NO320635B1 - Fremgangsmate for permeabilisering og identifisering av erytrocytter og sett for permeabilisering og immunisering derav. - Google Patents
Fremgangsmate for permeabilisering og identifisering av erytrocytter og sett for permeabilisering og immunisering derav. Download PDFInfo
- Publication number
- NO320635B1 NO320635B1 NO19993380A NO993380A NO320635B1 NO 320635 B1 NO320635 B1 NO 320635B1 NO 19993380 A NO19993380 A NO 19993380A NO 993380 A NO993380 A NO 993380A NO 320635 B1 NO320635 B1 NO 320635B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- erythrocytes
- fetal
- oligosaccharide
- permeabilization
- erythrocyte
- Prior art date
Links
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 title claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 16
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 239000008191 permeabilizing agent Substances 0.000 claims description 12
- 108010044495 Fetal Hemoglobin Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- -1 aliphatic aldehyde Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M LDS 751 dye Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C1=CC2=CC(N(C)C)=CC=C2[N+](CC)=C1C=CC=CC1=CC=C(N(C)C)C=C1 FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N O6-alpha-D-Galactopyranosyl-D-galactose Natural products OCC1OC(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C(O)C1O AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N gentiobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for permeabilisering og identifisering av erytrocytter og sett for permeabilisering og immunmerking derav.
Metoder for cytometrisk analyse av føtale erytrocytter etter merking med fluorescerende antistoffer inne i erytrocyttene eksisterer allerede.
Et antistoff og tilhørende metode selges av firma BIOATLANTIQUE i Nantes (Frankrike) under betegnelsene «Anticorps monoclonal anti-hémoglobine foetale» og «Protocole pour la cytométrie de f lux». Denne metode har den ulempe at den er omstendelig og komplisert med tolv vaskinger og 16 timers inkubering.
Et annet antistoff og tilhørende metode selges av CALTAG LABORATOIRES i Burlingame, California (USA) under betegnelsene «Monoclonal antibodiesto human fetal hemoglobin» og «Anti-HbF-flow cytometric protocol». Denne fremgangsmåten er kortere med seks vaskinger, men som som fikseringsmiddel benyttes glutaraldehyd som ikke er stabilt ved romtemperatur.
Det ville derfor være ønskelig å ha reagenser for permeabilisering av erytrocytter, og som er stabile og som kan oppbevares i mer enn 1 år, og en fremgangsmåte for erytrocytt-permeabilisering som ikke inneholder mer enn fire vasketrinn og en kort inkuberingstid, for eksempel 30 minutter.
Etter betydelig forskningsinnsats har søkeren nå oppdaget at det kan oppnås permeabilisering av erytrocytter, uten vesentlig hemoglobintap fra cellen, ved å behandle erytrocytter med et fikseringsmiddel og et permeabiliseringsmiddel.
Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er således en fremgangsmåte for permeabilisering av erytrocytter som kjennetegnes ved at erytrocyttene suksessivt underkastes virkningen av - (a) et fikseringsmiddel som inneholder et alifatisk aldehyd og et oligosakkarid, - (b) et permeabiliseringsmiddel som inneholder et overflateaktivt middel og et oligosakkarid.
Denne nye fremgangsmåte gjør det mulig for et antistoff å innta erytrocytten og et intracellulært antigen som skal analyseres. De antigener som forekommer i erytrocytten, og særlig de som bæres av hemoglobinet, benyttes for å skjelne og identifisere føtale erytrocytter.
Fikseringsmidlet inneholder et alifatisk aldehyd, et oligosakkarid og fortrinnsvis et sulfatert polysakkarid. Det foreligger særlig i et tilnærmet isotonisk eller hypertonisk og fortrinnsvis svakt surt medium.
Det alifatiske aldehyd, fortrinnsvis et C1-C5-aldehyd, kan for eksempel være paraformaldehyd og særlig formaldehyd.
Det alifatiske aldehyd kan foreligge i en konsentrasjon på 0,3M til 12.3M, særlig 1,5M til 10M og helst 3M til 8,3M. Under foretrukne betingelser for bruk av ovennevnte fikseringsmiddel, benyttes 6,7M formaldehyd.
Fikseringsmidlet inneholder også et oligosakkarid, fortrinnsvis et disakkarid. Som eksempler på disakkarider kan nevnes sakkarose, cellobiose, rrialtose, laktose, gentiobiose, melibiose og særlig trehalose.
Oligosakkaridet kan forekomme i en konsentrasjon på 0.025M til 1,32M, særlig 0,132M til 0,19M og helst 0.26M til 1,06M. Under foretrukne betingelser inneholder fikseringsmidlet ca. 0,8M trehalose.
Et sulfatert polysakkarid benyttes med fordel for å unngå aggregasjoner som inkluderer nukleinsyrer, hvilket reduserer bakgrunnsstøyen når ovennevnte prosess benyttes i en fremgangsmåte for påvisning av erytrocytter.
Det forekommer i fikseringsmidlet i en konsentrasjon på mellom 0,1 mg/mL og 10 mg/mL. Fikseringsmidlet inneholder fortrinnsvis ca. 1 mg/mL dekstransulfat med en molekylvekt i området 500.000.
Fikseringsmidlet har for eksempel en pH på mellom 3 og 8, særlig mellom 4 og 7. Det er fortrinnsvis svakt surt og helst mellom ca. 5 og 6. Under bestemte betingelser har fikseringsmidlet en pH på ca. 5,5, fortrinnsvis tilsatt en 10 mM løsning av natriumdihydrogenfosfat som buffer.
Isotonisiteten av fikseringsmidlet oppnås fortrinnsvis ved en NaCI-konsentrasjon på 0,15M.
Permeabiliseringsmidlet inneholder et zwitterionisk overflateaktivt middel, og særlig et anionisk overflateaktivt middel. Dette anioniske overflateaktive middel er for eksempel natriumdioksycholat eller N-laurylsarkosid, og særlig natriumdodekylsulfat.
Konsentrasjonen av det overflateaktive middel kan være mellom 0,001% og 10% og særlig mellom 0,01 og 5%. Under foretrukne betingelser inneholder det permeabiliserende middel ca. 0,03% natriumdodekylsulfat.
I tillegg inneholder det permeabiliserende middel et oligosakkarid, særlig trehalose, som nevnt i forbindelse med fikseringsmidlet.
Konsentrasjonen av trehalose i permeabiliseirngsbufferen ligger for eksempel mellom 0.0026M og 0.26M, fortrinnsvis mellom 0.026M og 0,13M og helst ca. 0.053M.
Permeabiliseirngsmidlets pH er fortrinnsvis svakt sur med en pH på mellom 3 og 8, særlig mellom 5 og 6. Permeabiliseringsmidlet har under bestemte betingelser en pH på ca. 5,5.
Permeabiliseringsmidlets pH holdes fortrinnsvis ved hjelp av buffer, hensiktsmessig ved å benytte 10 mM natriumdihydrogenfosfat og 10 mM natriumcitrat.
Permeabiliseringsbufferen er fortrinnsvis tilnærmet isotonisk, for eksempel ved å benytte en natriumkloridkonsentrasjon på 0,15M.
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan særlig benyttes til identifisering av føtale erytrocytter, ved hjelp av en ny fremgangsmåte for immun-merking ved å benytte antistoffer. Etter fiksering og permeabilisering, vaskes erytrocyttene, hovedsakelig for å fjerne det overflateaktive middel som ville kunne ha en uheldig innvirkning på de antistoffene som benyttes for å påvise antigener inne i erytrocytten.
Vaskemidlet er fortrinnsvis en løsning som har pH på mellom 3 og 8, og som med fordel er svakt surt med pH på mellom 5 og 6. Denne løsningen kan inneholde et nøytralt overflateaktivt middel og et salt av sterke syrer og baser, som f.eks. NaCI og KCI. Fortrinnsvis inneholder vaskemidlet ikke overflateaktivt middel og er hypotonisk. Under særlig foretrukne betingelser er vaskemidlet destillert eller demineralisert vann.
Det er følgelig mulig å påvise føtale erytrocytter blant en populasjon av erytrocytter i blod fra voksne.
Den mest kjente er metoden til Kleihauer, basert på føtale erytrocytters bedre motstandsevne mot hypotonisk lysering. Under enkelte hypotoniske betingelser observeres en lekkasje av hemoglobin fra voksnes erytrocytter, men ikke fra føtale erytrocytter, hvilket gjør det mulig ved mikroskopering å skjelne føtale erytrocytter ut fra deres farve.
Ulempen ved denne fremgangsmåte er at et stort antall erytrocytter må passere mikroskopet for påvisningen av et lite antall føtale erytrocytter, noe som representerer en betydelig grad av manipulering. Enkelte sykdommer kan dessuten føre til en modifisering av erytrocyttene og resultere i en rekke falske positive. Ifølge enkelte rapporter er denne test heller ikke lett å reprodusere.
Andre fremgangsmåter er basert på permeabilisering av erytrocytter og immun-merking av føtalt hemoglobin (g-hemogiobin) med et fluorescerende antistoff inne i de føtale erytrocytter. Sistnevnte fremgangsmåte tillater telling ved cytometri, men har den ulempe at enkelte erytrocytter av voksen opprinnelse kan inneholde føtalt hemoglobin (F-celler). Ved enkelte sykdommer, så som talassemi, er antallet voksne erytrocytter som inneholder føtalt hemoglobin, øket.
Det ville derfor være ønskelig å ha en fremgangsmåte for immun-merking av føtale erytrocytter som er meget følsom og med reduserte muligheter for feil.
Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er således ovennevnte permeabiliseringsprosess som kjennetegnes ved at (d) erytrocyttene i tillegg omsettes med to forskjellige antistoffer mot to føtale antigener som uttrykkes uavhengig på erytrocytten. Det ene, det føtale hemoglobin finnes inne i cellen, det andre, i-antigenet, finnes utenpå cellen.
Under dette immun-merkingstrinnet blandes erytrocyttene, fortrinnsvis suspendert i vann, med et like stort volum fosfatbuffer inneholdende 5 mg/mL bovint serumalbumin og de to antistoffene. Under dette trinn blir pH nøytral, noe som får antistoffet til å virke godt, og erytrocyttmiljøet forblir svakt hypotonisk, noe som muliggjør god penetrering av antistoffer.
Den samtidige immun-merking av føtalt hemoglobin og i-antigen med antistoffene merket med to forskjellige fluorescerende markører, gjør det mulig å telle føtale erytrocytter som forskjellige fra «F-cellene».
Merkingen av antistoffene med de fluorescerende markørene, som f.eks. fluorescein-N-isotiocyanat eller fykoerytrin, kan for eksempel foretas konvensjonelt som beskrevet for eksempel av G.T. HERMANSON i Bioconjugate Techniques, kapittel 8.1.1, Fluorescein Derivatives, s. 302-305, Academic Press 1996, eller kapittel 8.1.7., Phycobiliprotein Derivatives, s. 362-364. Det aktuelle antistoff kan spesielt konjugeres med fykoerytrin aktivert med succinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-cykloheksan-1-karboksylat etter reduksjon med 1 mM DL-ditiotreitol i PBS.
Under foretrukne betingelser for den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, benyttes monoklonale antistoffer av type lgG1 NaM16-2F4 deponert ved C<p>llection Nationale de Microorganismes (CNCM) i Paris 23. juni, 1998 under nummer I-2044, for å merke føtalt hemoglobin, og det monoklonale antistoff av type IgM NaM61-1 A2, deponert ved Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) i Paris 23. juni, 1998 under nummer I-2043, for merking av i-antigenet.
Under andre foretrukne anvendelsesbetingelser for oppfinnelsen, kan testens
følsomhet økes ved å tilsette en markør for nukleinsyrene med en tredje farve.
Ved trefarve-cytometri kan forekomster av en falsk «bakgrunnsstøy», ofte
leukocytter eller døde celler som er rike på DNA, derved elimineres.
Under særlig foretrukne betingelser er den markør som benyttes for nukleinsyrene et cellekjerne-farvestoff, for eksempel ved at det festes til DNA, særlig
'"LDS 751 (MOLÉCULÅR PROBÉSlhc^, OR, USA)V ~~
Ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er et erytrocytt-permeabiliseringssett som kjennetegnes ved at det innbefatter
(a) et passende isotonisk eller hypertonisk fikseringsmiddel som inneholder
et alifatisk aldehyd og et oligosakkarid,
(b) et permeabiliseringsmiddel som inneholder et overflateaktivt middel og
et oligosakkarid.
Ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er et sett for føtal erytrocytt immun-merking, som kjennetegnes ved at det inneholder ovennevnte erytrocytt-permeabiliseringssett så vel som to forskjellige antistoffer mot to føtale antigener som uttrykkes uavhengig på erytrocytten.
Endelig vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for identifisering av føtale erytrocytter ved immun-merking, som kjennetegnes ved at erytrocyttene suksessivt underkastes virkningen av: (a) et fikseringsmiddel som inneholder et alifatisk aldehyd og et
oligosakkarid i et tilnærmet isotonisk eller hypotonisk miljø,
(b) et permeabiliseringsmiddel som inneholder et overflateaktivt middel
eller et oligosakkarid som opereres i henhold til krav 8,
(c) et vaskemiddel for hovedsakelig å fjerne det overflateaktive middel, (d) to forskjellige antistoffer mot to føtale antigener som uttrykkes
uavhengig på erytrocytten,
hvoretter de føtale erytrocytter påvises.
Denne påvisning kan foretas i henhold til velkjente metoder for påvisning av fluorescerende forbindelser, kombinert med anvendelsen av måleterskler eller måleskalaer.
De foretrukne betingelsene for gjennomføring av de ovenfor beskrevne fremgangsmåter gjelder likeledes andre av de ovenfor beskrevne oppfinnelsesgjenstander, særlig settene.
De etterfølgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1: Fikseringsreagens
6.67M formaldehyd
0,8M D(+)trehaiose
0,15M natriumklorid
0,01 M natriumdihydrogenfosfat
1 mg/mL dekstransulfat (MV 500.000)
pH 5,5
Permeabi liseri ngsreagens
0,001 M natriumdodecylsulfat
0,15M NaCI
0,01 M natriumdihydrogenfosfat
0,01 M natriumcitrat
0. 053. D(+)trehalose
pH 5,5
Eksempel 2: Fremgangsmåte for permeabilisering
Fire blodprøver ble valgt ut for å underkastes en permeabiliseringsprosedyre.
Prøvene ble benyttet med etylendiamin-tetraeddiksyre (EDTA) som antikoagulant.
1. Blod fra en mann.
2. En milliliter av blodet fra punkt 1 tilsatt 0,01 mL navlestrengsblod tatt under fødsel. 3. Blod fra gravid kvinne, hvor blodet er blitt undersøkt etter Kleihauers metode, og som hadde gitt negativt resultat. 4. Blod fra gravid kvinne, hvor blodet er blitt undersøkt etter Kleihauers metode, og som hadde gitt positivt resultat, med en verdi på 0,1% føtale erytrocytter.
Hver prøve av 0,01 ml_ blod ble blandet med 0,1 ml_ fikseringsreagens (Eksempel 1) og blandingen inkubert i 30 minutter ved romtemperatur (20-25°C). Etter inkubering ble 3 ml_ fosfatbuffer (PBS = fosfatbuffret saltvann) tilsatt som vaskevæske og det hele sentrifugert ved 300 g.
Etter avsugning ble cellene tatt opp i 3 ml_ permeabiliseringsreagens (Eksempel 1) og sentrifugert ved 300 g.
Etter avsugning ble cellene tatt opp i 1 ml_ demineralisert vann.
Eksempel 3: Immun-merking av føtale erytrocytter
20 |xL av hver av tilberedningene fra Eksempel 2 av erytrocytter suspendert i
vann, ble blandet med 20 uL av følgende tilberedning.
PBS inneholdende:
- 50 ng/mL av det monoklonale antistoff NaM16-2F4 rettet mot føtalt hemoglobin og konjugert med fluorescein-isotiocyanat som beskrevet av G.T. HERMANSON i Bioconjugate Techniques, kapittel 8.1.1., Fluorescein Derivatives, s. 302-305, Academic Press, 1996; - 3,12 ng/mL monoklonalt antistoff NaM61-1A2 rettet mot i-antigen og konjugert med fykoerytrin som beskrevet av G.T. HERMANSON i Bioconjugate Techniques, kapittel 8.1.7., Phycobiliprotein Derivatives, s. 362-364;
- 3,12 ug/mL LDS 751 (Molecular Probes, OR, USA),
- 5 mg/mL bovint serumalbumin (BSA).
Etter inkubering i 15 minutter ble 3 mL fosfatbuffer inneholdende 0,17M formaldehyd tilsatt til hver blanding som en vaskevæske og sentrifugert ved 300 g i 5 minutter. Etter avsugning ble cellene tatt opp i 0,5 mL fosfatbuffer inneholdende 0,17M formaldehyd.
Hybridomet tilsvarende det monoklonale antistoff NaM16-2F4, ble deponert ved Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) i Paris 23. juni, 1998 under nummer I-2044. Det monoklonale antistoff NaM16-2F4 er av lgG1-type. Hybridomet tilsvarende det monoklonale antistoff NaM61-1A2, ble deponert ved Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) i Paris 23. juni, 1998 under nummer I-2043. Det monoklonale antistoff NaM61 er av IgM-type.
Eksempel 4: Cytometrisk analyse
Et Coulter XL-cytometer (Miami, Florida, USA) ble benyttet for å analysere resultatene. Fluorescens-justeringene FL1 og FL2 og kompensasjonene ble oppnådd i henhold til produsentens instruksjoner, ved å benytte én referanseprøve «Cytotrol» (Coulter No. Cat. 6604248) blandet med 20 u.L av prøve nr. 1 i Eksempel 2, og merket med en blanding av CD4-FITC (fluorescein-N-isotiocyanat) og CD8-PE (fykoerytrin) (Immunotech, Cat. No. IM0747).
Justeringen og kompensasjonen av FL4 ble oppnådd med prøve 2 av Eksempel 2 etter immun-merking i henhold til Eksempel 3. Figur 1 viser et spredningsdiagram av forekomster for prøve 2 (Eksempel 2) etter immun-merking (Eksempel 3). Forekomster mindre enn de for erytrocyttene ble utelatt som mindre enn en terskelverdi. Figur 2 viser en side-spredningsanalyse og FL4 forekomster for prøve 2 (Eksempel 2) etter immun-merking (Eksempel 3), hvor forekomster av mindre størrelse enn vist i Figur 1 er utelatt. LDS751-positive forekomster (leukocytter og ikke-identifiserte partikler) ble ekskludert fra porten. Figur 3 viser FL1 og FL2-analyse av erytrocyttpopulasjonene etter immun-merking (Eksempel 3) og inkludert i porten som vist i Figur 2.
I Figur 1 kan det iakttas en populasjon av homogene forekomster av voksne og føtale erytrocytter. En terskelverdi for forover-spredning utelukker forekomster av mindre størrelse enn den valgte terskelverdi, f.eks. verdier som tilsvarer blodplater og rester. Et lite antall leukocytter og rester av større dimensjon inngår i populasjonen.
I Figur 2 sees den samme populasjon som i Figur 1 vist i side-spredning og i FL4, en fluorescerende region emittert av LDS751. De LDS751 -positive forekomstene, og også leukocyttene og restene av større dimensjon, er ekskludert fra analysen av en port som skapes omkring de negative forekomstene og inkluderer de voksne og føtale erytrocyttene.
I Figur 3, hvor prøvene 1, 2, 3, 4 (Prøve 1 (Eksempel 2): erytrocytter fra voksent blod som tjener som kontroll; Prøve 2 (Eksempel 2): erytrocytter fra voksent blod blandet med 0,01 vol/vol. navlestrengsblod; Prøve 3 (Eksempel 2): erytrocytter fra Kleihauer-negativt blod som tjener som kontroll; Prøve 4 (Eksempel 2): erytrocytter fra Kleihauer-positivt blod) tilsvarer henholdsvis A, B, C og D, kan det sees en analyse i FL1 og FL2 av populasjonene av forekomster fremstillet etter skalaen i Figur 2. Figur 3B tilsvarer fremstillingen i Figur 2, som ligner fremstillinger tilsvarende Figur 3A, C og D.
I Figurene tilsvarer FL1 ekspresjonen av det føtale hemoglobin og FL2 ekspresjonen av i. Båndet til venstre avgrenset av abscisse = 1, inneholder de forekomster som tilsvarer voksne erytrocytter, og det registreres en klar distinksjon mellom de voksne og føtale erytrocytter. I Figur 3B sees i vindu F de forekomster som ikke forekommer i Figur 3A og som tilsvarer navlestrengsblod som var blitt tilsatt til det voksne blod. I Figur 3D sees i vindu F forekomster som ikke forekommer i Figur 3C og som tilsvarer føtale erytrocytter som sirkulerte i blodet til en kvinne etter føtal hemoragi.
Det kan fra det foran angitte trekkes den konklusjon at fremgangsmåten og påvisningsreagensene for føtale røde blodceller ifølge oppfinnelsen, har vist seg effektive i en modell hvor navlestrengsblod ble tilsatt til voksent blod og likeledes i tilfellet med føtal hemoragi hos en gravid kvinne.
Det kan fra det ovenfor angitte likeledes trekkes den konklusjon at ovennevnte fremgangsmåte og reagenser muliggjør påvisning av gammakjeden av hemoglobin i røde blodceller. I tillegg til tilfellet med føtal hemoragi hos gravide kvinner, kan fremgangsmåten særlig anvendes ved talassemi, sigdcelleanemi og jemmangel hos gravide kvinner, etc. Fremgangsmåten og reagensene muliggjør også påvisning av en rød blodcelle av føtal eller ikke-føtal opprinnelse, gjennom nærvær eller fravær av blodgruppe i.
Claims (14)
1. Fremgangsmåte for permeabilisering av erytrocytter,
karakterisert vedat erytrocyttene suksessivt underkastes virkningen av: - (a) et fikseringsmiddel som inneholder et alifatisk aldehyd og et oligosakkarid, - (b) et permeabiliseringsmiddel som inneholder et overflateaktivt middel og et oligosakkarid.-
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat fikseringsmidlet er i et tilnærmet isotonisk eller hypertonisk miljø.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1-2,karakterisert vedat fikseringsmidlet har en pH på 4 til 7.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3,karakterisert vedat permeabiliseringsmidlets overflateaktive middel er anionisk.
5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-4,karakterisert vedat permeabiliseringsmidlet har en pH på 5 til 6.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-5,karakterisert vedat dessuten (c) erytrocyttene, etter fiksering og permeabilisering, vaskes under bruk av et vaskemiddel for hovedsakelig å fjerne det overflateaktive middel.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6,karakterisert vedat fikseringsmidlet også inneholder et sulfatert polysakkarid.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1-7,karakterisert vedat dessuten (d) erytrocyttene omsettes med to forskjellige antistoffer mot to føtale antigener som uttrykkes uavhengig på erytrocytten.
9. Sett for permeabilisering av erytrocytter,karakterisert vedat det inneholder (a) et passende isotonisk eller hypertonisk fikseringsmiddel som inneholder et alifatisk aldehyd og et oligosakkarid, (b) et permeabiliseringsmiddel som inneholder et overflateaktivt middel og et oligosakkarid.
10. Sett for immun-merking av føtale erytrocytter,karakterisert vedat det inneholder et sett for permeabilisering av erytrocytter ifølge krav 9, så vel som to forskjellige antistoffer mot to føtale antigener som uttrykkes uavhengig på erytrocytten.
11. Sett ifølge krav 10,karakterisert vedat de to antistoffene mot to føtale antigener som uttrykkes uavhengig på erytrocytten, er merket med to ulike fluorescerende merkinger.
12. Sett ifølge krav 10 eller 11,karakterisert veda t de to føtale antigenene som uttrykkes uavhengig på erytrocytten, på den ene side er føtalt hemoglobin inne i cellen, og på den annen side, i-antigenet forekommende på utsiden av cellen.
13. Sett ifølge krav 10-12,karakterisert vedat det monoklonale antistoff NaM16-2F4 av lgG1-type, deponert ved Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) i Paris 23. juni, 1998 under nummer I-2044, benyttes for å merke føtalt hemoglobin, og det monoklonale antistoff NaM61-1A2 av IgM-type, deponert ved Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) i Paris 23. juni, 1998 under nummer I-2043, benyttes for merking av i-antigenet.
14. Fremgangsmåte for identifisering av føtale erytrocytter ved immun-merking,karakterisert vedat erytrocyttene suksessivt underkastes virkningen av: - (a) et fikseringsmiddel som inneholder et alifatisk aldehyd og et oligosakkarid i et tilnærmet isotonisk eller hypertonisk miljø, - (b) et permeabiliseringsmiddel som inneholder et overflateaktivt middel og et oligosakkarid, - (c) et vaskemiddel hovedsakelig for å fjerne det overflateaktive middel, - (d) to forskjellige antistoffer mot to føtale antigener som uttrykkes uavhengig på erytrocytten,
hvorpå de føtale erytrocytter påvises.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9809006A FR2781055B1 (fr) | 1998-07-09 | 1998-07-09 | Reactif et methode pour la permeabilisation et l'identification des erythrocytes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO993380D0 NO993380D0 (no) | 1999-07-08 |
| NO993380L NO993380L (no) | 2000-01-10 |
| NO320635B1 true NO320635B1 (no) | 2006-01-02 |
Family
ID=9528613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19993380A NO320635B1 (no) | 1998-07-09 | 1999-07-08 | Fremgangsmate for permeabilisering og identifisering av erytrocytter og sett for permeabilisering og immunisering derav. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6534279B1 (no) |
| EP (1) | EP0971233B1 (no) |
| JP (1) | JP2000039433A (no) |
| AT (1) | ATE225936T1 (no) |
| AU (1) | AU754271B2 (no) |
| DE (1) | DE69903380T2 (no) |
| DK (1) | DK0971233T3 (no) |
| ES (1) | ES2184399T3 (no) |
| FR (1) | FR2781055B1 (no) |
| NO (1) | NO320635B1 (no) |
| NZ (1) | NZ336635A (no) |
| PT (1) | PT971233E (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10010959A1 (de) * | 2000-03-06 | 2001-09-20 | Eppendorf Geraetebau Netheler | Verfahren zum Übertragen von Material in einem Zellsystem |
| DE60219642T2 (de) * | 2001-09-04 | 2008-01-17 | Iq Corp. B.V. | Bestimung und quantifizierung von erythrocytenpopulation in proben |
| US20040214243A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-10-28 | Beckman Coulter, Inc. | Differential determination of hemoglobins |
| US7803523B2 (en) | 2004-08-27 | 2010-09-28 | University Health Network | Whole blood preparation for cytometric analysis of cell signaling pathways |
| US7541190B2 (en) * | 2005-02-07 | 2009-06-02 | Beckman Coulter, Inc. | Method of measurement of cellular hemoglobin |
| CN100465642C (zh) * | 2007-07-18 | 2009-03-04 | 清华大学 | 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 |
| US7968279B2 (en) * | 2008-08-13 | 2011-06-28 | Beckman Coulter, Inc. | Reference control for cell by cell analysis |
| WO2019060687A1 (en) | 2017-09-21 | 2019-03-28 | Beckman Coulter, Inc. | METHOD FOR DETERMINING RED FETAL GLOBULES IN MATERNAL CIRCULATION BY FLOW CYTOMETRY |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4751179A (en) * | 1984-05-31 | 1988-06-14 | Coulter Electronics, Inc. | Method and reagents for differential determination of four populations of leukocytes in blood |
| US5246829A (en) * | 1984-10-04 | 1993-09-21 | Immunotech | Products for separation applicable to cells in the immunopurification field |
| FR2571498B1 (fr) * | 1984-10-04 | 1988-04-08 | Immunotech Sa | Procede de separation de cellules utilisant des anticorps et des billes de faible densite |
| US5563033A (en) * | 1985-10-22 | 1996-10-08 | The University Of Massachusetts Medical Center | Detection of individual gene transcription |
| EP0307882B1 (en) * | 1987-09-18 | 1994-06-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Immunological switch for controlling the reporting of test results |
| NZ230747A (en) * | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| US5102788A (en) * | 1988-11-21 | 1992-04-07 | Hygeia Sciences, Inc. | Immunoassay including lyophilized reactant mixture |
| US5641628A (en) * | 1989-11-13 | 1997-06-24 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA |
| US5853986A (en) * | 1990-04-02 | 1998-12-29 | Becton Dickinson And Company | Chemical promotion of nucleic acid hybridization |
| IE76319B1 (en) * | 1990-07-23 | 1997-10-22 | Becton Dickinson Co | Preservation of cells as controls or standards in cellular analysis |
| US5413732A (en) * | 1991-08-19 | 1995-05-09 | Abaxis, Inc. | Reagent compositions for analytical testing |
| ATE180018T1 (de) * | 1991-08-23 | 1999-05-15 | Molecular Probes Inc | Verwendung von haloalkylderivaten von reportermolekülen zur analyse der metabolischen aktivität in zellen |
| US5576424A (en) * | 1991-08-23 | 1996-11-19 | Molecular Probes, Inc. | Haloalkyl derivatives of reporter molecules used to analyze metabolic activity in cells |
| US5998483A (en) * | 1991-09-20 | 1999-12-07 | Camiener; Gerald W. | Glyoxal-containing preservative compositions |
| US5629147A (en) * | 1992-07-17 | 1997-05-13 | Aprogenex, Inc. | Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization |
| US5596090A (en) * | 1992-07-24 | 1997-01-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antisense oligonucleotides directed against human VCAM-1 RNA |
| US5691160A (en) * | 1992-08-14 | 1997-11-25 | Biogen, Inc. | Effects of actin filaments of fibrin clot structure and lysis |
| US5457024A (en) * | 1993-01-22 | 1995-10-10 | Aprogenex, Inc. | Isolation of fetal erythrocytes |
| FR2705359B1 (fr) * | 1993-05-19 | 1995-08-18 | Immunotech Sa | Méthode de protection des cellules leucocytaires, composition protectrice, composition de sang protégée, et méthode d'analyse sanguine. |
| FR2705360B1 (fr) * | 1993-05-19 | 1995-08-18 | Immunotech Sa | Méthode et composition pour la lyse des érythrocytes, composition de sang, et méthode d'analyse leucocytaire. |
| US5352613A (en) * | 1993-10-07 | 1994-10-04 | Tafas Triantafillos P | Cytological screening method |
| US5459268A (en) * | 1993-10-25 | 1995-10-17 | Molecular Probes, Inc. | Xanthylium dyes that are well retained in mitochondria |
| US5432054A (en) * | 1994-01-31 | 1995-07-11 | Applied Imaging | Method for separating rare cells from a population of cells |
| US5662813A (en) * | 1994-10-21 | 1997-09-02 | Bioseparations, Inc. | Method for separation of nucleated fetal erythrocytes from maternal blood samples |
| US5750339A (en) * | 1994-11-30 | 1998-05-12 | Thomas Jefferson University | Methods for identifying fetal cells |
| US5858667A (en) * | 1996-09-06 | 1999-01-12 | Litron Laboratories | Method for the enumeration of micronucleated erythrocyte populations with a single laser flow cytometer |
| US5731156A (en) * | 1996-10-21 | 1998-03-24 | Applied Imaging, Inc. | Use of anti-embryonic hemoglobin antibodies to identify fetal cells |
| US5962234A (en) * | 1997-10-20 | 1999-10-05 | Applied Imaging Corporation | Use of anti-embryonic epsilon hemoglobin antibodies to identify fetal cells |
-
1998
- 1998-07-09 FR FR9809006A patent/FR2781055B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-06-23 US US09/338,505 patent/US6534279B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-05 PT PT99430012T patent/PT971233E/pt unknown
- 1999-07-05 EP EP99430012A patent/EP0971233B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-05 DK DK99430012T patent/DK0971233T3/da active
- 1999-07-05 ES ES99430012T patent/ES2184399T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-05 AT AT99430012T patent/ATE225936T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-05 DE DE69903380T patent/DE69903380T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-07 JP JP11192898A patent/JP2000039433A/ja active Pending
- 1999-07-07 NZ NZ336635A patent/NZ336635A/xx unknown
- 1999-07-08 NO NO19993380A patent/NO320635B1/no unknown
- 1999-07-08 AU AU39107/99A patent/AU754271B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2781055A1 (fr) | 2000-01-14 |
| JP2000039433A (ja) | 2000-02-08 |
| NO993380L (no) | 2000-01-10 |
| NO993380D0 (no) | 1999-07-08 |
| ATE225936T1 (de) | 2002-10-15 |
| FR2781055B1 (fr) | 2000-10-13 |
| DE69903380D1 (de) | 2002-11-14 |
| US6534279B1 (en) | 2003-03-18 |
| ES2184399T3 (es) | 2003-04-01 |
| AU754271B2 (en) | 2002-11-07 |
| DE69903380T2 (de) | 2003-09-11 |
| PT971233E (pt) | 2003-02-28 |
| NZ336635A (en) | 2000-11-24 |
| AU3910799A (en) | 2000-02-10 |
| DK0971233T3 (da) | 2003-02-10 |
| EP0971233A1 (fr) | 2000-01-12 |
| EP0971233B1 (fr) | 2002-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5122453A (en) | Method for discriminating surface stained lymphocytes | |
| EP0161770B1 (en) | Lysing agent for analysis of peripheral blood cells | |
| US4902613A (en) | Lysing agent for analysis of peripheral blood cells | |
| EP0788605B1 (en) | Detection of antibodies to bacterial antigens by fluorescence polarization | |
| Allen et al. | Morbidity from malaria and immune responses to defined Plasmodium falciparum antigens in children with sickle cell trait in The Gambia | |
| US6951727B2 (en) | Methods and reagents for quantitation of cell-surface molecule expression on peripheral blood cells | |
| EP0105465B1 (en) | Process for producing adult t cell leukemia associated antigen | |
| Fejes-Toth et al. | Isolated principal and intercalated cells: hormone responsiveness and Na+-K+-ATPase activity | |
| CA1319592C (en) | Conservative whole blood sample preparation technique | |
| NO320635B1 (no) | Fremgangsmate for permeabilisering og identifisering av erytrocytter og sett for permeabilisering og immunisering derav. | |
| Magnani et al. | Preparation and characterization of biotinylated red blood cells | |
| JP2001506005A (ja) | 細胞の選択的溶解 | |
| Schols et al. | Detection of immediate early, early and late antigens of human cytomegalovirus by flow cytometry | |
| AU592528B2 (en) | Specific binding flow cytometry method | |
| Ruckerbauer et al. | V. Detection of the Virus in Infected Materials by Immunofluorescence | |
| JPH1175892A (ja) | マラリア原虫の検出方法 | |
| US5599682A (en) | Method for the protection of leucocytes and method of blood analysis | |
| Jalla et al. | Enumeration of lymphocyte subsets using flow cytometry: Effect of storage before and after staining in a developing country setting | |
| WO1999024832A1 (en) | Distinguishing of viable, early apoptotic and necrotic cells | |
| Brenan et al. | Topographical studies of lymphocyte localization using an intracellular fluorochrome | |
| Karlsson et al. | Demonstration of Francisella tularensis (syn. Pasteurella tularensis) in sylvan animals with the aid of fluorescent antibodies | |
| US5776697A (en) | Characterization or determination of the amount of blood cells by means of poultry antibodies | |
| US20040110122A1 (en) | Three-color reagent for measurement of CD4 positive lymphocytes by flow cytometry | |
| Suganuma et al. | Qualitative and quantitative analysis of erythrocyte surface membrane sialyl residues using affinity cytochemistry with special reference to diabetic patients | |
| Jalla et al. | Modifications in flow cytometric estimation of t cell subsets and b cells in peripheral blood to reduce the cost of investigation |