NO310598B1 - Middel og blanding for anvendelse som medikament, fremgangsmåte for fremstilling av middel, samt antistoffer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et middel for anvendelse som et medikament.

Oppfinnelsen vedrører også en blanding for anvendelse som et medikament.

Oppfinnelsen vedrører også en doseenhet samt en fremgangsmåte for fremstilling derav.

Endelig vedrører oppfinnelsen antistoffer.

Disse og ytterligere trekk ved oppfinnelsen er som beskrevet i patentkravene.

Middelet og blandingen ifølge oppfinnelsen kan anvendes som vaksine eller medikament for den profylaktiske og terapeutiske behandling av fisk, blant annet laks, ørret og karpe i forbindelse med Aeromonas salmonicida (A. salmonicida) infeksjon.

A. salmonicida er et patogen av noe betydning, spesielt innen aktiviteter som fiskeoppdrett, på grunn av at den fører til den systemiske sykdom furunkulose (Herman, R.L. (1968) Fish furunculosis 1952-66, Trans. Amer. Fish. Soc. 97:221-230). Akutte former av denne sykdom er forbundet med rask vekst av organismen i de viktigste kroppsorganer som til slutt fører til sepsis ofte fulgt av alvorlig vevsnekrose. Organismen er særlig kjent for dens virkninger på laksetypene, men kan også infisere en rekke forskjellige fiskearter. Videre har organismen betydelige økonomiske virkninger på grunn av dens evne til å indusere erytrodermatittsykdom i karpe. Intramuskulær injeksjon av så få som hundre virulente celler kan frembringe død innen ni timer, og da asymptomatiske bærere kan dø av fulminant furunkulose dersom de utsettes for omgivelsesmessig stress, er det ønskelig å vaksinere fisk i motsetning til å forsøke legende behandlinger.

Det er kjent at fisk danner antistoffer mot både virulente og ikke-virulente A. salmonicida celler eller deres ekstracellulære produkter (ECP), men det er funnet at direkte produksjon av antistoffer ved tilførsel av disse antigener til sølvlaks gir mindre effektiv beskyttelse enn tilførsel av antiserum fra kanin. Det viser seg at kaniner er mere effektive enn fisk når det gjelder å reagere på beskyttende antigener (Olivier et al. (1985), J. Fish Dis., 8:43-55), men uansett har naturen til disse antigener (immunogener) ennå ikke blitt bestemt.

Videre arbeid har vist at mens størstedelen av formalinbe-handlede A. salmonicida ECP-antigener er immunogeniske i kaniner, var de fleste inkluderende proteasen og hemolysinet ikke påvisbart immunogenisk i regnbueørret (Hastings et al.

(1988), J. Fish. Dis., 11:309-323). Mistanken om at den ekstracellulære proteasekomponent av ECPer er en viktig faktor ved virulens og vekst førte til undersøkelse av disse som mulige spesifikke immunogeniske antigener (Hastings et al. (1988), Aquaculture, 70:207-218). Disse studier viste at det er mulig å tilveiebringe noe beskyttelse ved anvendelse av kaninantiserum som inneholder antistoffer mot nevnte protease, idet antiserum mot stammer som mangler protease har marginal beskyttelseseffekt.

Man har vist at kaninantiserum mot A. salmonicia ikke kan aktivere fiskekomplement i regnbueørret (Sakai et al. (1981), Bull. Jpn. Soc. Sei. Fish., 47:979-991) og det kan derfor ikke drepe bakteriene eller virke som opsoniner, og er anta-gelig kun istand til å nøytralisere de biologiske virkninger av deres toksiner. Beskyttelsenivået og dettes varighet i slik "passivt" immunisert fisk avhenger av i hvilken grad kaninantistoffene kompleksdannes med de bakterielle antigener som er frigjort i fisken. Foreliggende oppfinner og medar-beidere har funnet at kaninantiserum som er monospesifikke overfor ekstracellulær protease ikke gir passiv beskyttelse.

(K.K. Lee-thesis (1990), Aberdeen University - "Studies on the extracellular lethal factors of A. salmonicida in Atlantic salmon").

Noe suksess er oppnådd av forskere som har emulgert en spesi-fikk kromatografisk fraksjon av A. salmonicida ekstracellu-lært produkt i Freunds ufullstendige tilsetningsmiddel og injisert denne intraperitonealt inn i bekkerøye (Cipriano et al. (1985), Can. J. Fish. Aquat. Sei. 42, 1290-1294). Ørret som kun ble injisert med denne fraksjon var imidlertid ikke beskyttet. Videre analyser viser at fraksjonen inneholder lipopolysakkarid (LPS), noe som også organismens endotoksin gjør, og elektroforese viser at fraksjonen og endotoksin omfatter lignende blandinger av proteiner, skjønt ikke-pro-teinmaterial også er tilstede. Det skal bemerkes at det ekstracellulære produkt som her ble anvendt var fra 96 timer gamle kulturer og ble antatt å inneholde store mengder av cellevegg LPS. Disse resultater er overensstemmende med dem som er oppnådd tidligere med preparater av hele bakterie-celler i tilsetningsmiddel/adjuvans (Krantz et al. (1964), Prog. Fish-Cult. 26:3-10).

Foreliggende oppfinner har funnet biologiske og kjemiske forskjeller mellom ekstern LPS (ELPS) definert heri som det oppnådd fra ekstracellulære fluider avledet fra cellefri kultursupernatant, og det oppnådd fra A. salmonicida celleveggfraksjoner (CWLPS). Disse inkluderer forskjeller i hemo-lytisk aktivitet, fettsyremetylester- og sukkersammensetning. Det er videre overraskende bestemt at ELPS fra bakteriekul-turer uten tilsetningsmiddel tilveiebringer relative prosent-vise overlevelsesverdier (RPS) i overkant av 65 % når doser på 100 /zg og større injiseres inn i fisk i et volum på 0,1 ml. Injeksjon av doser på 50 /zg eller mindre beskytter ikke og doser over 50 /zg (500 /zg/ml x 0,1 ml = 50 /xg/fisk) er således bestemt som nødvendige for å tilveiebringe en beskyttende respons. Den optimale dose er omtrent 200 /ig/fisk.

Disse intraperitoneale doser av ekstern LPS (ELPS) som er nødvendige for å indusere beskyttelse er godt over dem som er tilstede i råkulturer og i eksisterende kommersielle vaksiner og den humorale og beskyttende respons er funnet å være dose-avhengig .

Foreliggende oppfinner har tilveiebragt et enda mere effek-tivt vaksinemiddel som ytterligere kan indusere antistoffer som i realiteten dreper A. salmonicida bakterier. Dette er av noe betydning da denne organisme som kjent er resistent overfor serumantistoffdreping. Dette middel omfatter ytre-membranprotein(OMP)komponenter produsert med A. salmonicida dyrket under jernbegrensende betingelser.

Jernbegrensende dyrkingsbetingelser er dem hvor mengden jern som er tilgjengelig for bakteriene i kulturen er mindre enn dem som kreves for normal vekst og kan oppnås ved å ikke inkludere tilstrekkelig jern i mediet eller å inkludere chelatdannende midler deri som reduserer jernets tilgjenge-lighet. Subdyrking av organismer flere ganger i slike medier før produksjon utarmer passende jernlagrene.

Det er kjent at bakterier har et nødvendig behov for jern og at A. salmonicida er typisk i dette henseende. Det er videre blitt vist at A. salmonicida induseres til å danne slike OMPer ved jernbegrensende forhold (Chart og Trust (1983), J. Bacteriol., 156:758-764). Disse jernregulerte OMPer (IROMPer) er blitt karakterisert ved anvendelse av elektroforese og kan isoleres ved hjelp av forskjellige standard teknikker som f.eks. elektroforese og/eller sentrifugering (Aoki og Holland (1985), FEMS Microbiol. Lett. 27:299-305).

Til tross for at deres eksistens og isolasjon er rapportert, er hverken egnetheten av disse eller relaterte OMPer som vaksineaktive komponenter eller deres respektive antistoffer som terapeutiske, baktericide midler for behandling av fisk for furunkuloseinfeksjon blitt foreslått. Der hvor jernregulerte OMPer er blitt fremstilt for vaksine-screeningformål er de ikke blitt vist til å være effektive (Evenburg et al.

(1988), J. Fish Diseases, vol. 11, side 337-349). I denne forbindelse skal det bemerkes at disse OMPer tilsynelatende ikke var dem som er identifisert i den foreliggende søknad da kulturen hvori de ble fremstilt inneholdt hva foreliggende oppfinner har funnet til å være utilstrekkelig jern-chelatdannende forbindelse (10 /zM 2,2 '-dipyridyl) til å fremkalle produksjon av IROMPer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således et middel for anvendelse som et medikament som er kjennetegnet ved at middelet omfatter jern-begrensede ytre-membranproteiner (IROMPer) av Aeromonas salmonicida, som kan oppnås ved å dyrke A. salmonicida organismer ved jernbegrensede betingelser som er ekvivalente med dem som kan oppnås i nærvær av minst 100 /zM 2,2-dipyridyl, men som ikke kan oppnås ved å dyrke organismene under forhold med mye jern.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et middel for anvendelse som et medikament som er kjennetegnet ved at middelet omfatter et eksternt lipopolysakkarid (ELPS) som kan oppnås fra ekstracellulære fluider avledet fra cellefri A. salmonicida kultursupernatant og/eller fra A. salmonicida celleveggfraksjoner, hvor kulturene er kulturer som er mindre enn 96 timer gamle.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en blanding for anvendelse som et medikament som er kjennetegnet ved at den omfatter IROMPer av Aeromonas salmonicida som angitt i det foregående og ELPS av Aeromonas salmonicida som angitt i det foregående.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en doseenhet omfattende et middel som angitt i det foregående som er kjenne-tgnet ved at enheten har et volum og et innhold av IROMPer som er egnet for administrering av minst 2 0 /zg IROMPer til en fisk i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en doseenhet omfattende ELPS som angitt i det foregående som er kjennetegnet ved at enheten har minst 50 /zg ELPS og er av volum egnet for administrering av tilstrekkelig ELPS til en fisk for å fremkalle en immunrespons, uten adjuvans, i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel. Foreliggende oppfinnelse vedrører ogsa en blanding som er kjennetegnet ved at den omfatter ELPS som angitt i det foregående fra supernatantfluidet av en kultur av Aeromonas salmonicida i en konsentrasjon på minst 0,5 mg/ml, men som i alt vesentlig ikke inneholder noe Aeromonas salmonicida cellevegg LPS.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også antistoffer som er kjennetegnet ved at de er produsert mot IROMPer av Aeromonas salmonicida som angitt i det foregående.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en blanding som er kjennetegnet ved at den omfatter antistoffer som angitt i det foregående sammen med en fysiologisk aksepterbar bærer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en blanding som angitt i det foregående som er kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av Aeromonas salmonicida under aerobe betingelser ved konstant pH (f.eks. pH 7,0) i et jernbegrenset dyrkingsmedium i nærvær av minst 100 /zM 2,2-dipyridyl, inaktivering av kulturen etter 24 til 72 timer, sentrifugering av en prøvemengde av inaktivert kultur for å sedimentere celler som uttrykker IROMPer og tilsetning av sedimenterte celler tilbake til et volum av supernatant inntil den ønskede konsentrasjon er oppnådd.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et middel som omfatter jernregulerte ytre-membranproteiner (IROMPer) av A. salmonicida, definert heri som de ytre-membranproteiner (OMP) avledet fra A. salmonicida organismer som er blitt dyrket under jernbegrensede betingelser, men som ikke er funnet når slike organismer dyrkes under forhold med mye jern, som vaksineaktiv komponent eller medikament for profylakse og/eller terapi av sykdom fremkalt med A. salmonicida .

Oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer som er produsert i fisk eller andre dyr mot IROMPer og/eller ELPS, og blandinger inneholdende disse antistoffer, for anvendelse som medikamenter for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling av sykdom fremkalt av A. salmonicida. Disse antistoffer og blandinger per se tilveiebringes i f.eks. en fysiologisk tålbar bærer som en vandig bærer, særlig selve antiserumene og affinitetsrensede antistoffer fra disse antiserumene som er resuspendert i slike vandige bærere.

Det eksterne lipopolysakkarid (ELPS) (som definert heri), oppnådd fra supernatantfluidet av en kultur av A. salmonicid kan anvendes i en mengde som er tilstrekkelig til å fremkalle en immunrespons ved tilførsel til fisk uten adjuvans, som et medikament for den profylaktiske behandling av sykdom fremkalt av A. salmonicida. Dette aspekt er relatert til andre aspekter av oppfinnelsen i den utstrekning at både ELPS og IROMP-komponenter er nødvendige for at medikamentet for profylakse av sykdommer fremkalt av A. salmonicida (dvs A. salmonicida vaksiner) skal være maksimalt effektiv. Det er klart at disse komponenter vil kunne tilføres separat men innen en gitt tidsramme for å oppnå den ønskede maksimale effekt. Da de utgjør en del av den samme oppfinnelsesidé, dvs en vaksine for A. salmonicida, er de her omtalt som separate komponenter innen den samme oppfinnelse.

Oppfinnelsen tilveiebringer også blandinger omfattende nevnte A. salmonicida ELPS i en mengde som er tilstrekkelig for nevnte anvendelse og tilveiebringer ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling derav. Slike blandinger omfatter passende minst 0,5 mg/ml ELPS slik at 0,1 ml av en flytende blanding kan tilveiebringe tilstrekkelig ELPS til å gi en immunrespons. Foretrukne mengder for slike blandinger er 1 mg/ml eller mer, mere foretrukket 2 mg/ml eller mer.

En blanding ifølge oppfinnelsen omfattende både IROMP- og ELPS-komponenter kan anvendes som vaksine.

Det tilveiebringes særlig "doseenheter" av slike blandinger av IROMPer, ELPS og IROMP/ELPS-kombinasjonsblandinger. Uttrykket doseenhet relaterer til formuleringer av blandingene som er egnet for tilførsel til dyr som skal vaksi-neres eller behandles terapeutisk. Som slike doseenheter anvendes særlig ampuller av flytende vaksineblanding, pelleter, tabletter, kapsler, implantater osv som er kjent for å være egnet for tilførsel av midler til fisk. I tilfellet med pelleter kan et stort antall være nødvendig for å tilføre den nødvendige dose, mens flere fisk kan behandles ved intraperitoneal injeksjon med f.eks. 0,1 ml doser fra en enkelt 5 ml ampulle. I denne forbindelse ser man for seg at betegnelsen "antall doseenheter" som anvendt heri kan være mindre enn en. For en 5 ml ampulle kan således en 0,1 ml dose tilføres i 0,02 av en doseenhet. For en 1 fig IROMP-pellet kan imidlertid tyve doseenheter (pelletene) være nødvendig. Det essen-sielle trekk med disse doseenheter er at et fysiologisk tål-bart antall enheter for en enkelt tilførsel bør inneholde nok vaksinekomponent.

IROMP-komponenten kan anvendes i isolert form, men kan passende anvendes i form av en helmembran som en formalibehand-let helmembran eller hel ytre-membranfraksjoner avledet fra en jernbegrenset kultur eller mere passende, formalibehand-lede helceller fra en slik kultur. Det jernbegrensede dyrkingsmedium omfatter ethvert medium som er kjent til å være egnet for vekst eller ernæring av A. salmonicida organismer hvor jernkomponenten er blitt utelatt eller redusert til under nivåer som er nødvendig for normal vekst eller hvortil jernbegrensende midler er blitt tilsatt. Passende jernbegrensende midler er chelatdannende midler som f.eks. EDTA, EDDA og dipyridyl og anvendelse av disse er særlig foretrukket på grunn av deres evne til å utarme interne jernlagre i organismene og således stimulere jernsøkende mekanismer forbundet med IROMP-komponentene. I denne forbindelse skal det bemerkes at 2,2 '-dipyridylnivåer på 10 /zM er utilstrekkelig. 100 mg/ml EDDA eller 100 /zM 2,2 1-dipyridyl er særlig inkludert.

En typisk dyrking av IROMPer gjennomføres fra 24 timer til 72 timer før cellene inaktiveres med formalin eller annen baktericid behandling eller isolering av IROMP-komponenten. Dyrkingen gjennomføres passende ved omtrent omgivelsestemperatur og foretrukket aerobt ved konstant pH.

I en foretrukket prosedyre blir først en subkultur av A. salmonicida dyrket i et jern-chelatdannende middel som inneholder medium i omtrent 24 timer ved omgivelsestemperatur (f.eks. 22°C), foretrukket med rysting, hvoretter den anvendes for å inokulere en fermenteringsbeholder som inneholder det samme vekstmedium hvor bakteriene så dyrkes i omtrent 48 timer (to døgn), igjen ved omgivelsestemperatur under aerobe forhold og ved konstant pH (f.eks. pH 7,0). Kulturen inaktiveres etter 48 timer og en passende konsentrasjon av celler er dannet som bestemt ved måling av mengden av celler som uttrykker IROMPer.

Ved anvendelse av den foretrukne prosedyre som beskrevet over kan en egnet konsentrasjon av celler passende oppnås ved å sentrifugere prøvemengder av den inaktiverte kultur og hvor sedimenterte celler innføres tilbake i et volum av supernatanten inntil den ønskede konsentrasjon er oppnådd. Ved anvendelse av en typisk avirulent A. Salmonicida stamme, er en cellekonsentrasjon mellom IO7 og 10<9>/ml tilstrekkelig til å gi en immunogen respons ved intraperitoneal injeksjon i et volum på 0,1 ml pr. fisk.

Denne foretrukne fremgangsmåte er særlig egnet da den tilveiebringer både IROMP- og ELPS-komponenter i en kultur. Et særlig fordelaktig trekk med denne fremgangsmåte er at ELPS-komponenten i supernatanten ikke nedsettes når de sedimenterte celler tilsettes. Når således begge komponenter er tilstede i den samme kultur på denne måte bør man sikre seg at ELPS-nivået får anledning til å nå den effektive konsentrasjon før dyrkingen stanses. Det er funnet at bruk av 0,1 ml i x IO7 celler/ml supernatant dannet som over er tilstrekkelig til å beskytte fisk ved intraperitoneal (i.p.)injeksjon, skjønt andre volum/fortynningskombinasjoner som gir tilstrekkelig antall celler pr. fisk kan være egnet. I denne forbindelse er det funnet at intraperitoneal tilførsel av 20 Mg/fisk isolert IROMP-komponent som beskrevet heri er tilstrekkelig til å gi baktericide antiserumer. Vaksiner i henhold til oppfinnelsen er imidlertid blitt bestemt som aktive når de tilføres på andre måter, f.eks. ved at fisk nedsenkes

i vaksine eller ved orale tilførselsformer, f.eks. i kapsler.

Det vil være klart at for formålet med behandling av etablert A. salmonicida infeksjon vil IROMP- og/eller ELPS-antistoffer i henhold til oppfinnelsen være mest effektive da de ikke har den medfølgende forsinkelse med hensyn til virkning som bruk av antigen vil ha på grunn av immunresponstid. IROMP-antistoffer har også den fordel at de er baktericide.

Fremstillingen av vaksine/terapeutiske komponenter og vaksiner/terapeutiske blandinger og effektiviteten av blandingene i henhold til oppfinnelsen som medikamenter for profylakse og terapi av furunkulose skal nå beskrives nærmere under henvis-ning til de etterfølgende eksmempler og forsøksresultater.

EKSEMPEL 1: Renset ELPS - Sammenligning med cellevegg LPS

(CWLPS).

Renset ELPS ble fremstilt fra cellefrie ekstracellulære produkter av en stamme av A. salmonicida ved anvendelse av metoden etter Westphal og Jann (Methods in carbohydrate chemistry

(1965) 5, side 83-91), og dets kjemi ble sammenlignet med den for LPS isolert fra A. salmonicida cellevegger (tabell 1).

Vekt%-verdiene som er angitt er omtrentlige og er tilveiebragt for å hjelpe den fagkyndige i å identifisere ELPS-komponenten i kultursupernatanter. For å unngå økning i CWLPS bør relativt nye kulturer anvendes, f.eks. mindre enn 96 timer gamle.

Disse tall tilsvarer ELPS-sukkerkomponenten omfattende 77 % mannose hvor CWLPS har en sukkerkomponentsammensetning på 32,6 % fukose, 32,7 % ribose og 27,8 % glukose, alle i vekt% uten vann. Lipidbestemmelse av begge fraksjoner ga om-trentelige tall på 14,8 vekt% lipid for ELPS og 49,5 vekt% lipid for CWPLS.

Sammenligning av immunogen aktivitet for ELPS med CWLPS. Unglaks ble vaksinert intraperitonealt med 0,1 ml vaksine omfattende 2 mg/ml av enten ELPS (eksempel 1) eller CWLPS i fosfatbufret saltvann. Kontrollfisk mottok 0,1 ml Dulbeccos fosfatbufret saltvann.

Fisken ble holdt ved 14°C i seks uker etter vaksinasjon og en blodprøve ble tatt og serumet ble analysert for antistoffer mot ELPS eller CWLPS. Etter seks uker ble fisken utsatt for en mere virulent heterolog stamme av A. salmonicida og døde-ligheten i hver gruppe ble målt. Den relative prosentandel overlevelse (RPS) ble deretter beregnet (tabell II).

Kontrolldødeligheten var 77 %, p = 0,05 ved students t test.

En forskjellig og overlegen virkning av ELPS i forbindelse med å danne en beskyttende respons i vaksinert fisk ble således klart vist. Kryssabsorpsjonsstudier på antiserumene dannet ved vaksinasjon med hver av de to LPSer viser en for-skjell i epitopisk struktur hos disse antigener.

EKSEMPEL 2: IROMPer av A. salmonicida.

IROMPer ble fremstilt ved å høste celler fra en 500 ml Trypton soyabuljong (TSB)/100 tiM 2, 2 ■-dipyridyl A. salmonicida kultur ved sentrifugering (8.000 g i 30 minutter ved 4°C) , cellene ble vasket med 20 ttiM Tris (hydroksymetyl) metyl-amin (TrisHCl, pH 7,2), resuspendert i 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 7,2), inneholdende 0,1 fig DNase og 0,1 fig RNase pr. ml og f enylmetylsulfonylf luorid (PMSF, 50 /xgml"1) , og behan-dlet med ultralyd på is (6 x 30 s). Hele celler og rester ble fjernet ved sentrifugering (20.000 g i 20 minutter ved 4°C). Indre membraner ble oppløseliggjort ved tilsetning av Sarkosyl (natrium N-laurylsarkosinat) til 1,5 % (volum/volum) og inkubert i 30 minutter ved 22°C. Sarkosyluoppløselig IROMPer ble samlet ved sentrifugering ved 100.000 g i en time ved 4°C, vasket og suspendert i 20 mM Tris-HCl og lagret ved -20°C.

De IROMP-inneholdende dannede fraksjoner ble analysert ved metoden etter Bradford (Analytical Biochem. (1976) 72, 248-2 54) ved anvendelse av fenolsvovelsyremetode/glukosestandard etter Dubois (Analytical Chem, (1956) 28, 350-356) for karbo-hydratbestemmelse, flere LPS-tester og tiobarbiturat 2-keto-3-deoksyoktonat (KDO) testen.

Alle bekreftet deres status som OMPer. Ved konsentrasjonen på 2 00 /xg/ml IROMPer ble store mengder LPS og karbohydrat påvist skjønt (virulente) stammer med A-lag hadde mindre på grunn av det ytterligere protein. (Se tabell III). Prot-einkonsentrasjonen ble standardisert i hvert tilfelle før beregning av andre variabler.

Sammenligning av IROMPer fra forskjellige stammer av

A. salmonicida.

For å bestemme virkningen av jernbegrensning på OMPer av

A. salmonicida generelt ble 18 typiske stammer og to atypiske stammer dyrket på TSB inneholdende EDDA (100 mg/ml), og dannede OMPer ble sammenlignet ved hjelp av SDS-PAGE med dem fra organismer dyrket i TSB alene og TSB/EDDA pluss FeCl3

(0,54 mM). Dyrking under betingelser med jernbegrensning resulterte i ekspresjon av fire nye OMPer (IROMPer) med tilsynelatende molekylvekt 82, 77, 72 og 70 kDa som ikke var tilstede i kulturer av de stammer som var dyrket under betingelser med jernanrikning (TSB eller TSB+EDDA+FeCl3).

Dyrking av A. salmonicida ble gjennomført under varierende betingelser for å undersøke om ufordelaktige temperaturer eller oksygeneringsnivåer ikke induserer produksjon av IROMPer under betingelser med jernanrikning. Anvendelse av 15°C, 22°C og anaerobe betingelser resulterte i seg selv ikke i ekspresjon av IROMPer. Anvendelse av 2,2<1->dipyridyl (100 txM) i stedet for EDDA dannet imidlertid identiske IROMPer, men i kvantitativt større mengder, noe som indikerer at denne chelatdanner er foretrukket. Det ble gjennomført studier på IROMP-kryssreaktivitet med lakseantiserum og monospesifikt kanin anti-IROMP-antiserum dannet mot IROMPer fra en enkelt stamme og alle viste farging ved anvendelse av Western blotting teknikker.

SDS-PAGE analyse av OMP-vaksiner indikerer at den eneste for-skjell mellom jernanriket og jernbegrenset OMP-fraksjon er tilstedeværelsen av 82, 77, 72 og 70 kDA IROMPer.

EKSEMPEL 3:IROMP-antistoffer/blandinger - passiv immunisering.

Et lakseantiserum dannet mot en blanding av IROMPer fra to typiske A. salmonicida stammer dyrket under jernbegrensende forhold og vist til å inneholde antistoffer rettet mot IROMPer ved anvendelse av Western blotting teknikker ble anvendt for passivt å immunisere atlanterhavslaks mot bad-challenge-eksponering overfor en virulent stamme hvorpå en RPS på 77 % var produsert.

For å sikre at IROMPer var ansvarlig for det ovennevnte ble RPS-monospesifikt anti-IROMP antiserum fremstilt i kanin mot gelisolerte IROMPer av den typiske stamme også evaluert for evnen til passivt å immunisere mot en heterolog badekspone-ring hvorpå 55 % RPS var oppnådd. Affinitetsrenset IgG fra kaninantiserum ga videre en RPS på 83 %.

EKSEMPEL 4: Baktericid aktivitet av iramunserum.

Antiserum ble dannet ved å injisere laks intraperitonealt med en blanding av like mengder IROMPer av to typiske A. salmonicida dyrket under jernbegrensende forhold i kombinasjon med Freunds fullstendige tilsetningsmiddel. Tre typiske stammer og en atypisk stamme av A. salmonocida ble anvendt for å bestemme deres evne til vekst in vitro i varmeinaktivert normalt fiskeserum. Alle stammer som ble undersøkt viste seg i stand til å kunne dette. En avirulent stamme som kunne produsere IROMPer (som alle stammer som til nå er testet) var ikke i stand til å vokse i slikt serum når komplement var tilstede skjønt de virulente stammmer var i stand til dette.

I motsetning til dette ble laks anti-IROMP serum pluss komplement funnet til å være baktericid idet 45 til 84 % organismer ble drept i den tilmålte tidsperiode for forsøket. Når komplementkilden ble varmeinaktivert ble den baktericide aktivitet redusert til 15 til 2 0 % drepte organismer. Selek-tiv absorpsjon av antistoffene viste at den baktericide aktivitet lå fullstendig hos IROMPene. Lignende absorpsjon med kaninantiserum bekreftet også dette og kaninantiserum pluss komplement var baktericid for 63 til 85 % organismer i motsetning til 15 til 60 % med varmebehandlet komplement.

EKSEMPEL 5: Aktiv immuniser ing av laks med isolerte IROMPer. Atlanterhavsunglaks (omtrent 8 til 10 g) ble holdt i tanker med ferskvann med tilførsel av friskt oppvarmet rennende vann som ble tilført fra en lokal innsjø og oppvarmet til 14°C. Fisk ble bedøvet med etyl p-aminobenzoat under immunisering og hver ble injisert intraperitonealt med 0,1 ml PBS inneholdende 2 0 /zg IROMPer som dannet i det foregående. 42 dager etter immunisering ble fisk underkastet en 24 timers badek-sponering for omtrent 1 x IO<5> cfu av en virulent stamme av A. salmonicida og dødelighet ble målt daglig. RPS-verdier på 36,9 % (heterolog eksponering) og 55 % (homolog eksponering) til 100 % ble oppnådd sammenlignet med kontroller eksponert for A. salmonicida stammer.

EKSEMPEL 6: Antiserum med fisk og ikke-fisk opprinnelse

produsert fra IROMPer.

Atlanterhavsunglaks (omtrent 8 til 10 g) ble holdt i tanker med ferskvann som fikk tilført friskt rennenede vann ved 18°C og ble immunisert intraperitonealt med 100 /il laks anti-IROMP serum, kanin anti-IROMP serum eller 50 fil affinitetskolonne-renset kanin anti-IROMP IgG, idet de to sistnevnte inkluderer normalt kaninserum (SAPU) som en komplementkilde. IgG ble renset på en Immunopure A/G kolonne. 42 dager etter immunisering ble fiskene underkastet en 24 timers badchallenge-eksponering av omtrent 1 x IO<5> cfu av en virulent stamme av A. salmonicida og dødeligheten ble målt daglig. Infeksjon med organisme ble bekreftet i form av dødeligheter ved hjelp av standard metoder (tabell V).

ESKEMPEL 7: Kombinert IROMP- og ELPS-vaksine.

Prøver av en A. salmonicida stamme uten A-lag lagret i behol-dere nedsenket i flytende nitrogen inneholdende Trypton soyabuljong (TSB) og glyserol ble påført på Trypton soyaagar (TSB pluss 1,5 % vekt/volum agar (TSA) Oksoid Ltd.) inneholdende enten 100 mg/l etylendiamin-di-(o-hydroksyfenyleddiksyre)

(EDDA) eller 100 /zM 2,2-dipyridyl (Sigma) for å begrense til-gjengeligheten av jern ved blant annet å redusere indre jernlagre .

En subkultur av den ovennevnte behandlede organisme ble dyrket i 24 timer ved 22°C i 100 ml TSB inneholdende den samme konsentrasjon EDDA eller 2,2-dipyridyl som over, og mediet ble rystet i denne periode. Subkulturen ble anvendt for ytterligere inokulering av et slikt vekstmedium i en fermenteringsbeholder som deretter ble dyrket i 48 timer ved 22°C under aerobe forhold ved en konstant pH på 7,0 ved anvendelse av 2M H3P04 og 2M NaOH som titreringsmidler. Den oppnådde kultur ble inaktivert ved tilsetning av 0,5 % formalin (40 % formaldehyd i vann).

Analyser viser at IROMP-komponenten inneholdt minst fire ytterligere ytre-membranproteiner i forhold til dem dannet under betingelser med tilstrekkelig jern. Antallet celler pr. ml dyrkingsmedium ble innstilt til 1 x IO<8> ved sentrifugering av kulturen og med tilbakeføring av celler inn i supernatanten, idet man således opprettholder ønskede celle-og ELPS-nivåer og med tilveiebringelse av en kombinasjonsvaksine. Skjønt denne metode er eksemplifisert med en ikke-virulent stamme uten A-lag kan den likeledes anvendes for produksjon av IROMPer fra virulente stammer med A-lag.

Effektivitetsstudier: En rekke konsentrasjoner av ELPS, inaktiverte IROMP-induserte celler og kombinasjoner av disse to ble injisert intraperitonealt inn i fisk i 0,1 ml volum-deler, og fisken ble eksponert for A. salmonicida og relativ prosentandel overlevelse ble bestemt. Resultatene av denne undersøkelse er gitt i den etterfølgende tabell VI.

Bemerk: Konsentradjonen av ELPS og IROMPer i vaksineløsning (kultursupernatanten i tilfellet med ELPS og IROMP-celler/- ELPS) er ti ganger den i dosen pr. fisk. I alle tilfeller gis vaksineløsningen som 0,1 ml pr. fisk.

Fra de ovennevnte resultater fra ELPS alene ser man at dosen som er nødvendig for å indusere beskyttelse er godt over den som er tilstede i råkultursupernatanter og eksisterende kommersielle vaksiner. Det er viktig at ELPS heller enn celle-veggavledet LPS anvendes idet den sistnevnte er forbundet med postulert lysisprodukt i eldre kulturer. For å sikre at ELPS anvendes anbefales det at kulturer som er mindre enn 96 timer gamle anvendes. Som angitt over tilveiebringer IROMP-celle-komponenten en baktericid immunogen respons så vel som en beskyttende respons. I dette forsøk ga ingen av komponentene fullstendig beskyttelse alene, men en kombinasjonsvaksine er vist til å gi 100 % RPS. Det er imidlertid vist (se IROMP-eksempler i det foregående) at i bestemte immuniseringskom-binasjoner av stamme/challenge-stamme kan 100 % RPS oppnås med IROMPer alene.

Temperaturvirkninger.

Anvendelsetemperaturen for de "aktive" IROMP-vaksiner i henhold til oppfinnelsen er kritisk. Vaksinasjon ved 4,5 og

6,5°C ble vist til å gi en mye saktere immunrespons enn vaksinasjon ved f.eks. 11 til 14°C i studier som ble gjennomført ved metodene anvendt i det foregående. Mens vaksinasjon ved

Claims (29)

1. disse lavere temperaturer i det minste vil ha noen grad av vellykkethet kan det ikke sikres at antistofftitrene vil være høye nok til å motstå en challenge inntil noe tid etter at omgivelsestemperaturen er blitt økt. Det er således en for-nuftig forholdsregel at oppvarmet vann anvendes under vaks-inasjonsprosessen eller at et ytterligere middel, f.eks. hjelpestoff, anvendes der lav temperatur er et problem. PATENTKRAV 1. Middel for anvendelse som et medikament,karakterisert ved at middelet omfatter jern-begrensede ytre-membranproteiner (IROMPer) av Aeromonas salmonicida, som kan oppnås ved å dyrke A. salmonicida organismer ved jernbegrensede betingelser som er ekvivalente med dem som kan oppnås i nærvær av minst 100 fiM 2,2-dipyridy-1, men som ikke kan oppnås ved å dyrke organismene under forhold med mye jern.
2. 2 . Middel som angitt i krav 1 eller blanding fremstilt derfra,karakterisert ved at middelet omfatter 82, 77, 72 og/eller 70 kDa IROMPer som kan avledes ved SDS-PAGE rensing.
3. 3. Middel for anvendelse som et medikament,karakterisert ved at middelet omfatter et eksternt lipopolysakkarid (ELPS) som kan oppnås fra ekstracellulære fluider avledet fra cellefri A. salmonicida kultursupernatant og/eller fra A. salmonicida celleveggfraksjoner, hvor kulturene er kulturer som er mindre enn 96 timer gamle.
4. 4. Blanding for anvendelse som et medikament, karakterisert ved at den omfatter IROMPer av Aeromonas salmonicida som angitt i krav 1 og ELPS av Aeromonas salmonicida som angitt i krav 3.
5. 5. Middel som angitt i krav 1,

   karakterisert ved at det omfatter IROMPer av Aeromonas salmonicida som angitt i krav l i en form som er egnet for administrering til et dyrelegeme for det formål å produsere antistoffer mot de nevnte IROMPer uten å bevirke infeksjon i denne organisme.
6. 6. Middel som angitt i krav 5,

   karakterisert ved at IROMPene er i form av isolerte IROMPer sammen med en fysiologisk aksepterbar bærer.
7. 7. Middel som angitt i krav 5,karakterisert ved at IROMPene er i form av inaktivert helcellemembranfraksjon, inaktivert helcelle-ytre-membranfraksjon eller inaktiverte helceller.
8. 8. Middel som angitt i krav 7,karakterisert ved at de inaktiverte fraksjoner eller celler er fraksjoner eller celler som er forma-linbehandlet.
9. 9. Doseenhet omfattende et middel som angitt i ett eller flere av kravene 5-8,karakterisert ved at enheten har et volum og et innhold av IROMPer som er egnet for administrering av minst 2 0 /zg IROMPer til en fisk i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.
10. 10. Doseenhet som angitt i krav 9,karakterisert ved at enheten har et innhold av IROMPer i form av inaktiverte helceller hvor enhetsvolumet og antallet celler er egnet for administrering av fra IO6 til IO<8> celler til en fisk i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.
11. 11. Doseenhet omfattende ELPS som angitt i krav 3 av Aeromonas salmonicida,karakterisert ved at enheten har minst 50 /zg ELPS og er av volum egnet for administrering av tilstrekkelig ELPS til en fisk for å fremkalle en immunrespons, uten adjuvans, i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.
12. 12. Doseenhet som angitt i krav 11,karakterisert ved at ELPS-innholdet er tilstrekkelig til å gi minst 100 iig ELPS til en fisk i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.
13. 13 . Doseenhet som angitt i krav 12,karakterisert ved at ELPS-innholdet er tilstrekkelig til å gi minst 200 txg ELPS til en fisk i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.
14. 14. Doseenhet som angitt i krav 9 eller 10, karakterisert ved at den ytterligere omfatter ELPS som angitt i krav 3 av Aeromonas salmonicida i en mengde som er tilstrekkelig til å fremkalle en immunrespons ved administrering til en fisk, uten adjuvans, i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.
15. 15. Doseenhet som angitt i krav 14,karakterisert ved at den har et tilstrekkelig ELPS-innhold til å gi mer enn 50 iig ELPS til en fisk i et fysiologisk aksepterbart antall enheter i en enkel tilførsel.
16. 16. Blanding,karakterisert ved at den omfatter ELPS som angitt i krav 3 fra supernatantfluidet av en kultur av Aeromonas salmonicida i en konsentrasjon på minst 0,5 mg/ml, men som i alt vesentlig ikke inneholder noe Aeromonas salmonicida cellevegg LPS.
17. 17. Blanding som angitt i krav 16,karakterisert ved at kulturen er 72 timer gammel eller mindre.
18. 18. Blanding som angitt i krav 17,karakterisert ved at kulturen er omtrent 2 døgn gammel.
19. 19. Blanding som angitt i krav 18,karakterisert ved at blandingen er i flytende form og ELPS er i en konsentrasjon på minst 1000 M<g>/ml.
20. 20. Blanding som angitt i krav 19,karakterisert ved at ELPS er i en konsentrasjon på minst 2000 izg/ml.
21. 21. Blanding som angitt i ett eller flere av kravene 16 til 20,karakterisert ved at den ytterligere omfatter IROMPer av Aeromonas salmonicida som angitt i krav 1 i en form som er egnet for administrering til et dyrelegeme for det formål å fremkalle antistoffer mot de nevnte IROMPer uten at det oppnås en Aeromonas salmonicida infeksjon.
22. 22. Blanding som angitt i krav 21,karakterisert ved at blandingen som angitt i krav 16 til 20 og formen av IROMPer er blitt avledet fra den samme kultur eller kulturer dannet under i alt vesentlig de samme betingelser, og bearbeidet for å oppnå separate ELPS og IROMP komponenter.
23. 23. Antistoffer,karakterisert ved at de er produsert mot IROMPer av Aeromonas salmonicida som angitt i krav 1.
24. 24. Antistoffer som angitt i krav 23,karakterisert ved at de er i en celle-eller serumfri form.
25. 25. Blanding,karakterisert ved at den omfatter antistoffer som angitt i ett eller flere av kravene 23 og 24 sammen med en fysiologisk aksepterbar bærer.
26. 26. Blanding som angitt i krav 25,karakterisert ved at den videre omfatter komplement fra dyret hvori antistoffene ble produsert.
27. 27. Blanding som angitt i ett eller flere av kravene 2 5 og 26,karakterisert ved at den omfatter antistoffer avledet fra en kanin.
28. 28. Fremgangsmåte for fremstilling av en blanding som angitt i krav 22,karakterisert ved at den omfatter dyrking av Aeromonas salmonicida under aerobe betingelser ved konstant pH (f.eks. pH 7,0) i et jernbegrenset dyrkingsmedium i nærvær av minst 100 /zM 2,2-dipyridyl, inaktivering av kulturen etter 24 til 72 timer, sentrifugering av en prøvemengde av inaktivert kultur for å sedimentere celler som uttrykker IROMPer og tilsetning av sedimenterte celler tilbake til et volum av supernatant inntil den ønskede konsentrasjon er oppnådd.
29. 29. Fremgangsmåte som angitt i krav 28,karakterisert ved at den dyrkede Aeromonas salmonicida stammen er en stamme som mangler A-lag og at cellene tilsettes tilbake inntil oppnåelse av en konsentrasjon på fra 10<7> til 10<9>/ml.