlet og IgA, IgG, IgM ble oppmålt ved hjelp av ELISA ved anvendelse av spesifikke antistoffer. Data uttrykkes som gjennomsnittlig Ig-konsentrasjon av tre fordypninger; SD var mindre enn 15%.

EKSEMPEL 3

Aldersassosierte forandringer i humoral immunitet påvirker kvaliteten mer enn kvantiteten av antistoff-responsen. Forandringer i kvaliteten av antistoff-responsen med alder inkluderer skifter i antistoffisotyper fra IgG til IgM og i antistoffaffiniteter fra høy til lav. De svekkete responsene fra de eldre på de fleste vaksinene og den større følsomheten hos de eldre for infeksjoner, har frembragt et syn at immun-senescens leder til et stadium av immundefekt. Selv om disse forandringer kan i stort henføres til en lavere kapasitet av T-celler og understøtte modningen av B-celler med tanke på isotyp og affinitetsmodning i periferien, viser dette eksempel en svakere kapasitet av minne-B-celler fra eldre dyr til å overleve på grunn av en mindre produksjon av NGF. NGF-administrering under modningsfasen av minne-B-celler gjenvinner den spesifikke høyaffinitets IgG-produksjonen hos eldre mus som

er immunisert med et vanlig brukt hapten, NIP-BSA.

RESULTAT OG DISKUSJON

SPESIFIKK IgG-PRODUKSJON BLIR STERKT UNDERTRYKKET HOS ELDRE MUS IMMUNISERT MED NIP

En gruppe på ti gamle (> 5 måneder gamle) og en gruppe med ti yngre (< 8 uker gamle) av slaget C57/BL6 av hunnkjønn ble vaksinert i.p. med 0,1 mg pr. mus av (4-hydroksy-5-jod-3-nitrofenyl)acetyl-bovinserum-eggehvite (NIP-BSA) (Reth et al., 1978) i 0,1 ml fosfatbufferet saltløsning (PBS) resuspendert i 0,1 ml komplett Freunds adjuvans. Etter 21 døgn ble det tappet 0,4 ml blod fra hvert dyr gjennom retro-orbital plexus-utsugning og anti-BSA antistoffer ble nøy-tralisert ved hjelp av tilsats av BSA til serumprøvene. NIP-spesif ikk IgG og IgM titer ble bestemt i ELISA. Fig. 3 viser at den spesifikke IgG-responsen mot NIP var signifikant påvirket hos eldre mus jamført med yngre mus, mens det spesifikke IgM-svaret mot hapten var likedan i de to muse-gruppene. Disse resultatene tyder på at de underliggende mekanismene for produksjon av NIP-spesifikt høyaffinitets immunoglobulin (somatisk hypermutasjon, isotyp skift) er ufullstendig hos eldre mus.

Det er rapportert at NGF er en autokrin overlevelsesfaktor for minne-B-lymfocytter (Torcia et al., 1996). For å kunne studere om det ufullstendige immunsvaret hos eldre mus kunne tilskrives en massiv død av minne-B-celler eller ikke, indusert gjennom fraværet av NGF-produksjonen eller NGF-tilgjengelighet isolerte vi minne-B-celler (som slgD-lymfocytter) gjennom panning-teknikker fra milten hos 10 eldre mus og fra 10 yngre mus som kontroll. Cellene ble dyrket i 16 timer ved 37°C og oversjiktene ble ivaretatt og NGF ble oppmålt ved hjelp av ELISA-teknikken. Tabell 3 viser at minne-B-celler som er isolerte fra eldre mus ikke er i stand til å produsere NGF, mens den samme populasjonen isolert fra yngre mus produserer høye nivåer av cytokin såsom har blitt rapportert (Torcia et al., 1996).

Som en konsekvens av redusert NGF-produksjon var overlev-elseskurven for minne-B-celler fra gamle mus vesentlig kortere sammenlignet med den hos samme populasjonen isolert fra yngre mus.

Claims (20)

1. Farmasøytisk kombinasjon til forsterkning av vaksine-ef f ektiviteten hos immunodefekte dyr som har evne til å produsere antistoffer, karakterisert ved at den omfattende: en vaksine som i et dyr kan stimulere produksjonen av antistoffer mot et sykdomsfremkallende middel som er fremmed for dyret; og en vaksine-effektivitetsforsterkende mengde av nerve-vekstfaktor (NGF) som forsterker produksjonen av antistoffene i dyret som svar på vaksinen.

2. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 1, ved hvilken dyret er menneske og vaksinen er valgt fra gruppen bestående av influensavaksine, hemofilus-influensavaksine, heptatitt-A-virusvaksine, heptatitt-B-virusvaksine, heptatitt-C-virusvaksine, tuberkulosevaksine, herpes-zoster-virusvaksine, cytomegalo-virusvaksine, pneumokokkal-pneumoniavaksine, meningokokk-meningitisvaksine, difteri-vaksine, tetanus-vaksine, rabies-vaksine, helikobakter-pylorivaksine, polio-vaksine og koppe-vaksine.

3. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 1, i hvilken vaksinen forekommer i en mengde av fra ca. lx IO"<9> g til ca. lx IO"<3> g og NGF forekommer i en mengde av ca. 0,001-100 mg/kg.

4. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 1, i hvilken vaksinen forekommer i en mengde av fra ca. lx IO"<8> g til ca. lx 10"<4> g og NGF forekommer i en mengde av ca. 0,1-10 mg/kg.

5. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 1, i hvilken NGF forekommer i en mengde av ca. 0,3-3 mg/kg.

6. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 1, omfattende en komposisjon inkluderende vaksinen og NGF.

7. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 6, i hvilken kompo-sisjonen inkluderer en farmasøytisk akseptabel bærer.

8. Anvendelse av en vaksine som i et immunodefekt dyr kan stimulere produksjonen av antistoffer mot et sykdomsfremkallende middel som er fremmed for dyret; og en vaksine-effektivitetsforsterkende mengde av nerve-vekstf aktor (NGF) som forsterker produksjonen av antistoffene i dyret som respons på vaksinen; til preparering av en farmasøytisk kombinasjon beregnet for vaksinasjonen, i hvilken vaksinen og nevnte NGF kan administreres separat eller sammen, og i hvilken effektiviteten av vaksinen i dyret forsterkes gjennom nevnte NGF.

9. Anvendelse ifølge krav 8, i. hvilken dyret er et menneske og vaksinen velges fra gruppen bestående av influensavaksine, hemofilus-influensavaksine, hepatitt-A-virusvaksine, hepatitt-B-virusvaksine, hepatitt-C-virusvaksine, tuberku-lose-vaksine, herpes-zoster-virusvaksine, cytomegalo-virusvaksine, pneumokokkal-pneumonia-vaksine, meningokokkal-meningitis-vaksine, difteri-vaksine, tetanus-vaksine, rabies-vaksine, helikobakterpylori-vaksine, polio-vaksine og koppe-vaksine.

10. Anvendelse ifølge krav 8, i hvilken vaksinen forekommer i en mengde av fra ca. lx 10"' g til ca. 1 x IO"<3> g og NGF forekommer i en mengde av ca. 0,001-100 mg/kg.

11. Anvendelse ifølge krav 8, i-hvilken vaksinen forekommer i en mengde av fra ca. 1 x IO"<8> g til ca. 1 x IO"<4> g og NGF forekommer i en mengde av fra ca. 0,01.10 mg/kg.

12. Anvendelse ifølge krav 8, i hvilken NGF forekommer i en mengde av ca. 0,3-3 mg/kg.

13. Anvendelse ifølge krav 8, i hvilken vaksinen administreres som en reaktiviseringsdose av vaksine.

14. Anvendelse ifølge krav 13, i hvilken NGF administreres ca. 3-4 dager før reaktiviseringsdosen av vaksinen.

15. Anvendelse ifølge krav 13, i hvilken NGF også administreres stort sett samtidig med administreringen av vaksinen.

16. Anvendelse ifølge krav 8, i hvilken vaksinen og NGF administreres gjennom injeksjon.

17. Anvendelse ifølge krav 8, der vaksinasjonen omfatter: administrering av en første dose av vaksinen til dyret; deretter, innen en tidsperiode av mellom ca. 1 uke og ca. 2 måneder etter administreringen av den første dosen, administrering til dyret av enten 1) en vaksine-effektivi-tetsf orsterkende mengde av nerve-vekstfaktor (NGF) som forsterker produksjonen av nevnte antistoffer i dyret som svar på vaksinen eller 2) en reaktiveringsdose av vaksinen sammen med en vaksine-effektivitetsforsterkende mengde av nerve-vekstfaktoren (NGF), for forsterkning av effektiviteten av vaksinen i dyret.

18. Anvendelse ifølge krav 17, i hvilken tidsperioden er ca.

10-45 dager.

19. Anvendelse ifølge krav 17, i hvilken tidsperioden er ca.

10-30 dager.

20. Anvendelse ifølge krav 17, i hvilken tidsperioden er ca.

10-20 dager.