NO20150566A1

NO20150566A1 - Survivin-avledede peptider og bruken av dem

Info

Publication number: NO20150566A1
Application number: NO20150566A
Authority: NO
Inventors: Eivind Per Thor Straten; Mads Hald Andersen
Original assignee: Survac Aps
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2015-05-07
Publication date: 2004-08-02
Also published as: NO340433B1; US20040210035A1

Description

SURVIVIN-AVLEDEDE PEPTIDER OG BRUKEN AV DEM

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg til nye survivin-avledede peptider og deres bruk for diagnostiske og terapeutiske formål, spesielt ved cancer. Særlig er de nye peptidene MHC klasse 1-begrensede T-celle-epitoper som har evne til å utløse cytotoksiske T-celle-responser i cancerpasienter, inkludert in situ og ex vivo responser. Spesifikt er slike nye peptider avledet av apoptose-inhibitorproteinet survivin, et kjent tumor-assosiert antigen (TAA).

TEKNISK BAKGRUNN OG TEKNIKKENS STAND

Prosessen som pattedyrs immunsystem kjenner igjen og reagerer på ikke-egne eller fremmede strukturer ved, er komplisert. En viktig del av systemet er T-celleresponsen. Denne responsen krever at T-celler kjenner igjen og reagerer med komplekser av celleoverflate-molekyler, såkalte humane leukocytt-antigener (HLA), som utgjør hovedvevsforlikelighetskomplekset (MHC, "the human major histocompatibility complex"), og peptider. Peptidene er avledet fra større molekyler som blir produsert i cellene, som også presenterer HLA/MHC-molekylet. Interaksjonen mellom T-celler og komplekser av HLA/peptid er begrenset ved at den krever en T-celle som er spesifikk for en bestemt kombinasjon av et HLA-molekyl og et peptid. Hvis en bestemt T-celle ikke er til stede, blir det ingen T-celle-respons, selv om partner-komplekset er til stede. På samme måte blir det ingen respons hvis det spesifikke komplekset er fraværende og T-cellen er til stede.

Mekanismen som T-celler kjenner igjen cellulære unormale tilstander ved, har også vært implisert ved cancer. Et eksempel er WO92/20356 der en familie av gener avdekkes som blir bygget inn i peptider som, i sin tur, blir uttrykt på celleoverflater og kan føre til lysis av tumorcellene ved spesifikke CTLer. Disse genene kalles MAGE-familien og antas å kode for forløpere for tumorforkastelsesantigener ("tumour rejection antigen precursors") eller "TRAP"-molekyler, og peptidene som er avledet av dem, kalles "tumorforkastelsesantigener" ("tumour rejection antigens") eller "TRA'er".

I WO 94/05304 er det avdekket nonapeptider som binder seg til HLA-Al-molekylet. Det refererte dokumentet avdekker at hvis bestemte peptiders spesifisitet for bestemte HLA-molekyler er kjent, skulle man forvente at et bestemt peptid binder seg til ett HLA-molekyl, men ikke til andre. Dette er av betydning fordi ulike individer har ulike HLA-fenotyper. Selv om identifikasjon av et bestemt peptid som partner for et bestemt HLA-molekyl har diagnostiske og terapeutiske følger, er disse derfor bare relevante for individer med denne bestemte HLA-fenotypen.

Flere peptider presentert av MHC-molekyler er blittkarakterisert, og det er funnet at noen av disse kan inneholde posttranslatoriske modifikasjoner som muligens har innvirkning på funksjonaliteten til HLA-peptid-komplekset. Følgelig er det i en del studier funnet en sammenheng mellom forandringer i fosforyleringsmønsteret og malign forandring (transformation). Videre er det vist at fosforylering kunne ha en nøytral, negativ eller til og med positiv effekt på peptidbinding til klasse 1 HMC og at fosfopeptid-spesifikk CTL, som skilte mellom de fosforylerte og de ikke-fosforylerte versjonene av peptidet, kunne bli dannet, noe som viser at slike CTL mest sannsynlig er en del av det klasse 1-MHC-begrensede CTL-repertoaret. Nylig er det vist at fosforylerte peptider virkelig blir produsert naturlig og presentert av MHC klasse 1-molekyler in vivo. Dessuten er det fastslått at fosforylerte peptider er til stede i ekstrakter av isolerte klasse 1-molekyler fra flere ulike EBV-transformerte B-celler.

Det er således velkjent at peptid-epitoper avledet av tumor-assosierte antigener (TAA) kan gjenkjennes som antigener av cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i sammenheng med MHC-molekyler (1). Imidlertid, selv om det er generelt akseptert at de fleste, hvis ikke alle, tumorer er antigene, er bare noen få virkelig immunogene i den betydning at tumorprogresjon blir tilfredsstillende kontrollert av immunsystemet.

For å overvinne denne begrensningen er flere immunoterapeutiske utprøvninger blitt initiert, for eksempel vaksinasjoner med TAA-avledede peptider. For melanom, tumoren for hvilken det største antallet CTL-definerte TAA er blittkarakterisert, er kraftige CTL-responser mot antigener blitt indusert av vaksinasjon, og noen pasienter opplevde en fullstendig remisjon fra sin sykdom (2,3). Imidlertid er de fleste av peptid-epitopene som er brukt i disse vaksinasjons-utprøvningene, melanocytt-spesifikke, og disse peptidene kan ikke brukes for tumorer av ikke-melanocytt-opprinnelse. Videre er ekspresjon av disse TAA'ene heterogen blant tumorer fra ulike pasienter og kan til og med variere mellom metastaser tatt fra en (samme) pasient. Likevel er i løpet av de siste par år en del tumorspesifikke peptid-antigener, som er uttrykt i en del ulike cancer-sykdommer, blitt identifisert, for eksempel HER-2 (4), Muc-1 (5) og telomerase (6).

Det er også vist at ved egnet manipulasjon kan tumor-antigener som er til stede i tumorer, bli eksponert for immunsystemet. Studier har vist at CD8+CTL-armen av immunresponsen, alene eller i kombinasjon med CD4+Th-celler, utgjør den primære antitumor-effektorarmen av den adaptive immunresponsen. Inntil nå har fokuset hovedsakelig vært på CTL-armen av immunresponsen. Imidlertid blir det mer og mer klart at CD4 T-celleresponsen spiller en essensiell rolle i tumorforkastelse (tumour rejection), spesielt i induksjonsfasen eller i forlengelsen av en CTL-respons in vivo. Følgelig kan inkorporeringen av klasse II-begrensede tumorantigener i effektive tumor-vaksinasjonsprotokoller øke effektiviteten av vaksinene.

Apoptose er et genetisk program for cellulært selvmord, og inhibisjon av apoptose er blitt foreslått som en viktig mekanisme involvert i cancer-dannelse ved å forlenge levetiden for celler som favoriserer oppsamling av transformerende mutasjoner (7). Survivin er et nylig identifisert medlem av familien av inhibitorer av apoptoseproteiner (IAP'er). I en global genekspresjonsanalyse av omtrent 4 millioner transkripter ble survivin identifisert som et av de viktigste genene som alltid var oppregulert i mange typer cancer, men ikke i normalvev (8). Faste tumorer med overekspresjon av survivin omfatter lunge-, kolon-, bryst-, pancreas-og prostatacancer samt hematopoietiske maligniteter (9). Dessuten er en rekke melanom- og ikke-melanom-hudcancere rapportert å være konstant survivin-positive (10,11). Overekspresjon av survivin i de fleste humane cancersykdommer antyder en generell rolle for apoptose-inhibisjon i tumorprogresjon, en oppfatning som underbygges av den observasjonen at ved kolorektal- og blærecancer, samt ved nevroblastom, var ekspresjon av survivin assosiert med en ufordelaktig prognose. Derimot er survivin udetekterbart i normalt vev hos voksne. Disse egenskapene kvalifiserer survivin som et egnet TAA for både diagnostiske og terapeutiske formål.

Slik er det i løpet av det siste tiåret identifisert et stort antall TAA'er som gjenkjennes av CTL'er på en hovedvevsforlikelighetsantigen-kompleks (MHC)-begrenset måte. Ettersom survivin er overuttrykt ved de fleste humane cancersykdommer, og inhibisjon av dets funksjon resulterer i økt apoptose, kan dette proteinet tjene som et mål for terapeutiske CTL-responser. Proteinet survivin og den potensielle diagnostiske og terapeutiske bruken av det er beskrevet i (8) og US 6.245.523, som er inkorporert her ved henvisning. Survivin er et 16,5 kDa cytoplasmisk protein som inneholder en enkel BIR og et sterkt ladet, kveilet karboksiterminal-område i stedet for en "RING finger", som hemmer apoptose indusert av vekstfaktor(IL-3)-nedgang når overført i B-celle-forløpere. Genet som koder for survivin, er nær identisk med sekvensen for effektorcelle-proteasereseptor - 1 (Effector Cell Protease Receptor-1) (EPR-1), men orientert i motsatt retning, noe som tyder på eksistensen av to separate gener duplisert i en "head-to-head"-konfigurasjon. I samsvar med dette kan survivin beskrives som et antisens EPR-l-produkt. Funksjonelt resulterer inhibisjon av survivin-ekspresjon via oppregulering av dets naturlige antisens EPR-1 transkript i massiv apoptose og redusert cellevekst.

US 6.245.523 beskriver isoleringen av renset survivin, og det presenterer nukleinsyre-molekyler som koder for proteinet survivin og antistoffer og andre molekyler som binder seg til survivin. US 6.245.523 avdekker også anti-apoptotisk aktive fragmenter av survivin-proteinet og varianter av det der en aminosyre-rest er blitt innsatt N- eller C-terminalt til eller innenfor den avdekkede survivinsekvensen. Det er spesifikt vist at slike peptider kan inneholde funksjonelle nøkkelrester som er nødvendige for apoptose, dvs. Trp i posisjon 67, Pro i posisjon 73 og Cys i posisjon 84.

Den foreliggende oppfinnelsen er basert på funnet at MHC klasse 1- begrensede peptider kan avledes fra survivinproteinet, som har evne til å binde seg til MHC klasse 1 HLA-molekyler og derved utløse både ex vivo og in situ CTL-immunresponser i pasienter som lider av et vidt spekter av cancersykdommer. Disse funnene tyder sterkt på at survivin opptrer som et TRAP-molekyl, som blir omdannet av celler til peptider som har TRA-funksjon. Tydeligvis åpner disse funnene veien for nye terapeutiske og diagnostiske tilnærminger som, på grunn av det faktum at survivin ser ut til å være uttrykt universelt av tumorceller, er generelt egnet for kontroll av cancersykdommer.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Følgelig gjelder oppfinnelsen i et første aspekt et MHC klasse 1-begrenset epitop-peptid avledet fra survivin, og den nevnte epitopen har minst ett av de følgende karakteristika: (i) har evne til å binde seg til klasse 1 HLA-molekylet til hvilket det er begrenset med en affinitet som målt ved mengden av peptidet som kan gi halvparten av maksimal gjenvinning av klasse 1 HLA-molekylet (Cso-verdi), som er maksimalt 50 uM, bestemt ved kompleksbindings-assay (assembly binding assay) som beskrevet her, (ii) har evne til å fremkalle INF-y-produserende celler i en PBL-populasjon hos en cancer-pasient med en frekvens på minst 1 per IO<4>PBL, bestemt ved et ELIS POT assay, og/eller (iii) har evne til in situ deteksjon i et tumorvev av CTL som er reaktive overfor epitop-peptidet.

Fortrinnsvis har peptidet i oppfinnelsen minst to, helst alle disse tre egenskaper.

I videre aspekter frembringer oppfinnelsen en farmasøytisk blanding og en blanding for ex vivo eller in situ diagnose av tilstedeværelsen i en cancerpasient av survivin-reaktive T-celler blant PBL eller i tumorvev, der denne blandingen omfatter et peptid som definert over.

I enda andre aspekter relaterer oppfinnelsen seg til en diagnostisk kit for ex vivo eller in situ diagnose av tilstedeværelsen i en cancerpasient av survivin-reaktive T- celler blant PBL eller i tumorvev, denne kit omfatter et peptid i samsvar med oppfinnelsen og et kompleks av et slikt peptid og et klasse 1 HLA-molekyl eller et fragment av et slikt molekyl.

I nok et annet aspekt er det også frembragt en fremgangsmåte for å detektere i en cancerpasient tilstedeværelsen av survivin-reaktive T-celler, der fremgangsmåten omfatter å opprette kontakt mellom et tumorvev eller en blodprøve og et kompleks som definert over og detektere binding av komplekset til vevet eller blodcellene.

I enda andre aspekter gjelder oppfinnelsen et molekyl som har evne til å binde seg spesifikt til et peptid i henhold til oppfinnelsen, for eksempel et antistoff eller et fragment av det, og til et molekyl som har evne til å blokkere bindingen av et slikt molekyl.

Et viktig aspekt av oppfinnelsen relaterer seg til anvendelsen av peptidene i oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av cancer. Et videre aspekt relaterer seg til bruken av blandingen eller molekylet som nevnt over for fremstilling av et medikament for behandling av cancer.

Enda andre aspekt relaterer seg uavhengig til en fremgangsmåte for å behandle cancer i et pattedyr, for eksempel i mennesker, og omfatter administrasjon til en pasient som lider av sykdommen, av en effektiv mengde av peptidet, blandingen eller et molekyl i oppfinnelsen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Det nye MHC klasse I-begrensede peptidet i oppfinnelsen erkarakterisert vedå ha minst ett av flere egenskaper, en av disse er evnen til å binde klasse I HLA-molekylet som det er begrenset til med en affinitet som, når den blir målt som mengden av peptidet som kan gjenvinne halvparten av det maksimale av klasse I HLA-molekylet (Cso-verdi) i et kompleksbindings-assay (assembly assay) som beskrevet her, er maksimalt 50 uM. Dette kompleksbindings-assay (assembly assay) utføres som beskrevet tidligere (12, 13), og det er basert på stabilisering av HLA-molekylet etter innsetting av peptidet hos den peptidtransportør-manglende cellelinjen T2. Deretter immunopresipiteres korrekt foldede stabile tunge kjeder av HLA ved å bruke konformasjonsavhengige antistoffer, og peptidbindingen blir kvantifisert.

Dette assay frembringer en enkel fremgangsmåte for screening av kandidatpeptider for deres evne til å binde seg til et gitt HLA-a I lei molekyl ved den ovenfor nevnte affiniteten. I foretrukne utførelsesformer er peptidet i oppfinnelsen et som har en Cso-verdi som er maksimalt 30 uM, for eksempel en Cso-verdi som er maksimalt 20 uM inklusive Cso-verdier på maksimalt 10 uM, maksimalt 5 uM og maksimalt 2 uM.

Som nevnt ovenfor, representerer HLA-systemet menneskets hovedvevs-forlikelighetsantigenkompleks- (MHC-) system. Generelt kontrollerer MHC-systemet en rekke karakteristika: transplantasjonsantigener, thymusavhengige immunresponser, visse komplement-faktorer og disposisjon for bestemte sykdommer. Mer spesifikt koder MHC for tre ulike typer av molekyler, det vil si klasse I, II og Ill-molekyler, som bestemmer de mer generelle karakteristika for MHC. Av (blant) disse molekylene er klasse I-molekylene såkalte HLA-A, HLA-B og HLA-C molekyler som presenteres på overflaten til de fleste celler med kjerne og trombocytter.

Peptidene i den foreliggende oppfinnelsen erkarakterisert vedderes evne til å binde til et bestemt MHC klasse I HLA-molekyl. Således er peptidet i en utførelsesform av en type som er begrenset til et MHC klasse I HLA-A-molekyl inklusive HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-Awl9, HLAA23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(wl9), HLA-A30(wl9), HLA-A31(wl9), HLA-A32(wl9), HLA-Aw33(wl9), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28). Enklere betegnelser er også brukt over alt i litteraturen, der bare den primære numeriske benevnelsen er brukt, dvs. HLA-A19 eller HLA-A24 i stedet for henholdsvis HLA-Awl9 og HLA-A24(9). I spesifikke utførelsesformer er peptidet i oppfinnelsen begrenset til en MHC klasse I HLA-type valgt fra gruppen som består av HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 og HLA-A24.

Peptidene i oppfinnelsen er avledet fra den kjente sekvensen for survivin, dvs. sekvensen som er beskrevet i US 6.245.523. Seleksjon av peptider som potensielt har evnen til å binde seg til et bestemt HLA-molekyl, kan gjøres ved sammenliknende oppstilling (alignment) av kjente sekvenser som bindes til et gitt bestemt HLA-molekyl for derved å avdekke dominansen av noen få relaterte aminosyrer ved bestemte posisjoner i peptidene. Slike fremtredende aminosyre-rester betegnes i dette dokumentet også anker-rester eller anker-restmotiver . Ved å følge en slik relativt enkel prosedyre basert på kjente sekvensdata som kan finnes i tilgjengelige databaser, kan peptider avledes av survivin-proteinmolekylet som sannsynligvis vil binde seg til det bestemte HLA-molekylet. Representative eksempler på slike analyser for en rekke HLA-molekyler er gitt i tabellen nedenfor: Følgelig, som et eksempel, vil nonapeptider som potensielt har evnen til å binde seg til HLA-A1, ha en av følgende sekvenser: Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y; Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y eller Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (der Xaa indikerer en hvilken som helst aminosyre-rest). På en lignende måte kan sekvenser som potensielt har evnen til å binde seg til et hvilket som helst annet HLA-molekyl, konstrueres.

Det vil forstås at personer med ordinære ferdigheter i teknikken vil være i stand til å identifisere flere "ankerrestmotiver" for et gitt HLA-molekyl.

Følgelig inkluderer nyttige utførelsesformer av peptidene i oppfinnelsen peptider for hvilke sekvensene omfatter, for hvert av de spesifikke HLA-allelene som er ført opp i tabellen, hvilken som helst av aminosyre-restene som indikert i tabellen.

Derfor vil en enkel tilnærming for å identifisere peptidene i oppfinnelsen inkludere følgende trinn: å velge et bestemt HLA-molekyl, f.eks. et som forekommer med stor hyppighet i en gitt populasjon, å utføre en sammenliknende oppstillingsanalyse som beskrevet over for å identifisere "ankerrestmotiver" i survivin-proteinet, å isolere eller konstruere peptider av en passende størrelse som omfatter ett eller flere av de identifiserte ankerrestene og å teste de resulterende peptidene for (I) evne til å binde seg til det bestemte HLA-molekylet ved å bruke kompleksbindingsassayet som beskrevet her, (ii) peptidenes evne til å utløse INF-y-produserende celler i en PBL-populasjon i en cancerpasient med en frekvens på minst 1 per IO<4>PBL'er som bestemt ved et ELISPOT assay som beskrevet her og/ eller (III) peptidenes evne til å oppdage in situ i et tumorvev CTL'er som er reaktive med epitop-peptidene som blir testet.

I spesifikke utførelsesformer er peptidet i oppfinnelsen et HLA-A2-begrenset survivin-avledet peptid som har en sekvens som er selektert fra det følgende: FLKLDRERA (survivinioi-109) (SEQ ID NO:l), TLPPAWQPFL (survivin5-i4) (SEQ ID N0:2), ELTLGEFLKL (survivin95-io4) (SEQ ID NO:3), LLLGEFLKL (SEQ ID NO:4) og LMLGEFLKL (SEQ ID NO:5). (Betegnelsen i parentes indikerer posisjonene av restene i survivin-proteinet som beskrevet i US 6.245.523). LLLGEFLKL (SEQ ID NO:4) er en sekvens avledet fra survivin96-io4 ved å substituere "T" i posisjon 2 i peptidet med en "L", og LMLGEFLKL (SEQ ID NO:5) er avledet fra survivin96-io4ved å substituere "T" i posisjon 2 med "M".

I andre nyttige utførelser er peptidet i oppfinnelsen et peptid som er begrenset av

et MHC klasse 1 HLA-B-molekyl inklusive hvilket som helst av de følgende: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-BW41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 og HLA-Bw47. I spesifikke utførelsesformer er MHC klasse 1 HLA-B-typen til hvilken peptidet i oppfinnelsen har evne til å binde seg, selektert fra HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 og HLA-B51.

I spesifikke utførelsesformer er peptidet i oppfinnelsen et HLA-B35-begrenset survivin-avledet peptid som har en sekvens selektert fra de følgende: CPTENEPDL (survivin46-54) (SEQ ID NO:6), EPDLAQCFF (survivinsi-s<g>) (SEQ ID NO:7), CPTENEPDY (SEQ ID NO:8) og EPDLAQCFY (SEQ ID NO:9). (Betegnelsene i parentes indikerer posisjonene i restene i survivin-proteinet som beskrevet i US 6.245.523.) CPTENEPDY (SEQ ID NO:8) er en sekvens som er avledet av survivin46-54 ved å substituere "L" i C-terminalen av peptidet med en "Y", og EPDLAQCFY (SEQ ID NO:9) er avledet fra survivinsi-59ved å substituere en "F"-rest i C-terminal 2 med en "Y".

I andre spesifikke utførelsesformer er peptidet i oppfinnelsen et HLA-Al-begrenset peptid som har en sekvens selektert fra de følgende: Survivin38-46(Sur38Y9) (en C endret til en Y ved P9, MAEAGFIHY)(SEQ ID NO: 38), Survivin47-56(Sur47Y10)(en Q endret til en Y ved P10, PTENEPDLAY(SEQ ID NO:39)), Survivin92-ioi (Sur92-101)

(QFEELTLGEF) (SEQ ID NO:27) og Survivin<g>a-ioi (Sur93T2)(en E endret til en T ved P2, FTELTLGEF (SEQ ID NO:36)). Peptidet i oppfinnelsen kan også være et HLA-A3-begrenset peptid, for eksempel Survivin 18-24 (Surl8K10)(en F endret til en K ved P10, RISTFKNWPK (SEQ ID NO:57); og/eller et HLA-All-begrenset peptid som

Survivin53-62(Sur53-62)(DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO:45) og/eller et HLA-A2-begrenset peptid som Survivini8-28(Surl8-28) (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO:66).

I andre nyttige utførelsesformer er peptidet i oppfinnelsen et peptid som er begrenset til et MHC klasse 1 HLA-C-molekyl inklusive noen av de følgende: HLA-Cwl, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 og HLA-Cwl6.

Fortrinnsvis omfatter peptidet i oppfinnelsen mindre enn 50 aminosyre-rester, og helst omfatter det maksimalt 20 aminosyre-rester, for eksempel maksimalt 10 aminosyre-rester. I spesifikke utførelsesformer er peptidet et heptapeptid, et oktopeptid, et nonapeptid, et dekapeptid eller et undekapeptid.

Peptidet i oppfinnelsen er, som nevnt ovenfor, avledet fra et survivinprotein eller et fragment av det. Det survivin proteinet som peptidet kan være avledet fra, er survivinprotein fra en hvilken som helst dyreart der proteinet er uttrykt. I foretrukne utførelsesformer stammer survivin-startproteinet fra en pattedyr-art, inklusive en gnagerart, kanin og en primat-art, som for eksempel menneske. Basert på sekvensen for det utvalgte survivinproteinet blir proteinet i oppfinnelsen avledet ved en hvilken som helst hensiktsmessig kjemisk eller enzymatisk behandling av survivin-startmaterialet som resulterer i et peptid av en passende størrelse som indikert ovenfor, eller det kan bli syntetisert ved en hvilken som helst konvensjonell peptidsyntese-prosedyre som personer med ordinære ferdigheter innen teknikken er kjent med.

Peptidet i oppfinnelsen kan ha en sekvens som er den naturlige sekvensen av det survivinproteinet det er avledet fra. Imidlertid kan peptider som har en høyere affinitet til et gitt HLA-molekyl, bli avledet fra en slik naturlig sekvens gjennom å modifisere sekvensen ved å substituere, fjerne eller legge til minst en aminosyre-rest, dvs. basert på prosedyren som er beskrevet ovenfor, ved hvilken ankerrestmotiver som gjelder det gitte HLA-molekylet, blir identifisert.

Derfor, for å øke immunogenisiteten av survivin-avledede peptider, kan aminosyre-substitusjoner introduseres i ankerposisjoner, men ikke ved TCR kontakt-rester, for å øke peptidbinding til HLA klasse I-molekylet. Dette har resultert i mer immunogene epitoper, f.eks. dette har økt kapasiteten til å indusere cancer- reaktive CTL, og det har vist seg å være mer egnet for induksjonen av klinisk meningsfulle CTL-responser. Det er dog viktig at mål-cancercellene uttrykker og presenterer det naturlige survivin-avledede peptidet på celleoverflaten. I denne sammenhengen er det av avgjørende viktighet at terapi-induserte CTL som er spesifikke for de modifiserte survivin-avledede peptidene, kryssreagerer med de naturlige analogene.

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også varianter og funksjonelle ekvivalenter av de survivin-avledede peptidene som beskrevet her. "Funksjonelle ekvivalenter" som brukt i den foreliggende konteksten bestemmes ved hjelp av henvisning til den korresponderende funksjonaliteten av et på forhånd bestemt fragment av den aktuelle sekvensen. Funksjonell ekvivalens kan bestemmes ved for eksempel lignende bindingsaffinitet til HLA klasse I-molekyler eller lignende potens vist ved ELISPOT-assayet.

Funksjonelle ekvivalenter eller varianter av et survivin-avledet peptid som beskrevet her, må forventes å utvise aminosyresekvenser som gradvis blir forskjellig fra de foretrukne, på forhånd bestemte sekvensene, etter som antall og omfang av inserter, delesjoner og substitusjoner inklusive bevarende substitusjoner, øker. Denne forskjellen måles som en reduksjon i homologi mellom en foretrukken, på forhånd bestemt sekvens og den survivin-avledede varianten eller den survivin-avledede funksjonelle ekvivalenten.

Homologien mellom aminosyresekvensene kan beregnes ved å bruke algoritmer som er godt kjent innen teknikken. Fragmenter med samme homologi som fragmenter som omfatter eller består av fortløpende survivin-avledede aminosyre-rester, må regnes å falle innenfor omfanget av den foreliggende oppfinnelsen når de er fortrinnsvis minst ca. 90% homologe, for eksempel minst 94 % homologe, inklusive 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% homologe med et på forhånd bestemt survivin-avledet peptid.

Videre kan det være fordelaktig å utføre post-translatoriske modifikasjoner av peptidene i oppfinnelsen. Det er vist at eksponering av bryst-carcinom MCF-7 eller livmorhals-carcinom HeLa-celler for anticancer-midler inklusive Adriamycin, Taxol eller UVB resulterte i en 4-5-dobbel økning i survivin-ekspresjon. Endringer i survivin-nivåer etter anticancer-behandling involverte ikke modulasjon av survivin mRNA-ekspresjon og var uavhengige av de novo gentranskripsjon. Omvendt resulterte hemming av survivin-fosforylering ved Thr<34>med den cyklin-avhengige kinaseinhibitoren flavopiridol i tap av survivin-ekspresjon, og ikke-fosforylerbart survivin Thr<34>—>Ala utviste akselerert klarering (clearance) sammenlignet med vill-type survivin. Sekvensiell fjerning av survivin-fosforylering ved Thr<34>økte tumorcelle-apoptose indusert av anticancer-midler uavhengig av p53 og hindret tumorvekst uten toksisitet i en brystcancer-xenograftmodell in vivo. Disse dataene tyder på at Thr<34->fosforylering på en avgjørende måte regulerer survivin-nivåer i tumorceller og at sekvensiell fjerning av Thr34-kinaseaktivitet kan fjerne kontrollpunktet for survivin-levedyktighet og øke apoptose i tumorceller.

Følgelig vurderes det at de survivin-avledede peptidene i oppfinnelsen omfatter forsforylerte peptider. Naturlige survivinfosfopeptid-antigener kan identifiseres ved scanning for forekomst av MHC-peptidbindende motiver omkring fosforyleringsstedet Thr34. Således inkluderer mulige survivin-avledede fosfopeptidsekvenser TPERMAEAGF, et antatt HLA-B35- og/eller HLA-B7-og/eller et HLA-B51-begrenset peptid-antigen. Ytterligere naturlige fosfopeptider som er omfattet av dette inkluderer: HLA-A2: CACTPERMAogCTPERMA

E A; HLA-A3: FLEGCACTP; HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51: WPFLEGCACT

(fosforylert Thr-rest er merket med fet skrift).

Et signifikant trekk ved peptidet i oppfinnelsen er dets kapasitet til å gjenkjenne eller utløse INF-y-produserende responder-T-celler, i.e. cytotoksiske T-celler (CTL'er) som spesifikt gjenkjenner det bestemte peptidet i en PBL-populasjon av tumorceller i en cancerpasient (målceller). Denne aktiviteten kan tilfredsstillende bestemmes ved å la PBL'er eller tumorceller fra en pasient gjennomgå et ELISPOT-assay som beskrevet i referanse (16) og i de følgende eksemplene. Før assayet utføres, kan det være en fordel å stimulere PBL-populasjonen eller tumorcellene som skal analyseres ved å la cellene være i kontakt med peptidet som skal testes. Fortrinnsvis har peptidet evne til å utløse eller gjenkjenne INF-y-produserende T-celler med en hyppighet på minst 1 per IO<4>PBL'er som bestemt ved et ELISPOT-assay som brukt her. Mer fordelaktig er hyppigheten minst 5 per IO<4>PBL'er, aller helst minst 10 per IO<4>PBL'er, for eksempel minst 50 eller 100 per 10<4>PBL'er. ELISPOT-assayet representerer et solid redskap for å monitorere survivinpeptid-spesifikke T-celleresponser. Imidlertid, selv om det er vist at ELISPOT-reaktivitet i de fleste tilfeller korrelerer med CLL'enes kapasitet til å lysere målcellene, kan konklusiv evidens for denne antagelsen bare gis direkte. Slik direkte evidens frembringes her, siden det ble vist (se eksempel 2) at survivin reaktive celler isolert ved hjelp av HLA/peptidkomplekser innehar funksjonell kapasitet til å lysere målceller. I tillegg er det vist at de isolerte CTVene som gjenkjenner spesifikt et peptid i oppfinnelsen, hadde evne til å lysere HLA-avstemte tumorceller av annen opprinnelse, for eksempel melanomer og brystkreft. Dette funnet tyder sterkt på at cancerceller generelt omdanner og presenterer det samme endogene survivinpeptidet. Derfor er en hovedimplikasjon av funnene her at peptidene i oppfinnelsen blir uttrykt og kompleksbundet med HLA-molekyler på en rekke cancerceller av ulik histologisk opprinnelse. Dette gjør disse cancercellene mottagelige for destruksjon av CTL'er og fremhever den potensielle nytten av survivin-immunisering for å kontrollere veksten av ulike neoplasmer. Forekomsten av spontane CTL-responser i PBL'er og tumorceller på HLA-begrensede survivin-avledede peptid-epitoper fra pasienter som lider av tre ubeslektede cancertyper, dvs. brystcancer, melanom og CLL, styrker ytterligere det universelle immunoterapeutiske potensialet for dette tumorantigenet.

I overensstemmelse med dette har peptidet i oppfinnelsen i en annen foretrukken utførelsesform evne til å utløse INF-y-produserende celler i en PBL-populasjon fra en pasient som har en cancersykdom der survivin er uttrykt, inklusive en hematopoietisk malignitet iberegnet kronisk lymfatisk leukemi og kronisk myeloid leukemi, melanom, brystcancer, livmorhals(cervix)cancer, ovariecancer, lungecancer, koloncancer, pankreascancer og prostatacancer. Spesifikt har peptidet i oppfinnelsen evne til å utløse en immunrespons i form av en T-celle som har cytotoksisk effekt mot survivin-uttrykkende celler av en cancercellelinje, inklusive en cellelinje selektert fra brystcancer-cellelinjen MCF-7 og melaonom-cellelinjen FM3.

I tillegg til deres kapasitet til å utløse immunresponser i PBL-populasjoner og cancercellelinjer ble det vist at peptidene i oppfinnelsen også har evne til å utløse cytolytiske immunresponer in situ, dvs. i faste tumorvev. Dette ble vist ved å frembringe HLA-peptidkomplekser, for eksempel ved multimerisering og ved å bli utstyrt med en detekterbar etikett, og å bruke slike komplekser i immunhistokjemiske farginger for å oppdage i et tumorvev CTVer som er reaktive med epitop-peptidet i oppfinnelsen. Følgelig er et ytterligere signifikant trekk ved peptidet i oppfinnelsen at det har evne til in situ deteksjon i et tumorvev av CTL'er som er reaktive med epitop-peptidet.

Det vurderes om peptidene i oppfinnelsen, i tillegg til deres kapasitet til å binde seg til HLA-molekyler som resulterer i presentasjon av HLA-komplekser på celleoverflater, der disse kompleksene i sin tur oppfører seg som epitoper eller mål for cytotolytiske T-celler, kan utløse andre typer av immunresponser, som B-responser som resulterer i produksjon av antistoffer mot kompleksene og/eller en forsinket hypersensibilitets- (Delayed Type Hypersensitivity (DTH)) reaksjon. Den sistnevnte typen immunrespons defineres som en rødhet og en palpabel fortykkelse (induration) ved injeksjonsstedet for peptidet i oppfinnelsen.

Det er velkjent at de ulike HLA-molekylene er av ulik forekomst i de store befolknings-populasjonene. Følgelig er det et behov for å identifisere peptidepitoper som er begrenset til flere HLA klasse I-molekyler for å utvide pasientkohorten som kan behandles i samsvar med metodene i den foreliggende oppfinnelsen. Karakteriseringen av multiple survivin-epitoper med ulike HLA-restriksjonselementer utvider det kliniske potensialet for dette mål-antigenet på to viktige måter: (i) Den øker antall pasienter som er egnet for immunterapi basert på survivin-avledede peptider. HLA-A2-antigenet uttrykkes av omtrent 50 % av kaukasiske og asiatiske populasjoner, HLA-A1 og HLA-A3-antigenene uttrykkes begge av omtrent 25 % av kaukasiere og 5 % av asiater, mens HLA-All-antigen uttrykkes av omtrent 15 % av kaukasiere og 30 % av asiater. Selv om disse antallene ikke kan summeres på grunn av co-ekspresjon, vil en kombinasjon av peptider begrenset av et mangfold av disse med sikkerhet omfatte de fleste cancerpasienter. (ii) Den felles målretting (targeting) mot flere restriksjons-elementer i hver pasient vil sannsynligvis redusere risikoen for immunitetstap ved HLA-alleltap. Tap av ett enkelt HLA-allel utgjør en signifikant del av MHC-forandringer som er beskrevet for cancerceller, mens fullstendig tap av klasse I-ekspresjon er en heller sjelden hendelse. Derfor, gjennom identifikasjonen av survivin-epitoper begrenset til ulike HLA-alleler er det nå mulig å utpeke mer enn ett HLA-molekyl samtidig i pasienter med allel-overlapping.

Følgelig, basert på beskrivelsen av den foreliggende oppfinnelsen, vil en person som er dyktig innen teknikken, være i stand til å utvikle sterkt immunogene multi-epitop-vaksiner. Fortrinnsvis bør slike vaksiner utformes for å fremme en samtidig frigivelse av de best egnede survivin-avledede peptidene, eventuelt i kombinasjon med andre egnede peptider og/eller adjuvanter som beskrevet nedenfor.

Videre, som tidligere beskrevet, har det vært en økende interesse for å utløse tumorspesifikk T-hjelpercelle-immunitet, dvs. å vaksinere med klasse II-MHC-begrensede epitoper, til tross for det faktum at tumorer generelt ikke uttrykker klasse II MHC. Dette er basert på det nye funnet at induksjonen og effektiviteten for den vaksineinduserte antitumorresponsen i mange tilfeller krever medvirkning av tumorspesifikke CD4-positive Th-celler. En viktig drivende faktor for utviklingen av vaksiner med en mer kompleks sammensetning er derfor ønsket om å utpeke (target) multiple tumor-antigener, for eksempel ved å utforme vaksiner som omfatter eller koder for en samling av nøyaktig selekterte CTL- og Th-celle-epitoper.

Åpenbart representerer multi-epitop-vaksiner en effektiv metode for å øke immuniteten mot epitoper avledet av flere ulike antigener uten behov for introduksjon (genkoding) av potensielt skadelige proteiner som for eksempel onkoproteiner. Slike vaksiner tillater også selektiv induksjon av immunitet mot subdominante og kryptiske celle-epitoper, som kan være særlig viktige når det gjelder tumorassosierte autoantigener for hvilke toleranse kan forekomme for epitopene som er betydelig presentert i normale vev. Videre kan antigenpresenterende celler mislykkes i å presentere bestemte epitoper som er uttrykt i tumorceller på grunn av funksjonell forskjell mellom

immunoproteasomene til antigenpresenterende celler og de "konstitutive" proteasomene som er til stede i de fleste tumorceller. Når det gjelder peptidbaserte vaksiner, kan slike epitoper administreres i en "klar-f or-MHC" form, som muliggjør presentasjon gjennom eksogen innsetting uavhengig av antigenopptak og omdannelse ved vertens antigenpresenterende celler.

Det er evident at funnene i den foreliggende oppfinnelsen frembringer grunnlaget for så vel terapeutiske som diagnostiske applikasjoner av de survivin-avledede proteinene.

Et viktig aspekt av den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg derfor til en blanding som omfatter: I et videre aspekt frembringer den foreliggende oppfinnelsen følgelig en farmasøytisk blanding som omfatter ett eller flere av peptidene i oppfinnelsen alene eller i passende kombinasjon med andre proteiner eller peptidfragmenter. I spesifikke utførelsesformer kan slike andre proteiner eller peptidfragmenter inkludere, uten å være begrenset til, proteiner som er involvert i regulering av celleapoptose eller peptidfragmenter av disse. Egnede eksempler på slike proteiner kan være selektert fra Bcl-2-proteinfamilien, for eksempel Bcl-2-proteinet, Bcl-w-proteinet, Mcl-l-proteinet, Bcl-Xi_-proteinet og peptidfragmenter avledet fra hvilket som helst av proteinene. Andre kjente apoptose-inhibitorer inkluderer medlemmer av apoptose-inhibitorprotein (inhibitor of apoptosis protein (IAP))-familien, som X-IAP, C-IAP1 og C-IAP2. Disse proteinene er alle relativt allment uttrykt, mens inhibitoren av apoptose-polypeptid ML-IAP har en heller selektiv ekspresjon, og er overveiende detektert i melanomer. Fragmenter av ML-IAP som har evne til å utløse en spesifikk T-cellerespons, dvs. en cytotoksisk T-cellerespons eller en T-hjelpercelle-respons, kan derfor eventuelt inkluderes i blandingen i den foreliggende oppfinnelsen. Nyttige peptidfragmenter av ML-IAP inkluderer ML-IAP245(RLQEERTCKV)(SEQ ID NO:75), ML-IAP280(QLCPICRAPV)(SEQ ID NO:76),

ML-IAP90(RLASFYDWPL)(SEQ ID NO:77), ML-IAP154(LLRSKGRDFV)(SEQ ID

NO:78), ML-IAP230(VLEPPGARDV)(SEQ ID NO:79), ML-IAP98(PLTAEVPPEL)(SEQ ID NO:80), ML-IAP34(SLGSPVLGL)(SEQ ID NO:81), ML-IAP54(QILGQLRPL)(SEQ ID NO:82), ML-IAP99(LTAEVPPEL)(SEQ ID NO:83), ML-IAPsa (GMGSEELRL)(SEQ ID NO:84) og ML-IAP200(ELPTPRREV)(SEQ ID NO:85).

Dessuten kan blandingen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen frembringes som en multiepitop-vaksine som omfatter klasse I-begrenset epitop- og/eller klasse II-begrensede epitoper som definert ovenfor.

Eksempler på en aktuell foretrukken multiepitop-vaksine inkluderer "skreddersydde" kombinasjoner av survivin-avledede peptid-epitoper avhengig av vevstypen for den gitte pasienten, for eksempel kan et individ som er bærer av HLA-A2, HLA-A3 og HLA-B35 fenotyper, bli vaksinert med en vaksine som omfatter surlM2, sur9, surl8K10, sur46Y9, sur51Y9. I tillegg kan den farmasøytiske blandingen i oppfinnelsen med fordel omfatte minst ett ytterligere immunogent protein eller peptidfragment av dette selektert fra et protein eller peptidfragment som ikke tilhører eller er avledet fra survivin-proteinet. I spesifikke utførelsesformer er det immunogene proteinet eller peptidfragmentet av dette avledet fra Bcl-2-proteinfamilien som beskrevet ovenfor. Et annet immunogent Bcl-2-avledet peptid er et HLA-A2-begrenset peptid som har en sekvens selektert fra de følgende: BCI172, Bcliso, Bebos og BCI214.

Fordi peptidene i oppfinnelsen er relativt små molekyler, kan det i slike blandinger være nødvendig å kombinere peptidene med ulike stoffer som for eksempel adjuvanter for å produsere vaksiner, immunogene blandinger etc. Adjuvanter er, bredt definert, stoffer som promoterer immunresponser. Ofte er det beste valg av adjuvant Freunds komplette eller ukomplette adjuvant, eller drepte B. pertussis-organismer, brukt for eksempel i kombinasjon med alun(alum)-presipitert antigen. En generell diskusjon om adjuvanter finnes i Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. utgave, 1986) på sidene 61-63. Goding skriver imidlertid at når det aktuelle antigenet har lav molekylvekt eller er svakt immunogent, er kobling til en immunogen bærer anbefalt. Eksempler på slike bærer-molekyler inkluderer albueskjell (keyhole limpet)- haemocyanin, okse-serumalbumin, ovalbumin og fjærfe-immunoglobulin. Ulike saponinekstrakter er også foreslått å være nyttige som adjuvanter i immunogene blandinger. Nylig er det blitt foreslått å bruke granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), et velkjent cytokin, som en adjuvant (WO 97/28816).

Følgelig omfatter oppfinnelsen en terapeutisk blanding som videre omfatter en hvilken som helst substans inklusive hvilken som helst av de ovenfor nevnte eller kombinasjoner av dem. Det er også vurdert at antigenet, dvs. peptidet i oppfinnelsen, og adjuvanten kan administreres hver for seg i den mest passende rekkefølgen.

Valget av antigen i den farmasøytiske blandingen i oppfinnelsen vil være avhengig av parametere som kan bestemmes av fagpersoner. Som tidligere nevnt, presenteres hvert av de ulike peptidene i oppfinnelsen på celleoverflaten av et bestemt HLA-molekyl. Som sådant, hvis et individ som skal behandles, blir typet med hensyn til HLA-fenotype, selekteres et peptid/peptider som er kjent for å binde seg til det bestemte HLA-molekylet. Alternativt selekteres det aktuelle antigenet basert på forekomsten av de ulike HLA-fenotypene i en gitt populasjon. Som et eksempel er HLA-A2 den hyppigst forekommende fenotypen i den kaukasiske populasjonen, og derfor vil en blanding som inneholder et survivin-avledet peptid som binder seg til HLA-A2, være aktiv i en stor del av denne populasjonen. Imidlertid kan blandingen i oppfinnelsen også inneholde en kombinasjon av to eller flere survivin-avledede peptider der hvert av dem interreagerer spesifikt med et annet HLA-molekyl for å dekke en større del av målpopulasjonen. Altså, som eksempler, kan den farmasøytiske blandingen inneholde en kombinasjon av et peptid begrenset til et HLA-A-molekyl og et peptid begrenset til et HLA-B-molekyl, for eksempel inkludere de HLA-A- og HLA-B-molekylene som tilsvarer forekomsten av HLA-fenotypene i målpopulasjonen, som for eksempel HLA-A2 og HLA-B35. Dessuten kan blandingen omfatte et peptid begrenset til et HLA-C-molekyl.

Det er antatt at nyttige immmunogene blandinger i oppfinnelsen i tillegg til et survivin-avledet peptid som definert her, kan omfatte en immunologisk effektiv mengde av survivin-proteinet som sådan(t) slik det er definert her, eller et immunogent fragment av dette.

Mengden av det immunogene peptidet i oppfinnelsen i den farmasøytiske blandingen kan variere avhengig av den bestemte anvendelsen. Men en enkeltdose av immunogenet ligger fortrinnsvis et sted mellom ca. 10 ug og ca. 5000 ug, mer fordelaktig mellom ca. ca. 50 ug og ca. 2500 ug, for eksempel mellom ca. 100 ug og ca. 1000 ug. Administrasjonsveier inkluderer intradermal, subkutan og intravenøs tilførsel, implantasjon i form av en "time release" formulering etc. Alle kjente administrasjonsformer er omfattet her. Dette omfatter også alle konvensjonelle doseringsformer som innen teknikken regnes som egnede formuleringer av injiserbare immunogene peptidblandinger, for eksempel lyofiliserte former og oppløsninger, suspensjoner eller emulsjonsformer som inneholder, om nødvendig, konvensjonelle farmasøytisk akseptable bærestoffer, oppløsningsmidler, konserveringsmidler, hjelpestoffer, bufferkomponenter etc. Den immunoprotektive effekten av blandingen i henhold til oppfinnelsen kan bestemmes ved å bruke forskjellige tilnærminger. Eksempler på dette er gitt i de følgende eksemplene. Et ytterligere eksempel på hvordan en CTL-respons som er fremkalt av den immunogene blandingen, kan bestemmes, er gitt i WO 97/28816, supra. En vellykket immunrespons kan også bestemmes ved forekomsten av DTH-reaksjoner etter immunisering og/eller deteksjon av antistoffer som spesifikt gjenkjenner peptidet(ene) i vaksineblandingen.

I foretrukne utførelsesformer er den farmasøytiske blandingen i oppfinnelsen en immunogen blanding eller vaksine som har evne til å utløse en immunrespons på en cancersykdom. Slik det er brukt her, refererer uttrykket "immunogen blanding eller vaksine" seg til en blanding som utløser minst en type immunrespons rettet mot cancerceller. En slik immunrespons kan derfor være av en hvilken som helst av typene som er nevnt ovenfor: En CTL-respons der CTL'er blir dannet som er i stand til å gjenkjenne HLA/peptid-komplekset som presenteres på celleoverflater, og som resulterer i celle-lysis, dvs. i det vaksinerte individet utløser vaksinen produksjon av effektor-T-celler som har en cytotoksisk effekt mot cancercellene, en B-cellerespons som fører til produksjon av anticancer-antistoffer og/eller en immunrespons av DHT-type.

I nyttige utførelsesformer blir en immunrespons rettet mot en cancersykdom utløst ved å administrere peptidet i oppfinnelsen enten ved å lade MHC klasse I-molekyler på antigenpresenterende celler (APCer) fra pasienten, ved å isolere PBL'er fra pasienten og inkubere cellene med peptidet før injeksjon av cellene tilbake i pasienten eller ved å isolere forløper-APCer ved å bruke cytokiner og antigen før cellene injiseres tilbake i pasienten. Således er, i en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, metoden for behandling av cancerpasienter en som er kjennetegnet ved at peptidet administreres ved å presentere peptidet for pasientens antigenpresenterende celler (APCer) ex vivo fulgt av injeksjon av de behandlede APCene tilbake i pasienten. Det finnes minst to alternative måter å utføre dette på. Ett alternativ er å isolere APCer fra cancerpasienten og inkubere (lade) MHC klasse I-molekylene med peptidet. "Ladning" av MHC klasse I-molekylene betyr å inkubere APCene med peptidet, slik at APCene med MHC klasse I-molekylene som er spesifikke for peptidet, vil binde seg til peptidet og derfor bli i stand til å presentere det for T-cellene. Deretter blir APCene re-injisert i pasienten. En annen alternativ metode bygger på de nye funnene som er gjort innen feltet dendrittisk cellebiologi. I dette tilfellet isoleres monocytter (som er forløpere for dendrittiske celler) fra pasienten og differensieres in vitro til profesjonelle APCer (eller dendrittiske celler) ved bruk av cytokiner og antigen. Dette er beskrevet i eksemplene 3 og 5, der adherente PBL'er (som hovedsakelig er monocytter) blir dyrket in vitro sammen med GM-CSF, IL-4 og TNF-a. Deretter blir de in vitro genererte DCene pulsert med peptidet og injisert i pasienten.

På grunn av det faktum at survivin viser seg å være uttrykt i de fleste cancerformer, er det svært sannsynlig at vaksinene i henhold til oppfinnelsen kan frembringes for å kontrollere en hvilken som helst type cancersykdom der survivin er uttrykt. Således er vaksineblandingen i henhold til oppfinnelsen immunologisk aktiv mot for eksempel en hematopoietisk malignitet inklusive kronisk lymfatisk leukemi og kronisk myeloid leukemi, melanom, brystcancer, livmorhalscancer, eggstokkcancer, lungecancer, koloncancer, pankreascancer og prostatacancer.

Av beskrivelsen ovenfor vil den øvede person lett forstå at peptidene i oppfinnelsen er anvendelige som cancerdiagnostiske redskaper, spesielt anvendelige, da peptidene er avledet fra survivin som er uttrykt i alle cancertyper. Derfor frembringer peptidene i oppfinnelsen grunnlaget for å utvikle universelt appliserbare diagnostiske og prognostiske prosedyrer når det gjelder cancersykdommer. I andre anvendelige utførelsesformer er blandingen i oppfinnelsen en blanding for ex vivo eller in situ diagnose av forekomsten i en cancerpasient, for eksempel basert på deteksjon av survivin-reaktive T-celler blant PBL'er eller i tumorvev.

Følgelig er det, i enda videre aspekter, frembrakt en diagnostisk kit for ex vivo eller in situ diagnose av forekomsten av survivin-reaktive T-celler blant PBL'er eller i tumorvev som omfatter ett eller flere peptider i oppfinnelsen, og en metode for å detektere forekomsten av survivin-reaktive T-celler i en pasient, der metoden omfatter å bringe tumorvev eller en blodprøve i kontakt med et kompleks av et peptid i oppfinnelsen og et klasse I HLA-molekyl eller et fragment av et slikt molekyl og detektere binding av komplekset til vevet eller blodcellene.

En annen nyttig diagnostisk eller prognostisk tilnærming er basert på generering av antistoffer i en heterolog dyreart, for eksempel murine antistoffer rettet mot et humant survivin-avledet peptid i oppfinnelsen, som så kan brukes, for eksempel til å diagnostisere for forekomst av cancerceller som presenterer peptidet. For slike immuniseringsformål kan mengden av peptid være mindre enn den som brukes i forløpet for in vivo terapi, som nevnt ovenfor. Generelt kan en foretrukken dose ligge mellom ca. 1 ug og ca. 750 ug peptid. Det er også mulig å produsere monoklonale antistoffer basert på immunisering med et peptid i oppfinnelsen. Følgelig relaterer den foreliggende oppfinnelsen seg også til et molekyl, nærmere bestemt et monoklonalt eller polyklonalt antistoff som inkluderer et fragment av dette, som har evne til å binde seg spesifikt til et peptid i oppfinnelsen og til et molekyl som har evne til å blokkere en slik binding, for eksempel et antistoff fremkalt mot det monoklonale eller polyklonale antistoffet som er rettet mot et peptid i oppfinnelsen.

I et aspekt frembringer oppfinnelsen et kompleks av et peptid i oppfinnelsen og et klasse I HLA-molekyl eller et fragment et slikt molekyl, som er nyttig som et diagnostisk reagens slik det er beskrevet supra. Komplekset dannes ved en hvilken som helst konvensjonell metode inklusive dem som er beskrevet i de følgende eksemplene. Et slikt kompleks kan være monomert eller multimert.

Den foreliggende oppfinnelsen frembringer hjelpemidler for å lindre, eller kurere en cancersykdom. Følgelig er det et videre aspekt av oppfinnelsen å bruke peptidene

som definert ovenfor for fremstilling av et medikament til behandling av cancer. Et enda videre aspekt av den foreliggende oppfinnelsen relaterer seg til anvendelse av et molekyl eller en blanding som definert ovenfor for fremstilling av et medikament til behandling av cancer. Fortrinnsvis en cancersykdom assosiert med ekspresjon av survivin, inklusive som eksempler: en hematopoietisk malignitet medregnet kronisk lymfatisk leukemi og kronisk myeloid leukemi, melanom, brystcancer, livmorhalscancer, eggstokkcancer, lungecancer, koloncancer, pankreascancer og prostatacancer. Anvendelsen omfatter administrering til en pasient som lider av sykdommen, en effektiv mengde av den farmasøytiske blandingen i overensstemmelse med oppfinnelsen, et molekyl som har evne til å binde seg spesifikt til et peptid i oppfinnelsen og/eller et molekyl som har evne til å blokkere bindingen av et slikt molekyl.

I noen tilfeller vil det være hensiktsmessig å kombinere anvendelsen av oppfinnelsen med en konvensjonell cancerbehandling, som strålebehandling eller kjemoterapi.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i større detalj i de ikke-begrensende eksemplene og figurene nedenfor, der

Fig. 1 illustrerer T-celleresponsen som målt ved et ELISPOT i pasient CLL1 til intet peptid, Surl (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10)-peptid og Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO:3)-peptid. PBL'er ble stimulert en gang med peptid før utplating ved 6xl0<5>celler per brønn i duplikat. Gjennomsnittsantall spots per peptid ble kalkulert ved å bruke en CCD scanning-anordning og et datasystem, Fig. 2 illustrerer T-cellerespons som målt ved et ELISPOT i pasient CLL1 til intet peptid, peptidanalogen SurlL2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO:4) og peptidanalogen SurlM2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO:5). PBL'er ble stimulert en gang med peptid før fordeling på plate med IO<4>celler per brønn i duplikat. Gjennomsnittlig antall spots per peptid ble kalkulert ved å bruke en CCD scanning-anordning og et datasystem, Fig. 3 viser responser, målt i et ELISPOT i pasient CLL2 og CLL3, på intet peptid (svart søyle), Su ri (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10)-peptidet (grå søyle), Sur9(ELTLGEFLKL, SEQ ID NO:3)-peptidet (hvit søyle), det analoge peptidet SurlL2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO:4) (lysegrå søyle) og det analoge peptidet SurlM2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) (mørkegrå søyle). Hvert eksperiment ble utført med IO<5>celler per brønn i duplikat, og gjennomsnittlig antall spots ble kalkulert, Fig. 4 representerer T-celler som ble isolert fra tu mo r-infiltrerte lymfeknuter fra pasient Meil, Mel2 og Mel3, stimulert en gang in vitro og analysert i et ELISPOT assay for respons på intet peptid (svart søyle), peptidene Surl (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) (grå søyle) og Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO:3) (hvit søyle). Hvert eksperiment ble utført i duplikat med IO<5>celler per brønn. I hvert eksperiment var det også inkludert to brønner uten tilsetning av peptid. Det gjennomsnittlige antallet spots per peptid ble kalkulert for hver pasient, Fig. 5 viser funksjonell aktivitet av survivin-spesifikke CTL'er. CTL'er ble isolert fra en melanom-infiltrert lymfeknute ved å bruke survivin-dekkede magnetiske kuler (beads). (A) Spesifikk lysis av melanom-cellelinjer; det HLA-A2-positive FM3 (triangel) og den HLA-A2-negative FM45 (kvadrat). (B) Spesifikk lysis av brystcancer-cellelinjer; det HLA-A2-positive MCF-7 (triangel) og det HLA-A2-negative BT-20 (kvadrat), Fig. 6 viser frekvens av survivin-reaktive CTVer i PBL fra brystcancerpasienter. Reaktivitet ble undersøkt i tre brystcancerpasienter (øverst, i midten og nederst, henholdsvis) ved ELISPOT. For hver pasient ble assayene utført i fravær av peptid, i nærvær av surl-peptid, i nærvær av sur9 og i nærvær av det modifiserte surlM2-peptidet. 1 x IO<4>effektorceller per brønn ble brukt. Grafen fremstiller kvantifiseringen av reaktive celler, grå kolonner representerer gjennomsnittlig antall IFN-y-produserende celler, Fig. 7 illustrerer HLA-35-binding av survivin-avledede peptider og analyse av den peptid-medierte gjenvinningen av HLA-B35-molekyler ved survivin-avledede peptider. Lysater av metabolsk merkede T2-B35-celler ble inkubert ved 4°C i nærvær av 50, 5, 0,5, 0,05 og 0,005 mM av peptid. Gjenvinningen av HLA-B35 ble analysert i et kompleksbindingsassay og kvantifisert etter IEF-gelelektroforese ved å bruke ImageGauge phosphorimager software (FUJI fotofilm Co., Ltd., Japan). Cso-verdien er den konsentrasjonen av peptidet som er nødvendig for å oppnå halvparten av maksimal binding til HLA-B35, Fig. 8 viser spontane T-celleresponser observert i PBL'er fra cancerpasienter. A) Antall IFNy-spotdannende celler målt i ELISPOT assay uten peptid (hvite søyler), med sur51-59 (svarte søyler) eller sur46-54 (grå søyler), blant in vitro stimulerte PBL'er fra pasient CLL5 (IO<5>celler/brønn), HEM12 (IO<5>celler/brønn) og HEM8 (5xl0<4>celler/brønn). B) Antall spotdannende celler blant 1.7xl0<5>PBL'er fra HEM 12, dyrket i 10 dager med peptid-pulserte modnede, autologe dendrittiske celler. Kolonnene representerer gjennomsnittet av to målinger, Fig. 9 viser spontane T-celleresponser mot naturlige og modifiserte survivinpeptider i melanompasienter. A) Antall spotdannende celler målt ved ELISPOT-assay mot sur51-59 og sur51Y9 fra pasient FM25 i PBL'er (4xl0<3>celler/brønn) og TIL'er (7xl0<4>celler/brønn) så vel som TIL'er fra FM45 (IO<4>celler/brønn). B) Antall spotdannende celler målt ved ELISPOT-assay mot sur46 og sur46Y9 målt i TIL'er fra FM74 (5xl0<3>celler/brønn). Kolonnene representerer gjennomsnittet av to målinger med den ikke-spesifikke IFNy-frigjøring subtrahert, Fig. 10 illustrerer bindingsaffinitet av survivin-avledede peptider til HLA-A1. Båndene av klasse I MHC tunge kjeder ble kvantifisert på en Phosphorimager. Mengden av stabiliserte HLA-A1 tunge kjeder er direkte relatert til bindingsaffiniteten for det tilsatte peptidet. Den peptidmedierte gjenvinningen av HLA-A1 (arbitrære enheter) indusert av 40, 4, 0.4, 0.04 uM av Sur93-101 (linje), Sur93T2 (kvadrat), Sur49-58 (sirkel) eller Influenza A, PB1 591-599 (triangel), Fig. 11 viser spontane responser mot HLA-Al-begrensede peptider. Spontane T-celleresponser mot survivin-avledede peptider målt ved ELISPOT-assay. Det gjennomsnittlige antallet av peptidspesifikke IFNy-spots dannet som respons på Sur92-101, Sur38Y9, Sur47Y10 og Sur93T2 blant 5xl0<4>in vitro stimulerte PBL eller TIL fra melanompasienter. De peptidspesifikke responsene som er vist, ble observert blant analyser av 6 PBL-prøver og 3 TIL-prøver fra melanom (Med-pasienter. Ikke-spesifikke IFNy-spots er subtrahert. Søyler: omfang av duplikater, Fig. 12 viser spontane responser mot HLA-A11-begrensede peptider. Spontane T-celleresponser mot survivin-avledede peptider målt ved ELISPOT-assayet. Det gjennomsnittlige antallet av peptidspesifikke IFNy-spots dannet som respons på Sur53-62 blant 5xl0<4>in vitro stimulerte PBL eller TIL fra cancerpasienter. De peptidspesifikke responsene som er vist, ble observert blant analyser av 5 melanom(Mel)-pasienter (5 PBL, 1 TIL) og 2 CLL (CLL)-pasienter (PBL). Ikke-spesifikke IFNy-spots er subtrahert. Søyler: omfang av duplikater, Fig. 13 illustrerer spontane responser mot HLA-A3-begrensede peptider. Spontane T-celleresponser mot survivin-avledede peptider som målt ved ELISPOT-assayet. Det gjennomsnittlige antallet av peptidspesifikke IFNy-spots dannet som respons på Surl8K10 blant 5xl0<4>in vitro stimulerte PBL eller TIL fra melanompasienter. De peptidspesifikke responsene som er vist, ble observert blant analyser av 23 PBL- prøver og TIL-prøver fra melanom(Mel)pasienter. Ikke-spesifikke IFNy-spots er subtrahert. Søyler: omfang av duplikater, Fig. 14 illustrerer spontane responser mot HLA-A2-begrensede peptider. Spontane T-celleresponser mot survivin-avledede peptider målt ved ELISPOT-assayet. Det gjennomsnittlige antallet av peptidspesifikke IFNy-spots dannet som respons på llmer-peptidet, Surl8-28 blant 5xl0<4>in vitro stimulerte PBL fra cancerpasienter. De peptidspesifikke responsene som er vist, ble observert blant analyser av 10 PBL-prøver fra 2 melanom(Mel), 6 CLL(CLL) og 2 bryst-carsinom(MC)-pasienter. Ikke-spesifikke IFNy-spots er subtrahert. Søyler: omfang av duplikater, Fig. 15 illustrerer spontane T-celleresponser mot survivin-avledede peptider målt ved ELISPOT-assayet. Det gjennomsnittlige antallet av peptidspesifikke IFNy-spots dannet som respons på sur6-14 (LPPAWQPFL) blant IO<5>in vitro stimulerte PBL fra fem melanompasienter (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), to CLL-pasienter (CLL1, CLL54) og to brystcancerpasienter (brystll, brystl5). Ikke-spesifikke IFNy-spots er subtrahert, Fig. 16 illustrerer laboratorieverdiene for stabil deteksjon av LDH, kolinesterase, kreatinin, hemoglobin, leukocytter og trombocytter etter vaksinasjonsbehandling hos fire pasienter (ARW, • KN, - WWE, ■ GB) Fig. 17 viser kinetisk analyse av immunitet for survivinpeptider bestemt ved IFNy ELISPOT. PBMCer ble oppnådd før den første DC-vaksinasjonen og tre måneder etter denne. Antallet IFNy-spotdannende celler større enn bakgrunn er beskrevet.

I følgende tabell er det ført opp en liste over aminosyresekvenser for peptider brukt her og deres respektive SEQ ID NO:

EKSEMPEL 1

Identifikasjon av en cytotoksisk T-lymfocyttrespons på apoptose-inhibitorproteinet survivin i cancerpasienter

Sammendrag

Ved å bruke CTL-epitoper avledet av survivin er det gjort en studie av spesifikk T-cellereaktivitet mot slike antigener i perifert blod fra pasienter med kronisk lymfatisk leukemi (CLL) og i tumorinfiltrerte lymfeknuter fra melanompasienter ved ELISPOT-analyse. CTL-responser på survivin-avledede peptidepitoper ble detektert

i tre av seks melanompasienter og i tre av fire CLL-pasienter. Ingen T-cellereaktivitet ble detektert i PBL fra seks friske kontroller. Survivin-avledede peptider kan derfor tjene som viktige og vidt anvendelige mål for anti-cancer immunoterapeutiske strategier.

Introduksjon

Survivinproteinet ble undersøkt for forekomst av HI_A-A*0201 (HLA-A2)-bindende peptidmotiver, og etter vellykket identifikasjon, ble peptidene brukt til å teste for spesifikk T-cellereaktivitet i leukemi- og melanompasienter ved ELISPOT-assay. I begge pasientkohorter ble CTL-responser på to survivin-avledede peptidepitoper detektert, mens ingen T-cellereaktivitet kunne detekteres i de friske kontrollene. Disse data tyder på at survivin representerer et vidt uttrykt tumorantigen som gjenkjennes av autologe T-celler.

Materiale og metoder

Pasienter og normale kontroller

Perifere veneblodprøver fra 4 pasienter med diagnosen CLL (kalt CLL1-4) og blodprøver fra 6 normale individer ble tappet i hepariniserte glass. PBL'er ble isolert ved bruk av Lymphoprep-separasjon og frosset i kalvefosterserum (FCS) med 10 % dimetylsulfoksid. I tillegg ble T-lymfocytter fra tumorinfiltrerte lymfeknuter samlet fra 6 melanompasienter (kalt mell-6). Nylig fjernede lymfeknuter ble skåret til små fragmenter, knust for å frigjøre celler til kultur og kryopreservert. PBL'er var tilgjengelig fra 4 av melanompasientene. Alle de inkluderte individene var HLA-A2-positive som bestemt ved FACS-analyse ved å bruke det HLA-A2-spesifikke antistoffet BB7.2. Antistoffet var renset fra hybridom-supernatant. Pasientprøver ble skaffet fra København Amts Sygehus i Herlev, Danmark. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene før noen av disse målingene.

Survivin- avledede peptider

Alle peptider ble skaffet fra Research Genetics (Huntsville, AL, USA) og levert med

>90 % renhet verifisert ved HPLC- og MS-analyse. Peptidene som ble brukt, er ført opp i tabell 1.

<a>Verdiområde som er ført opp med senket skrift, indikerer posisjonen i peptidet i survivinsekvensen som beskrevet i US 6.245.523.

<6>Cso-verdien er den konsentrasjonen av peptidet som er nødvendig for å oppnå halvparten av maksimal binding til HLA-A2, bestemt som beskrevet nedenfor.

Kompleksbindingsassay for peptidbinding til klasse I MHC- molekyler

Kompleksbindingsassays for binding av de syntetiske peptidene til klasse I MHC-molekyler som er metabolsk merket med [35S]-metionin, ble utført som beskrevet (12,13). Kompleksbindingsassayet er basert på stabilisering av klasse I-molekylene etter ladning med peptid i peptidtransportør-manglende cellelinje T2. Deretter ble korrekt foldede, stabile tunge kjeder av MHC immunpresipiterert ved bruk av konformasjonsavhengige antistoffer. Etter IEF-elektroforese ble gelene eksponert for phosphorlmager-skjermer, og peptidbinding ble kvantifisert ved å bruke Imagequant Phosphorlmager-programmet (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Antigenstimulering av PBL' er

For å utvide sensitiviteten for ELISPOT-assayet ble PBL'er stimulert en gang in vitro før analyse (14,15). Friske og tidligere fryste PBL'er ga lignende resultater i ELISPOT-assayet. På dag 0 ble PBL'er eller knust lymfeknute tinet og utsådd i 2 ml/brønn ved en konsentrasjon på 2xl0<6>celler i 24 brønn-plater (Nunc, Danmark)

i AIM-medium (Life Technologies, Roskilde, Danmark), 5 % varme-inaktivert humant serum og 2 mM av L-glutamin i nærvær av 10 uM av peptid. I hvert eksperiment ble en brønn uten peptid inkludert. To dager senere ble 300 IU/ml rekombinant interleukin-2 (IL-2) (Chiron, Ratingen, Tyskland) tilsatt til kulturene. De dyrkede cellene ble testet for reaktivitet ved ELISPOT-assay på dag 12.

ELISPOT- assay

ELISPOT-assayet som ble brukt til å kvantifisere peptid-epitopspesifikke interferon-y-frigjørende effektorceller, ble utført som i (16). Kort beskrevet ble 96-brønnplater med bunn av nitrocellulose (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Danmark) ble dekket med anti-IFN-y-antistoff (1-D1K, Mabtech, Nacka, Sverige). Brønnene ble vasket, blokkert med AIM V medium og celler ble tilsatt i duplikater i ulike cellekonsentrasjoner. Peptider ble så tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert over natten. Den påfølgende dag ble mediet kastet og brønnene ble vasket før tilsetning av biotinylert sekundært antistoff (7-B6-l-Biotin, Mabtech). Platene ble inkubert i 2 timer, vasket og Avidin-enzymkonjugat (AP-Avidin, Calbiochem, Life Technologies) tilsatt til hver brønn. Plater ble inkubert ved RT i en time og enzym-substratet NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 5-10 min. Reaksjonen ble terminert ved å vaske med springvann til etter fremkomst av mørkfiolette spots. Spots ble talt ved å bruke Alphalmager-systemet (Alpha, Innotech, San Leandro, CA. USA) og den peptidspesifikke CTL-frekvensen (ev. antallet) kunne kalkuleres fra antallet spotdannende celler. Assayene ble alle utført i duplikat for hvert peptidantigen.

Resultater

Binding av survivin- avledede peptider til HLA- A2

Aminosyresekvensen for survivinproteinet ble screenet for de mest sannsynlige HLA-A2 nona- og dekamer peptidepitopene ved å bruke de viktigste HLA-A2-spesifikke ankerrestene (17). Ti survivin-avledede peptider ble syntetisert og undersøkt for binding til HLA-A2. En epitop fra HIV-1 pol476-484 (ILKEPVHGV, SEQ ID NO: 11) (tabell 1) ble brukt som en positiv kontroll. Den peptidkonsentrasjonen som er nødvendig for halvparten av maksimal gjenvinning av klasse I MHC (Cso-verdi), var 0,7 uM for den positive kontrollen. Til sammenligning bandt peptidet med betegnelsen Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO:3) seg med en affinitet på Cso = 10 uM. Peptidene betegnet henholdsvis Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO:l) og Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID NO:2) bandt seg til HLA-A2 ved Cso = 30 uM, mens Surl (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) og Sur3 (KVRRAIEQL, SEQ ID NO: 13) bandt seg svakere (Cso > 100 uM). Fem av peptidene som ble undersøkt (Sur2, Sur4, Sur5, Sur7 og SurlO), bandt seg ikke til HLA-A2.

Siden Surl er en svak HLA-A2-binder, ble to analoge peptider, betegnet henholdsvis SurlL2 og SurlM2, der en bedre ankerrest (leucin eller metionin) erstattet det naturlige treonin i posisjon 2, syntetisert. Begge disse peptidene binder seg med nesten like høy affinitet til HLA-A2 som den positive kontrollen (Cso = l uM).

CTL- respons på survivin i CLL- pasienter

PBL'er fra fire HLA-A2-positive CLL-pasienter ble stimulert en gang in vitro før undersøkelse i ELISPOT-assayet. Denne prosedyren ble valgt for å utvide sensitiviteten for ELISPOT. Alle de ti survivin-avledede peptidene som er nevnt ovenfor, ble inkludert i den første linjen av eksperimenter. Responser ble detektert på Surl og Sur9, og bare data for disse peptidene er gitt i figurene. Figur 1 viser CTL-reaktivitet på Surl og Sur9 som bestemt i pasient CLL1. Hver spot representerer en peptidreaktiv, INF-y-produserende celle. Gjennomsnittlig antall spots per peptid ble kalkulert ved å bruke en CCD-scanning-anordning og et datasystem. Femtito Sur9 peptidspesifikke spots (etter subtraksjon av spots uten tilsatt peptid) per 6xl0<5>ble detektert i pasienten CLL1 (fig. 1). Ingen respons ble detektert på det svake HLA-A2-bindende peptidet Surl, men pasienten responderte kraftig på den sterke HLA-A2-bindende peptidanalogen SurlM2 (35 peptidspesifikke spots per IO<4>celler) (fig.2). Ingen respons ble detektert på den andre sterke HI_A-A2-bindende peptidanalogen SurlL2 i denne pasienten (fig.2). Pasient CLL2 responderte kraftig på Sur9 (128 peptidspesifikke spots per IO<5>celler) og svakt på Surl (22 peptidspesifikke spots per IO<5>celler) (fig.3). Responsen på SurlL2-analogen var bare ubetydelig økt sammenlignet med den naturlige epitopen, mens pasienten responderte tilsvarende kraftig på SurlM2-peptidet som på dekamer-peptidet Sur9. I pasient CLL3 ble det observert en svak respons på Sur9 (fig.3). Ingen respons på Surl- eller det modifiserte Surl-peptidet ble observert i pasienten. Ingen survivinresponser ble detektert i den siste pasienten, CLL4 (data ikke vist). PBL'er fra 6 friske HLA-A2-positive kontroller ble analysert for å utrede hvor vidt en respons på survivin kunne bli detektert i friske individer. Ingen respons ble observert i noen av kontrollene på noen av de survivin-avledede peptidene.

CTL- respons på survivin i melanompasienter

T-lymfocytter isolert fra tumorinfiltrerte lymfeknuter fra HLA-A2-positive melanompasienter ble undersøkt. Den nylig fjernede lymfeknuten ble skåret til små fragmenter og knust for å frigjøre celler til kultur. Celler ble stimulert en gang med peptid in vitro før undersøkelse i ELISPOT-assayet. Survivin-spesifikke T-celler ble detektert i tre av de seks analyserte pasientene. En kraftig Sur9-respons ble detektert i pasient Mel2 og Mel3. En svakere respons på Surl-peptidet ble også detektert i disse pasientene (fig.4). I Meil var responsen på det svakt bindende peptidet Surl kraftigere enn responsen på den sterkere HLA-A2-binderen Sur9 (fig.4). Ingen respons ble detektert i de tumorinfiltrerte lymfeknutene fra de siste tre melanompasientene (Mel4-6). PBL'er fra to av de survivin-reagerende pasientene, Meil og Mel2, og fra to av de ikke-reagerende pasientene, Mel4 og Mel5, ble undersøkt. Ingen respons kunne detekteres på verken Sur9 eller Surl i PBL'er fra noen av disse pasientene (data ikke vist).

EKSEMPEL 2

Spontane cytotoksiske T-celleresponser på survivin-avledede MHC klasse I-begrensede T-celle-epitoper in situ og ex vivo i cancerpasienter Sammendrag

Spontane cytotoksiske T-celleresponser på survivin-avledede MHC klasse I-begrensede T-celle-epitoper ble vist in situ så vel som ex vivo i brystcancer-, leukemi- og melanompasienter. Dessuten var survivin reaktive T-celler som var isolert ved hjelp av magnetiske kuler dekket med MHC/peptidkomplekser, cytotoksiske overfor HLA-avstemte tumorer fra ulike vevstyper. Ved å være et universelt tumorantigen kan survivin tjene som et bredt appliserbart mål for anticancer-immunterapi.

Materiale oa metoder

Konstruksjon av HLA- peptidkomplekser for T- cellefarging og T- cellesortering.

Et gjenkjennelsessted (a recognition site) for enzymatisk biotinylering ved bruk av biotin-proteinligase (BirA) in fusjon med 5'-enden av den ekstracellulære domene av HLA A<*>0201 (rester 1-275) ble uttrykt i E. coli BL21 (DE3). Det rekombinante proteinet ble renset med størrelses- (Sephadex G25, Pharmacia) og ionebytter-(mono-Q, Pharmacia) kromatografi fra inklusjonslegemer (inclusion bodies) solubilisert i 8 M urea. HLA A<*>0201 ble foldet in vitro ved fortynning i nærvær av det modifiserte survivinpeptidet SurlM2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO:5) eller MAA-peptidet gpl00154-163, og deretter biotinylert som beskrevet tidligere (35, 36).

Etter gelfiltrering på en Pharmacia Sephadex G25-kolonne for å fjerne ubundet biotin ble proteinet multimerisert med streptavidin-FITC-konjugerte dekstranmolekyler (velvillig skaffet av L. Winther, DAKO, Danmark) for å generere multivalente HLA-dekstranforbindelser for immunhistokjemi. HLA A<*>0201-konstruktet var en velvillig gave fra Dr. Mark M. Davis (Dept. of Microbiology and Immunology, Stanford University, Palo Alto, CA). Celleseparasjon ble utført som tidligere beskrevet (37). Kort beskrevet ble 5 x IO<6>streptavidin- konjugerte magnetiske kuler (Dynal, Oslo, Norge) vasket to ganger i 200 ul kald PBS, 0,5 ug peptid/A<*>0201-monomere ble tilsatt og blandingen inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Etter to vasker ble disse kulene blandet med PBL'er i et forhold på 1:10 og deretter inkubert i 1 time fulgt av presipitering av kule-bundne celler i et magnetisk felt. Presipitasjonstrinnet ble repetert en gang.

Immunhistokjemiske farginger

For farging med FITC-konjugerte, multimere peptid/MHC-komplekser ble vevssnitt tørket over natten og deretter fiksert i kald aceton i 5 min. Alle inkubasjonstrinn ble utført ved romtemperatur og i mørke: (i) 45 min. av det primære antistoffet (fortynnet 1:100), (ii) CY 3-konjugert geit anti-mus (fortynnet 1:500, kode 115-165-100, Jackson ImmunoResearch, skaffet fra Dianova, Hamburg, Tyskland) i 45 min. og endelig (iii) multimerene i 75 min. Mellom hvert trinn ble objektglassene vasket to ganger i 10 min. i PBS/BSA 0,1 %. Objektglassene ble plassert i "vectashield" og oppbevart i kjøleskap inntil de ble observert under det konfokale mikroskopet.

Cyto toksisitetsassay

Konvensjonelle [51Cr]-frigjøringsassays for CTL-mediert cytotoksisitet ble gjennomført som beskrevet i (13). Målceller var autologe EBV-transformerte B-cellelinjer, den HLA-A2-positive brystcancercellelinjen MCF-7 (tilgjengelig ved ATCC), den HLA-A2-positive melanomcellelinjen FM3 (38), den HLA-A2-negative brystcancercellelinjen BT-20 (tilgjengelig fra ATCC) og den HLA-A2-negative melanomcellelinjen FM45 (38). Alle cancercellelinjer uttrykte survivin, undersøkt ved RT-PCR (data ikke vist).

ELISPOT- assay

ELISPOT-assayet ble brukt for å kvantifisere peptidepitop-spesifikke IFN-y-frigjørende effektorceller og er beskrevet tidligere (39). Kort beskrevet ble 96-brønnplater med bunn av nitrocellulose (MultiScreen MAIP N45, Millipore) dekket med et anti-IFN-y-antistoff (1-DIK, Mabtech, Sverige), og ikke-spesifikk binding ble blokkert ved å bruke AIM V (GibcoBRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Lymfocytter ble tilsatt i ulike cellekonsentrasjoner sammen med de spesifikke peptidene og T2-celler og inkubert over natten ved 37°C. Etter to vasker ble det biotinylerte deteksjonsantistoffet (7-B6-l-Biotin, Mabtech) tilsatt. Spesifikk binding ble visualisert ved å bruke alkalisk fosfatase-avidin sammen med det respektive substratet (GibcoBRL). Reaksjonen ble terminert ved tilsynekomst av mørkfiolette spots, som ble kvantifisert ved å bruke Alphalmager-systemet (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Peptidene som ble brukt i ELISPOT, var Surl, Sur9 og det Surl-analoge peptidet SurlM2 som beskrevet i eksempel 1.

Resultater

In situ farging av HLA- A2/ survivinreaktive T- celler

I eksempel 1 ble to survivin-avledede epitoper som gjenkjennes av T-celler i leukemi og melanom, dvs. Surl, identifisert. Den svake bindingsaffiniteten for Surl til HLA-A2 ble vesentlig bedret ved å erstatte treonin ved posisjon 2 med en bedre ankerrest (metionin; SurlM2). Dette tiltaket gjorde det mulig å konstruere stabile HLA-A2/peptidkomplekser. Disse kompleksene ble multimerisert ved å bruke dekstranmolekyler, som ble konjugert med streptavidin og FITC. Multimeriserte MHC-komplekser ble brukt for å farge acetonfiksert, frosset materiale. Ved å bruke et confokalt lasermikroskop kunne SurlM2/HLA-A<*>0201-reaktive CTL'er lett bli detektert in situ i tumormikromiljøet. Vi beskrev (påviste) slike celler i primærtumoren og i vaktpost- (sentinel-) lymfeknuten i en pasient med melanom i stadium III så vel som i en primær brystcancer-lesjon. For å sikre fargingens spesifisitet ble en serie av negative kontroller gjennomført. Verken bruken av peptid/HLA-dekstran-mulitimere med peptider avledet fra melanom-differensieringsantigenet gplOO på samme tumor eller SurlM2/HLA-dekstran-multimere ved en tumorprøve tatt fra en HLA-A2-negativ donor resulterte i en positiv farging.

Isolerte survivin- reaktive CTUer ( ?) lyse tumorcellelinjer av annen opprinnelse

For å karakterisere den funksjonelle kapasiteten for survivin-reaktive CTL'er, ble disse cellene isolert ved hjelp av magnetiske kuler dekket med HLA-A2/SurlM2-komplekser (36). En nylig resektert melanom-infiltrert lymfeknute ble skåret til små fragmenter og knust for å frigjøre celler til kultur. Celler ble stimulert en gang med peptid in vitro før isolering. En dag etter isolering ble IL-2 tilsatt, og på dag 5 ble disse cellenes kapasitet til å drepe tumorceller testet enten ved ELISPOT eller i standard 51Cr-frigjøringsassays. For det første var det ved hjelp av ELISPOT-analyse mulig å fastslå at CTL'er isolert ved å bruke det modifiserte SurlM2/HLA-A2-komplekset, også responderte på det naturlige Surl-peptidet (data ikke vist). For det andre ble cytotoksisiteten for de survivinreaktive CTL'ene mot den HLA-A2-positive melanom-cellelinjen FM 3 (fig.5A) og den HLA-A2-positive brystcancer-cellelinjen MCF-7 (fig.5B) testet. De isolerte T-cellene lyserte effektivt begge HLA-A<*>0201-cellelinjene. Derimot ble ingen cytotoksisitet observert mot den HLA-A2-negative melanom-cellelinjen FM45 (fig.5A) eller den HLA-A2-negative brystcancer-cellelinjen BT-20 (fig. 5B).

Survivinreaktivitet målt i PBL med ELISPOT

Forekomsten av survivinreaktive T-celler i PBL'er fra ti HLA-A2-positive brystcancerpasienter ble undersøkt med ELISPOT. Før analyse ble PBL'er stimulert en gang in vitro for å utvide sensitiviteten for assayet. Reaktivitet på de følgende survivin-peptidene ble undersøkt: Surl, Sur9 og SurlM2. Survivin-spesifikke T-celler ble detektert i seks av de ti HLA-A2-positive brystcancerpasientene. Representative eksempler er gitt i fig.6. I PBL'er fra to pasienter ble en respons mot Surl og den modifiserte analogen Sur 1M2 detektert, men ikke mot Sur9 (fig.6, øverst, i midten), i tre pasienter ble en respons på Sur9 detektert, men ikke på Surl og SurlM2 (fig.6, nederst), og en pasient responderte bare på SurlM2. Derimot ble ingen survivinresponser detektert i PBL'er fra 20 friske HLA-A2-positive donorer. Likeledes ble PBL'er fra fjorten HI_A-A2-positive melanompasienter undersøkt. Survivinresponser var til stede i syv av disse pasientene (tabell 2). To pasienter responderte på Sur9-peptidet, tre på SurlM2-peptidet, en på både Surl og SurlM2 og en på alle tre peptider. I eksempel 1 ble T-celleresponser på survivin i 3 pasienter med kronisk lymfatisk leukemi (CLL) testet (tabell 2; CLL1, CLL2, CLL3). Disse studiene ble utvidet ved å bruke PBL'er fra tre andre CLL-pasienter. Påfallende produserte alle pasienter en T-cellerespons på minst en survivinepitop (tabell 2, CLL5, CLL6, CLL7). Dessuten ble PBL'er fra en pasient som led av kronisk myeloid leukemi (KML), undersøkt. I denne pasienten ble en respons på alle tre peptider identifisert (data ikke vist). Dataene er oppsummert i tabell 2.

a) Hyppighet (frequency) av reaktive celler per IO<4>; 14 pasienter undersøkt. b) Hyppighet (frequency) av reaktive celler per IO<4>; 10 pasienter undersøkt.

c) Hyppighet av reaktive celler per IO<5>; 7 pasienter undersøkt.

EKSEMPEL 3

HLA-B35-begrensede immunresponser på survivin-avledede peptider i cancerpasienter

Sammendrag

I denne studien ble to survivin-avledede epitoper som er begrenset til HLA-B35, identifisert ogkarakterisert. Spesifikk T-cellereaktivitet mot begge disse epitopene var til stede i perifert blod fra pasienter med ulike hematopoietiske maligniteter og melanom. Substitusjoner av ankerrester ved C-terminalen bedret gjenkjennelsen av tumorinfiltrerende lymfocytter fra melanompasienter. Videre ble det vist spontane cytotoksiske T-celleresponser på survivin in situ i en primær melanomlesjon. Disse epitopene utvider appliserbarheten av fremtidige vaksinestrategier basert på survivinpeptider i relasjon til maligniteter så vel som (til) HLA-profil for pasientene som er involvert.

I eksemplene 1 og 2 ble HLA-A2-begrensede, survivin-avledede T-celle-epitoper studert. Siden HLA-A2 bare er uttrykt i omtrent 30 % av den kaukasiske populasjonen (63), må peptidepitoper begrenset til andre HLA klasse I-molekyler identifiseres for å øke fraksjonen av pasienter som kan (could be) behandles. I denne studien ble det identifisert to nye T-celle-epitoper fra survivin begrenset til HLA-B35, som er uttrykt i 9 % av den kaukasiske populasjonen (63), og spontane immunresponser på disse survivinpeptidene ble detektert i pasienter med ulike hematopoietiske maligniteter og melanom.

Materiale og metoder

Pasienter

Perifere veneblodprøver fra cancerpasienter ble samlet, PBL'er ble isolert ved å bruke Lymphoprep-separasjon (Avdeling for klinisk immunologi, Universitets Hospitalet, København) og frosset i FCS med 10 % DMSO. Ti HLA-B35-positive pasienter ble selektert for videre analyse. Disse pasientene led av henholdsvis melanom, CLL, follikulært lymfom (FL), diffus stort B-celle lymfom (DLBCL) og multippelt myelom (MM). Ved tidspunktet for innsamling av blodprøvene hadde pasientene ikke fått medisinsk behandling i løpet av de fire foregående (previous) månedene. Dessuten ble tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) isolert fra lymfeknuter samlet fra tre av melanompasientene og frosset i i FCS med 10 %

DMSO.

Peptider

Syv syntetiske survivin-avledede peptider ble brukt i denne studien: Sur6-14, Surll-19, Sur34-43, Sur46-54, Sur51-59, Sur46Y9, Sur51Y9 og et EBV-avledet peptid, EBNA3A 457-466 (63). Alle peptider ble skaffet fra Research Genetics (Huntsville, AL) og levert med >90 % renhet, verifisert ved HPLC- og MC-analyse. Peptidene er ført opp i tabell 3 nedenfor.

Kompleksbindingsassay for peptidbinding til MHC klasse I- molekyler

Kompleksbindingsassayet beskrevet i eksemplene 1 og 2 ble brukt for å måle bindingsaffinitet for de syntetiske peptidene til HLA-B35-molekylene, som var metabolsk merket med [S35]metionin. Kort beskrevet er assayet basert på peptidmediert stabilisering av tomme HLA-molekyler frigjort, etter cellelyse, fra den TAP-fattige cellelinje 12, stabilt transfektert med HLA-B35 (velvillig skaffet av Dr J. Haurum, Symphogen ApS, Lyngby, Danmark). Stabilt foldede HLA-molekyler ble immunpresipitert ved å bruke det konformasjonsavhengige mAb W6/32. HLA-molekylene ble separert ved IEF-elektroforese, geler ble eksponert for phosphorimager-skjermer (Imaging plate, FUJI photo film Co., LTD., Japan), analysert og mengden av korrekt foldede HLA-molekyler ble kvantifisert ved å bruke ImageGauge phosphorimager software (FUJI photo film Co., LTD., Japan).

Antigenstimulering av PBL' er

For å utvide sensitiviteten for ELISPOT-assayet ble lymfocytter stimulert en gang in vitro med peptid før analyse (14, 15). PBL'er eller TIL'er ble tinet og stimulert med 50 uM av de individuelle peptidepitopene i 96-brønnplater i 2 timer ved 26 °C (5xl0<5->10<6>celler per peptid) og slått sammen i ytterligere 10 dagers kultur ved 37 °C i x-vivo med 5 % humanserum (HS), i 24-brønn plater (Nunc, Roskilde, Danmark) med 2xl0<6>celler per brønn. På inkubasjonens annen dag ble 40 ug/ml IL-2 (Apodan A/S, Danmark) tilsatt. På dag 10 ble de dyrkede cellene testet for reaktivitet ved ELISPOT-assay.

ELISPOT- assayet

ELISPOT-assayet som ble brukt til å kvantifisere peptidspesifikke, IFN-y-frigjørende effektorceller i PBL'er eller TIL'er samlet fra cancerpasienter, ble utført som beskrevet i eksempel 1. Kort beskrevet ble 96-brønnplater med bunn av nitrocellulose (MultiScreen MAIP N45; Millipore, Hedehusene, Danmark) dekket med mAb mot humant IFN-y, 7,5 ug/ml (1-DIK; Mabtech, Nacka, Sverige). Brønnene ble vasket og blokkert i x-vivo (x-vivo 15TM BioWhittacker, Molecular Applications Aps, Danmark) og celler ble tilsatt i duplikater ved ulike konsentrasjoner. For antigenpresentasjon ble IO<4>T2-B35-celler, med og uten 10 uM peptid, tilsatt per brønn. Platene ble inkubert over natten, cellene kastet og brønnene vasket før tilsetning av biotinylert sekundært antistoff (7-B6-l-Biotin; Mabtech). Platene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur, vasket og avidin-alkalisk fosfatase-konjugat ble tilsatt (AP-Avidin, Calbiochem, Life Technologies, Inc.). Etter en times inkubering ved romtemperatur ble enzymsubstratet nitroblue tetrazolium/5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (Code No.K0598, DakoCytomation Norden A/S) tilsatt, og mørkfiolette spots kom til syne på 3-7 min. Denne reaksjonen ble terminert ved å vaske med springvann. Spots ble talt ved å bruke Alpha Imager System (Alpha Innotech, San Leandro, CA), og antallet (the frequency) av peptidspesifikke T-celler ble kalkulert ut fra antallet av spotdannende celler.

Alle assays ble utført i duplikater for hvert peptidantigen, og lymfocytter dyrket i samme brønn ble testet i samme celleantall med og uten peptid for å måle antallet av peptidspesifikke celler i kulturen.

Modning av dendrittiske celler ( D<C>er)

Adherente celler ble isolert fra PBL'er etter 2 timers kultur. Disse ble dyrket i ytterligere 10 dager i RPMI 1640 (GibcoTM Invitrogen corporation, UK) med 10 % FCS. 800 ng/ml GM-CSF (PreproTech, London, UK) og 40 ng/ml IL-4 (Prepro-Tech) ble tilsatt hver tredje dag. På dag 10 ble DCer modnet i 24 timer ved å tilsette 50 ng/ml TNF-a (PreproTech). Etter modning ble DCer frigjort og pulsert med 20 uM peptid i nærvær av 3 ug/ml 32-mikroglobulin i 2 timer ved 26°C.

Isolering av peptidspesifikke T- celler

Antigenspesifikke T-celler ble isolert ved å bruke sur51Y9/HLA-B35-dekkede magnetiske kuler som beskrevet i eksempel 2. Biotinylerte monomere av HLA-B35 med sur51Y9 (skaffet fra Prolmmune, Oxford, UK) ble koblet til streptavidin- dekkede magnetiske kuler (Dynabeads M-280, Dynal A/S, Oslo, Norge) ved å inkubere 2,5 ug monomere med 5 x IO<6>kuler i 40 ul PBS i 20 min. ved romtemperatur. De magnetiske kompleksene ble vasket tre ganger i PBS ved å bruke en magnetisk anordning (Dynal A/S, Oslo, Norge) og deretter blandet med PBL'er i et forhold på 1:10 i PBS med 5 % BSA og rotert svært forsiktig i en time. Antigenspesifikke CD8<+->T-celler assosiert til de magnetiske kompleksene ble forsiktig vasket to eller tre ganger. Isolerte celler ble resuspendert flere ganger i x-vivo supplementert med 5 % humant serum og inkubert i 2 timer før de magnetiske kulene ble frigjort og fjernet fra cellesuspensjonen. De isolerte antigenspesifikke CD8<+->T-cellene ble brukt i ELISPOT-assay for å analysere kryssreaktiviteten mellom det naturlige og det modifiserte peptidet.

TCR klonotype- mapping ved " denaturerende"- gradientgel- elektroforese ( DGGE)

DGGE klonotype-kartlegging (mapping) av de humane TCR BV-regioner 1-24 er blitt beskrevet i detalj (66). Kort fortalt ble RNA isolert ved bruk av Purescript Isolation Kit (Gentra Systems Inc. MN) og transkribert cDNA ble amplifisert ved PCR ved å bruke primers for de variable områdene av TC R-beta kjedene i kombinasjon med en vanlig konstant "regions-primer". Dataprogrammet MELT87 ble brukt for å sikre at de amplifiserte DNA-molekylene var egnet for DGGE-analyse forutsatt at en 50 bp GC-rik sekvens (GC-clamp) var bundet til 5'-enden av den konstante regions-primeren. DGGE-analyse ble gjort i 6 % polyakrylamidgeler som inneholdt en gradient av urea og formamid fra 20 % til 80 %. Elektroforese ble utført ved 160 V i 4.5 timer i 1 x TAE-buffer ved en konstant temperatur på 54

°C.

Immunhistokjemiske farginger

Multimeriserte peptid/H LA-komplekser ble brukt for å identifisere antigenspesifikke T-celler in situ i tumorlesjoner i cancerpasienter ved å bruke prosedyren som er beskrevet i eksempel 2. Biotinylerte sur51Y9/HLA-B35-monomere ble levert av Proimmune limited, Oxford, UK. De biotinylerte monomerene av sur51Y9/HLA-B35 ble multimerisert med streptavidin-FITC-konjugerte dekstranmolekyler (velvillig skaffet av L. Winther, DAKO, Glostrup, Danmark) for å generere multivalente HLA-dekstran-forbindelser for immunhistokjemi. Vevsbiter ble tørket over natten og deretter fiksert i kald aceton i 5 min. Alle inkubasjonstrinnene ble utført i mørke ved romtemperatur: (a) 45 min med det primære antistoffet (fortynnet 1:100) (b) Cy 3-konjugert geit anti-mus- antistoff (fortynnet 1:500; code 115-165-100, Jackson ImmunoResearch, skaffet fra Dianova, Hamburg, Tyskland) i 45 min, og til slutt (c) multimerene i 75 min. Mellom hvert trinn ble objektglassene plassert i vectashield og oppbevart i kjøleskap inntil de ble observert under det konfokale mikroskopet (Leica).

Resultater

Identifikasjon av HLA- B35- bindende survivin- avledede peptider

Aminosyresekvensen for survivin ble screenet for nonamere og dekamere peptider med ankerrester i samsvar med det peptidbindende motivet i (of) HLA-B35 (67). Fem peptider ble selektert som inneholdt prolin som det N-terminale ankeret i posisjon 2 og fenylalanin, leucin, isoleucin eller tyrosin som C-terminale ankerrester (tabell 3). Kompleksbindingsassay avdekket to peptider, sur51-59 (EPDLAQCFF, SEQ ID NO:7) og sur46-54 (CPTENEPDL, SEQ ID NO:6), som hadde evne til å stabilisere HLA-B35 effektivt. I tillegg viste to peptider, sur34-43 (TPERMAEAGF, SEQ ID NO:20) og sur6-14 (LPPAWQPFL, SEQ ID NO: 18) en svak stabilisering, mens det gjenstående peptidet ikke stabiliserte HLA-B35 i det hele tatt. Peptid konsentrasjonen som var nødvendig for halv maksimal gjenvinning av HLA-B35 (Cso), ble estimert til 13 uM for sur51-59 og 20 uM for sur46-54. Til sammenligning hadde den positive kontroll-epitopen C24 fra EBNA3A458-466 (YPLHEQHQM, SEQ ID NO:21) en estimert Cso-verdi på 0,8 uM.

For å øke bindingsaffiniteten for sur46-54 og sur51-59 ble aminosyren ved C-terminalen erstattet med tyrosin, en bedre ankerrest (67). Gjenvinningen av HLA-B35 mediert av de modifiserte peptidene ble analysert ved kompleksbindingsassay, og Cso-verdier ble estimert til 1,5 uM for sur51Y9 og 4 uM for sur46Y9 (fig.7).

Spontane immunresponser mot naturlige peptidepitoper

Innledningsvis ble fem pasienter analysert for spontane immunresponser på de fire naturlige HLA-B35-bindende peptidene sur51-59, sur46-54, sur34-43 og sur6-14. Disse fem pasientene hadde ulike hematopoietiske maligniteter: HEM8 og HEM18 led av MM, HEM12 av FL, HEM9 hadde DLBCL og CLL5 hadde CLL.

INF-y ELISPOT-assays ble utført på PBL'er etter 10 dager med in vitro stimulering for å detektere peptid-forløper-CTL'er. Spontane immunresponser ble detektert mot to av de naturlige HLA-B35-bindende peptidene, sur51-59 og sur46-54. To pasienter, HEM 12 og CLL5, viste en respons på både sur51-59 og sur46-54, mens HEM8 kun viste en respons på sur51-59 (figur 8A og B). Ingen respons kunne detekteres i de to gjenstående pasientene, HEM9 og HEM 18, og ingen respons kunne detekteres på de meget svakt bindende peptidene sur34-46 og sur6-14 i noen av pasientene.

En alternativ tilnærming til in vitro stimulering ble brukt i pasient HEM 12, dvs. PBL'er ble dyrket sammen med modnede autologe dendrittiske celler pulsert med sur51-59 for å stimulere en CTL-respons in vitro. PBL'er fra denne kulturen viste sterk reaktivitet overfor sur51-59 i ELISPOT (fig.8B).

Økt gjenkjennelse av modifiserte peptider

Som beskrevet ovenfor, resulterte peptidmodifikasjoner for økning av HLA-B35-affiniteten i en 5 til 10 ganger høyere affinitet for HLA-B35 sammenlignet med de naturlige peptidene. En gruppe av fem melanompasienter ble analysert for spontane immunresponser på både de naturlige og de modifiserte peptidene ved hjelp av ELISPOT-assay. PBL-prøver ble analysert etter in vitro stimulering, mens TIL-prøver ble analysert direkte. Spontane immunresponser ble observert i enten PBL'er eller TIL'er fra tre av de fem pasientene. FM25 viste reaktivitet mot sur51-59 og sur51Y9 i både PBL- og TIL-prøver (fig.9A). FM45 responderte bare på det modifiserte peptidet sur51Y9, med en sterk respons detekterbar i TIL'er. Ingen PBL'er var tilgjengelige fra denne pasienten (fig.9A). FM74 viste en sterk respons på sur46Y9 i TIL, men ingen respons på det naturlige peptidet var detekterbar (figur 9B). En svak respons på sur46Y9 ble også observert i PBL'er fra FM74 (data ikke vist).

Kryssreaktivitet mellom det naturlige og det modifiserte peptidet

Den høye affiniteten for sur51Y9 overfor HLA-B35 gjør det mulig å produsere stabile monomere av HLA-B35 med sur51Y9. Etter å ha fastslått forekomsten av survivinreaktive T-lymfocytter i tumorinfiltrerte lymfeknuter og PBL'er fra ulike cancerpasienter, ble magnetiske kuler dekket med slike HLA-B35/Sur51Y9-komplekser, og disse ble brukt for å isolere survivinreaktive T-lymfocytter fra PBL fra pasient CLL5. Denne pasienten viste en kraftig respons på sur51-59. Kuler ble sterkt bundet til celleoverflaten av de spesifikke cellene, visualisert ved mikroskopi (data ikke vist), noe som tillot presipitering av antigenspesifikke celler i et magnetisk felt. De isolerte sur51Y9-spesifikke cellene responderte kraftig på sur51-59 (figur 9), mens ingen respons kunne detekteres i gjenstående PBL'er (data ikke vist). Isoleringen ble analysert ved den RT-PCR/DGGE-baserte TCR klonotype-mapping. Denne teknikken tillater analyse for T-celleklonalitet i komplekse cellepopulasjoner, selv om bare et lite antall celler er tilgjengelig. Disse analysene viste at 8 ulike kloner var isolert (data ikke vist).

Antigenspesifikke T- celler til stede in situ i en mela nom lesjon er

Sur51Y9/HLA-B35-monomere ble multimerisert ved å bruke dekstranmolekyler konjugert med streptavidin og FITC. Multimeriserte MHC-komplekser ble brukt til å farge acetonfiksert, frosset materiale ved å benytte prosedyren som er beskrevet i eksempel 2. Antigenspesifikke celler ble visualisert ved bruk av et konfokalt lasermikroskop. Snitt av primært melanom fra tre pasienter ble analysert, og Sur51Y9/HLA-B35-reaktive CTL'er kunne enkelt detekteres in situ i tumor-mikromiljøet i en av pasientene. Farging sammen med en mAb mot granzym B viste at disse survivinspesifikke CTL'ene frigjorde granzym B, og utviste cytotoksisk aktivitet, HLA-B35-negative melanompasienter ble brukt som kontroller (data ikke vist).

EKSEMPEL 4

Identifikasjon av nye survivin-avledede CTL-epitoper med ulike HLA-A-begrensningsprofiler

Sammendrag

Nye HLA-A1-, HLA-A2-, HLA-A3- og HLA-A11-begrensede survivinepitoper blekarakterisertpå basis av CTL-responser i cancerpasienter. Disse epitopene øker signifikant antall pasienter som er elektive for immunterapi basert på survivin-avledede peptider. I tillegg vil den kollektive målretting av flere restriksjons-elementer sannsynligvis redusere risikoen for immun-bortfall på grunn av tap av HLA-allel.

Materialer og metoder

Pasienter

Pasientprøver ble mottatt fra Universitetet i Wurzburg, Tyskland og København Amts Sygehus i Herlev, Danmark. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene før noen av disse målingene. Vevstyping ble utført av Avdeling for klinisk immunologi, Universitetssykehuset, København, Danmark. Perifere blod lymfocytter (PBL) fra cancerpasienter med melanom, brystcancer og kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) ble isolert ved bruk av Lymphoprep-separasjon og frosset i kalvefosterserum (FCS) med 10 % dimetylsulfoksid. Videre ble det skaffet T-lymfocytter fra primærlesjoner og fra tumorinfiltrerte lymfeknuter fra melanompasienter. Nylig resektert tumorvev ble skåret til små fragmenter og knust for å frigi tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) for kryopreservering.

Peptider

Alle peptider ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) og levert med >80 % renhet, verifisert ved HPLC og MS-analyse. Alle peptider som ble brukt, er ført opp i tabell 4 under eksempel 5 nedenfor.

Cellelinjer

Den humane T2-cellelinjen er et TAPI- og TAP2-fattig hybrid av B-LCL.174- og T-LCL CEM-cellene, og uttrykker derfor bare lave nivåer av HLA klasse I-molekyler

(HLA-A<*>0201 og HLA-B<*>5101) på celleoverflaten. T2-celler transfektert med HLA-A<*>0301 ble velvillig skaffet av dr A McMicheael, IMM, John Radcliffe Hospital, Oxford. T2-celler transfektert med HLA-A<*>1101 ble velvillig skaffet av dr M Masucci, MTC, Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige. BM36.1-cellelinjen er også fattig på TAP-funksjon og har en lignende fenotype som T2 med lav ekspresjon av HLA klasse I (HLA-A<*>0101, HLA-B<*>3501) på overflaten. BM36.1-cellene ble velvillig skaffet av dr A Ziegler, Humboldt Universitet, Berlin, Tyskland.

Kompleksbindingsassay for peptidbinding til MHC klasse I- molekyler

Bindingsaffiniteten for syntetiske peptider (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) til HLA-Al-, -A2-, A3- eller All-molekyler metabolsk merket med [<35>S]-metionin ble målt i kompleksbindingsassayet, som beskrevet tidligere (12). Analysen er basert på peptidmediert stabilisering av tomme HLA-molekyler frigjort ved cellelysis fra de TAP-fattige cellelinjene. Stabilt foldede HLA-molekyler ble immunpresipitert ved å bruke det HLA klasse I-spesifikke, konformasjonsavhengige mAb W6/32, og separert ved isoelektrisk fokuserende (IEF) gelelektroforese. Båndene for de tunge MHC-kjedene ble kvantifisert ved bruk av ImageGauge Phosphorimager-programmet (FUJI photo film Co., Carrollton, TX, USA). Båndintensiteten er proporsjonal med mengden av peptidbundet klasse I MHC-kompleks gjenvunnet i løpet av assayet. Følgelig er graden av stabilisering av HLA-molekylet direkte relatert til bindingsaffiniteten av det tilsatte peptidet. Peptidkonsentrasjonene som ble brukt til å analysere gjenvinningen av HLA-molekylene, var 40, 4, 0.4, 0.04 uM for HLA-A1 og HLA-A11 og 100, 10, 1, 0.1, 0.01 uM for HLA-A2 og HLA-A3. Cso-verdien ble deretter kalkulert for hvert peptid som tilstrekkelig peptid konsentrasjon for å oppnå halvparten av maksimal stabilisering.

Antigenstimulering av PBL

For å utvide sensitiviteten for ELISPOT-assayet ble PBL stimulert en gang in vitro før analyse. På dag 0 ble PBL eller knuste lymfeknuter tinet og fordelt på plater med 2 x 10<6>celler i 2ml/brønn på 24 brønnplater (Nunc, Roskilde, Danmark) i x-vivo-medium (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), 5 % varmeinaktivert humanserum og 2 mM av L-glutamin i nærvær av 10 uM av peptid. To dager senere ble det tilsatt 20 IU/ml rekombinant interleukin-2 (IL-2) (Chiron, Ratingen, Tyskland) til kulturene. De dyrkede cellene ble testet for reaktivitet i ELISPOT på dag 10.

ELISPOT- assay

ELISPOT-assayet ble brukt for å kvantifisere peptidepitop-spesifikke interferon-y-frigjørende effektorceller som tidligere beskrevet (16). Kort beskrevet ble 96-brønnplater med bunn av nitrocellulose (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Danmark) dekket med anti-IFN-y-antistoff (1-DIK, Mabtech, Nacka, Sverige). Brønnene ble vasket, blokkert med x-vivo-medium og cellene tilsatt i duplikater i ulike cellekonsentrasjoner. Peptidene ble så tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert over natten. Den påfølgende dagen ble media kastet og brønnene ble vasket før tilsetning av biotinylert sekundært antistoff (7-B6-l-Biotin, Mabtech). Platene ble inkubert i 2 timer, vasket, og avidin-alkalisk fosfatase-konjugat (Calbiochem, Life Technologies, Inc. San Diego, CA, USA) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert ved romtemperatur i en time, vasket, og enzymsubstratet NBT/BCIP (DakoCytomation Norden A/S Glostrup, Danmark) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved RT i 5-10 min. Etter fremkomsten av mørkfiolette spots ble reaksjonen terminert ved å vaske med springvann. Spots ble talt ved å bruke ImmunoSpot® Series 2.0 Analyzer (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, USA), og den peptidspesifikke CTL-freqvensen kunne kalkuleres fra antall spotdannende celler. Alle assays ble utført i duplikater for hvert peptidantigen.

Resultater

Identifikasjon av HLA- Al- bearensede survivinepitoper

Binding av survivin- avledede peptider til HLA- A1

Aminosyresekvensen for survivinproteinet ble screenet for de mest sannsynlige HLA-Al-nonamer- eller dekamerpeptid-epitopene ved å bruke de viktigste HLA-A1-ankerrestene, aspartamsyre (D), glutaminsyre (E) ved posisjon 3 og tyrosin (Y), fenylalanin (F) ved C-terminalen. I samsvar med dette ble seks survivin-avledede peptider syntetisert og undersøkt for binding til HLA-A1 (tabell 4). I tillegg ble de to peptidene Sur38-46 (MAEAGFIHC)(SEQ ID NO:23) og Sur47-56 (PTENEPDLAQ)

(SEQ ID NO:25) inkludert, til tross for at de inneholder bare ett av hovedankrene, siden begge ble identifisert som mulige gode bindere ved den prediktive algoritmen til Rammensee et al, tilgjengelig på http:// svfpeithi. bmi- heidelberq. com/. Cso-verdier ble estimert for hvert peptid som den peptidkonsentrasjonen som er nødvendig for å oppnå halvparten av maksimal stabilisering av HLA-A1 (tabell 4). Bare ett av disse peptidene, Sur92-101 (QFEELTLGEF) (SEQ ID NO:27), bandt seg med nesten samme høye affinitet som en kjent positiv kontrollepitop fra Influenza A-proteinet basisk polymerase 1 (PB1) (VSDGGPNLY), eksemplifisert i figur 10. Sur93-101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO:24) hadde en lav bindingsaffinitet for HLA-A1, mens ingen av de andre analyserte peptidene bandt seg til HLA-Al (tabell 4). Følgelig syntetiserte vi en rekke analoge peptider der bedre ankerrester erstattet de naturlige aminosyrene. Vi modifiserte de to peptidene Sur38-46 (MAEAGFIHC)

(SEQ ID NO:23) og Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO:25) ved å introdusere henholdsvis tyrosin (Y) i stedet for cystein (C) eller glutamin (Q) ved C-terminalen. Begge de modifiserte peptidene bandt seg sterkt til HLA-Al (tabell 4). I tillegg substituerte vi aminosyrene ved posisjon 2 med hjelpeankrene treonin (T) eller serin (S) i de to peptidene Sur92-101 og Sur93-101. Disse modifikasjonene hadde ikke noen positiv effekt på bindingen av Sur92-101 til HLA-A1. Derimot bandt Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ ID NO:36) seg med høy affinitet til HLA-Al(tabell 4).

Figur 10 illustrerer bindingen av det naturlige lav affinitet-peptidet Sur93-101, det høy affinitet- modifiserte peptidet Sur93T2 og det ikke-bindende peptidet Sur49-58 sammenlignet med den positive kontrollepitopen fra influensa. Til slutt modifiserte vi Surl4-22, Sur34-43, Sur49-58, Sur51-59, Sur92-101 og Sur93-101 med tyrosin (Y) ved C-terminalen, men dette forbedret ikke bindingsaffiniteten til HA-A1 for noen av disse peptidene (data ikke vist).

HLA- A1- begrensede CTL- responser mot survivin- avledede peptider i cancerpasienter

PBL fra seks melanompasienter og TIL fra tre melanompasienter ble analysert for nærvær av CTL'er som er spesifikke mot noen av de fire høy affinitet- survivin-avledede peptidene Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 og Sur93T2 ved hjelp av ELISPOT. T-cellereaktivitet mot minst ett av de survivin-avledede peptidene ble observert i tre PBL-prøver og en TIL-prøve fra i alt ni analyserte pasienter. Som man ser av figur 11, inneholdt PBL fra en pasient, Mel.Al-3, en T-cellerespons mot alle fire peptider, Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 og Sur93T2. Mel.Al-2 viste responser mot Sur47Y10, Sur92-101 og Sur93T2, mens i Mel.Al-l/TIL og Mel.Al-4/PBL ble det observert responser mot Sur47Y10 og Sur93T2, henholdsvis (figur 11).

I tillegg ble ti melanompasienter testet for immunreaktivitet mot de naturlige peptidene Sur93-101, Sur38-46 og Sur47-56 ved hjelp av ELISPOT; imidlertid ble ingen peptidspesifikke responser detektert i noen av disse pasientene (data ikke vist).

Identifikasjon av HLA- All- beqrensede survivinepitoper

Binding av survivin- avledede peptider til HLA- A11

Aminosyresekvensen for survivinproteinet ble screenet for nonamere og dekamere peptider med bindingsmotiver korresponderende med sekvensen for HLA-A3-superfamilien, inklusive HLA-A3 og HLA-A11. Peptidsekvenser med hovedankermotivene, leucin (L) i posisjon 2 og lysin (K) ved C-terminalen, ble valgt sammen med peptidsekvenser som hadde beslektede aminosyrer i disse posisjonene i samsvar med den prediktive algoritmen til Ramensee et al (tabell 4).

Tretten peptider ble forutsagt ut fra proteinsekvensen for survivin og analysert for binding til HLA-A11 og HLA-A3. Tre av disse peptidene, Sur53-62 (DLAQCFFCFK)

(SEQ ID NO:47), Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO:42) og Surl 12-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO:44), bandt seg til HLA-A11 med høy affinitet, sammenlignbart med den virale epitopen fra EBV nukleært antigen 4 (AVFDRKSDAK) (SEQ ID NO:63). I tillegg bandt ett peptid , Surll2-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO:51), seg svakt til HLA-A11 (tabell 4).

HLA- All- begrensede CTL- responser mot survivin- avledede peptider I cancerpasienter

PBL fra fem melanompasienter og to CLL-pasienter ble testet for T-cellereaktivitet mot de fire HLA-All-bindende peptidene Sur53-62, Sur54-62, Surl 12-120 og Surl 12-121. Vi kunne detektere responser mot det survivin-avledede peptidet Sur53-62 i PBL fra to av melanompasientene, Mel.Al 1-1, Mel.All-2, ved hjelp av ELISPOT (figur 12). Dessuten kunne vi detektere Sur53.62-spesifikke T-celler blant tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) fra en tumorinfiltrert lymfeknute i pasient Mel.Al 1-2 (figur 12). I pasient Mel.Al 1-1 ble det observert en kraftig immunrespons mot survivinpeptidet Sur53-62 i fem ulike blodprøver tatt over en periode på to år (data ikke vist).

Identifikasjon av HLA- A3- beqrensede survivinepitoper

Binding av survivin- avledede peptider til HLA- A3

De survivinavledede peptidene som var forutsagt for binding til HLA-A3-superfamilien, ble i tillegg analysert for binding til HLA-A3. Bare to av peptidene, Surll2-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO:44) og Surll2-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO:57), bandt HLA-A3 med høy affinitet, på tilsvarende måte som den virale epitopen, Influenza A nukleoprotein 265-273 (ILRGSVAHK) (SEQ ID NO:74) (tabell 4). Videre bandt to peptider, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO:47) og Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO:43) (seg) svakt til HLA-A3.

Noen av peptidene uten detekterbar binding ble modifisert i et forsøk på å øke bindingsaffiniteten for HLA-A3. Vi syntetiserte derfor to analoge peptider av Sur54-62 og Surll3-122 der en bedre ankerrest, leucin (L) erstattet det naturlige alanin

(A) i posisjon 2. Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO:56) bandt HLA-A3 med høy affinitet, mens Surll3L2 (ILKETNNKKK) (SEQ ID NO:59) bare bandt seg svakt

(tabell 4). I tillegg syntetiserte vi fire analoge peptider av Sur5-13, Surl3-22, Surl8-27 og Sur53-61 der den bedre ankerresten lysin (K) erstattet det naturlige fenylalanin (F) ved C-terminalen. Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO:54) og Surl8K10 (RISTFKNWPK) (SEQ ID NO:58) bandt seg til HLA-A3 med høy affinitet, mens substitusjonene ikke hadde noen detekterbar effekt på bindingen til HLA-A3

av Surl3K9 (FLKDHRISTK) (SEQ ID NO:57) og Sur53K9 (DLAQCFFCK) (SEQ ID NO:55) sammenlignet med de naturlige analogene.

HLA- A3- begrensede CTL- responser mot survivin- avledede peptider i cancerpasienter

Ni prøver fra melanompasienter (fem PBL og fire TIL) ble analysert for immunreaktivitet mot de to naturlige høy affinitet- HLA-3A-bindende peptidene Surll2-120 og Surll2-121 så vel som de to naturlige, svakt bindende peptidene Sur53-62 og Sur95-103. Imidlertid kunne ingen immunresponser mot disse peptidene detekteres ved ELISPOT i noen av pasientene. Deretter ble de samme pasientene analysert for spontan immunreaktivitet mot de tre høy affinitet-modifiserte survivin-avledede peptidene Sur5K9, Surl8K10 og Sur54L2. CTL-reaktivitet ble detektert mot Surl8K10 i TIL-prøver fra tre pasienter, Mel.A3-l, Mel.A3-2, Mel.A3-3 (figur 13). Ingen responser ble detektert mot de to andre peptidene, Sur5K9 og Sur54L2. For å verifisere disse responsene ytterligere ble PBL fra atten andre melanompasienter analysert for CTL-reaktivitet mot Surl8K10. Tre responderende pasienter, Mel.A3-4, Mel.A3-5 og Mel.A3-6, ble funnet blant disse, slik at resultatet ble i alt seks responderende pasienter blant de syv og tyve pasientene som ble analysert (figur 13).

Identifikasjon av en ny HLA- A2- beqrenset survivinepitop

Binding av 11- mere survivin- avledede peptider til HLA- A2

Aminosyresekvensen for survivinproteinet ble screenet for de mest sannsynlige HLA-A2 11-mere epitopene ved å bruke de viktigste HLA-A2-spesifikke ankerrestene. Seks survivin-avledede peptider ble syntetisert og undersøkt for binding til HLA-A2. Ingen av de undersøkte peptidene bandt seg med lignende høy affinitet som en kjent positiv kontrollepitop fra Epstein-Barrvirus BMLF28o-288-peptid (GLCTLVAML) (SEQ ID NO: 72) (tabell 4). Den peptid konsentrasjonen som er nødvendig for halvparten av maksimal gjenvinning av HLA-A2 (Cso-verdi), var 0.9 uM for den positive kontrollen. Til sammenligning bandt peptidene Surl8-28 (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO:67) og Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQ ID NO:69) seg svakt til HLA-A2 (Cso = 69 uM og 72 uM henholdsvis). Men de to kjente HLA-A2-begrensede survivinepitopene bandt seg in på en lignende måte svakt til HLA-A2, Sur95-104 (ELTLGEFLKL) (SEQ ID NO:43) bandt seg med intermediær affinitet (Cso = 10 uM), mens Sur96-104 (LTLGEFLKL) (SEQ ID NO: 10) bandt seg bare svakt (Cso > 100 uM). De resterende fire 11-mere peptidene som ble undersøkt (Sur4-14 (PTLPPAWQPFL) (SEQ ID NO:66), Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ ID NO:68), Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO:70) og Surl03-113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO:74), bandt seg ikke til HLA-A2.

HLA- A2- begrensede CTL- responser mot survivin- avledede peptider i cancerpasienter

PBL fra ti cancerpasienter (to melanom- (Mel), seks CLL- (CLL) og to brystcancer-(MC) pasienter) ble først analysert for å utrede om de to svaktbindende llmer-proteinene, Surl8-28 og Sur86-96, ble presentert av HLA-A2 og gjenkjent av cancerpasientenes immunsystem. CTL-responser mot Surl8-28 ble funnet i PBL fra to av de ti pasientene som ble analysert (CLL-1, CLL-2, figur 14), mens ingen respons kunne detekteres mot Sur86-96 (data ikke vist). For ytterligere å verifisere disse Surl8-28-spesifikke responsene ble PBL fra tolv andre pasienter (syv melanom-, en CLL- og fire brystcancerpasienter) analysert for CTL-reaktivitet mot dette peptidet. Blant disse hadde fire pasienter (CLL-3, MC-1, MC-2, Mel.A2-l) Surl8-28-spesifikk immunreaktivitet som var detekterbar ved ELISPOT (figur 14). Totalt hadde altså PBL fra seks av to og tyve analyserte pasienter en CTL-respons mot Surl8-28.

Identifikasjon av HLA- B7- beqrensede survivinepitoper

Binding av survivin- avledede peptider til HLA- B7

Aminosyresekvensen for survivinproteinet ble screenet for peptider av ni til ti aminosyrer, med ankerrester i samsvar med peptidbindingsmotivet i HLA-B7. Fem peptider ble selektert og analysert for sin evne til å stabilisere HLA-B7 i kompleksbindingsassay. Cso-verdier ble estimert for hvert peptid som den peptidkonsentrasjonen som er nødvendig for halv maksimal stabilisering av HLA-B7

(tabell 4). To survivin-avledede peptider, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) og surl 1-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19), stabiliserte HLA-B7 svakt med Cso-verdier over 100 uM, mens sur46-54 (CPTENEPDL) (SEQ ID NO:6), sur51-59 (EPDLAQCFF) (SEQ ID NO:7) og sur34-43 (TPERMAEAGF) (SEQ ID NO:20) ikke bandt seg til HLA-B7 (tabell 4).

HLA- B?'- begrensete CTL- responser mot survivin- avledede peptider i cancerpasienter

HLA-A7-positive PBL fra fem melanompasienter (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), to CLL-pasienter (CLL1, CLL54) og to brystcancerpasienter (brystll, brystl5) ble testet for T-cellereaktivitet mot de svakt HLA-A7-bindende peptidene sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) og surll-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19). Vi kunne detektere en sterk, spontan CTL-respons mot det survivin-avledede peptidet sur6-14 i PBL i en CLL-pasient og i en brystcancerpasient (figur 15). I tillegg kunne vi detektere en svak respons mot dette peptidet i melanompasienten mel3 (figur 15).

Sammendrag av HLA- allelbeqrensede immunresponser på survivin- avledede peptider i cancerpasienter

En rekke av survivin-avledede peptider som omfattet 9-11 aminosyrerester, ble testet for binding til de følgende HLA-alleler: HLA-A1, HLA-A3, HLA-A11 og HLA-B7 ved å bruke kompleksbindingsassay for peptidbinding til MHC

klasse I-molekyler beskrevet i de foregående eksemplene. I tillegg ble flere av peptidene testet for sin evne til å utløse en CTL immunrespons ved bruk av ELISPOT-assayet, slik det også er beskrevet ovenfor.

En oppsummering av resultatene, inklusive resultater oppnådd i de foregående eksemplene, er gitt i den følgende tabell 4:

' En respons ble observert mot peptidet Surl 12-120 i en lymfompasient (HEM34) ved hjelp av ELISPOT. " Responser ble detektert mot peptidet Sur53-62 i 3 lymfompasienter (HEM9, 11, 34) ved hjelp av ELISPOT. iv En svak respons ble observert i en melanompasient (FM-TIL95) ved hjelp av ELISPOT. vii En respons ble observert mot Surll2-121 i en melanompasient

(PM6), mest evident i en metastatisk lymfeknute-suspensjon, og svakere i TIL fra primærtumor og PBL, ved hjelp av ELISPOT.

viii En respons mot peptidet Sur6-14 ble observert i en CLL-pasient (CLL9), og en svakere respons ble observert i en lymfompasient ved hjelp av ELISPOT (HEM21) (data ikke vist).

EKSEMPEL 5

Terapeutiske utprøvingsprosedyrer ved å bruke survivin-avledede peptider som immunogener

Sammendrag

Fem tungt forbehandlede stadium IV-melanompasienter ble vaksinert med den modifiserte HLA-A2-begrensede survivin-epitopen, nemlig surlM2-peptidet, presentert av autologe dendrittiske celler i en palliativ behandling (compassionate use setting). Fire av pasientene viste (mounted) sterke T-celleresponser på denne epitopen målt ved ELISPOT-assay. Videre avdekket in situ peptid/HILA-A2 multimer-farging infiltrasjonen av survivinreaktive celler i både visceral- og bløtvevsmetastaser. Det var påfallende at ikke vaksinasjonsassosiert toksisitet ble observert. Dataene viser at det er nyttig å indusere T-cellerespons mot survivin, selv for melanompasienter i sent stadium, og at disse vaksinasjonene er godt tolerert.

Materialer og metoder

Pasient- valgbarhet og behandlingsregime

Alle kliniske behandlingsregimer var i samsvar med Helsinkideklarasjonen og alle pasienter gav informert samtykke før behandling. Pasienter med stadium IV kutant eller uvealt melanom var valgbare hvis deres sykdom var progressiv til tross for minst to ulike kjemo-, immun- eller kjemoimmunterapier. Pasientene måtte dessuten være 18 år eller eldre, uttrykke HLAA<*>0201 og lide av målbar (measurable) sykdom validert ved kraniale-, thorax- og abdominale CT-undersøkelser (computed tomography scans). Pasientenes Karnofsky-indeks måtte være 60 % eller bedre. Ingen systemisk kjemo- og/eller immunterapi var tillatt i 4 ukersperioden før vaksinasjonen. Viktige eksklusjonskriterier var evidens for CNS-metastaser, aktive autoimmune eller infeksiøse sykdommer, graviditet og amming og signifikant psykiatrisk abnormalitet. Peptidpulserte, dendrittiske celler ble generert som tidligere beskrevet (82). Kort beskrevet ble PBMCer fra leukoforese isolert på LymphoprepTM (Nycomed Pharma), frosset i aliquots og lagret i flytende nitrogen. En uke før vaksinasjonen ble PBMCer tinet, vasket og dyrket i medium som inneholdt gentamicin, glutamin og varmeinaktivert, autologt plasma. På dag 1 og 5 ble IL-4 og GM-CSF tilsatt. For å differensiere modne DCer ble TNF-y og prostaglandin E2 tilsatt på dag 6. På dag 7, da cellene viste fenotypiske og morfologiske karakteristika for modne DCer, dvs. en tilslørt fremtreden (a veiled appareance) og = 75 % CD83-ekspresjon, ble de pulsert med en modifisert survivin-avledet HLA-A2-begrenset survivin96-io4-epitop, LMLGEFLKL (SEQ ID NO 10) (Clinalfa, Sveits) 14. Celler ble bare brukt til vaksinasjon hvis mikrobielle tester på prøver fra kulturer tatt på dag 1 og 5 viste seg å være sterile.

Pasienter ble vaksinert med 7 dagers intervaller for de første to vaksinene fulgt av 28 dagers intervaller for ytterligere vaksinasjoner. Totalt 10-20 x IO<6>modne, surviving6-io4-pulsed DCer ble resuspendert i PBS som inneholdt 1 % humant serumalbumin, og injisert intradermalt i alikvoter av 1,5 x IO<6>DCer per injeksjonssted i de ventromediale områdene av lårene nær de regionale lymfeknutene. Lemmer der drenerende lymfeknuter hadde blitt fjernet og/eller bestrålt, ble ekskludert. Leukoforese (leukapheresis) ble gjentatt etter 5 vaksinasjoner i fravær av alvorlig forverring av pasientens helsetilstand eller forekomst av CNS-metastaser.

Måling av klinisk og immunologiske responser

CT-scans ble utført før vaksinasjon og hver tredje måned deretter eller ved alvorlige kliniske tegn på sykdomsprogresjon. Immunologiske responser ble monitorert ved ELISPOT-assay ved bruk av PBMCer tatt hver tredje måned, for å detektere survivin<g>6-io4-spesifikk IFN-y-frigjøring. For å utvide sensitiviteten for ELISPOT-assayet ble PBMCer stimulert en gang in vitro ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler per ml i 24-brønnplater (Nunc, Danmark) i X-vivo medium (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), supplert med 5 % varmeinaktivert humant serum og 2 mM av L-glutamin i nærvær av 10 uM av peptid. To dager senere ble det tilsatt 40 IU/ml rekombinant interleukin-2 (IL-2) (Chiron, Ratingen, Tyskland). Etter 10 dager ble cellene testet for reaktivitet. For dette formål ble nitrocellulose-bottomed 96-brønnplater (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Glostrup, Danmark) dekket med et anti-IFN-y-antistoff (1-DIK, Mabtech, Sverige). Lymfocytter ble tilsatt med IO<4->IO<5>celler i 200 pl X-vivo-medium per brønn sammen med IO<4>T2-celler og de relevante peptidene i en endelig konsentrasjon på 2 uM. Etter inkubasjon over natten ved 37°C og to vasker ble det biotinylerte deteksjonsantistoffet (7-B6-l-Biotin, Mabtech, Sverige) tilsatt, dets spesifikke binding ble visualisert ved bruk av alkalisk fosfata se-a vid in sammen med det respektive substratet (GibcoBRL). Reaksjonen ble terminert ved fremkomst av mørkfiolette spots, som ble kvantifisert ved å bruke Alphalmager System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Survivin96-io4/HLA-A5,£0201-reaktive CD8+-T-lymfocytter ble også ettersporet in situ både ved vaksinasjonsstedene og i visceral og bløtvev eller i kutane metastaser ved hjelp av multimert survivin96-io4/HLA-A<*>0201-komplekser. Vaksinasjonssteder ble skåret ut 24 timer etter intradermal injeksjon i alle pasienter, mens metastatiske lesjoner ble fjernet kun hos utvalgte pasienter, hvis lett tilgjengelig (pasientene KN og GB), eller fjernet i løpet av en kurativ behandling (pasient WW). Fargingsprosedyren for multimere peptid/MHC-komplekser er beskrevet nylig (68). De multimere survivin96-io4/HLA-A<*>0201-kompleksene ble generert ved introduksjon av et gjenkjennelsessted for enzymatisk biotinylering ved 5'-enden av den ekstracellulære domenen av HLA-A<*>0201 (rester 1-275). Det rekombinante proteinet ble renset ved eksklusjon basert på størrelse (Sephadex G25, Pharmacia, Erlangen, Tyskland) og ionebytter-(mono-Q, Pharmacia)kromatografi og foldet in vitro ved fortynning i nærvær av de respektive peptidene og B2-mikroglobulin. Etter gelfiltrering på en Sephadex G25-kolonne ble proteinet multimerisert med streptavidin-FITC konjugert med (to) dekstranmolekyler (velvillig skaffet av L. Winther, DAKO, København, Danmark) for å generere multivalente HLA-dekstran-komplekser. Kryopreserverte seksjoner av de respektive prøvene ble tørket over natten og deretter fiksert i kald aceton i 5 min. Alle inkubasjonstrinn ble utført i mørke ved romtemperatur på følgende måte: (i) 45 min. med et anti-CD8-antistoff (1:100, klon HIT8a, Pharmingen, San Diego, CA), (ii) Cy3-konjugert geit anti-mus (fortynnet 1:500, kode 115-165-100, Dianova, Hamburg, Tyskland) i 45 min og til slutt (iii) multimerene i 75 min. Mellom hvert trinn ble objektglassene vasket to ganger i 10 minutter i PBS/BSA 0.1 %. Til slutt ble objektglassene anbrakt i vectashield og observert under et Leica Confocal mikroskop (TCS 4D, Leica, Mannheim, Tyskland).

Resultater

Pasientkarakteristika og klinisk forløp

Fem pasienter med langkommet stadium IV-melanom ble inkludert, to led av uvealt melanom, en av bløtvevsmelanom og de resterende to av kutant melanom. På grunn av manifestasjon av symptomatisk hjernemetastase ble en pasient tatt av behandling etter bare to vaksinasjoner. De andre fire pasientene fikk opp til 15 vaksinasjoner. En pasient døde av hjertestans i tumorfri tilstand etter kirurgisk reseksjon av gjenværende metastaser. En annen pasient ble tatt av behandling etter 10 vaksinasjoner på grunn av fremkomst av viscerale metastaser (RW). En pasient forble i studien etter 15 vaksinasjoner. Detaljerte pasientkarakteristika, tidligere behandling, antall vaksinasjoner og overlevelsesstatus er oppsummert i tabell 5.

Ingen alvorlig toksisitet opptråde. Hemoglobin, leucocytter og trombocytter så vel som laktat dehydrogenase, kreatinin og kolinesterase ble således ikke påvirket av vaksinasjonsbehandlingen (fig. 16). Ingen tegn på systemisk eller lokal toksisitet ble observert ved injeksjonsstedene. Videre var det ingen deteksjon av dårligere sårtilheling, hemorragiske sykdommer, dårlig hjertefunksjon), vaskulitt eller inflammatorisk tykktarmsyndrom. I en pasient (WW) kunne pre-eksisterende levermetastaser stabiliseres under vaksinasjonsbehandlingen, men en ny adrenal metastase oppstod. Uheldigvis døde denne pasienten på grunn av hjertestans, til tross for tumorfrihet etter kurativ kirurgi. En hjernemetastase ble detektert i pasient PB bare 4 uker etter vaksinasjonsstart. Derfor måtte denne pasienten ekskluderes fra videre vaksinasjoner etter bare to DC-injeksjoner. De andre tre pasientene viste langsom progresjon av metastatisk sykdom uten vesentlig forverring i sin generelle helsetilstand. Bemerkelsesverdig kunne det for pasient KN oppnås en total overlevelse på 13 måneder (fra vaksinasjonsstart til død) til tross for en tung metastatisk ladning og rask sykdomsprogresjon ved start av vaksinasjonen. Pasient GB forble på protokoll i 14 måneder etter start av vaksinasjon med survivin-peptid pulserte DCer. Det bør imidlertid noteres at begge pasienter (RW og GB) fikk lokal tilleggsbehandling for tumorkontroll, enten bestråling av subkutane tumorer (RW) eller lokal kjemoterapi (GB).

Survivin - spesifikke CD8+- T- celleresponser

For å monitorere kinetikken for cytotoksiske T-celleresponser ble PBMCer tatt før og tre måneder etter vaksinasjon testet for reaktivitet på den modifiserte survivin<g>6-io4-epitopen ved ELISPOT for IFN-y. Før analyse ble PBMCer stimulert en gang in vitro for å utvide sensitiviteten for dette assayet. I alle fire pasientene som ble testet, var en induksjon av survivin<g>6-104-reaktive T-celler evident (fig. 17). Analyse for reaktivitet på andre HLA-A<*>0201-begrensede survivinpeptider, dvs. det ikke-modifiserte surviving6-io4 og den ved-siden-av-liggende Sur9-epitopen, viste en T-cellerespons mot disse peptidene i to av pasientene (KN og RW) (data ikke vist).

Den prognostiske og kliniske verdien av målinger av tumorspesifikke T-celleresponser i perifert blod er det blitt stilt spørsmål ved gjentatte ganger, derfor testet vi også for forekomst av surviving6-io4/HLA-A<*>0201-reaktive CD8+ T-lymfocytter blant tumorinfiltrerende lymfocytter in situ ved peptid/MHC-multimerfarging. For å validere metoden analyserte vi først vevsprøver fra forsinket type hypersensitivitetsreaksjoner som opptråde på vaksinasjonsstedet innen 24 timer. Denne analysen bekreftet tidligere observasjoner av at intradermale injeksjoner av peptidpulserte DC induserer et sterkt peptidspesifikt inflammatorisk celleinfiltrat. Deretter ble peptid/MHC-multimer-fargingsprosedyren anvendt på bløtvev- og viscerale metastaser, noe som avdekket nærvær av surviving6-io4/HLA-A<*>0201-reaktive celler i CD8+-infiltratet. Denne observasjonen antyder at vaksinasjonen induserer ikke bare T-celler med den ønskede spesifisitet, men også meddeler dem med den nødvendige målsøkende (homing) kapasitet.

Claims

1. MHC klasse I-begrenset epitop-peptid avledet fra survivin, nevnte epitop har sekvensen RISTFKNWPK som spesifisert av SEKV ID NR: 58 og har minst ett av de følgende karakteristika: (i) er i stand til å binde til klasse I HLA-A3-molekylet med en affinitet som målt ved mengden av peptidet som kan bevirke halv maksimal gjenvinning av klasse I HLA-molekylet (Cso-verdi), som maksimalt er 50^.M som bestemt ved et HLA-stabiliseringsassay; (ii) er i stand til å utløse IFN-y-produserende celler i en perifer blodlymfocyt- (PBL-) populasjon fra en cancerpasient med en frekvens på minst 1 per IO<4>PBL'er som bestemt ved et ELISPOT-assay, og/eller (iii) er i stand til in situ deteksjon i et tumorvev av CTL'er som er reaktive med epitop-peptidet for bruk som et medikament.

2. Peptid ifølge krav 1 for bruk som et medikament, der peptidet har en Cso-verdi som maksimalt er 30 uM.

3. Peptid ifølge krav 1 eller 2 for bruk som et medikament, der peptidet har en Cso-verdi som maksimalt er 20 uM.

4. Peptid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav for bruk som et medikament, der peptidet maksimalt omfatter 20 aminosyre-rester.

5. Peptid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav for bruk som et medikament, der peptidet maksimalt omfatter 10 aminosyre-rester.

6. Peptid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav for bruk som et medikament, der peptidet er i stand til å (i) utløse IFN-y-produserende celler i en PBL-populasjon fra en cancerpasient med en frekvens på minst 10 per 10<4>PBL'er, og/eller utløse IFN-y-produserende celler i en PBL-populasjon fra en pasient som har en cancersykdom der survivin uttrykkes, der cancersykdommen er valgt fra gruppen bestående av en hematopoetisk malignitet som omfatter kronisk lymfatisk leukemi og kronisk myeloid leukemi, melanom, brystkreft, cervixcancer, ovarialcancer, lungekreft, koloncancer, pankreaskreft og prostatakreft.

7. Farmasøytisk blanding som omfatter peptidet ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 6 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

8. Farmasøytisk blanding ifølge krav 7, der nevnte blanding er en time release formulering.

9. Farmasøytisk blanding ifølge krav 7, yderligere indeholdende et peptid der er begrenset til et HLA-A-molekyl, og et peptid der er begrenset til et HLA-B-molekyl og eventuelt et peptid der er begrenset til et HLA-C-molekyl.

10. Farmasøytisk blanding som omfatter peptidet ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 6 og en farmasøytisk akseptabel bærer, for bruk som et medikament.

11. Farmasøytisk blanding ifølge krav 10 for bruk som et medikament, der nevnte blanding er en time release formulering.

12. Farmasøytisk blanding ifølge krav 10 for bruk som et medikament, der nevnte blanding yderligere indeholdende et peptid der er begrenset til et HLA-A-molekyl, og et peptid der er begrenset til et HLA-B-molekyl og eventuelt et peptid der er begrenset til et HLA-C-molekyl.

13. Peptid ifølge et hvilket som helst av krav 1-6, for bruk for behandlingen av kræft.

14. Peptid ifølge krav 13, for bruk for behandlingen av kræft, der kreftsykdommen er valgt fra gruppen bestående av en hematopoetisk malignitet som omfatter kronisk lymfatisk leukemi og kronisk myeloid leukemi, melanom, brystkreft, cervixcancer, ovarialcancer, lungekreft, koloncancer, pankreaskreft og prostatakreft.