NO322726B1 - Method for identifying the risk of thrombogenetic disorder in determining TAFI-IIe347 polymorphism and using the TAFI-IIe347 or TAFI-IIe347 gene to produce a diagnostic. - Google Patents
Method for identifying the risk of thrombogenetic disorder in determining TAFI-IIe347 polymorphism and using the TAFI-IIe347 or TAFI-IIe347 gene to produce a diagnostic. Download PDFInfo
- Publication number
- NO322726B1 NO322726B1 NO20050677A NO20050677A NO322726B1 NO 322726 B1 NO322726 B1 NO 322726B1 NO 20050677 A NO20050677 A NO 20050677A NO 20050677 A NO20050677 A NO 20050677A NO 322726 B1 NO322726 B1 NO 322726B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tafi
- gene
- ile347
- amino acid
- risk
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 42
- 108090000201 Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102100035023 Carboxypeptidase B2 Human genes 0.000 claims abstract 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 claims description 13
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 claims description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 9
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000003174 enzyme fragment complementation Methods 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 claims description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 3
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 2
- 229940049370 fibrinolysis inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 2
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 230000009787 cardiac fibrosis Effects 0.000 abstract 1
- 230000004776 neurological deficiency Effects 0.000 abstract 1
- 102000003847 Carboxypeptidase B2 Human genes 0.000 description 33
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 9
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 208000008457 Neurologic Manifestations Diseases 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000001567 anti-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 3
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 3
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000946518 Homo sapiens Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 2
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 2
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound OCCN1CCNCC1 WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710189812 Bilin-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 235000016795 Cola Nutrition 0.000 description 1
- 241001634499 Cola Species 0.000 description 1
- 235000011824 Cola pachycarpa Nutrition 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000023661 Haematological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000007211 cardiovascular event Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013075 data extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000008058 pain sensation Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N ramipril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](C[C@@H]2CCC[C@@H]21)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N 0.000 description 1
- 229960003401 ramipril Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102000029752 retinol binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000053 retinol binding Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- -1 sucrose or glucose Chemical compound 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000000672 surface-enhanced laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000003871 white petrolatum Substances 0.000 description 1
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for identifikasjon av rsiko for trombogenisk forstyrrelse som uten begrensning inkluderer hjerteflimmer, slag, forlenget avbrutt neurologisk mangel (PRIND), forbigående iskemisk attakk (TIA), aterosklerotisk cerebrovaskulær sykdom (CVD) og/eller koronar hjertesykdom, så vel som til en fremgangsmåte for å selektere pasienter med risiko for trombogenisk forstyrrelse, til en fremgangsmåte for identifikasjon av et farmasøytika for terapien eller profylaksen av en trombogenisk forstyrrelse, så vel som til en fremgangsmåte for produksjon av et medikament og et diagnostika ved anvendelse av TAFI-I1e347 polymorfisme.The present invention is directed to a method for identifying the risk of thrombogenic disorder which includes, without limitation, cardiac fibrosis, stroke, prolonged interrupted neurological deficiency (PRIND), transient ischemic attack (TIA), atherosclerotic cerebrovascular disease (CVD) and / or coronary artery disease. as well as to a method for selecting patients at risk of thrombogenic disorder, to a method for identifying a pharmaceutical for the therapy or prophylaxis of a thrombogenic disorder, as well as to a method for producing a drug and a diagnostic using TAFI -I1e347 polymorphism.
Description
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for å identifisere risiko for trombogenisk forstyrrelse, som uten begrensning inkluderer hjertefiimmer, slag, forlenget avbrutt neurologisk mangel (PRIND = prolonged intermitted neurological deficit), forbigående iskemisk anfall (TIA = transitory ischemic attack), aterosklerotisk cerebrovaskulær sykdom (CVD = atherosclerotic cerebrovascular disease) og/eller koronar hjertesykdom, en fremgangsmåte for identifikasjon av et farmasøytika for behandling eller profylakse av en trombogenisk forstyrrelse, og anvendelse av TAFI-Ile347 eller TAFI-Ile347-genet for å fremstille et slikt farmasøytisk preparat. The present invention is directed to a method for identifying risk for thrombogenic disorder, which includes without limitation heart fibrillation, stroke, prolonged interrupted neurological deficit (PRIND = prolonged intermittent neurological deficit), transient ischemic attack (TIA = transitory ischemic attack), atherosclerotic cerebrovascular disease (CVD = atherosclerotic cerebrovascular disease) and/or coronary heart disease, a method for identifying a pharmaceutical for the treatment or prophylaxis of a thrombogenic disorder, and using TAFI-Ile347 or the TAFI-Ile347 gene to produce such a pharmaceutical preparation.
Den trombinaktiverbare fibrinolyseinhibitoren (TAFI) er et kjent plasmazymogen som syntetiseres i leveren som et prepropeptid inneholdende 423 aminosyrer med en molekylvekt på 55 kDa (figur 1). Prepropeptidet inneholder et 22 aminosyrer langt signalpeptid (aminosyrene nr. 1-22), et 92 aminosyrer langt aktiveringspeptid og et 309 aminosyrer langt katalytisk doméne. Nukleinsyresekvensen inneholder 1723 nukleotider (figur 2). Proteinsekvensaksesjonsnummeret (NCBI-protein database) til TAPI er NP_001863, nukleotidsekvensaksesjonsnummeret (NCBI-nukleotid database) er NM_001872, og aksesjonsnummeret for TAFI-mformasjon i OMIM ("Online Mendelian Inheritance in Man") er 603101. The thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) is a known plasma zymogen that is synthesized in the liver as a prepropeptide containing 423 amino acids with a molecular weight of 55 kDa (Figure 1). The prepropeptide contains a 22 amino acid long signal peptide (amino acids no. 1-22), a 92 amino acid long activation peptide and a 309 amino acid long catalytic domain. The nucleic acid sequence contains 1723 nucleotides (Figure 2). The protein sequence accession number (NCBI protein database) of TAPI is NP_001863, the nucleotide sequence accession number (NCBI nucleotide database) is NM_001872, and the accession number for TAFI mformation in OMIM ("Online Mendelian Inheritance in Man") is 603101.
TAFI aktiveres av trombin, plasmin eller trombin/trombomodulin-komplekset Etter prosessering svekker TAFI blodlevringslysering ved å fjerne lysinrestene fra en fibrinklump. Aktivert og prosessert TAFI er ustabilt ved 37 °C og har en halveringstid på ca. 8 minutter. Derfor spiller TAFI en sentral rolle i homeostasen der den fungerer som en potent fibrinolyseinhibitor. Det humane TAFI-genet er kartlagt til kromosom 13ql4.11. Det består av 11 eksoner og spenner over en genomisk region på ca. 48 kb lengde (Boffa et al., (1999) Biochemistry, 38,6547-6558)). TAFI is activated by thrombin, plasmin or the thrombin/thrombomodulin complex After processing, TAFI impairs coagulation lysis by removing the lysine residues from a fibrin clot. Activated and processed TAFI is unstable at 37 °C and has a half-life of approx. 8 minutes. Therefore, TAFI plays a central role in homeostasis where it acts as a potent fibrinolysis inhibitor. The human TAFI gene has been mapped to chromosome 13ql4.11. It consists of 11 exons and spans a genomic region of approx. 48 kb length (Boffa et al., (1999) Biochemistry, 38, 6547-6558)).
Genetisk analyse av TAFI-genet hos mennesker avslørte flere variable nukleotider (SNP'er, enkel nukleotidpolymorfisme) i promoteren og i den kodende regionen. For SNFer i promoterregionen til TAFI-genet er det vist at noen av disse polymorfismene også er assosiert med endrete TAFI-proteinnivåer i blodet (Franco et a/., 2001, Haematologica, 86,510-517; Henry et al., 2001, Blood, bind 97, nr. 7,2053-2058). Genetic analysis of the human TAFI gene revealed several variable nucleotides (SNPs, single nucleotide polymorphism) in the promoter and in the coding region. For SNFs in the promoter region of the TAFI gene, it has been shown that some of these polymorphisms are also associated with altered blood TAFI protein levels (Franco et al., 2001, Haematologica, 86,510-517; Henry et al., 2001, Blood, volume 97, no. 7, 2053-2058).
Nylig ble to SNFer identifiserte i den kodende regionen til TAFI-genet, som fører til en ammosyreutbytting i den korresponderende TAFI-proteinet, disse polymorfismene er T169A (T « Treonin (Thr) ved posisjon 169 til A = Alanin (Ala)) og T347I (Treonin ved posisjon 347 til I = Isoleusin (Ile)). TAFI-Ile347-varianten ser ut til å ha en forlenget halveringstid fra 8 minutter til 15 minutter, og ser ut til å ha et øket antifibrinolytisk potensiale på 60 % (Brouwers et al., 2001, Blood, bind 98, nr. 6,1992-1993; Schneider et al, 2001, J. Biological Chemistry, bind 277, nr. 2,1021-1030) under de testete in vitro betingelsene. Variasjoner ved posisjon 169 av TAFI-proteinet ser ikke ut til å ha noen effekt på det antifibrinolytiske potensialet til TAFI (Schneider et al., Recently, two SNFs were identified in the coding region of the TAFI gene, which leads to an amino acid substitution in the corresponding TAFI protein, these polymorphisms are T169A (T « Threonine (Thr) at position 169 to A = Alanine (Ala)) and T347I (Threonine at position 347 to I = Isoleucine (Ile)). The TAFI-Ile347 variant appears to have a prolonged half-life from 8 minutes to 15 minutes, and appears to have an increased antifibrinolytic potential of 60% (Brouwers et al., 2001, Blood, Vol. 98, No. 6, 1992-1993; Schneider et al, 2001, J. Biological Chemistry, Vol. 277, No. 2, 1021-1030) under the in vitro conditions tested. Variations at position 169 of the TAFI protein do not appear to have any effect on the antifibrinolytic potential of TAFI (Schneider et al.,
2002, supra). I øyeblikket finnes det imidlertid ingen tilgjengelige data om de kliniske effektene, om det finnes noen, av de beskrevne polymorfismene inkluderende TAFI-Ile347- vari anten for trombogenisk eller andre forstyrrelser. 2002, supra). At present, however, there are no available data on the clinical effects, if any, of the described polymorphisms including the TAFI-Ile347 variant for thrombogenic or other disorders.
Santamaria et al., 2003, Stroke, Vol. 34, side 2387-2391 og Boffa et al., 2001, Current Drug Targets-Cardiovascular and Haematological Disorders, Vol 1, side 59-74 beskriver nær beslektet teknikk. De beskriver imidlertid ikke hvordan TAFI-Ile347 har betydning for igangsettelse av trombogene forstyrrelser og hvordan dette kan anvendes forbehandling og forebygge slike forstyrrelser. Santamaria et al., 2003, Stroke, Vol. 34, pages 2387-2391 and Boffa et al., 2001, Current Drug Targets-Cardiovascular and Haematological Disorders, Vol 1, pages 59-74 describe closely related techniques. However, they do not describe how TAFI-Ile347 is important for the initiation of thrombogenic disturbances and how this can be used for pre-treatment and to prevent such disturbances.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det funnet at spesielt individer med en TAFI-Ile347 polymorfisme har øket risiko for slag og forbigående iskemisk anfall (TIA). Derfor kan den genetiske TAFI-Ile347 polymorfisme anvendes som en genetisk markør, for eksempel for identifisering av risiko for en trombogenisk forstyrrelse, for utvelgelse av pasienter som har risiko for trombogenisk forstyrrelse, for eksempel i kliniske studier, for identifisering av et farmasøytika for terapi og/eller profylakse av en trombogenisk forstyrrelse, for produksjon av et medikament for forebyggelse og/eller den terapeutiske behandling av en trombogenisk forstyrrelse, for produksjonen av et diagnostika for identifisering av en trombogenisk forstyrrelse og/eller for tilpasning av dosering av et medikament for behandling og/eller profylakse av en trombogenisk forstyrrelse. According to the present invention, it has been found that especially individuals with a TAFI-Ile347 polymorphism have an increased risk of stroke and transient ischemic attack (TIA). Therefore, the genetic TAFI-Ile347 polymorphism can be used as a genetic marker, for example for the identification of risk for a thrombogenic disorder, for the selection of patients at risk of a thrombogenic disorder, for example in clinical trials, for the identification of a pharmaceutical for therapy and /or prophylaxis of a thrombogenic disorder, for the production of a drug for the prevention and/or the therapeutic treatment of a thrombogenic disorder, for the production of a diagnostic for the identification of a thrombogenic disorder and/or for adjusting the dosage of a drug for treatment and /or prophylaxis of a thrombogenic disorder.
Derfor er en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse rettet mot en in vitro fremgangsmåte for identifikasjon av risiko for en trombogenisk forstyrrelse som uten begrensning inkluderer risiko for hjerteflimmer, slag, forlenget avbrutt neurologisk mangel (PRIND), forbigående iskemisk anfall (TIA), aterosklerotisk cerebrovaskulær sykdom (CVD) og/eller koronar hjertesykdom, der fremgangsmåten omfatter å bestemme i en prøve tilstedeværelsen av en aminosyreutbytting fra treonin til isoleusin ved posisjon 347 i den trombinaktiverbare fibrinolyseinhibitoren (TAFI) med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (TAFI-Ile347). Fordi diabetikere ofte viser hypofibrinolyse er prøven fortrinnsvis fra en diabetiker. Vanligvis er prøven en celle eller en kroppsvæske, for eksempel blod eller en dyre- eller en menneskecelle, isolert fra et dyr eller menneske. Therefore, an embodiment of the present invention is directed to an in vitro method for the identification of risk for a thrombogenic disorder which includes without limitation the risk of cardiac fibrillation, stroke, prolonged interrupted neurological deficit (PRIND), transient ischemic attack (TIA), atherosclerotic cerebrovascular disease ( CVD) and/or coronary heart disease, where the method comprises determining in a sample the presence of an amino acid substitution from threonine to isoleucine at position 347 in the thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 (TAFI-Ile347). Because diabetics often show hypofibrinolysis, the sample is preferably from a diabetic. Typically, the sample is a cell or a body fluid, such as blood or an animal or human cell, isolated from an animal or human.
TIA, PRIND og slag er nevrologiske mangler med en plutselig start som skyldes en vaskulær sykdom, slik som en trombogenisk forstyrrelse som bare er forskjellige med hensyn på tidsperioden for rekonvalesens og i alvorlighetsgraden. For eksempel varer de nevrologiske manglene ved TIA vanligvis mindre enn 24 timer, og resulterer ikke i permanent hjerneskade. For PRIND varer de nevrologiske manglene vanligvis i mer enn 24 timer uten permanent hjerneskade. Et slag resulterer vanligvis en permanent hjerneskade. TIA, PRIND, and stroke are neurologic deficits with a sudden onset due to a vascular disease, such as a thrombogenic disorder, that differ only in terms of the time period of recovery and severity. For example, the neurological deficits of TIA usually last less than 24 hours and do not result in permanent brain damage. For PRIND, the neurological deficits usually last for more than 24 hours without permanent brain damage. A stroke usually results in permanent brain damage.
TAFI-Ile347 polymorfismen kan generelt bestemmes ved fremgangsmåter kjent fra litteraturen. En fremgangsmåte er å bestemme aminosyreutbyttingen ved aminosyresekvensering, for eksempel standard proteindegradering eller analyse av proteinsekvensfragmenter med massespektrometri, enzymatisk behandling av proteinet og etterfølgende analyse av degraderingsproduktet, eller ved hjelp av et bindingsprotein eller et bindingspeptid eller aptamer, spesifikt rettet mot TAFI-Ile347, spesielt ved hjelp av et antistoff, en antigenbindende del av et antistoff og/eller et proteinskaffold, fortrinnsvis et anticalin. The TAFI-Ile347 polymorphism can generally be determined by methods known from the literature. One method is to determine the amino acid yield by amino acid sequencing, for example standard protein degradation or analysis of protein sequence fragments by mass spectrometry, enzymatic treatment of the protein and subsequent analysis of the degradation product, or by means of a binding protein or a binding peptide or aptamer, specifically targeting TAFI-Ile347, in particular by means of an antibody, an antigen-binding part of an antibody and/or a protein scaffold, preferably an anticalin.
Ifølge foreliggende oppfinnelse refererer uttrykket "bindingsprotein" eller "bindingspeptid" til en klasse proteiner eller peptider som spesifikt binder TAFI eller TAFI-Ile347 og som inkluderer uten begrensning monospesifikke polyklonale eller monoklonale antistoffer, antistoffragmenter eller proteinskaffold som spesifikt er rettet mot TAFI eller TAFI-Ile347, for eksempel anticaliner som er spesifikt rettet mot TAFI-Ile347. Uttrykket "spesifikt" betyr at bindingsproteinet eller -peptidet skiller mellom TAFI-Ile347 og andre polymorfismer ved aminosyreposisjon nr. 347 i TAFI, spesielt TAFI-Thr347. According to the present invention, the term "binding protein" or "binding peptide" refers to a class of proteins or peptides that specifically bind TAFI or TAFI-Ile347 and which include without limitation monospecific polyclonal or monoclonal antibodies, antibody fragments or protein scaffolds that specifically target TAFI or TAFI-Ile347 , for example anticalins that specifically target TAFI-Ile347. The term "specific" means that the binding protein or peptide distinguishes between TAFI-Ile347 and other polymorphisms at amino acid position #347 of TAFI, particularly TAFI-Thr347.
Bestemmelse av andre polymorfismer ved aminosyreposisjon nr. 347 i TAFI, spesielt TAFI-Thr347, kan anvendes som referanse eller kontroll i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Determination of other polymorphisms at amino acid position no. 347 in TAFI, especially TAFI-Thr347, can be used as a reference or control in the method according to the present invention.
Prosedyren for å konstruere et antistoff eller antistoffragment utføres i samsvar med fremgangsmåter velkjent for fagpersoner, for eksempel ved å immunisere et pattedyr, for eksempel en kanin med TAFI eller TAFI-Ile347, der det er passende i nærvær av for eksempel Freunds adjuvans og/eller aluminiumhydroksidgéler (se for eksempel Diamond, B. A. et al, 1981, The New England Journal of Medicine: 1344-1349). De polyklonale antistoffer som dannes i dyret som et resultat av en immunologisk reaksjon, kan deretter isoleres fra blodet ved anvendelse av velkjente fremgangsmåter og for eksempel renses ved kolonnekromatografi. Monoklonale antistoffer kan for eksempel konstrueres i samsvar med den kjente fremgangsmåten til Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C, 1991, Nature, 349,293-299). The procedure for constructing an antibody or antibody fragment is carried out in accordance with methods well known to those skilled in the art, for example by immunizing a mammal, for example a rabbit, with TAFI or TAFI-Ile347, where appropriate in the presence of, for example, Freund's adjuvant and/or aluminum hydroxide gels (see, for example, Diamond, B. A. et al, 1981, The New England Journal of Medicine: 1344-1349). The polyclonal antibodies which are formed in the animal as a result of an immunological reaction can then be isolated from the blood using well-known methods and, for example, purified by column chromatography. Monoclonal antibodies can, for example, be constructed in accordance with the known method of Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C, 1991, Nature, 349,293-299).
Ifølge foreliggende oppfinnelse forstås uttrykket "antistoff' eller "antistofrfagment" også som antistoffer eller antigenbindende deler derav som er laget rekombinant, og der hvor det er passende modifiseres slik som kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, multifunksjonelle antistoffer, bispesifikke eller oligospesifikke antistoffer, enkeltrådete antistoffer og F(ab)- eller F(ab)2-rfagmenter (se for eksempel EP-Bl-0 368 648, According to the present invention, the term "antibody" or "antibody fragment" is also understood as antibodies or antigen-binding parts thereof that have been made recombinantly, and where appropriate modified such as chimeric antibodies, humanized antibodies, multifunctional antibodies, bispecific or oligospecific antibodies, single-stranded antibodies and F(ab) or F(ab)2 fragments (see for example EP-Bl-0 368 648,
US 4 816 567, US 4 816 397, WO 88/01649, WO 93/06213 eller WO 98/24884). US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213 or WO 98/24884).
Som et alternativ til de klassiske antistoffene er det også mulig å anvende proteinskaffold mot TAFI eller TAFI-Ile347, for eksempel anticaliner som er basert på lipocalin (Beste et al., 1999, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 96,1898-1903). De naturlige ligandbindende setene i lipocalinene, for eksempel det retinolbindende protein eller det bilinbindende proteinet kan endres, for eksempel ved hjelp av en "kombinatorisk proteinkonstruksjon tilnærming" på en slik måte at de binder selektivt til haptener, her til TAFI eller TAFI-Ile347 (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482,337-50). Andre kjente proteinskaffold er kjente for å være alternativer til antistoffer for molekylær gjenkjenning (Skerra, 2000, J. Mol. Recognit., 13,167-187). As an alternative to the classical antibodies, it is also possible to use protein scaffolds against TAFI or TAFI-Ile347, for example anticalins which are based on lipocalin (Beste et al., 1999, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 96, 1898-1903). The natural ligand-binding sites in the lipocalins, for example the retinol-binding protein or the bilin-binding protein can be modified, for example by means of a "combinatorial protein design approach" in such a way that they bind selectively to haptens, here to TAFI or TAFI-Ile347 (Skerra , 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482,337-50). Other known protein scaffolds are known to be alternatives to antibodies for molecular recognition (Skerra, 2000, J. Mol. Recognit., 13,167-187).
Aptamerer er nukleinsyrer som binder med høy affinitet til et polypeptid, her TAFI eller TAFI-Ile347. Aptamerene kan isoleres ved seleksjonsfremgangsmåter slik som SELEX (se for eksempel Jayasena, 1999, Clin. Chem., 45:1628-50; Klug og Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20:97-107; US 5 582 981) fra en stor samling av enkeltrådete RNA-molekyler. Aptamerene kan også syntetiseres og selekteres i deres speilbildeform, for eksempel som L-ribonukleotidet (Nolte et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14:116-1119; Klussmann et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14:1112-1115). Former isolerte på denne måte har fordel av at de ikke er degraderte av naturlig forekommende ribonukleaser, og derfor innehar de høyere stabilitet. Aptamers are nucleic acids that bind with high affinity to a polypeptide, here TAFI or TAFI-Ile347. The aptamers can be isolated by selection methods such as SELEX (see, for example, Jayasena, 1999, Clin. Chem., 45:1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20:97-107; US 5 582,981) from a large collection of single-stranded RNA molecules. The aptamers can also be synthesized and selected in their mirror image form, for example as the L-ribonucleotide (Nolte et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14:116-1119; Klussmann et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14:1112 -1115). Forms isolated in this way have the advantage that they are not degraded by naturally occurring ribonucleases and therefore have higher stability.
En annen fremgangsmåte for å bestemme TAFI-Ile347 polymorfisme er analyse av TAFI-genet, spesielt nukleinsyresekvensen ved posisjon 1064 for påvisning av nukleotidutbyttingen fra cytidin til tymidin. Vanligvis kan bestemmelsen av nukleotidutbyttingen utføres ved nukleinsyresekvensering, for eksempel pyrosekvensering, sekvenseringsfremgangsmåter som anvender radioaktivt merkete nukleotider eller nukleotider som er merket med en fluorescerende farge, primerutvidelsesanalyse, analyse av sekvensfragmenter med massespektrometri eller ved hjelp av et antistoff, en antigenbindende del av et antistoff eller et proteinskaffold, fortrinnsvis et anticalin og/eller en komplementær nukleinsyre, spesifikt rettet mot mutasjonen i TAFI-genet. Another method for determining the TAFI-Ile347 polymorphism is analysis of the TAFI gene, particularly the nucleic acid sequence at position 1064 to detect the nucleotide exchange from cytidine to thymidine. Generally, the determination of the nucleotide yield can be performed by nucleic acid sequencing, for example pyrosequencing, sequencing methods using radioactively labeled nucleotides or nucleotides labeled with a fluorescent dye, primer extension analysis, analysis of sequence fragments by mass spectrometry or by means of an antibody, an antigen-binding portion of an antibody or a protein scaffold, preferably an anticalin and/or a complementary nucleic acid, specifically targeting the mutation in the TAFI gene.
I dette henseende betyr uttrykket "spesifikt" at antistoffet, en antigenbindende del av del av et antistoff eller et proteinskaffold, fortrinnsvis et anticalin, og/eller en komplementær nukleinsyre, skiller mellom TAFI-Ile347-genet og andre polymorfismer av nukleotidkodonet for aminosyreposisjon nr. 347 i TAFI, spesielt TAFI-Thr347. Den foretrukne nukleotidutbyttingen fra polymorfismen av aminosyren ved posisjon nr. 347 er nukleotidet ved posisjon 1064. In this regard, the term "specifically" means that the antibody, an antigen-binding part of part of an antibody or a protein scaffold, preferably an anticalin, and/or a complementary nucleic acid, distinguishes between the TAFI-Ile347 gene and other polymorphisms of the nucleotide codon for amino acid position no. 347 in TAFI, especially TAFI-Thr347. The preferred nucleotide yield from the polymorphism of the amino acid at position #347 is the nucleotide at position #1064.
De komplementære nukleinsyrene som fortrinnsvis er enkeltrådete DNA-molekyler, kan kjemisk syntetiseres, for eksempel i samsvar med fosfotriesterrfemgangsmåten (se for eksempel Uhlmann, E. & Peyman, A., 1990, Chemical Reviews, 90:543-584). Disse komplementære nukleinsyrene kan anvendes som hybridiseirngsprober, for eksempel på DNA-mikromatriser, eller som oppformeringsprober, for eksempel i "TaqMan"-analysen ("TaqMan" Laboratory), som er en fluorogenisk 5' nukleaseanalyse. The complementary nucleic acids, which are preferably single-stranded DNA molecules, can be chemically synthesized, for example, according to the phosphotriester five-step method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A., 1990, Chemical Reviews, 90:543-584). These complementary nucleic acids can be used as hybridization probes, for example on DNA microarrays, or as amplification probes, for example in the "TaqMan" analysis ("TaqMan" Laboratory), which is a fluorogenic 5' nuclease analysis.
Den antigenbindende delen av et antistoff eller proteinskaffold kan produseres i henhold til det ovenfor beskrevne. The antigen-binding portion of an antibody or protein scaffold can be produced as described above.
I alle tilfeller er det fordelaktig for fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og i tillegg bestemme andre potensielle polymorfismer ved aminosyreposisjon 347 i TAFI, for eksempel TAFI-Thr347, som en referanse eller kontroll, fortrinnsvis med en fremgangsmåte som ovenfor beskrevet. In all cases, it is advantageous for the method according to the present invention and in addition to determine other potential polymorphisms at amino acid position 347 in TAFI, for example TAFI-Thr347, as a reference or control, preferably with a method as described above.
Med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan vanligvis en øket risiko for vaskulær forstyrrelse uten begrensning inkludere hjerteflimmer, slag, forlenget avbrutt neurologisk mangel (PRIND), forbigående iskemisk anfall (TIA), aterosklerotisk cerebrovaskulær sykdom (CVD) og/eller koronar hjertesykdom, sammenliknet med en referanse eller kontroll identifiseres som kan føre til en profylaktisk og/eller terapeutisk behandling av et individ, for eksempel en diabetiker, eller til tilpassing av doseringen av et farmasøytika som skal gis, som beskrevet nedenfor. With the method of the present invention, an increased risk of vascular disorder may typically include, without limitation, fibrillation, stroke, prolonged interrupted neurologic deficit (PRIND), transient ischemic attack (TIA), atherosclerotic cerebrovascular disease (CVD), and/or coronary heart disease, compared to a reference or control is identified which may lead to a prophylactic and/or therapeutic treatment of an individual, for example a diabetic, or to the adjustment of the dosage of a pharmaceutical to be given, as described below.
En annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for identifikasjon av et farmasøytika, helst en hemmer av TAFI-De347 for terapien og/eller profylaksen av en trombogenisk forstyrrelse som uten begrensning inkluderer hjerteflimmer, slag, forlenget avbrutt neurologisk mangel (PRIND), forbigående iskemisk attakk (TIA), aterosklerotisk cerebrovaskulær sykdom (CVD) og/eller koronar hjertesykdom, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene: Another embodiment of the present invention is directed to a method for the identification of a pharmaceutical, preferably an inhibitor of TAFI-De347 for the therapy and/or prophylaxis of a thrombogenic disorder which includes without limitation cardiac fibrillation, stroke, prolonged interrupted neurological deficit (PRIND), transient ischemic attack (TIA), atherosclerotic cerebrovascular disease (CVD) and/or coronary heart disease, where the method comprises the steps:
(a) å tilveiebringe TAFI-Ile347 eller TAFI-Ile347-genet, (a) providing TAFI-Ile347 or the TAFI-Ile347 gene;
(b) å tilveiebringe en testforbindelse, og (b) providing a test compound, and
(c) å måle eller påvise påvirkningen av testforbindelsen på TAFMle347 eller TAFI-Ile347-genet. (c) measuring or detecting the effect of the test compound on the TAFMle347 or TAFI-Ile347 gene.
Ifølge den foreliggende oppfinnelse refererer uttrykket "inhibitor" til en biokjemisk eller kjemisk forbindelse som inhiberer eller reduserer zymogenisk aktivitet til TAFI-Ile347, spesielt fjerningen av lysinrestene fra en fibrinklump, og/eller som reduserer halveringstiden til TAFI-Ile347, spesielt med minst ca. 20 % til ca. 50 %, fortrinnsvis minst med ca. 30 % til ca. 45 %, spesielt med ca. 45 %. Uttrykket "ca." betyr vanligvis en feilmargin på ± 20 %, spesielt ± 10 %, fortrinnsvis ± 5 %. According to the present invention, the term "inhibitor" refers to a biochemical or chemical compound that inhibits or reduces the zymogenic activity of TAFI-Ile347, especially the removal of the lysine residues from a fibrin clot, and/or that reduces the half-life of TAFI-Ile347, especially by at least approx. 20% to approx. 50%, preferably at least with approx. 30% to approx. 45%, especially with approx. 45%. The term "approx." usually means a margin of error of ± 20%, especially ± 10%, preferably ± 5%.
Generelt tilveiebringes TAFI-Ile347 eller TAFI-Ile347-genet eksempelvis i et analysesystem og bringes direkte eller indirekte i kontakt med en testforbindelse, spesielt en biokjemisk eller kjemisk testforbindelse, dvs. i form av et kjemisk forbindelsesbibliotek. Deretter måles eller påvises virkningen av testforbindelsen på TAFI-Ile347 eller TAFI-Ile347-genet. Passende inhibitorer kan så analyseres og/eller isoleres. For screening av kjemiske forbindelsesbiblioteker, foretrekkes anvendelsen av høykapasitetsanalyse, som er kjent for fagpersoner eller som er kommersielt tilgjengelige. In general, TAFI-Ile347 or the TAFI-Ile347 gene is provided, for example, in an analysis system and brought directly or indirectly into contact with a test compound, especially a biochemical or chemical test compound, i.e. in the form of a chemical compound library. The effect of the test compound on TAFI-Ile347 or the TAFI-Ile347 gene is then measured or detected. Appropriate inhibitors can then be analyzed and/or isolated. For screening of chemical compound libraries, the use of high-throughput assays known to those skilled in the art or commercially available is preferred.
Ifølge foreliggende oppfinnelse refererer uttrykket "kjemisk forbindelsesbibliotek" til en mengde kjemiske forbindelser som er samlet fra mange kilder, inkludert kjemisk syntetiserte molekyler og naturlige produkter, eller som er generert ved kombinatorisk kjemiske teknikker. According to the present invention, the term "chemical compound library" refers to a set of chemical compounds collected from many sources, including chemically synthesized molecules and natural products, or generated by combinatorial chemical techniques.
Generelt blir påvirkningen av testforbindelsen på TAFI-Ile347 eller TAFHle347-genet målt eller påvist i en heterogen eller homogen analyse. Som anvendt heri er en heterogen analyse en analyse som inkluderer ett eller flere vasketrinn, mens det i en homogen analyse ikke er påkrevd med slike vasketrinn. Reagensene og forbindelsene bare blandes og måles. In general, the effect of the test compound on the TAFI-Ile347 or TAFHle347 gene is measured or detected in a heterogeneous or homogeneous assay. As used herein, a heterogeneous assay is an assay that includes one or more washing steps, while in a homogeneous assay such washing steps are not required. The reagents and compounds are simply mixed and measured.
Passende funksjonelle analyser kan baseres på genekspresjon av TAFI~Ile347 i nærvær av en biokjemisk eller kjemisk forbindelse som skal testes som en inhibitor av TAFI-Xle347 genekspresjon, kan den direkte inhiberingen måles ved måter som vanligvis er kjent for en fagperson, og som er beskrevet ovenfor. For å måle den enzymatiske aktiviteten til TAFI (for eksempel som en referanse eller kontroll) og/eller TAFI-Ile347, kan for eksempel clotlysis og/eller fjerning av lysinrester fra fibrin eller vanligvis dets karboksypeptidaseaktivitet ved anvendelse av for eksempel det syntetiske karboksypeptidasesubstratet anisylazoformyllysin måles i en passende analyse som er kjent for fagperson (se for eksempel Schneider, M. et al., 2002, suprd). Appropriate functional assays can be based on gene expression of TAFI~Ile347 in the presence of a biochemical or chemical compound to be tested as an inhibitor of TAFI-Xle347 gene expression, the direct inhibition can be measured by means generally known to one skilled in the art and described above. To measure the enzymatic activity of TAFI (for example as a reference or control) and/or TAFI-Ile347, for example clotlysis and/or removal of lysine residues from fibrin or usually its carboxypeptidase activity using, for example, the synthetic carboxypeptidase substrate anisylazoformyllysine can be measured in an appropriate assay known to those skilled in the art (see, for example, Schneider, M. et al., 2002, suprd).
Heterogene analyser er for eksempel ELISA (enzymkoblet immunsorbent analyse), DELFIA, SPA og flashplateanalyse. Heterogeneous analyzes are, for example, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), DELFIA, SPA and flash plate analysis.
ELISA er en generelt kjent analyse som anvender et enzym som markørmolekyl. For eksempel startes en peroksidase fargereaksjon ved tilsetting av peroksidasesubstrat, og den optiske tetthet måles i et passende densimeter. ELISA is a generally known analysis that uses an enzyme as a marker molecule. For example, a peroxidase color reaction is started by adding peroxidase substrate, and the optical density is measured in a suitable densimeter.
DELFIA (dissosiasjonsforsterket lantanid fluorimmunanalyse) baserte analyser er fast faseanalyse. Antistoffet merkes vanligvis med Europium eller et annet lantanid, og Europiumfluorescensen påvises etter at ikke-bundet Europiummerkete antistoffer er vasket bort. DELFIA (dissociation enhanced lanthanide fluorine immunoassay) based assays are solid phase assays. The antibody is usually labeled with Europium or another lanthanide, and the Europium fluorescence is detected after unbound Europium-labeled antibodies have been washed away.
SPA (scintillasjons nærhetsanalyse) og flash plateanalyse utnytter vanligvis biotin/avidin interaksjoner for å fange radioaktivt merkete substrater. Vanligvis inkluderer reaksjonsblandingen et biotinylert peptidsubstrat. Etter reaksjonen fanges de biotinylerte peptidene av streptavidin. I SPA-påvisning bindes streptavidin på scintillasjonsinneholdende kuler, mens i flash platepåvisningen bindes streptavidin på brønnens innside i scintillasjonsinneholdende mikrotiterplater. Straks det er immobilisert er det radioaktivt merkete substratet nær nok scintillanten for å stimulere lysemisjonen. Alternative homogene analyser er for eksempel TR-FRET, FP, ALPHA, EFC og genanalyser. SPA (scintillation proximity assay) and flash plate assays typically utilize biotin/avidin interactions to capture radiolabeled substrates. Typically, the reaction mixture includes a biotinylated peptide substrate. After the reaction, the biotinylated peptides are captured by streptavidin. In SPA detection, streptavidin is bound to scintillation-containing beads, while in flash plate detection, streptavidin is bound to the inside of the well in scintillation-containing microtiter plates. Once immobilized, the radioactively labeled substrate is close enough to the scintillant to stimulate light emission. Alternative homogeneous analyzes are, for example, TR-FRET, FP, ALPHA, EFC and gene analyses.
TR-FRET (tidsbestemt fluorescensresonansenergioverføring) baserte analyser er analyser som vanligvis utnytter fluorescensresonansenergioverføring mellom Europium og APC, et modifisert allofycocyanin eller andre fargestoffer med overlappende spektra, slik som Cy3/Cy5 eller Cy5/Cy7 (Schobel, U. et al., 1999, Bioconjugate Chem. TR-FRET (timed fluorescence resonance energy transfer) based assays are assays that typically utilize fluorescence resonance energy transfer between Europium and APC, a modified allophycocyanin, or other dyes with overlapping spectra, such as Cy3/Cy5 or Cy5/Cy7 (Schobel, U. et al., 1999, Bioconjugate Chem.
10:1107-1114). Etter eksitasjon av for eksempel Europium med lys ved 337 nm, fluorescerer molekylet ved 620 nm. Men hvis denne fluorofor er APC nær nok, vil Europium overføre sin eksitasjonsenergi til APC, som fluorescerer ved 665 nm. Etter reaksjonen tilsettes Europiummerkete antistoffer sammen med streptavidin-APC. Den tette nærhet mellom APC og Europium fluorofor vil forårsake en bremsing av Europium fluorescens med fordel for APC fluorescensen (FRET). 10:1107-1114). After excitation of, for example, Europium with light at 337 nm, the molecule fluoresces at 620 nm. However, if this fluorophore is close enough to APC, Europium will transfer its excitation energy to APC, which fluoresces at 665 nm. After the reaction, Europium-labeled antibodies are added together with streptavidin-APC. The close proximity between APC and Europium fluorophore will cause a slowing of Europium fluorescence in favor of APC fluorescence (FRET).
Fluorescens polarisering (FP) baserte analyser er analyser som anvender polarisert lys for å eksitere fluorescerende substratpeptider i løsning. Disse fluorescerende peptidene er frie i løsning, tumler rundt og forårsaker det emitterte lyset til å bli depolarisert. Når substratpeptidet binder til et større molekyl vil dets tumlende hastighet imidlertid sterkt reduseres og det emitterte lyset forblir veldig polarisert. Fluorescence polarization (FP) based assays are assays that use polarized light to excite fluorescent substrate peptides in solution. These fluorescent peptides are free in solution, tumbling around and causing the emitted light to become depolarized. However, when the substrate peptide binds to a larger molecule, its tumbling speed will be greatly reduced and the emitted light will remain highly polarized.
ALPHA (oppformert luminescens nærhetshomogen) baserte analyser er analyser som er avhengige av overføring av enkelt oksygen mellom donor- og akseptorkuler som bringes i hverandres nærhet. Ved eksitering ved 680 nm omdanner foto-sensitiviserere i donorkuler omgivende oksygen til enkeltilstandsoksygen som diffuserer opptil en distanse på 200 nm. Kjemiluminiserende grupper i akseptorkulene overfører energi til fluorescerende mottakere innen kulen, som så emitterer lys ved ca. 600 nm. ALPHA (amplified luminescence proximity homogeneous) based assays are assays that rely on the transfer of singlet oxygen between donor and acceptor spheres that are brought into close proximity to each other. Upon excitation at 680 nm, photo-sensitizers in donor spheres convert ambient oxygen into singlet oxygen which diffuses up to a distance of 200 nm. Chemiluminescent groups in the acceptor spheres transfer energy to fluorescent receivers within the sphere, which then emit light at approx. 600 nm.
EFC (enzymfragment komplementering) baserte analyser eller ekvivalente analyser, kan anvendes spesielt for høykapasitetsscreening av forbindelser. EFC-analyse baseres på et konstruert p-galaktosidaseenzym bestående av to fragmenter; enzymakseptoren (EA) og enzymdonoren (ED). Når fragmentene er separert er det ingen b-galaktosidaseaktivitet, men når fragmentene er sammen assosierer de (komplement) og danner aktivt enzym. EFC-analyse benytter et ED-analyttkonjugat der analytten kan gjenkjennes av et spesifikt bindingsprotein, slik som et antistoff eller en reseptor. I fravær av det spesifikke bindingsproteinet, er ED-analyttkonjugatet i stand til å komplementere EA slik at det dannes aktivt p-galaktosidase som produserer et positivt luminiserende signal. Hvis ED-analyttkonjugatet er bundet av et spesifikt bindingsprotein forhindres komplementering med EA, og det er intet signal. Hvis fri analytt tilveiebringes (i en prøve) vil den konkurrere med ED-analyttkonjugatet for binding til det spesifikke bindingsproteinet. Fri analytt vil frigjøre ED-analyttkonjugat for komplementering med EA, og produsere et signal avhengig av mengden fri analytt til stede i prøven. EFC (enzyme fragment complementation) based analyzes or equivalent analyses, can be used especially for high-throughput screening of compounds. EFC assay is based on an engineered β-galactosidase enzyme consisting of two fragments; the enzyme acceptor (EA) and the enzyme donor (ED). When the fragments are separated there is no b-galactosidase activity, but when the fragments are together they associate (complement) and form active enzyme. EFC analysis uses an ED-analyte conjugate where the analyte can be recognized by a specific binding protein, such as an antibody or a receptor. In the absence of the specific binding protein, the ED-analyte conjugate is able to complement the EA to form active β-galactosidase that produces a positive luminescent signal. If the ED-analyte conjugate is bound by a specific binding protein, complementation with EA is prevented and there is no signal. If free analyte is provided (in a sample) it will compete with the ED-analyte conjugate for binding to the specific binding protein. Free analyte will release ED-analyte conjugate for complementation with EA, producing a signal dependent on the amount of free analyte present in the sample.
Et eksempel på en genanalyse er to-hybridsystemanalysen (Fields og Stemglanz (1994) Trends in Genetics, 10,286-292; Colas og Brent (1998) TIBTECH, 16,355-363). I denne testen transformers celler med ekspresjonsvektorer som uttrykker fusjonsproteiner bestående av polypeptidet i følge oppfinnelsen, og et DNA-bindende domene til en transkripsjonsfaktor, slik som Gal4 eller LexA. De transformerte cellene inneholder i tillegg et rapportørgen med en promoter inneholdende bindingsseter for det korresponderende DNA-bindingsdoménet. Ved transformasjon med en annen ekspresjonsvektor uttrykkende et annet fusjonsprotein bestående av et kjent ellet ukjent polypeptid, og et aktiveringsdoméne, for eksempel fra Gal4 eller herpes simplex virus VP 16, kan ekspresjonen av rapportørgenet økes mye dersom det andre fusjonsproteinet interagerer med polypeptidet. Som en konsekvens av dette kan dette testsystemet anvendes for å screene biologiske eller kjemiske forbindelser som inhiberer en interaksjon mellom TAFI-He347 og dets substrat, for eksempel fibrin. På denne måten er det mulig å identifisere nye, aktive forbindelser hurtig. An example of a gene assay is the two-hybrid system assay (Fields and Stemglanz (1994) Trends in Genetics, 10,286-292; Colas and Brent (1998) TIBTECH, 16,355-363). In this test, cells are transformed with expression vectors that express fusion proteins consisting of the polypeptide according to the invention, and a DNA-binding domain of a transcription factor, such as Gal4 or LexA. The transformed cells additionally contain a reporter gene with a promoter containing binding sites for the corresponding DNA binding domain. By transformation with another expression vector expressing another fusion protein consisting of a known or unknown polypeptide, and an activation domain, for example from Gal4 or herpes simplex virus VP 16, the expression of the reporter gene can be greatly increased if the second fusion protein interacts with the polypeptide. As a consequence, this test system can be used to screen biological or chemical compounds that inhibit an interaction between TAFI-He347 and its substrate, for example fibrin. In this way, it is possible to identify new, active connections quickly.
En annen analyse baseres på fastfasebundete polypeptider, slik som TAFI-Ile347. En testforbindelse inneholder således eksempelvis en påvisbar markør, forbindelsen kan være radioaktivt merket, fluorescensmerket eller luminisensmerket. Videre kan forbindelser tilkobles proteiner som tillater indirekte påvisning, for eksempel ved hjelp av enzymatisk katalyse som bruker en peroksidaseanalyse som anvender et kromogenisk substrat eller ved å binde et påvisbart antistoff. En annen mulighet er å undersøke de fastfasebundne proteinkompleksene ved hjelp av massespektrometri (SELDI). Forandringer i konformasjonen av for eksempel TAFI-Ile347 i løpet av dets aktivering som resultat av interaksjon med en testsubstans, kan påvises for eksempel ved forandring i fluorescens av en endogen tryptofanrest i polypeptidet Another assay is based on solid-phase bound polypeptides, such as TAFI-Ile347. A test compound thus contains, for example, a detectable marker, the compound can be radioactively labeled, fluorescently labeled or luminescently labeled. Furthermore, compounds can be attached to proteins that allow indirect detection, for example by means of enzymatic catalysis using a peroxidase assay using a chromogenic substrate or by binding a detectable antibody. Another possibility is to examine the solid-phase bound protein complexes using mass spectrometry (SELDI). Changes in the conformation of, for example, TAFI-Ile347 during its activation as a result of interaction with a test substance can be detected, for example, by changes in the fluorescence of an endogenous tryptophan residue in the polypeptide
De fastfasebundne polypeptidene kan også være en del av en oppstilling. Fremgangsmåter for å konstruere slike oppstillinger ved anvendelse av fastfasekjemi og fotolabile beskyttelsesgrupper er beskrevet i US 5 744 305. Disse oppstillingene kan også bringes i kontakt med testforbindelse eller forbindelsesbiblioteker og testes for interaksjon, for eksempel binding eller forandring i konformasjon. The solid-phase bound polypeptides can also be part of an array. Methods for constructing such arrays using solid phase chemistry and photolabile protecting groups are described in US 5,744,305. These arrays can also be contacted with test compound or compound libraries and tested for interaction, for example binding or change in conformation.
På en fordelaktig måte utføres fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse i et robotsystem, for eksempel utsåing ved hjelp av robot og et robotflytende overføringssystem, for eksempel ved anvendelse av mikrovæsketekmkker, dvs. kanaliserte strukturer. In an advantageous manner, the method according to the present invention is carried out in a robotic system, for example seeding with the aid of a robot and a robotic liquid transfer system, for example using microfluidic technologies, i.e. channeled structures.
I en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse utføres fremgangsmåten i form av et høykapasitets screeningssystem. I et slikt system er det fordelaktig at screeningsfremgangsmåten automatiseres og miniatyriseres, spesielt anvender den miniatyriserte brønner og mikrovæsketeknikker som kontrolleres av en robot. In another embodiment according to the present invention, the method is carried out in the form of a high-capacity screening system. In such a system, it is advantageous that the screening procedure is automated and miniaturized, in particular it uses miniaturized wells and microfluidic techniques controlled by a robot.
En annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er rettet mot anvendelse for identifikasjon av en trombogenisk sykdom hos en diabetiker. Den trombogeniske forstyrrelse, inkluderer uten begrensning hjerteflimmer, slag, forlenget avbrutt neurologisk mangel (PRIND), forbigående iskemisk attakk (TIA), aterosklerotisk cerebrovaskulær sykdom (CVD) og/eller koronar hjertesykdom. Another embodiment according to the present invention is aimed at use for the identification of a thrombogenic disease in a diabetic. The thrombogenic disorder includes, without limitation, fibrillation, stroke, prolonged interrupted neurologic deficit (PRIND), transient ischemic attack (TIA), atherosclerotic cerebrovascular disease (CVD), and/or coronary heart disease.
For fremstilling av medikamentet formuleres vanligvis det identifiserte farmasøytika med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere eller hjelpesubstanser, slik som fysiologisk bufferløsning, for eksempel natriumkloridløsning, demineralisert vann, stabilisatorer som protease- eller nukleaseinhibitorer fortrinnsvis aprotinin, s-aminokapronsyre eller pepstatin-A eller kelateringsmidler som EDTA, gélformuleringer som hvit vaselin, lav-viskositets parafin og/eller gul voks, osv., avhengig av tilførselsmåte. For the manufacture of the drug, the identified pharmaceutical is usually formulated with one or more pharmaceutically acceptable carriers or auxiliary substances, such as physiological buffer solution, for example sodium chloride solution, demineralized water, stabilizers such as protease or nuclease inhibitors preferably aprotinin, s-aminocaproic acid or pepstatin-A or chelating agents such as EDTA, gel formulations such as white petroleum jelly, low-viscosity paraffin and/or yellow wax, etc., depending on the route of administration.
Passende tilleggsstoffer er videre eksempelvis detergenter som for eksempel Triton-X-100 eller natriumdeoksycholat, men også polyoler som for eksempel polyetylenglykol eller glyserol, sukkere som for eksempel sukrose eller glukose, zwitterioniske forbindelser som for eksempel aminosyrer som glysin eller spesielt taurin eller betain og/eller et protein som for eksempel bovint eller humant serumalbumin. Detergenter, polyoler og/eller zwitterioniske forbindelser foretrekkes. Suitable additives are further, for example, detergents such as Triton-X-100 or sodium deoxycholate, but also polyols such as polyethylene glycol or glycerol, sugars such as sucrose or glucose, zwitterionic compounds such as amino acids such as glycine or especially taurine or betaine and/ or a protein such as bovine or human serum albumin. Detergents, polyols and/or zwitterionic compounds are preferred.
Den fysiologiske bufferløsningen har fortrinnsvis en pH på ca. 6,0-8,0, spesielt en pH på ca. 6,8-7,8, særlig en pH på ca. 7,4, og/eller en osmolaritet på ca. 200-400 milliosmol/liter, fortrinnsvis på ca. 290-310 milliosmol/liter. Medikamentets pH justeres vanligvis ved anvendelse av en passende organisk eller uorganisk buffer, slik som for eksempel fortrinnsvis fosfatbuffer, tris-buffer (tris(hydroksymetyl)aminometan), HEPES-buffer ([4-(2-hydroksyetyl)piperazin]etansulfons<y>re) eller MOPS-buffer (3-morfolin-l-propansulfonsyre). Valget av respektiv buffer avhenger generelt av den ønskete buffermolaritet Fosfatbuffer er egnet for eksempel for injeksjons- og infusjonsløsninger. The physiological buffer solution preferably has a pH of approx. 6.0-8.0, especially a pH of approx. 6.8-7.8, especially a pH of approx. 7.4, and/or an osmolarity of approx. 200-400 milliosmol/litre, preferably of approx. 290-310 milliosmol/liter. The pH of the drug is usually adjusted using a suitable organic or inorganic buffer, such as, for example, preferably phosphate buffer, tris buffer (tris(hydroxymethyl)aminomethane), HEPES buffer ([4-(2-hydroxyethyl)piperazine]ethanesulfon<y> re) or MOPS buffer (3-morpholine-1-propanesulfonic acid). The choice of respective buffer generally depends on the desired buffer molarity Phosphate buffer is suitable, for example, for injection and infusion solutions.
Medikamentet kan tilføres på konvensjonell måte, for eksempel ved orale doseringsformer, slik som for eksempel tabletter eller kapsler, ved hjelp av slim-membranene, for eksempel nese eller den orale hule, i form av "dispositorer" implantert under huden ved hjelp av injeksjoner, infusjoner eller géler inneholdende medikamentene. Det er videre mulig å tilføre medikamentet topikalt og lokalt for å behandle den bestemte leddsykdommen beskrevet ovenfor, om det er passende, i form av liposomkomplekser. Behandlingen kan videre utføres ved hjelp av et transdermalt, terapeutisk system (TTS), som muliggjør en midlertidig, kontrollert medikamentrfigivelse. TTS er kjent for eksempel fra EP 0944398 Al, EP 0916336 Al, EP 0889723 Al og EP 0852493 Al. The medication can be administered in a conventional way, for example by oral dosage forms, such as for example tablets or capsules, by means of the mucous membranes, for example the nose or the oral cavity, in the form of "dispositors" implanted under the skin by means of injections, infusions or gels containing the drugs. It is further possible to administer the drug topically and locally to treat the particular joint disease described above, if appropriate, in the form of liposome complexes. The treatment can also be carried out using a transdermal therapeutic system (TTS), which enables a temporary, controlled drug delivery. TTS is known for example from EP 0944398 A1, EP 0916336 A1, EP 0889723 A1 and EP 0852493 A1.
Injeksjonsløsninger anvendes vanligvis bare hvis relativt små mengder av en løsning eller suspensjon, for eksempel fra omkring 1-20 ml skal tilføres kroppen. Infusjonsløsninger anvendes vanligvis hvis en større mengde av en løsning eller suspensjon, for eksempel én eller flere liter skal tilføres. Fordi bare noen få milliliter gis i tilfellet av injeksjonsløsninger, i kontrast til infusjonsløsninger, vil ikke små forskjeller i pH og det osmotiske trykket til blodet eller vevsvæsken i injeksjonen være merkbart, eller vil bare være merkbart i en ubetydelig grad med hensyn til smertefølelse. Fortynning av formuleringen før anvendelse ifølge oppfinnelsen, er derfor generelt ikke nødvendig. I tilfelle tilførsel av relativt store mengder, bør imidlertid formuleringen fortynnes kort før tilførsel i en slik grad at minst omtrent isotonisk løsning oppnås. Eksempel på isotonisk løsning er en 0,9 % løsningsstyrke av natriumklorid. I tilfelle infusjon kan fortynninger utføres ved å anvende sterilt vann, mens tilførselen for eksempel kan utføres via en såkalt bypass. Injection solutions are usually only used if relatively small amounts of a solution or suspension, for example from around 1-20 ml, are to be administered to the body. Infusion solutions are usually used if a larger quantity of a solution or suspension, for example one or more litres, is to be administered. Because only a few milliliters are given in the case of injection solutions, in contrast to infusion solutions, small differences in the pH and the osmotic pressure of the blood or tissue fluid in the injection will not be noticeable, or will only be noticeable to a negligible degree with respect to pain sensation. Dilution of the formulation before use according to the invention is therefore generally not necessary. However, in the case of administration of relatively large amounts, the formulation should be diluted shortly before administration to such an extent that at least an approximately isotonic solution is obtained. An example of an isotonic solution is a 0.9% strength solution of sodium chloride. In the case of infusion, dilutions can be carried out by using sterile water, while the supply can, for example, be carried out via a so-called bypass.
I en annen utførelsesform anvendes TAFI-Ile347 eller TAFI-Ile347-genet for produksjon av et diagnostika for identifikasjon av en vaskulær sykdom, spesielt hos en diabetiker, som uten begrensning inkluderer hjerteflimmer, slag, forlenget avbrutt neurologisk mangel (PRIND), forbigående iskemisk attakk (TIA), aterosklerotisk cerebrovaskulær sykdom (CVD) og/eller koronar hjertesykdom. In another embodiment, TAFI-Ile347 or the TAFI-Ile347 gene is used for the production of a diagnostic for the identification of a vascular disease, particularly in a diabetic, which includes without limitation cardiac fibrillation, stroke, prolonged interrupted neurological deficit (PRIND), transient ischemic attack (TIA), atherosclerotic cerebrovascular disease (CVD) and/or coronary heart disease.
TAFI-Ile347 kan for eksempel anvendes for produksjon av bindingsproteiner, bindingspeptider eller aptamerer, og kan benyttes som diagnostiske midler, som beskrevet ovenfor. TAFI-Ile347-genet kan anvendes i seg selv, spesielt i enkeltrådet form eller for produksjon av en komplementær nukleinsyre, fortrinnsvis et komplementært, enkeltrådet DNA, og kan benyttes som en hybridiserings- og/eller oppformeirngsprobe, generelt kjent av fagpersoner i feltet TAFI-Ile347 can, for example, be used for the production of binding proteins, binding peptides or aptamers, and can be used as diagnostic agents, as described above. The TAFI-Ile347 gene can be used per se, especially in single-stranded form or for the production of a complementary nucleic acid, preferably a complementary, single-stranded DNA, and can be used as a hybridization and/or amplification probe, generally known to those skilled in the art
Som beskrevet ovenfor viser TAFI-Ile347 utvidet halveringstid og øket antifibirnolytisk aktivitet in vivo, og fortrinnsvis en øket risiko for slag og TIA. Individer med en TAFI- As described above, TAFI-Ile347 shows extended half-life and increased antifibrinolytic activity in vivo, and preferably an increased risk of stroke and TIA. Individuals with a TAFI
Ile347 polymorfisme trenger derfor en større mengde av et medikament for behandling og/eller profylakse av en trombogenisk forstyrrelse. Generelt bør doseringen av et medikament tilpasses den genetiske TAFI-profilen til et individ eller pasient, fortrinnvis til individer eller pasienter som er homozygote med hensyn på isoleusin i posisjon 347. Bestemmelsestrinnet (a) i den foreliggende fremgangsmåten kan utføres som forklart ovenfor. Ile347 polymorphism therefore needs a greater amount of a drug for treatment and/or prophylaxis of a thrombogenic disorder. In general, the dosage of a drug should be tailored to the TAFI genetic profile of an individual or patient, preferably to individuals or patients who are homozygous for isoleucine at position 347. The determination step (a) of the present method may be performed as explained above.
De påfølgende eksemplene, tabell og figurer vil forklare den foreliggende oppfinnelse uten å begrense oppfinnelsens formål. The following examples, table and figures will explain the present invention without limiting the purpose of the invention.
Beskrivelse av figurene Description of the figures
Figur 1 viser proteinsekvensen til TAFI. Figure 1 shows the protein sequence of TAFI.
Figur 2 viser nukleotidsekvensen til TAFI. Figure 2 shows the nucleotide sequence of TAFI.
Forkortelser Abbreviations
TAFI-varianter som har treonin ved posisjon 347 i proteinet som en konsekvens av polymorfismer ved den korresponderende posisjon på begge allelene til TAFI-genet betegnes TAFI-347-TT. TAFI variants that have threonine at position 347 in the protein as a consequence of polymorphisms at the corresponding position on both alleles of the TAFI gene are designated TAFI-347-TT.
TAFI-varianter som har treonin og isoleusin ved posisjon 347 i proteinet som en konsekvens av en polymorfisme ved den korresponderende posisjon på ett av begge allelene til TAFI-genet betegnes TAFI-347-TI. TAFI variants that have threonine and isoleucine at position 347 in the protein as a consequence of a polymorphism at the corresponding position on one of both alleles of the TAFI gene are designated TAFI-347-TI.
TAFI-varianter som har isoleusin ved posisjon 347 i proteinet som en konsekvens av polymorfismer ved den korresponderende posisjon på begge allelene til TAFI-genet betegnes TAFI-347-II. TAFI variants that have isoleucine at position 347 in the protein as a consequence of polymorphisms at the corresponding position on both alleles of the TAFI gene are designated TAFI-347-II.
Eksempler Examples
TAFI-polymorfismen ved posisjon 347 i TAFI-proteinet (NCBI aksesjonsnummer for proteinsekvens: NP_001863; Figur 1) ble analysert i en pasientgruppe med eller uten kardiovaskulære begivenheter eller endepunkter. The TAFI polymorphism at position 347 of the TAFI protein (NCBI protein sequence accession number: NP_001863; Figure 1) was analyzed in a group of patients with and without cardiovascular events or endpoints.
1. SNP ( enkel nukleotidpolvmorfismet påvisning ved sekvensering og analyse 1.1 Oppformering av genomisk DNA-region med polymorfisme av interesse 1. SNP ( simple nucleotide polymorphism detection by sequencing and analysis 1.1 Amplification of genomic DNA region with polymorphism of interest
For påvisning av det nukleotidutbyttete cytidin med tymidin ved posisjon 1064 i TAFI-sekvensen med NCBI aksesjonsnummer NM_001872 som fører til TAFI-Ile347-proteinvariant (tabell 2) ble de følgende oppformeringsprimeme anvendt: For detection of the nucleotide-exchanged cytidine with thymidine at position 1064 in the TAFI sequence with NCBI accession number NM_001872 that leads to the TAFI-Ile347 protein variant (Table 2), the following amplification primers were used:
For oppformeringen ble den følgende PCR-protokollen anvendt, mens alle de påfølgende reagenser for oppformeringen var fra Applied Biosystems (Foster City, USA): 20 ng genomisk DNA; 1 enhet TaqGold polymerase; 1 x Taq polymerasebuffer; 500 uM dNTP; 2,5 mM MgCk; 200 nM av hvert oppformeringsprimerpar (for sekvens se oppformeringsprimerpar 1. ovenfor); For the amplification, the following PCR protocol was used, while all subsequent reagents for the amplification were from Applied Biosystems (Foster City, USA): 20 ng genomic DNA; 1 unit of TaqGold polymerase; 1 x Taq polymerase buffer; 500 µM dNTP; 2.5 mM MgCl; 200 nM of each amplification primer pair (for sequence see amplification primer pair 1. above);
H2Otil5 ul. H2O to 5 ul.
Oppformeringsprogram for PCR/genotyping: Propagation program for PCR/genotyping:
95 °C x 10 minutter x 1 syklus; 95 °C x 10 minutes x 1 cycle;
95 °C x 30 sekunder 95 °C x 30 seconds
70 °C x 30 sekunder x 2 sykluser; 70 °C x 30 seconds x 2 cycles;
95 °C x 30 sekunder 95 °C x 30 seconds
65 °C x 30 sekunder x 2 sykluser; 65 °C x 30 seconds x 2 cycles;
95 °C x 30 sekunder 95 °C x 30 seconds
60 °C x 30 sekunder x 2 sykluser; 60 °C x 30 seconds x 2 cycles;
95 °C x 30 sekunder 95 °C x 30 seconds
56 °C x 30 sekunder 56 °C x 30 seconds
72 °C x 30 sekunder x 40 sykluser; 72 °C x 30 seconds x 40 cycles;
72°Cx 10 minutter 72°Cx 10 minutes
4 °C x 30 sekunder x 1 syklus. 4 °C x 30 seconds x 1 cycle.
1.2 Identifikasjon av polymorfismer av interesse 1.2 Identification of polymorphisms of interest
For minisekvensering og påvisning av polymorfismer ble den påfølgende protokollen anvendt, mens alle de påfølgende reagenser var fra Applied Biosystems (Foster City, USA): 2 ul renset PCR-produkt; 1,5 ul BigDye terminatorsett; 200 nM av en sekvenseringsprimer (for sekvens se forover eller revers oppformeirngsprimer 1. ovenfor); H20 til 10 ul. For minisequencing and detection of polymorphisms, the following protocol was used, while all the following reagents were from Applied Biosystems (Foster City, USA): 2 µl purified PCR product; 1.5 ul BigDye terminator kit; 200 nM of a sequencing primer (for sequence see forward or reverse amplification primer 1. above); H20 to 10 µl.
Oppformeringsprogram for sekvensering: Amplification program for sequencing:
96 °C x 2' x 1 syklus; 96 °C x 2' x 1 cycle;
96 °C x lO- 96 °C x lO-
SS <6>C x 10" 65 °C x 4* x 30 sykluser; 72 °C x 7 SS <6>C x 10" 65 °C x 4* x 30 cycles; 72 °C x 7
4 °C x 30" x 1 syklus. 4 °C x 30" x 1 cycle.
Sekvensene ble først analysert med sekvenseringsanalyseverktøy (Applied Biosystems, Foster City, USA) for rådataekstraksjon, deretter prosessert med Phred (base fremkaller), Phrap (sammenstiller), polyphred (SNP fremkaller) og Consed (resultat iakttaker). Phred, Phrap, Polyphred og Consed er dataprogramvare konstruert ved Washington Universitet av Phil Green, (http ://www.genome. washington.edu). The sequences were first analyzed with sequencing analysis tools (Applied Biosystems, Foster City, USA) for raw data extraction, then processed with Phred (base developer), Phrap (assembler), polyphred (SNP developer) and Consed (result observer). Phred, Phrap, Polyphred and Consed are computer software designed at the University of Washington by Phil Green, (http://www.genome.washington.edu).
1.3 Statistiske tilnærmingsmåter for genotype/fenotype korrelasjon 1.3 Statistical approaches for genotype/phenotype correlation
Alle analyser ble utført med SAS statistisk pakke (versjon 6,12 eller høyere, SAS Institute GmbH, Heidelberg, Tyskland). For påvisning av assosiasjoner mellom genetiske polymorfismer og et stort antall kliniske relevante parametre ble beskrevne statistikker beregnet (median, kvadraturer) og Wilcoxon-rank-sum-tester ble utført. Wilcoxon-rank-sum-test ble anvendt for sammenlikning av to uavhengige prøver. Beregningen av test-statistikken er basert på gradene i den sammenslåtte prøven. All analyzes were performed with the SAS statistical package (version 6.12 or higher, SAS Institute GmbH, Heidelberg, Germany). For the detection of associations between genetic polymorphisms and a large number of clinically relevant parameters, described statistics were calculated (median, squares) and Wilcoxon rank-sum tests were performed. The Wilcoxon rank-sum test was used for comparison of two independent samples. The calculation of the test statistics is based on the grades in the combined sample.
For søk etter assosiasjoner mellom SNP'er og risikofaktorer og sykdommer ble Chi-Square-Test utført og antall og prosenter ble beregnet for å beskrive dataene. Chi-Square-Testen er en statistisk test for å beregne avhengigheten av to variabler. Verdiene av variablene finnes i to eller flere klasser. For analyse av assosiasjonen av disse variablene, ble en eventualitetstabell anvendt. Denne tabellen inneholder like mange rader som antall realiseringer av den andre variabelen. Hver celle inneholder en spesiell pasients karakteristikk. For konstruksjon av en teststatistikk ble forskjellene av beregnete og observerte frekvenser beregnet. To search for associations between SNPs and risk factors and diseases, the Chi-Square-Test was performed and numbers and percentages were calculated to describe the data. The Chi-Square Test is a statistical test for calculating the dependence of two variables. The values of the variables are found in two or more classes. For analysis of the association of these variables, a contingency table was used. This table contains as many rows as the number of realizations of the second variable. Each cell contains a particular patient's characteristic. For construction of a test statistic, the differences of calculated and observed frequencies were calculated.
Etter inspeksjon av resultatene ble relevante variabler utvalgt. For å ta hensyn til ukontrollerte samtidige variabler, ble logistikkregresjon anvendt for å validere resultatene. Logistikkregresjonsfremgangsmåten ble anvendt for å analysere påvirkningen av flere forklarende variabler på en bestemt respons variabel. Den assosierte, statistiske testen ga en p-verdi. Tolkningen av denne p-verdi er After inspection of the results, relevant variables were selected. To account for uncontrolled covariates, logistic regression was applied to validate the results. The logistic regression method was used to analyze the influence of several explanatory variables on a specific response variable. The associated statistical test produced a p-value. The interpretation of this p-value is
betydelig påvirkning av den assosierte forklarende variabelen. significant influence of the associated explanatory variable.
For en todelt variabel ble forskjellsforholdet beregnet Forskjellsforholdet er forholdet av forskjellene for at en begivenhet vil finne sted i en gruppe til sannsynligheten for at begivenheten vil rinne sted i den andre gruppen. For a two-part variable, the difference ratio was calculated The difference ratio is the ratio of the differences that an event will take place in one group to the probability that the event will take place in the other group.
2. Resultater 2. Results
Resultatene ble oppnådd ved analyse av en undergruppe av en pasientpopulasjon, mens undergruppen hadde de følgende karakteristikker: Alle diabetikere, ingen behandling med ACE-inhibitoren Ramipril, ingen alkohol. The results were obtained by analyzing a subgroup of a patient population, while the subgroup had the following characteristics: All diabetics, no treatment with the ACE inhibitor Ramipril, no alcohol.
Som det ses av tabellen har alle individer med TAFI-I347I-polymorfisme øket risiko for slag, (7,35 % vs. 3,35 %) og TIA (4,41 % vs. 0,7 %), sammenliknet med individer med TAFI-I347T og TAFI-T347T-polymorfisme. As seen from the table, all individuals with the TAFI-I347I polymorphism have an increased risk of stroke, (7.35% vs. 3.35%) and TIA (4.41% vs. 0.7%), compared to individuals with TAFI-I347T and TAFI-T347T polymorphism.
Claims (28)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20050677A NO322726B1 (en) | 2005-02-09 | 2005-02-09 | Method for identifying the risk of thrombogenetic disorder in determining TAFI-IIe347 polymorphism and using the TAFI-IIe347 or TAFI-IIe347 gene to produce a diagnostic. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20050677A NO322726B1 (en) | 2005-02-09 | 2005-02-09 | Method for identifying the risk of thrombogenetic disorder in determining TAFI-IIe347 polymorphism and using the TAFI-IIe347 or TAFI-IIe347 gene to produce a diagnostic. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20050677D0 NO20050677D0 (en) | 2005-02-09 |
| NO20050677L NO20050677L (en) | 2006-08-10 |
| NO322726B1 true NO322726B1 (en) | 2006-12-04 |
Family
ID=35229567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20050677A NO322726B1 (en) | 2005-02-09 | 2005-02-09 | Method for identifying the risk of thrombogenetic disorder in determining TAFI-IIe347 polymorphism and using the TAFI-IIe347 or TAFI-IIe347 gene to produce a diagnostic. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO322726B1 (en) |
-
2005
- 2005-02-09 NO NO20050677A patent/NO322726B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20050677L (en) | 2006-08-10 |
| NO20050677D0 (en) | 2005-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6628226B2 (en) | Evaluation method for gout predisposition | |
| JP2005536187A (en) | Diagnosis and treatment of diseases associated with N-formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) | |
| US8940286B2 (en) | Urate transporter, as well as method and kit for evaluating urate transport-related disease factor and inflammation-related disease factor, and test sample and drug | |
| JP2008515394A (en) | Heart pressure related genes | |
| JPWO2015108180A6 (en) | Gout onset-related molecule, evaluation method and evaluation kit for uric acid-related disease predisposition and inflammation-related disease predisposition, test body and drug | |
| US8420321B2 (en) | Method for the identification of a risk for a thrombogenic disorder by determining the TAFI-Ile347 polymorphism | |
| JP2012110335A (en) | Method for identifying risk for thrombogenic disorder by determining tafi-ile347 polymorphism | |
| US20110111394A1 (en) | Ctgf as a biomarker, therapeutic and diagnostic target | |
| US8071297B2 (en) | Method for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases | |
| NO322726B1 (en) | Method for identifying the risk of thrombogenetic disorder in determining TAFI-IIe347 polymorphism and using the TAFI-IIe347 or TAFI-IIe347 gene to produce a diagnostic. | |
| CA2496985C (en) | Method for the identification of a risk for a thrombogenic disorder by determining the tafi -ile347 polymorphism | |
| US20110130347A1 (en) | Identification of new splice-variants of g-protein coupled receptor ep3 and uses thereof | |
| US7122655B2 (en) | Compositions involving M-RIP, and related methods for screening for anti-hypertensive agents, and uses thereof | |
| Deng et al. | Angiotensin detection: A comprehensive review of current methods and novel technologies | |
| KR20230035082A (en) | Renin-based assay of hepcidin | |
| ES2308157T3 (en) | DISGNOSTICS AND TREATMENTS FOR DISEASES ASSOCIATED WITH THE DOPAMINE D3 RECEPTOR (DRD3). | |
| JP2005534282A5 (en) | ||
| Jain et al. | Biomarkers of Cardiovascular Disorders | |
| WO2008046543A1 (en) | Cell protective genes | |
| WO2011039171A1 (en) | Vasoactive peptide and derivatives thereof | |
| Mouton | The role of novel protein-protein interactions in the function and mechanism of the sarcomeric protein, myosin binding protein H (MyBPH) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |