NO316478B1 - Fremgangsmåte og apparat for simultan kvantifisering av ulike radionuklideri et stort antall regioner på overflaten av en biologiskmikromatrise eller lignende objekt - Google Patents

Description

Teknisk fagfelt

Oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte og apparat for simultan kvantifisering av mengdene av en eller flere radioaktive nukhder innen tilfeldige områder på en overflate hvor disse nukhdene har blitt deponert, adsorbert eller fiksert Disse radioaktive nukhdene tjener som markører på stoffer som typisk har blitt inkorporert inn i snitt, eller inn i større molekyler som ved ulike mekanismer har blitt bundet til kjemiske stoffer på denne overflaten Fremgangsmåten er spesielt velegnet for DNA mikromatrisemåhnger ved bruk av nukleotider merket med ulike beta-emitterende radionukhder

Bakgrunn

Det er allment akseptert at tusener av gener og deres produkter, dvs RNA og proteiner, i en levende organisme fungerer på en komplisert og velorganisert måte som skaper livets mysterium Tradisjonelle metoder i molekylærbiologi fungerer generelt på en "ett-gen-i-ett-eksperiment-basis", noe som gjør det vanskelig å oppnå den fullstendige forståelsen av genets funksjon Således representerer mikromatnser et av de kraftigste nye verktøy innen biologisk forskning som kommer om noen få år, siden det gir muligheten til å studere et komplett sett av gener og deres produkter samtidig

En mikromatnse er en ordnet oppstilling av biologiske molekyler som er immobilisert i prøve-pnkker på en testplate som tilbyr et medium for sammenligning av kjente og ukjente prøver av biologisk molekyler De immobiliserte molekylene på testplaten kalles ofte for probemolekyler, mens de biologiske molekylene fra testprøven blir betegnet som målmolekyler I det tilfellet at probemolekylene og målmolekylene utgjør spesifikke komplementære par av biologiske molekyler, kan den ordnede oppstillingen av testmolekyler bli brukt for å identifisere spesifikke biologiske molekyler i en testprøve fra en organisme, og også til å bestemme mengden av disse molekylene Typiske eksempler på komplementære biologiske molekyler er hybridisenngspar av DNA, gen-antigen I mikromatnser har prøvepnkkene typisk diametre på mindre enn 200um, men "makromatnser" med prøvepnkker med diametre på typisk 300um har blitt beskrevet

Den biologiske mikromatnseteknikken kan bli brukt i et stort antall anvendelser som diagnose, identifisering/oppdagelse av nye gener og proteiner, oppdagelse av legemidler, farmakologisk og toksikologisk forskning osv Teknikken kan også bh brukt for sammenlignende tester hvor biologiske komponenter fra flere kilder som blir adsorbert på samme matrise, for eksempel fra en frisk celle og en tumorcelle

Blant biologiske mikromatnser er det spesielt en type som har tiltrukket seg oppmerksomhet de senere årene DNA-matrisen Denne teknologien forventes å kunne monitorere hele genomet på en enkelt matrise, og gjør det dermed mulig å oppnå et bedre bilde av vekselvirkningene mellom tusener av gener samtidig

Kjent teknikk

Generelt kan den konvensjonelle metoden for bestemmelse av biologisk aktivitet ved DNA-mikromatriser beskrives som følger, tråder av probe-cDNA (typisk 500-5000 baser lang) blir immobilisert i en spesifikk og ordnet matrise på en stiv plate (typisk en glassplate) Så blir probe-cDNAet eksponert for en eller flere mål (merket cDNA fra en testprøve), enten separat eller i en blanding Målene, merket cDNA, blir produsert enzymatisk ved revers transknptase fra prøver av RNA som blir ekstrahert fra testprøver, og merket med spesifikke markørmolekyler De revers-transknberte RNA-transknptene av prøvene blir hybndisert med probe-cDNAet på mikromatrisen Dermed kan mengden og typen av hvert mål-cDNA bli bestemt ved å måle posisjonen og konsentrasjonen av hvert markørmolekyl på hver prikk på mikromatrisen, siden markørsignalet fra hver prikk reflekterer de relative transkriptmengdene for hvert spesifikke transknpt på hver prikk på mikromatrisen For å eliminere prøvevanasjon er signalforholdet mellom to konkurrerende prøver den foretrukne målingen

Fluoroscens- merkede nukleotider

Tradisjonelt har deteksjonen av signaler med denne teknologien vært basert på in vitro innkorporerte nukleotider merket med passende fuoroforer, dvs at spesifikke fluoroforer (fluorescerende molekyler) med en distinkt farge blir satt inn i RNA ekstrahert fra hver prøve Altså blir nukleotider merket med fluoroforer med en distinkt farge inkorporert inn i mål-cDNA som vil bh hybndisert til probe-cDNA Fluoroforene kan bh eksitert med ulike bølgelengder, og tilsvarende emittere ved ulike bølgelengder Med laserlys og bruken av passende filtre for å separere signalene fra to eller flere cDNA-populasjoner, vil man generelt oppnå dette

Det generelle behovet for startmateriale ligger omkring 50(4.g av totalt RNA, eller omtrent 5x10 celleekvivalenter Denne relativt store mengden av materiale ekskluderer bruken av standard teknologi fra en del svært relevante anvendelser, inkludert klinisk diagnostikk En svært signifikant faktor for denne mangelen på sensitivitet er den lave innkorporeringsraten av de tilgjengelige fluoroformerkede nukleotider ved revers transknptase av cDNA fra RNA Altså vil bare et lite antall fluoroscensmolekyler bh inkorporert per syntetisert cDNA Anvendelser som krever innkorporering av fluorescens gjennom cellekultur vil også være ekskludert ettersom fluoroformerkede nukleotider generelt ikke vil bh inkludert gjennom det cellulære maskineriet Nye teknikker for å oppnå bedre signal styrke inkluderer enzymatisk amplifisering av prøvematenalet og kjemisk amplifisering Slike metoder viser at det er mulig å redusere prøvestørrelsen Amplifisenngsteknikker har nylig blitt publisert, og muliggjør en reduksjon i prøvestørrelse ned til lOOng totalt RNA startmatenale Dette er oppnådd gjennom en eller flere runder mellom RNA og cDNA I denne reaksjonen er det mulig å oppnå omtrent 50 gangers økning i materiale for hver runde ved å feste på en T7-promotor til en ende for å muliggjøre generering av RNA, og i den andre enden utnytte en egenskap ved enkelte revers-transkriptaser for å addere en spesiell primer til alle cDNAene ved de fleste 5'-endene ved den første reverse transknptasen Denne egenskapen er nødvendig for å unngå generering av cDNA med kortere lengde

En alternativ strategi er å amplifisere signalet fra restmaterialet ved kjemiske metoder Den mest sensitive strategien tilgjengelig så langt, er basert på nøster av DNA-forgrenede syntetiske molekyler Disse kan bh bundet til poly-A-haler av cDNA for matrisehybndisering Generelt kan en 250-gangers økning i signalstyrke oppnås

Ingen av disse strategiene har bhtt testet grundig med hensyn på pålitelighet og sensitivitetsnivåer Det er sannsynlig at amplifisenngsteknikker vil gi grader av skjevhet (eng bias) i forhold til startmaterialet pga den enzymatiske natur til prosessen, kombinert med stor variasjon i mRNA-lengde for ulike transknpter Den store mengden av materiale som er nødvendig for å oppnå en adekvat signalstyrke og problemet med at tilgjengelige fluoroforer bare med vanskelighet blir akseptert av revers-transknptase-enzymer representerer store ulemper med kjent teknikk

Nukleotider merket med radioaktivitet

Det er kjent at problemet med lav akseptens av revers-transknptase-enzymer kan løses ved å bruke radioaktive isotoper for merking av nukleotider Historisk sett har radioaktive isotoper vært i utbredt bruk for sensitiv deteksjon og kvantifisering av nukleinsyrer Vanlig bruk har vært begrenset til bruken av en eneste, vanligvis beta-emitterende, radionukhde, innkorporert enten inn i en probe av (detektornukleinsyre) eller in vivo Deteksjonen har vært gjort med væskescintillasjon eller gammatellere, og i tilfeller med en todimensjonal distribusjon (f eks Northern eller Southern blots) har autoradiografi, fosforplater og digitale autoradiografisystemer vært brukt Målinger av distribusjonen av et radioaktivt stoff i et tynt vevssnitt eller i Northern og Southern blots har tradisjonelt blitt gjort med filmautoradiografi, og denne metoden er fremdeles det vanlige valget for høyoppløsningsstudier Den er imidlertid beheftet med et begrenset dynamisk intervall (kun i størrelsesorden 1 5-3) og lav sensitivitet, den er arbeidskrevende og gir unøyaktige bestemmelser

Fosforplatesystemer har en mye høyere sensitivitet enn filmautoradiografi, 250 ganger mer sensitive enn røntgenfilm med 32P og 60-100 ganger mer sensitive enn direkte filmautoradiografi med ,4C og <35>S Det lineære dynamiske intervallet til disse systemene er IO<4->10<5>, og kvantifisenngsmetoder gir resultater som er mye mer pålitelige enn med film Imidlertid blir ikke områder med aktiviteter under den nedre grenseverdien nøyaktig kvantifisert, og uunngåelig medfører dette en begrensning i nøyaktigheten ved målinger av aktivitetsdistribusjoner Et viktig praktisk problem med de to siste radiografi-modahtetene er nødvendigheten av å kjenne eksponeringstiden før bildetakning slik at under-eller overeksponering blir unngått Spesielt med film, hvor eksponeringstiden kan være måneder, kan et dårlig estimat av eksponeringstid forårsake mye bortkastet tid

Problemene knyttet til disse to autoradiograif-modahtetene kan stort sett bli eliminert ved å bruke digitale systemer med direkte hendelsesdeteksjon Dette gir resultater med absolutt linearitet, telleraten er bare begrenset av hastigheten i elektronikken, og behovet for nøyaktige estimater av eksponeringstider er eliminert ettersom man kan inspisere det kumulative bildet til enhver tid Selv om den geometriske oppløsningen i tilgjengelige systemer ikke kan konkurrere med den i filmteknikker, er den sammenlignbar med oppløsningen i fosforplatesystemer

Imidlertid kan ikke disse teknikkene separere bidrag fra ulike lkke-monoenergetiske nukhder, og kan dermed ikke anvendes for simultan kvantifisering av to eller flere radioaktive emittere på samme prikk på en biologisk mikromatnse Dette utelukker enhver anvendelse hvor man ønsker å simultant sammenligne aktiviteten fra mer enn et opphav, som f eks en frisk celle og en tumorcelle Dermed er en hel klasse av viktige diagnostikk- og forskningsanvendelser utestengt fra fordelene med merking av nukleotider og/eller andre biologiske molekyler med radioaktive isotoper I tillegg, i følge vårt kjennskap, er kjente metoder og kjent apparatur for å utføre konvensjonelle autoradiografimetoder alle begrenset til å merke alle molekyler på overflaten med bare en radionukhde om gangen, og med et begrenset antall radionukhder Altså finnes det et behov for en generell metode for å gjøre simultan bestemmelse av radioaktiviteten/intensiteten av to eller flere ulike radionukhder i hver prikk i en biologisk mikromatnse Et gammakamera utstyrt med en parallellhull-kolhmator kan brukes for å simultant måle fordelingen av flere gammaemitterende radionukhder på en overflate Imidlertid kan ikke dette kameraet vise strukturer med romlig utstrekning på sub-milhmeter skala

Hensikt med oppfinnelsen

Hovedhensikten med oppfinnelsen er å frambringe en metode og apparatur for å utføre simultan kvantifisering og/eller sammenligning av en eller flere biologiske målmolekyler som er distinkt merket med radioaktive isotoper, og deretter adsorbert på en probematnse av biologiske molekyler deponert på et substrat, og som vesentlig reduserer de ovennevnte problemene En tilleggshensikt med oppfinnelsen er å fremskaffe en metode og apparatur for simultan bestemmelse av to eller flere cDNAer som er merket med beta-emitterende radionukhder med distinkte fordelinger, og som så er adsorbert på en DNA-mikromatrise

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

De ovennevnte målsetninger kan nåes ved de egenskaper framsatt i den følgende beskrivelse og ledsagende krav

Målsetningene med denne oppfinnelsen kan nåes ved å utnytte et digitalt deteksjonssystem som er i stand til å a) lagre posisjonen og energien til hver enkelt partikkel/foton som treffer dens overflate, b) gjøre sanntids omorganisering og reduksjon av datamengden, og c) simultant estimere mengdene av to eller flere radionukhder tilstede innen en tilfeldig region på en probeflate, dvs ved metoder nylig utviklet av Kvmnsland og Skrettmg [5] for separering av bidragene fra to radioaktive nukhder i et autoradiogram Det digitale systemet eller apparatet omfatter en elektronisk innretning for deteksjon og avbildning av små radioaktive prøver, og som er i stand til å registrere og lagre den deponerte energien og posisjonen til hver partikkel som penetrerer instrumentets sensorsystem Denne innretningen er en videreutvikling av instrumentet angitt i US5 656 818 og EP 0 983 705, begge patenter er innlemmet ved referanse Virkningsmekanismen til instrumentet er vesentlig det samme som instrumentet angitt i patentene sitert ovenfor Derfor vil vi her bare gi en kort beskrivelse av virkningsmekanismen til det oppfmneriske , instrumentet, som kan betraktes som bestående av to deler

1 En monolittisk halvledersensor utformet som en enkelt plate Platen bør fortrinnsvis ha et større, eller i det minste det samme overflateareal som den biologiske mikromatnse Typiske dimensjoner vil være et areal i størrelsesorden 10 kvadratcentimeter og en tykkelse på 300u,m Overflaten på den monolittiske halvlederplaten er på en side dekket med parallelle bånd eller "striper" av et sensitivt p-type materiale, og den andre siden er dekket med parallelle bånd av n-type materiale n-type-båndene er vinkelrette på p-type-båndene Altså dannes en pn-diode på hver skjæring mellom båndene, og båndene vil dermed danne en matrise som frambringer en todimensjonal utlesning av treffposisjon av partikkelen emittert fra de radioaktive markørene Dvs , så lenge diodene er reversert forspent så vil de svare med en strømpuls på de to ortogonale stripene som de er koblet til når en radioaktiv partikkel penetrerer inn i dioden Stnpeavstanden er typisk i størrelsesorden 50um Dvs at for et areal hk 64mm x 32mm vil det være 1280 x 640 striper, noe som gir instrumentet en todimensjonal matrise på 820 000 piksler Halvlederplaten kan tilpasses til å respondere på alle typer radioaktivitet, inkludert a, P, y og positron stråling Avhengig av energinivåer og type radioaktivitet, kan monolittiske plater av Si, GaAs, CdTe eller CdZnTe etc bh brukt

2 Et elektronisk system for å lese ut signalene fra sensoren Systemet består av Multi-Chip-Modules (MCM's) som omslutter sensorplaten, og som består av flere parallelle FE-chiper (ASIC), hver med en matrise av forforsterker og støyfiltrerende forsterkmngskanaler For hver partikkel som penetrerer sensoren, vil ladningen fra sensorens x- og y-stnper som bærer de største ladningene pluss de to nærmestliggende striper få integrert og filtrert deres ladningssignal av de korresponderende kanaler i de korresponderende FE-chiper for å gi energien til partikkelen Generelt vil en innkommende radioaktiv partikkel avgi sin energi ved å ionisere materialet i sensorplaten, slik at energien til partikkelen vil være proporsjonal med summen av amplitudene til de registrerte signalene i de aktuelle stripene til sensorplaten Det forsterkede signalet fra x- og y-siden bhr lest ut fra MCMene til et datainnsamhngssystem (DAQ), og styredatamaskinen mottar dermed x-y-koordinaten for den radioaktivt utsendte partikkelen sammen med energien i hendelsen

Ved å bruke denne spesifikke kombinasjonen av faststoffteknologi og høyt integrert utlesningselektronikk, oppnår man et svært nøyaktig og pålitelig instrument som registrerer energien og posisjonen til hver radioaktivt utsendte partikkel som går gjennom sensorplaten i instrumentet Dermed, ved å plassere sensorplaten i nær kontakt med den biologiske mikromatrisen kan man måle radioaktivitet for hver prøvepnkk på den biologiske mikromatrisen For å gjøre instrumentet nyttig og passende for andre typer stråling, er det planlagt å utstyre instrumentet med utskiftbare sensorplater som har samme dimensjon, men som er laget av ulike monolittiske halvledermaterialer, og som enkelt kan bh satt inn i den integrerte utlesningselektronikken Som et eksempel, hvis man bruker en sensorplate av silisium, som responderer bra på p-stråhng, og så ønsker å undersøke en biologisk mikromatnse merket med y-emittere, så kan instrumentet øyeblikkelig klargjøres for dette ved å erstatte sensorplaten av silisium med en sensorplate av kadmium-sink-tellund som responderer bra på y-stråling Under registrering er mikromatnseglassplaten plassert med prøvesiden ned i nær kontakt med halvledersensorplaten i instrumentet, atskilt av en l,3u.m tykk mylarfohe Dermed vil detektorsystemet, pga det todimensjonale mønsteret av pn-dioder, registrere både energien til den innkommende radioaktive partikkelen og posisjonen på den biologiske mikromatrisen den kom fra Dette betyr at den summerte emisjonsintensiteten må være tilstrekkelig lav for å tillate instrumentet å registrere en og en emisjonshendelse Den maksimale aktivitet som med pålitelighet kan måles på den totale overflaten strekker seg fra kosmisk bakgrunnsstråling (ca 1 Bq) opp til 10 MBq, men for mange praktiske applikasjoner foretrekkes en begrensning på 4-6 kBq

I tilfellet med p-emittere er det et generelt problem med sammenligninger og/eller simultane bestemmelser av aktivitet at de emitterer ved flere energinivåer og vil dermed normalt danne kontinuerlige energispektra Dvs at selv om man bruker to radioaktive isotoper som utsender p-partikler med gjennomsnittsenergier som er godt atskilt, så kan man ikke direkte vha den registrerte energien bestemme fra hvilken isotop den registrerte partikkelen kom fra Imidlertid kan energi spekteret bli målt separat for de to nukhdene, og disse spektrene kan bh brukt for å separere bidragene fra hver isotop så lenge som isotopene har spektra som er tilstrekkelig forskjellige

I metoden, i følge denne oppfinnelsen, blir energispektrene til isotopene dannet ved å dele det totale energispennet til de emitterte p-partiklene inn i en vektor med kmax diskrete energi nivåer, hvor kmax er et positivt heltall som fortrinnsvis burde være større enn 20 Dvs , for hver region, r, på probeoverflaten blir de registrerte p-partiklene klassifisert i følge hvilke av de k energinivåene de hører til Dermed har man oppnådd en diskret vektorrepresentasjon av det aktuelle energispekteret, = ^ Etlk , av isotopene for hver region på probeoverflaten

Som et resultat av sanntids omorganisering av data og en mulig påfølgende datareduksjon, gir instrumentet ved slutten av en forhåndsbestemt måletid bildeinformasjon i form av et bilde som inneholder k energibånd (energi-bånd-bilder), med analogi til et fargebilde som inneholder disse båndene som rød, blå, grønn etc Et element av et energi-bånd-bilde, betegnet som E, lk, inneholder antallet partikler innen det kle energi-intervallet som ble registrert ved den digitale koordinaten i, j

I enhver bilderegion, r, er det registrerte energi histogrammet Erk en lineær kombinasjon av de kjente energispektrene for hver av de aktuelle radioaktive isotopene I det følgende vil vi illustrere metoden for tilfellet hvor to isotoper blir brukt, men man skal ha i tankene at metoden kan brukes for et vilkårlig antall isotoper Hvis de kjente energispektrene ble målt med de samme energibåndene som ble brukt for måling av energi-bånd-bildene, og normalisert slik at summen over all energibånd er hk 1, så kan beregningene bh gjort som følger

La SAk og SBk betegne energispektrene ved nivå k oppnådd med rene prøver av isotop A og B La videre aT og br være de ukjente bidragene innen region r (totalt antall registrerte utsendelser) fra isotop A og B Det er viktig at energinivåene i referansespektrene er identiske med dem som blir brukt under datainnsamlingen i det faktiske eksperimentet som gir energi-bånd-bildene ( Erk)

Deretter

Disse relasjonene kan bh brukt i en av de ovennevnte algoritmene fra artikkelen av [5] for å estimere bidragene ar og br for hver region på probeoverflaten Artikkelen gir to generelle algoritmer en minste kvadraters metode (MK) og en maksimal sannsynlighet metode (MS) Begge er innkorporert ved referanse, og alt vi trenger å si er at ML-metoden er den enkleste og krever betydelig mindre regnekraft enn MS-metoden, men er beheftet med en noe større usikkerhet i estimatene Vi vil derfor fokusere på ML-metoden i den følgende diskusjonen, men likevel understreke at begge algoritmene er innkorporert i oppfinnelsen I prinsippet virker MK-algontmen som følger Målet er å finne hvilke bidrag ar og br som gir den minste feilsummen Sr over hele vektoren, hvor Sr er gitt ved Minima er bestemt ved

Som nevnt er metoden gitt som en bestemmelse av bidragene fra to isotoper Metoden kan imidlertid bh brukt for et vilkårlig antall isotoper ved bare å legge til et ledd av typen "Sek cr" for hver ekstra isotop i ligningene

I praksis blir metoden brukt som følger For hver piksel ij på sensorplaten blir en vektor EtJk med kmax tellere etablert i minnesystemet i instrumentet Hele datasettet, E, jk, blir initialt satt lik null Når den x'te, y'te pikselen registrerer en p-partikket vil den x'te y'te telleren med riktig nivånummer bli øket med en Denne prosessen fortsetter inntil et tilstrekkelig antall treff er registrert for å gi en statistisk representasjon av energispekteret, som så blir brukt i en av algoritmene for å bestemme bidragene fra isotop A og B i det registrerte energihistogrammet i hver region r på probeoverflaten

For å oppnå et fleksibelt instrument for et vidt spekter av anvendelser er instrumentet utstyrt med en sensorplate med svært høy oppløsning som inneholder et stort antall piksler Dermed vil oppløsningen av en biologisk mikromatnse være grovere enn oppløsningen i sensorplaten I disse tilfellene kan betydelig regnetid spares hvis de registrerte data fra nabopiksler kan kondenseres ved å legge dem til senterpikselen Mao, ved å addere f eks de registrerte hendelser i en pixel og alle dens nærmeste naboer (total 9 piksler) inn i en senterpiksel vil oppløsningen og dermed antall beregninger reduseres med en faktor 9 Hvis enda grovere oppløsning ønskes kan man inkludere alle nabopiksler i two omkringliggende rader (total 25 piksler) osv På denne måten simulerer vi en grovere sensoroppløsning, og reduserer de nødvendige beregningstnnn tilsvarende Den romlige kondensering inn i regioner gir også en total økning i antall registrerte hendelser for hvert element Erk i det resulterende kondenserte energi-bånd-bildet, som dermed gir en forbedret statistisk nøyaktighet i de estimerte fordelingene

Metoden krever på forhånd kjente energispektra for hver aktuell radionuklide Dette kan oppnås ved kalibrering av instrumentet med overflatefordelte kilder av hver av de aktuelle radionuklidene før bestemmelse av den ukjent prøven Kahbreringsprosedyren er innebygget som en automatisk prosedyre i instrumentet, hvor målte spektra blir fremskaffet for hver av stripene på den ene siden (x-siden) av sensorplaten Ved å bestemme første og andre moment av disse spektrene kan deres null forskyving og utbytte (eng gain) bestemmes i forhold til en referansestnpe (legg merke til at i kahbreringsprosedyren tas ikke energi i nabostripene med) Disse kahbrenngsdataene kan brukes i sanntid for å korrigere energien ved hver radioaktiv hendelse Med denne kahbreringsprosedyren unngår man problemer man støter på med eksterne fotonkilder hvor spredt stråling gir opphav til forandringer i spektrene Fordi glassplaten, som inneholder den biologiske mikromatrisen, kan være litt rotert i forhold til pnnsipalaksen til instrumentet, må rotasjonsvinkelen bestemmes slik at prøveprikkene på mikromatrisen danner nøyaktig vertikale og horisontale rader og kolonner i bildet Bestemmelsen av den optimale vinkelen kan gjøres som følger Et summert bilde blir dannet ved å addere alle bånd i energi-bånd-bildet E, jk, dvs en summering over indeksen k Dette bildet blir så rotert i steg på 0 1 grader, og for hver ny vinkel blir projeksjonene på x- og y-aksen beregnet Den optimale rotasjonsvinkelen korresponderer til den maksimale variansen (dvs den maksimale kontrastvanasjonen) Projeksjonene kan enkelt bh brukt for å bestemme den øvre, nedre, ytterste venstre og ytterste høyre posisjonen til en prøvepnkk Dermed er identifiseringen av en prøvepnkk enkel, og den assosierte regionen okkupert av denne prøvepnkken kan bh identifisert Det er dermed mulig å lage et nytt energi-bånd-bilde hvor hvert punkt korresponderer til en region okkupert av én prøvepnkk Dette vil signifikant styrke den statistiske nøyaktigheten i det endelige resultatet Denne metoden og apparatur har blitt beskrevet som en generell fremgangsmåte passende for simultan bestemmelse av bidragene fra mer enn en radioaktiv isotop i ett registrert energispektrum, som er en overlagring av ukjente bidrag fra hver isotop

Metoden er opplagt nødvendig i tilfeller med p-emittere siden disse har overlappende energispektra, men kan synes unødvendig for andre typer stråling (a, y) som er av monoenergetisk natur og som dermed gir svært distinkte energispektra som generelt ikke overlapper hverandre Men metoden ifølge denne oppfinnelsen kan være nyttig selv for disse tilfellene siden metoden kan bruke radioaktive isotoper som emitterer fotoner og partikler med små energiforskjeller fordi metoden vil separere mulige overlappene energibidrag I tillegg vil metoden automatisk behandle problemet med sekundære registreringer pga bakgrunnsstråling og uunngåelig spredning, og dermed gi bestemmelser med utmerket presisjon Egenskapen er en åpenbar fordel for alle typer stråling

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er et flytdiagram som skjematisk illustrerer en foretrukket realisering av oppfinnelsen i tilfellet med simultan bestemmelse av to eller flere cDNA som er merket med beta-emitterende radionukhder med distinkte fordelinger, og som så er adsorbert på en DNA-mikromatnse Fig 2 er et blokkdiagram som skjematisk illustrerer dataprosesseringen for å separere fordelingene fra hver radioisotop Fig 3 er et diagram som viser energispektrene for P- og S-isotopene som målt med apparaturen i følge oppfinnelsen, og hvor de faktiske antallene av energi-intervaller er brukt (energinivåer) Fig 4 viser x-akseprojeksjonen ved bestemmelsen av laksesperm merket med

P og S, både separat og i kombinasjon

Fig 5 viser et virtuelt fluoroforplot av en simultan bestemmelse av <33>P- og <3>SS-merkede RNA-hnjer fra OHS osteosarkom- og MCF-7 brystkreftceller, respektivt

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen vil nå bh beskrevet i detalj med referanser til de vedlagte figurene, og et eksempel på et foretrukket utfønngseksempel av oppfinnelsen

Figur 1 og 2 gir en skjematisk representasjon av en foretrukket utføring av metoden og apparaturen i følge oppfinnelsen Eksempelet er gitt i tilfellet med å bestemme aktiviteten av DNA-molekyler som er merket med to distinkte p-emittere og adsorbert på en DNA-mikromatnse Ut i fra diskusjonen ovenfor bør energispektrene til de to radionukhdene være tilstrekkelig distinkte og ha passende henfallsegenskaper som gjør p-emisjonen detekterbar innen en rimelig måletid To passende radionukhder for dette formålet er <35>S og 33S Energispektrene av reine prøver av disse isotopene er gitt i figur 3

I figur 1 er et objektglass som inneholder en DNA-mikromatnse merket med ukjente kvantiteter av de radioaktive p-emitterne <35>S og 3<3>S, markert med tallet 1 Objektglasset er plassert under og trykket mot en kvadratisk monolittisk halvledersensorplate 2 laget av silisium på en slik måte at DNA-mikromatrisen er dekket av sensorplaten Sensorplaten 2 og DNA-mikromatrisen er separert av en l,3um tykk mylarfohe (ikke vist) Dermed, når en p-partikkel er emittert fra en av radionukhdene vil den treffe sensorplaten 2 and skape en liten strømpuls i en pn-diode som ligger hovedsakelig rett over radionukhden som emitterte p-partikkelen Pga det todimensjonale nettverket av slike pn-dioder (også kalt piksler) i sensorplaten, vil det elektroniske systemet 3 i apparatet plukke opp posisjonen (x,y-koordinaten) til pikselen og dermed den aktuelle prøvepnkken på DNA-mikromatrisen som p-partikkelen kom fra Det elektroniske systemet vil også måle energien til p-partikkelen og sende denne informasjonen i digitalt format til en datamnsamlingsenhet 4 som akkumulerer alle registrerte hendelser og organiserer dem ifølge den registrerte posisjon og energi Datainnsamhngsenheten 4 kan bestå av enhver konvensjonell digital lagringsenhet som RAM-minnebnkker, harddisk, floppy-disk, CD-ROM etc Når datainnsamhngsenheten har mottatt nok data for å lage en statistisk pålitelig analyse, dvs når elementene av EtJk bærer nok informasjon, så stoppes registreringen av hendelser fra sensorplaten

Så utgjør de registrerte energi-bånd-bildene input for dataprogrammet som bestemmer mengdene av hver isotop for hver pixel, eller etter en kondensering mn i regioner som beskrevet tidligere for hver prøvepnkk på mikromatrisen, ved å bruke en av algoritmene gitt i [5] Dvs , algoritmen bestemmer hvor mye (med hvor mange registrerte hendelser) hver radionukhde bidro til eller Erk i tilfellet med en større prikk (En god kvantifisering vil selvfølgelig kreve kunnskap om nukleotidenes halvliv og detektorsensitiviteten for den aktuelle radionukliden (registrerte hendelser per enhet aktivitet på overflaten)) Denne prosedyren er skjematisk gitt i den uthevede boksen i figur 1 og i figur 2 Figurene avbilder et tilfelle med to p-emitterende radionukhder som blir bestemt ved minste kvadraters algoritmen, og hvor pikslene er kondensert med en faktor 9 (all omkringliggende piksler i et lag er addert til senterpikselen )

En fordel med denne metoden er at mengdene av hver isotop i hver testpnkk blir bestemt i absolutte kvantiteter Dette gir flere muligheter for presentasjon av informasjon En mulighet i tilfellet med to isotoper er å bestemme forholdet mellom isotopene i hver prikk, og presentere dette i et virtuelt kart som representerer den biologiske mikromatrisen En annen opsjon kan imitere fargene oppnådd med rød/grønne fluoroforteknikker i et enkelt bilde Ved å tilordne intensiteten av bildet av en av radionukhdene til en rød farge og den andre til en grønn farge, vil en fargeskala som blander rødt og grønt i ulike proporsjoner, bh laget Det er også mulig å presentere histogrammer som viser de absolutte kvantitetene av hver nukhde

Bestemmelse av absolutte kvantiteter av RNA

Gjennomførbarheten av den foretrukne realiseringen av metoden og apparaturen vil nå bh demonstrert i tilfellet med bestemmelse av absolutte kvantiteter av RNA merket med kjente kvantiteter av 33P og <3>SS

Etter kalibrering av instrumentet, og før målinger av DNA-mikromatrisen, ble spektrene for <33>P and <35>S målt separat som følger Løsninger av radionukhder ble jevnt deponert på et objektglass som så ble tillatt å tørke inn De multiple energi-bånd-biIdene som ble fremskaffet med disse objektglassene hadde en energi-intervallbredde på 15keV, og der var 20 intervaller som startet på en nedre terskelverdi på 20keV Spektrene ble laget med samme intervallstørrelse og antall nivåer, og det ble antatt at de var uavhengige av posisjonen på detektoren, og derfor bidrog hele bildene til spektrene For hver piksel (eller prikk), ble de ukjente bidragene P og S fra henholdsvis <33>P og 3<5>S bestemt ved hjelp av regresjonsanalysen og av maksimal sannsynhghetsmetoden De resulterende P- og S-bildene ble vist på skjermen som ett enkelt bilde på samme måte som er vanlig for å presentere bilder oppnådd ved flourescens Fosforbildet P ble sendt til den røde kanalen til skjermen, og svovelbildet S ble sendt til den grønne kanalen Like mengder rødt og grønt ville dermed gi en gulaktig farge

DNA-matrisene i alle eksempler ble preparert i henhold til følgende protokoll

Overflatebehandling

Poly-L-lysin-behandlete, rensete mikroskop-objektglass (Sigma Cat No S-8902) med dimensjonene 75 x 25 mm ble benyttet for trykking Objektglassene ble lysinbehandlet ved å plassere dem i NaOH/EtOH-løsning i 2 timer ved rysting (75g NaOH, 300 ml ddH20 og 450 ml 96% EtOH), deretter overført til ultrarent vann (dobbeltdestillert vann, ddH20) og dyttet opp og ned minst ti ganger inntil objektglasset ikke lenger viste optiske fenomener som blakking eller andre konsentrasjonsfenomener Objektglassene ble så gjentatte ganger renset i ferskt dobbeltdestillert vann med risting, deretter dyppet i poly-L-lysin-løsning (40 ml poly-L-lysin, 40 ml PBS og 200 ml ddH20) og plassert med risting i 1 time Til slutt ble objektglassene gjentatte ganger renset i ddH20 og så sentrifugert tørre (500rcf i 5 minutter), fulgt av oppvarming til 55°C i 1 time Objektglassene ble oppbevart i minst to uker ved romtemperatur før de ble benyttet til trykking

Trykking

En selvlaget robot ble benyttet som trykkemaskin, laget etter beskrivelse fra P Meltzer ved National Institute of Health, USA Karbidpenner med splitt, produsert av Beecher Inc ble benyttet, med trykking av 48 objektglass med 8 penner (2 x 4) i hver omgang Pennene ble renset med nedsenking i IM NaOH i 2 minutter, fulgt av 10% SDS i to minutter og en kort vask i ddH20 Pennene ble så behandlet med ultralyd i 10 sekunder før en ekstra rensing i ddH20 Pennene ble deretter blåst tørre med trykkluft DNA ble trykket direkte fra Costar 96-bønns brett (U-bunn, polystyren, kat no 3367), der DNA fra PCR-produkter først ble presipitert og oppløst m 25 ul 3xSSC Trykkingen ble utført med en luftfuktighet på omlag 50% Temperaturen varierte i området 27-30°C over forløpet av trykkeprosessen Det ble benyttet matriser som inneholdt 2200-2700 gener

Postprosessering

Objektglassene med påtrykket DNA ble så behandlet med en UV-dose på 100 mJ på å kryssbinde DNA til poly-L-lysin En blokkeringsløsning ble laget ved å løse opp 6 g succmat-anhydrid i 335 ml 1 -metyl-2-pyirohdinon og 15 ml IM borsyre (pH 8 0) ved omrøring med stavmagnet Objektglassene ble deretter dyppet og ristet i løsningen på plassert på nstemaskin i 15-20 minutter Glassene ble så gitt en kort rens i dobbeltdestillert vann, deretter dyppet i oppvarmet vann (95°C) i to minutter og overført til kalt 96 % EtOH i 30 sekunder Til slutt ble objektglassene tørket i sentrifuge (500 ref I 5 minutter) og lagret klare for bruk

Behandlingen av radioaktive cDNA-prober fulgte i alle eksperimenter følgende protokoll

Konvertering av 2- 5 fig total- RNÅ til33 P/ 35 S- merket første- tråd cDNA

En alfa-33P-dATP-løsmng (lOmCi/ml, kat no AH9904, Amersham Pharmacia Biotech), og en alfa-35S-dATP (lOmCi/ml, kat no AG1000, Amersham Pharmacia Biotech) ble benyttet for inkorporering av radioaktivitet Reverstransknpsjons (RT-)-reaksjonen ble laget på is

Reaksjonsblandingen ble innkubert ved 65°C i 5 minutter, og deretter avkjølt til 42°C i 5 minutter 1 ul SuperScnpt II-enzym ble tilsatt og videre inkubasjon ved 42°C foregikk i 30 minutter Ytterligere 1 u,l SuperScnpt II-enzym ble tilsatt og innkubert videre ved samme temperatur i 30 minutter Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 5 ul 500 mM ED TA og 10 ul IM NaOH ble tilsatt og blandingen innkubert ved 65°C i 60 minutter for å hydrolysere RNA Blandingen ble så avkjølt til romtemperatur og 20 ul 1 M Tns-HCl (pH 7 5) ble tilsatt for å nøytralisere løsningen Ferdige prober ble oppbevart på is inntil rensetrinnet skulle utføres

Proberensmg og forbehandling

Probene ble renset ved bruk av Microcon-kolonner 300 ul 1 x TE ble tilsatt til hver RT-reaksjon og de to ulikt merkete probene ble blandet før overføring til kolonnene og deretter sentrifugert ved 13000 rpm inntil 30-50 u.1 av løsningen var tilbake i kolonnene Etterfulgt av gjentatte tilsettinger av TE og sentrifugennger, ble det sentrifugert til gjenværende volum var 10 ul Kolonnene ble så invertert inn i nye reagensrør og sentrifugert i ett minutt ved 13K rpm for gjenvinning av all probe fra kolonnene Til et endelig volum på 18 ul (tilpasset volumet under et dekkglass på 22 x 20 mm) ble følgende tilsatt 1 ul 10 ug/ul COT-1 DNA, 1 ul 8 ug/ul poly A, 1 ul 4 ug/ul gjær tRNA, 1 ul 10

ug/ul BSA, 1 pl 50 x Denhardts løsning, 3 1 ul 20 x SSC (sluttkonsentrasjon 3 5 x SSC og 0 5 ul 10% SDS (sluttkonsentrasjon 0 3%) Proben ble avslutningsvis

oppvarmet i kokende vann i 2 minutter før sentrifugenng ved 1 OK rpm i 10 minutter

Eksempel 1

For å demonstrere gjennomførbarheten av metoden og apparaturen i følge oppfinnelsen, ble et modelleksperiment gjennomført med to isotoper <33>P og 3<5>S som ble fortynnet i laksesperm og pnntet på et objektglass for å gi en stråling på omtrent 1 Becquerel per prikk, ufortynnet I tillegg ble det laget en 5 log fortynnmgsrekke for å demonstrere det dynamiske intervallet til metoden og apparatet i følge oppfinnelsen Dette ble gjort separat for hver av de to nukhdene, og for en kombinasjon av nukhdene To matriser ble brukt med en senteravstand på 250u.m og 400pm Resultatet for alle tre eksperimentene er gitt i figur 4, både som et fluoroscensplot og i form av det registrerte energi spektrum som en projeksjon av signalet ned på x-aksen for å vise det kvantitative forholdet ved fortynning

Eksempel 2

For å verifisere anvendeligheten av metoden og apparatet i følge oppfinnelsen for mikromatnseanvendelser, ble et eksperiment gjennomført med reduserte mengder RNA fra to cellelinjer Ellers ble standard mikromatnseprosedyrer brukt Ved å bruke RNA fra to ulike cellelinjer, en OHS osteosarkom-cellehnje og en MCF-7 brystkreft-cellehnje, ble en vellykket separasjon av nukhdene gjort, og presentert som et fluoroforplot i form av et pseudofargebilde av de to isotopene, i figur 5 Figuren viser klart at metoden og apparatet, i følge oppfinnelsen, oppnår den dynamiske variasjonen av signaler som kan forventes fra lignende eksperimenter med fluoroforer, men med signifikant lavere start-RNA-mengder

Som nevnt blir radioaktivt merkede biologiske stoffer enkelt innkorporert i levende celler i motsetning til de fleste fluorescerende stoffer Dette kan gjøres ved å addere mediesubstitutter, slike som nukleotider, aminosyrer eller andre komponenter hvor radioaktive isotoper allerede har blitt innkorporert Denne muligheten åpner for en rekke nye anvendelser, hvor to er beskrevet her

Eksempel 3

Mengden protein i en celle er delvis regulert ved stabiliteten til dets korresponderende RNA Dette er generelt antatt å være relatert til størrelsen av poly-A-halen, og delvis andre sekvensspesifikke faktorer Fram til i dag har undersøkelse av individuelle mRNA-typer vært den foretrukne metoden Ved å innkorporering av to radioaktive markører blir det mulig å momtorere alle mRNA-typer i en populasjon ved sammenligning med en standard Dette tillater en genom-bred scanning av RNA-halvhv når det blir kombinert med DNA-mikromatnser

I stedet for å bruke cDNA med radioaktivitet i et cellefritt system enzymatisk, bhr a35S-UTP og a33P-UTP tilsatt til kulturmediet til parallelle cellekulturer i passende konsentrasjoner ved tid 0 Så lar man cellene vokse fram til tid 1 når de radioaktive nukleotidene har blitt innkorporert i tilstrekkelig grad for å kunne detektere RNAet som ble produsert i cellene fra tid 0 Ved tid 1 blir en parallell behandlet kjemisk for å blokkere RNA-syntese Ved tid 2 blir begge kulturene høstet, RNA blir isolert, og like mengder RNA fra begge kulturene blir blandet Blandingen blir så behandlet som den kombinerte proben av cDNA i eksempel 1 og hybndisert til mikromatrisen

Til slutt blir signalene registrert og analysert for å finne bidragene fra hver nukleotide for å finne forholdene Disse dataene reflekterer det relative halveringstiden til alle RNA-typer som er detekterbare i en cellelinje Denne nye prosedyren tillater genombred monitorering av den viktige cellulære regulenngsfunksjonen til RNA-halvhv i forbindelse med den tradisjonelle informasjonen som man får fra mikromatnseanalyse i standardformatet

Eksempel 4

I det framvoksende proteomiske feltet kan lignende metoder som det gitt i eksempel 3 anvendes når man bruker aminosyremarkører For eksempel, monitorering av ulike fosforylenngsgrader av proteiner, et viktig reguleringsfenomen i alle celler, kan gjøres ved å inkorporere radioaktivt merkede markører som blir tilsatt mediet Ved å pnnte antistoffmatriser kan lnnkorporenng av fosformarkører i mange ulike proteiner momtoreres samtidig Selv om oppfinnelsen has vært beskrevet som et tilfelle av eksempler på sammenlignende tester av to DNA/RNA-stoffer merket med en distinkt p-emitterende radionuklide hver, bør det understrekes at metoden og apparatet i følge oppfinnelsen er en generell fremgangsmåte for å bestemme mengdene av radioaktivt merkede biologiske molekyler som er adsorbert på en biologisk mikromatnse Dette gjelder for alle typer radioaktivitet, inkludert a-, p-, y- og positronstråling, og alle radioaktive nukhder, spesielt dem som kan inkorporeres inn i målmolekyler slik at radioaktiviteten kan justeres til i størrelsesorden 1-100 Becquerel i hver prikk i mikromatrisen 1 tillegg, selv om metoden er spesielt egnet for tilfellet med radioaktivitet med overlappende energispektra (P-emittere), så bør man være klar over at den statistiske behandlingen av de registrerte hendelser i metoden gir fordeler for monoenergetisk stråling også, spesielt hvis man anvender radionukhder som emitterer stråling med små energiforskjeller Disse fordelene innbefatter utmerket filtrering/separasjon av bakgrunnsstøy (sekundær stråling etc ) og en svært høy sensitivitet Metoden og apparatet er også utviklet for å anvendes på et hvilket som helst antall ulike radioaktive nukhder fra 1 og oppover Det finnes ingen teoretisk grense for dette antallet, men en praktisk grense er mindre enn omtrent 20, helst mindre enn 10, og enda mer foretrukket er mindre enn 5 radioaktive nukhder

Referanser

1 Wang, E , Miller, L D , Ohnmacht, G A , and Liu, E T (2000), "High-fidehty mRNA amphfication for gene profihng", Marincola FM Nat Bwtechnol, 18(4), 457-459 2 Nilsen, T W , Grayzel, J and Prensky, W (1997),"Dendntic Nucleic Acid Structures", J theor Biol, 187, 273-284 3 Wang, J , Rivas, G , Fernandes, T R , Jiang, M , Paz, J L L , Waymire, R , Nilsen, T W , and Getts, R C (1998), "Adsorbtion and Detection of DNA Dendnmers at Carbon Electrodes", Electroanalysis, 10, 553-556 4 Wang J , Jiang, M , Nilsen, T W , and Getts, R C (1998), "Dendntic Nucleic Acid Probes for DNA Biosensors ", J Am Chem Soc , 120, 8281-8282 5 Kvinnsland, Y and Skretting, A (2000), "Methods for separation of contnbutions from two radionuchdes in autoradiography with a sihcon strip detector", Phys Med Biol, 45, 1183-1193

Claims (20)

1 Fremgangsmåte for simultan kvantifisering av en eller flere radioaktive nuklide(r) innenfor vilkårlige regioner på en probeoverflate, hvor hver av den ene eller flere radioaktive nuklide(ne) fungerer som markør(er) på forbindelser som er blitt inkorporert i målvev, på kjemiske målmatenaler og/eller på biologiske målmolekyler som er blitt deponert, absorbert eller fiksert til kjemiske eller biologiske probesubstanser på probeoverflaten, karakterisert ved at - både posisjonen og energien til de emitterte partikler og/eller fotoner fra hver region på probeoverflaten registreres, og at - den registrerte informasjonen fra hver region brukes til å bestemme i absolutte kvantiteter, mengde og/eller aktivitet fra hver av den ene eller flere radioaktive nuklide(ne) tilstede i de enkelte regionene, ved hjelp av egnet statistisk evaluering av informasjonen

2 Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at - både den registrerte posisjonen og energien til de emitterte partikler og/eller fotoner fra hver region på probeoverflaten lagres og akkumuleres som et energi-bånd-bilde, dvs som en vektor bestående av kmaks energinivåer for hver region r over hele probeoverflaten

3 Fremgangsmåte i henhold til krav 2, karakterisert ved at - den statistiske evalueringen inkluderer minstekvadratersmetoden, hvor en linear kombinasjon av de forregistrerte energispektra for hver radioaktive markør (hvor de ukjente koeffisienter er bidraget fra hver radionuklide) blir tilpasset dataene fra et bildeelement eller en region til energibåndbildet (det registrerte sammensatte energihistogram eller vektor), og/eller - en maksimal sannsynlighetsmetode, hvor det målte energi spekteret for hver av de radioaktive markørene brukes til å finne det mest sannsynlige antall treff fra hver radioaktive markør i hvert energinivå som vil gi det registrerte histogram eller vektor, på denne måten gi det totale antall hendelser med opprinnelse fra hver av de radioaktive nukhdene

4 Fremgangsmåte i henhold til krav 2 eller 3, karakterisert ved at fremgangsmåten kan brukes på biologiske mikromatnser hvor målregionene har en typisk diameter på mindre enn 200um, og/eller på makromatnser hvor målregionene har typisk diameter på mer enn 300um

5 Fremgangsmåte i henhold til krav 1 til 4, karakterisert ved at fremgangsmåten kan brukes for kvantifisering av mengden av en eller flere radioaktive nukhder som sender ut enten a, P eller positron partikler og/eller y-fotoner, inkorporert i målmolekyler slik at radioaktiviteten ligger i området fra 1-100 Bq fra hver målregion på probeoverflaten

6 Fremgangsmåte i henhold til krav 5, karakterisert ved at fremgangsmåten brukes for lkke-monoenergetiske radioaktive markører, inkludert betaemitterende kjerner, som gir delvis og/eller fullstendige overlappende energi spektra

7 Fremgangsmåte i henhold til krav 6, karakterisert ved at de betaemitterende radionukhder inkluderer <33>P og<35>S

8 Fremgangsmåte i henhold til krav 7, karakterisert ved at fremgangsmåten brukes til å sammenligne den totale mRNA populasjonen i prøvematenale fra en celletype/linje med prøvematenale fra en standard celletype/linje, hvor - egnede konsentrasjoner av <35>S-UTP og <33>P-UTP parallelt tilsettes de to cellekulturene ved tid 0, - cellen dyrkes så for en tidsperiode fram til tid 1, til man har fått inkorporert tilstrekkhg med radioaktive nukleotider for deteksjon av RNA produsert i cellen fra tid 0, - ved tid 1, blokkeres RNA syntesen ved hjelp av kjemisk behandling og - ved tid 2, høstes begge kulturene, RNA isoleres og tilsvarende mengder av RNA fra de to kulturene blandes, og tilslutt - behandles blandingen som en kombinert probe med DNA og hybndiseres til en biologisk mikromatnse, hvor de totale mengdene av begge de radioaktive markørene kan bestemmes

9 Fremgangsmåte i henhold til krav 1-6, karakterisert ved at fremgangsmåten brukes til simultan monitorering av forskjellige sett med varierende fosforylenngsgrader av proteiner ved inkorporering av radioaktivt merkede aminosyremarkører tilsatt mediet, for så å absorbere disse på biologiske mikromatnser inneholdende strukturerte sett av antistoffer

10 Apparatur for å utføre simultan mengdekvantifisering av en eller flere radioaktive nukhder innenfor gitte test regioner på en probeoverflate, hvor disse kjernene er avsatt, absorbert eller fiksert, karakterisert ved at apparaturen omfatter, - et elektronisk system for sanntidsmålinger av treffposisjon og avsatt energi fra radioaktive partikler/fotoner som sendes ut fra regionene på probeoverflaten, og som omfatter en flerstnpe halvlederdetektor med ortogonale p- og n-type striper på hver side av detektoren som er i stand til å måle treff posisjonen (x,y koordinater) for hvert radioaktivt treff, så vel som partikkelens/fotonets avsatte energi, - en innlastningsmekanisme som tillater posisjonering av probeoverflaten i kontakt med hele halvlederdetektorens overflate, kun separert av en tynn mylarfilm for å beskytte detektoren, - en sanntids dataorganisertngsmodul som holder rede på og lagrer både posisjon og energi for hver av de radioaktive treffene, og som separerer de registrerte hendelsene for hver piksel (x,y-posisjon) på halvlederdetektoren inn i en vektor med k energinivåer, slik at et energibåndbilde dannes, - en datamodul omfattende et system og programvare som er i stand til å bruke energibåndbildet til å bestemme, i form av absolutte kvantiteter, mengde eller aktivitet for hver radioaktive markør per piksel eller pakket region på halvlederdetektoroverflaten, og - en modul for å vise fordelingen av aktivitet fra hver radioaktive markør for hver piksel på hele halvlederoverflaten, eller valgfritt areal av probeoverflaten

11 Apparatur i henhold ti! krav ] 0, karakterisert ved at det elektroniske systemet for sanntidsmåhnger av treffposisjon og avsatt energi fra de radioaktive partiklene/fotonene omfatter - en kvadratisk plate av monolittisk halvledermatenale med en typisk dimensjon på ti cm2 og en tykkelse på ca 300um, - en eller flere Multi-Chip moduler omfattende flere parallelle FE-chips med en matrise av forforsterkere og støyfiltrerende forsterkningskanaler som omgir halvledersensorplaten, og - et dataoppsamlingssystem i stand til å holde rede på posisjon (x,y) og energi for alle radioaktive hendelser som treffer den følsomme delen av ha 1 v 1 edersenso rp 1 aten

12 Apparatur i henhold til krav 10 eller 11, karakterisert ved at halvlederdetektoren har et følsomt område på 64 x 32 mm<2>, og hvor stnpeavstanden på de følsomme n-type båndene og de ortogonalt orienterte p-type stripene på motsatt side av halvlederpalten er 50um, resulterende i totalt 1280x640 striper eller et todimensjonalt rutenett med 820000 piksler

13 Apparatur i henhold til krav 10 til 12, karakterisert ved at innmatningsmekanismen og halvleder detektoren er utformet slik at halvlederplaten kan byttes ut med en annen halvleder med tilsvarende pikseldesign og dimensjoner, men av et annet halvledermatenale slik at systemet kan detektere forskjellige typer radioaktivitet

14 Apparatur i henhold til krav 13, karakterisert ved at halvlederplaten er en monolittisk plate omfattende et av følgende materialer Si, GaAs, CdTe eller CdZnTe

15 Apparatur i henhold til krav 10 til 14, karakterisert ved at computermodulen til apparaturen omfatter programvare som benytter informasjonen fra de registrerte vektorene av k energinivåer for hver piksel til separasjon/bestemmelse av bidraget fra hver av de radioaktive markørene, i form av absolutte kvantiteter, i det registrerte energispekter for hver piksel på halvledersensorplaten ved bruk av enten - minstekvadratersmetoden, hvor en lineær kombinasjon av tidligere registrerte energispektra for hver radioaktive markør blir tilpasset det målte sammensatte energispektrum, og/eller - maksimal sannsynhghetsmetoden, hvor de forventede energispektra for hver radioaktive markør brukes til å finne det mest sannsynlige antall treff fra hver radioaktive markør i hvert energinivå som vil gi det registrerte energi hi sto gram

16 Apparatur i henhold til krav 10 til 14, karakterisert ved at sanntidsdata orgamseringsmoduien, som holder orden på og lagrer både posisjon og energi for hver radioaktive hendelse, og som separerer de registrerte hendelsene for hver piksel (x og y posisjon) på halvlederdetektoren i en vektor av k energinivåer, er i stand til komprimere de registrerte og lagrede data ved å addere informasjon fra alle nabopikslenes vektorer til senterpikslenes vektor for å redusere CPU-tid, og sørge for å få den virtuelle oppløsningen på det digitale bilde i overensstemmelse med den fysiske oppløsningen på probeoverflaten, og/eller for øke den statistiske nøyaktigheten til de estimerte bidragene

17 Apparatur i henhold til krav 16, karakterisert ved at sanntidsdata organi senngsmodulen, kan addere et hvilket som helst antall av omkringliggende piksler for å få den virtuelle oppløsningen i overensstemmelse med grovere matriser på probeoverflaten, dvs at i tilfelle hvor en rad legges til vil alle de 8 nabopikslene som omgir den sentrale pikselen bh addert til den sentrale pikselen, og i tilfelle hvor to rader legges til vil alle de 8 pikslene fra den første raden og 16 piksler fra den andre omkringliggende raden bh addert til den sentrale pikselen, osv

18 Apparatur i henhold til krav 10 til 17, karakterisert ved at modulen for presentasjon av den bestemte aktiviteten for hver radioaktive markør på hver testregion på probeoverflaten består av en grafisk presentasjon av dataene i form av et virtuelt kart som representerer probeoverflaten, hvor hver radioaktive kjerne er representert med en bestemt farge, og hvor den bestemte kvantiteten fra hver radioaktive markør på hver testregion av probeoverflaten representeres ved bruk av intensitet på den tilhørende fargen, slik at en fargeskala genereres i det virtuelle kartet av den biologiske matrisen som er direkte sammenlignbare med output fra konvensjonelle fluorescensteknikker

19 Apparatur i henhold til krav 10 til 17, karakterisert ved at modulen for presentasjon av den bestemte aktiviteten fra hver radioaktive kjerne omfatter midler for presentasjon av data i form av histogramkart som avbilder kvantiteten av hver radioaktive kjerne i absolutte kvantiteter for hver testregion på probeoverflaten

20 Apparatur i henhold til krav 10 til 17, karakterisert ved at apparaturen er utstyrt med midler for å bestemme den fysiske utstrekningen i henhold til de absolutt høyeste, absolutt laveste, lengst til venstre og lengst til høyre posisjonene til hver prøvepnkk på den biologiske matrisen ved å addere opp alle bånd fra energibåndbildene til et enkelt summeringsbilde, beregne x-akse og y-akse projeksjonen til summeringsbildet, gjenta prosessen når bildet av den biologiske matrisen roteres med inkrementer på 0 1°, og bestemme den rotasjon som innretter radene av prikker med x-aksen med variansen til y-akse projeksjonene til summenngsbildene, og at projeksjonene brukes til å lokalisere rader og kolonner av prikker i bildet