NO309601B1 - Fremgangsmåte for syntese av deoksypyridinolin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av deoksypyridinolin.

Kollagen er tilstede i forskjellige former i alt vev. Det er nå akseptert at kollagen har form av aminosyrekjeder tverrbundet med pyridinium tverrbindinger. Pyridinium tverrbindinger blir dannet fra tre hydroksylysinresidier, to av disse er fra de terminale (ikke heliske) peptidene av kollagenmolekylet som blir enzymatisk omdannet til aldehyder før reaksjon og et tredje hydroksylysin i den heliske delen av et nabokollagenmolekyl. To pyridinium tverrbindinger, pyridinolin (PYD) og deoksypyridinolin (DPD) har blitt identifisert. Det har fra litteraturen blitt beskrevet teknikker for å måle pyridinolin i urin ved anvendelse av enzymmerket anti-PYD for å danne et pyridinolin-enzymmerket kompleks som kan bli påvist ved hjelp av en enzym-bundet immunosorbant analyse. Selv om analysen av PYD er nyttig som en måte å screene for osteoporose og rheumatoid artritt, kan dens tilstedeværelse i bindevev, såvel som i ben forårsake skjeve resultater for diagnose av osteoporose eller bennedbrytning. Immunoanalyser for deoksypyridinolin (DPD) som således bare blir funnet i ben, har vært foretrukket i forhold til de for PYD for tidlig påvirkning av bennedbrytning.

Testing for DPD kan bli gjennomført ved å bringe en fluidtestprøve, f. eks. urin i kontakt med et merket antistoff spesifikk for DPD. En spesielt hensiktsmessig metode for DPD-analyse involverer anvendelse av en teststrimmel av typen som er vist i fig. 1. Ved å referere til fig. 1 har stripe 10 et merket anti-DPD antistoffkompleks (typisk med gull sol som merkingsmateriale for å skaffe tilveie et gull sol-DPD antistoffkompleks) som binder med DPD i fluidtestprøven som blir påført påføringssone 12 av strimmel 10 og som beveger seg gjennom første oppfangingssone 14 og andre oppfangingssone 16.1 første oppfangingssone 14 er det immobilisert DPD som oppfanger ubundet, merket anti-DPD. Det merkede antistoff som ikke ble oppfanget i første oppfangingssone fordi det er kombinert med DPD i fluidtestprøven, blir oppfanget i andre oppfangingssone 16 ved hjelp av anti-DPD antistoffer som blir immobilisert i denne sonen. DPD-konsentrasjon i testprøven kan bli bestemt ved spektrofotometrisk måling av mengden v merket DPD oppfanget i første oppfangingssone 14, eller mer nøyaktig ved anvendelse av en algoritmisk behandling av reflektansmålinger fra sonene 14 og 16.

Den første oppfangingssonen 12 krever immobilisert DPD med hvilken det merkede anti-DPD ikke har reagert med DPD i fluidprøven, og kan kombinere for å bli immobilisert i denne oppfangingssonen. Denne type av en-gangs testsystem krever bruk av betydelige mengder DPD, som når det ble oppnådd fra dyreben, er relativt kostbar. Kostnaden involvert med kopling av naturlig DPD har ført til forsøk å syntetisere dette materialet og derved redusere kostnader ved diagnostiske teststrimler som benytter DPD i DPD-deteksj onssystemer.

En metode for syntese av DPD så vel som PYD og derivater av disse er beskrevet i publisert EP-patentsøknad 0 556 152 Ai. I denne fremgangsmåten blir en forbindelse med formel:

er reagert med en R-gruppe som er definert som X5-CH2-CHXi-Z-R3 hvori R, X, Y og Z grupper blir valgt for å skaffe tilvie DPD, PYD eller forskjellige derivater av disse. I hvert tilfelle blir pyridinringen dannet før tilsetning av sidekjeden til nitrogenatomet. I fremgangsmåte for fremstilling av DPD fra foreliggende oppfinnelse er færre trinn involvert fordi det ikke er nødvendig å separat fremstille X5-CH2-CHX1-Z-R3 for dermed å skaffe tilveie en mindre arbeidsintensiv metode.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av deoksypyridinolin, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved de trekk som fremgår fra medfølgende krav 1.

Fordelaktige og foretrukne trekk ved denne fremgangsmåten fremgår fra medfølgende krav 2-9.

Syntese av DPD ifølge foreliggende oppfinnelse involverer trinnene med:

a) reagering av en Na-beskyttet-O-beskyttet lysin (forbindelse 1, skjema 1) med minst to ekvivalenter av 5,6-epoksy-2-N-beskyttet-0-beskyttet(2S)-2-aminoheksanoat (forbindelse 5, skjema 1) i et passende oppløsningsmiddel for å produsere tilsvarende aminodiol (forbindelse 6, skjema 1). Egnede oppløsningsmidler omfatter acetonitril, metanol og vann/alkohol. I skjema 1 er det vist litiumperklorat som et additiv som blir tilveiebrakt med det formål å katalysere reaksjonen. To ekvivalenter av epoksid pr. ekvivalent av aminoheksanoat er nødvendig fordi dialkylering er den nødvendige prosessen. b) Aminodiol 6 ble deretter oksidert med et egnet oksidasjonsmiddel, slik som oksalylklorid-DMSO i et egnet oppløsningsmiddel som metylenklorid for å skaffe tilveie tilsvarende aminodiketon (forbindelse 7, skjema 1). Egnede oksidasjonsmidler som er forskjellig fra oksalylklorid-DMSO innbefatter tionylkloird-DMSO, trifluoreddikanhydrid-DMSO og eddikanhydrid-DMSO. Passende oppløsningsmidler som er forskjellig fra metylenklorid innbefatter dietyleter, tetrahydrofuran og kloroform. c) Aminodiketon fra trinn (b) blir videre reagert med en base som natriumhydroksid i alkohol eller tertiært amin, f. eks. trietylamin for å produsere 3-hydroksydihydropyridin som blir kombinert med et oksidasjonsmiddel slik som basen (DBN) i nærvær av O2 i et egnet oppløsningsmiddel som metylenklorid for å danne 3-hydroksypyridinringen for å skaffe tilveie pyridiniumprodukt 8 i skjema 1. Andre passende oksidasjonsmidler innbefatter dicyanodiklorkinon (DDQ), brom eller Mn02 mens reaksjonen kan bli gjennomført i andre oppløsningsmidler som metylenklorid, eddiksyre eller metanol. Produkt 8 blir avbeskyttet for å skaffe tilveie deoksypyirdinolin.

Foreliggende oppfinnelse blir videre illustrert ved hjelp av følgende eksempel.

EKSEMPEL

A. Fremstilling av Na-CBZ-O-t-butyl L-lysin (1)

En blanding av 25 g Na-CBZ-L-lysin fra Sigma, der CBZ er benzyloksykarbonyl, ble 250 ml t-butylacetat og 14 ml 70% perklorsyre kraftig blandet inntil alle faste stoffer av oppløst. Etter omrøring over natten ble 375 ml etylacetat tilsatt fulgt av 250 ml vann. pH i det vandige laget ble hevet til 5,5 med 20% NaOH hvorved den organiske fasen ble separert. Den vandige fasen ble ekstrahert med etylacetatoppløsning og pH igjen hevet til 10,5 hvorved den ble igjen ekstrahert med 200 ml fersk etylacetat. De organiske ekstraktene ble kombinert, vasket med mettet saltvann, tørket over Na2S04 og konsentrert. Resten ble tørket over natten over høyvakuum for å gi 23,2 g av et fargeløst, viskøst materiale.

<1>HNMR (60 Mhz, CDC13) 5: 7,35 (s, 5H), 5,1 (s, 2H), 4,2 (m, 1H), 3, l(m, 2H), 1,4 (s, 9H), 2,1-1,4 (m,4H).

B. Ne -dimetylamino-Na-CBZ-O-t-butyl-L-lysin (2)

En blanding bestående av 3,7 (27,2 mmol) av ZnCl2, 3,2 g (53 mmol) av NaCNBH3 og 60 ml metanol ble fremstilt og dette ble tilsatt en oppløsning av 18 g (51,7 mmol) av amin 1 i 180 ml metanol. Etter avkjøling til 10-15°C ble 12,4 ml 37% formaldehyd dråpevis tilsatt over en 2-3 minutters periode. Reaksjonen ble omrørt i 1 time og overvåket ved silikagel TLC med eluering ved å anvende en 60:10:1 (v/v/v/) blanding av kloroform/metanol/konsentrert ammoniakk (oppløsningsmiddel A). Et hundrede milliliter vann ble tilsatt og blandingen konsentrert til volum på 200 ml. Etylacetat (200 ml) ble tilsatt og pH hevet til 10,5 med 10% NaOH. Etylacetat ble separert og pH i den vandige fasen justert på nytt til 10,5 og ekstrahert med 200 ml fersk etylacetat. Etylacetatekstraktet ble kombinert, vasket med NaCl, tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert for å gi, etter tørking over natten under høyvakuum, 14,86 g av viskøs olje.

<1>HNMR (300 Mhz, deDMSO) 8: 7,56 (d, 1H), 7,35 (s, 5H), 5,05 (s, 2H), 3,85 (m, 1H), 2,15 (t, 2H), 2,08 (s, 6H), 1,60 (d avt, 2H), 1,40 (s, 9H), 1,35 (m, 4H).

C. Ne -dimetylamino-Na-CBZ-O-t-butyl-L-lysin-N-oksid (3)

En blanding bestående av 25,3 g dimetylamin 2, 7,9 ml 30% hydrogenperoksid og 150 ml metanol ble omrørt i 5 timer og etter dette ble ytterligere 7,9 g 30% hydrogenperoksid tilsatt. Reaksjonen fikk anledning til å omrøre i 48 timer og overvåket ved silikagel TLC, eluert med oppløsningsmiddel A. En 1 ml vandig slurry av tilnærmet 5 mg platina svart ble tilsatt hvorved reaksjonen ble omrørt i 7 timer og ytterligere en slurry av 5-10 mg svart platina ble tilsatt. Blandingen ble omrørt over natten og overvåket for peroksider ved å anvende peroksidtestpapir med oppvarming til 60°C for å fjerne peroksider når det var nødvendig. Med en gang reaksjonen testet negativt for peroksidet, ble blandingen filtrert og konsentrert. Resten ble oppløst i 300 ml EtOAc, tørket over Na2S04, filtrert, konsentrert og kromatografert på 400 g silikagel, eluert med oppløsningsmiddel A for å fremstille 13 g av produkt som en fargeløs olje.

'HNMR (300 Mhz, dgDMSO) 8: 7,78 (d, 1H), 7,37 (s, 5H), 5,05 (s, 2H), 2,88 (m, 1H), 3,05 (t, 2H), 2,95 (s, 6H), 1,70 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,32 (m, 2H).

Syntese av denne Na-beskyttede-O-beskyttede lysin er kjent fra litteraturen (Scott et al., Commun., 1981, 11(4), 303-314.

D. N-CBZ-2-amino-5-heksenoat-5-t-butylester (4)

En oppløsning av 14,8 g N-oksid 3 i 250 ml DMSO ble oppvarmet til 125°C i 2 timer mens man skylte med argon. DMSO ble destillert ved 70°C under vakuum. Kromatografi av resten på 450 ml silikagel, eluert med 20:80 (v/v) EtOAc/heksan, produserte produktet i fraksjoner 70-120 (18 ml fraksjoner). Disse ble kombinert og konsentrert og ga 3,15 g av produktet som en fargeløs olje.

<1>HNMR (300 Mhz, d6DMSO) 8: 7,62 (d, 1H), 7,35 (s, 5H), 5,78 (m, 1H), 5,08 (dd, 2H), 4,98 (m, 2H), 3,86 (m, 1H), 2,08 (dt, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 1,35 (m, 2H).

E. N-CBZ-2-amino-5,6-epoksy-heksanoat-5-t-butylester (5)

kfr. forbindelse 4 (trinn D)

85% m-klorperbenzosyre (mCpBA) fra Aldrich Chemical Co. ble renset ved oppløsning i metylenklorid og vasking med pH 7,5 buffer. Det organiske laget ble separert, tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert. Det faste stoffet ble tørket over natten under høyvakuum og oppbevart ved 3°C.

En blanding av 3,15 g heksanoat 4 (9,75 mmol) og 1,76 g mCpBA, (10,2 mmol) i 25 ml metylenklorid ble omrørt i 48 timer ved romtemperatur. Reaksjonen ble fortynnet med 125 ml EtOAc og vasket to ganger med 5% NaOH og deretter saltvann. Etter tørking og Na2S04, ble reaksjonen filtrert og konsentrert for å gi 2,9 g av produktet som en fargeløs olje.

<1>HNMR (300 Mhz, d6DMSO) 6: 7,35 (s, 5H), 5,05 (s, 2H), 3,90 (m, 1H), 2,65 (m, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 1,8-1,5 (s, 2H), 1,40 (s, 9H), 1,35 (m, 2H).

MS(FAB):358 (m+ + Na<+>)

F. 2,12-benzyloksykarbonylamino-7-(5-benzyloksykarbonylamino-5-t-butoksykarbonyl-pentyl)aza-1,13 -di-t-butyl-5,9-dihydroksy-tridecanodiat (6)

Epoksid 5 (1,68 g, 5,01 mmol) ble oppløst i 1,5 ml tørr acetonitril etter dette ble 0,53 g (5,01 mmol) av vannfri LiC104 tilsatt. Når det faste stoffet ble oppløst ble 0,8 g (23 mmol) av amin 1 i 1,5 ml acetonitril tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 50°C over natten og deretter konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert på 150 g silikagel, eluert med 7:1 (v/v) kloroform/oppløsningsmiddel A for å produsere 1 g aminodiol 6 og 0,5 g utvunnet epoksid. Diolen ble oppløst i en kjent mengde metylenklorid og lagret over 3Å molekylsikter for senere bruk.

MS(FAB) : 1007 (M<+>)

G. 3-hydroksy-l-(5-benzyloksyk^

benzyloksykarbonylarmno-2-t-buto 3 -t-butoksykarbonyl-propyl)-pyirdiniumsalt (8)

Til 1 ml metylenklorid ble det tilsatt 0,6 ml 2M (1,2 mmol) oksalylklorid i metylenklorid og blandingen avkjølt til -55°C. Dimetylsulfoksid (DMSO) (78 uL, 1,1 mmol) i 0,25 ml metylenklorid ble deretter tilsatt dråpevis. Etter 15 minutter ble 400 mg av diol 6 i 1 ml metylenklorid dråpevis tilsatt. Blandingen ble oppvarmet til -30°C under omrøring i 20 minutter og reaksjonen ble deretter avkjølt tilbake til -55°C hvorved 0,26 g (2,6 mmol) trietylamin ble tilsatt. Reaksjonen fikk anledning til å oppvarmes til romtemperatur og ble deretter fortynnet med 25 ml EtOAc, vasket med 5% NaOH etterfulgt av saltvann og tørket over Na2S04. Etter filtrering ble oppløsningen konsentrert for å gi 0,39 g av 2,12-benzyloksykarbonylamino-7-(5-benzyloksykarbonylamino-5-t-butoksykarbonyl-pentyl)aza-l,13-di-t-butyl-5,9-diokso-tridekanodiat 7 som ikke ble karakterisert på grunn av dens ustabilitet. Resten ble oppløst i 4 ml metylenklorid 0,25 g diazabicyklo[4.3.0.]non-5-ene (DBN) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt over natten beskyttet av et tørkerør. Eddiksyre (100 uL) ble tilsatt og oppløsningsmidlet inndampet. Resten ble kromatografert på 100 g silikagel eluert med 20:1:0,5 kloroform/metanol/eddiksyre. Fraksjoner 11-14 (18 ml fraksjoner) inneholdt 0,26 g pyridiniumprodukt 8.

H. Deoksypyirdinolin (DPD)

En blanding av 160 mg pyridiniumacetat 8 og 1 ml HBr i HO Ac ble omrørt i 30 minutter og deretter ble ytterligere 1 ml HBr/HOAc tilsatt. Etter 1 time ble oppløsningsmidlet fjernet og resten oppløst i 50 ml av en 4:1:1 (v/v/v) blanding n-butanol/vann/HOAc (oppløsningsmiddel B) og etter dette ble 5 g fibrøs cellulose tilsatt. Suspensjonen sto i 30 minutter og ble filtrert etterfulgt av tilsetning av 3 ytterligere gram cellulose til filtrat og ytterligere filtrering etter 2 timer. De to fase cellulosestoffene ble kombinert og oppslemmet i 50 ml vann og filtrert etter 30 minutter. En prøve ble fjernet hvis absorbans i pH 8 buffer ved 326 nm ved å anvende en 5290 molar ekstinksjonskoeffesient og molar molekylvekt på 413 indikerte 28 mg DPD. Oppløsningen ble lyofilisert og resten oppløst i 10 mmol HC1 og 8 g vasket BioRad AG-1X10 (Cl-form). Etter 1 time ble det resulterende filtrert og filtratet konsentrert til tørrhet på en Savant Speed-Vac konsentrator for å gi 56 mg av det meget hygroskopiske tetrakloridsaltet.

<!>HNMR (300 Mhz, d6DMSO) 6: 8,65 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 4,51 (t, 2H, J=7,5), 4,28 (t, 1H, J=7), 4,10 (t, 1H, 1=6), 3,99 (t, 1H, J=7), 3,4 (m, 2H), 3,2-2,9 (m, 2H), 2,2 (m, 2H), 2,1 (m, 2H), 2,0 (m, 2H), 1,5-1,3 (m, 2H).

O-t-butylestrene og CBZ-beskyttelsesgrupper kan bli fjernet ved hjelp av tallrike behandlinger som er kjent innenfor fagområdet slik det er beskrevet av Greene et al. i Protective Groups in Organic Synthesis; John Wiley & Sons: New York, 1991: s. 246 og 335-7. t-butylesteren kan således bli fjernet ved å anvende andre syrer slik som maursyre, saltsyre, P-toluensulfonsyre, trifluormetansulfonsyre, metansulfonsyre og trifluoreddiksyre. CBZ-gruppen kan bli fjernet ved hjelp av en lang rekke metoder slik som f.eks.; ved hydrolyse, med Lewis-syrer som aluminiumklorid, trimetylsilyljodid og bortribromid; fotolyse; elektrolyse; bariumhydroksid eller ved anvendelse av andre syrer som trifluorsulfonsyre og metansulfonsyre.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av deoksypyridinolin, karakterisert ved at den omfatter trinnene med: a) reagering av en Na-beskyttet-O-beskyttet lysin med formel: F«CBZ r CQMu 1 med minst to ekvivalenter av 5,6-epoksy-2-N-beskyttet-0-beskyttet-(2S)-2-aminoheksanoat med formel: NHCBZ for å fremstille tilsvarende aminodiol med formel: COj«u NHC8Z CO£*u NHC8Z b) reagering av aminodiolen med et oksidasjonsmiddel for å skaffe tilveie tilsvarende aminodiketon med formel: COjVBu NHCBZ c) reagering av aminodiketonet med en base for å danne tilsvarende 3-hydroksydihydropyridin og deretter reagering av nevnte 3-hydroksydihydropyridin med et oksidasjonsmiddel for å danne 3-hydroksypyridiniumringen for dermed å skaffe tilveie en forbindelse med formel: ca»u V NHC8Z /^capu og d) avbeskyttelse av forbindelsen fra trinn (d) for å skaffe tilveie deoksypyridinium med formel: CO^ N

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at alle mellomproduktene blir utvunnet og renset med unntak av aminodiketonet.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av deoksypyridinolin, karakterisert ved at den omfatter trinnene med: a) reagering av minst to ekvivalenter av N-CBZ-2-amino-5,6-epoksy-heksanoat-5-t-butylester i et passende oppløsningsmiddel med Nct-CBZ-O-t-butyl-L-lysin for å skaffe tilveie 2,12-benzyloksykarbonylamino-7-(5-benzyl-oksykarbonylamino-5-t-butoksykarbonylpentyl)aza-l,13-di-t-butyl-5,9-dihydroksy-tridekanoat og utvinning av denne diol; b) reagering av diolen fremstilt i trinn (a) med et egnet oksidasjonsmiddel i et passende oppløsningsmiddel for å skaffe tilveie 2,12-benzyloksykarbonyl-amino-7-(5-benzylkarbonylamino-5-t-butoksykarbonylpentyl)aza-1,13-di-t-butyl-5,9-diokso-tridekanodoat, og c) uten dens isolering, reagering av tridekanoatet med en base for å skaffe tilveie 3-hydroksy-l-(5-benzoksykarbonylamino-5-t-butoksykarbonylpentyl)-4-(2-benzyloksykarbonylamino-2-t-butoksykarbonyletyl)-5-(3-benzyloksy-karbonylamino-3 -butoksykarbonylpropyl)pyridiniumsalt; og d) reagering av pyridiniumsaltet fremstilt i trinn (c) med HBr i et passende oppløsningsmiddel for å skaffe tilveie deoksypyridinolin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at reaksjonen i trinn (a) gjennomføres i acetonitril, metanol eller en kombinasjon av vann og alkohol som oppløsningsmiddel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at litiumperklorat inkluderes i trinn (a) som en katalysator og acetonitril som oppløsningsmiddel.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at oksidasjonsmidlet i trinn (b) er oksalylklorid-DMSO, tionylkloird-DMSO, trifluoreddiksyreanhydrid-DMSO eller eddiksyreanhydrid-DMSO.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at oksidasjonsmidlet er oksalylklorid-DMSO.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at oppløsningsmidlet i trinn (b) er metylenklorid, dietyleter, tetrahydrofuran eller kloroform.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at basen i trinn (c) er trietylamin.