NO20120741A1

NO20120741A1 - Apparatus for performing "at-line" analysis of coliform bacteria in a water sample

Info

Publication number: NO20120741A1
Application number: NO20120741A
Authority: NO
Inventors: Henrik Braathen; James Berg; Trude Movig
Original assignee: Colifast As
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2013-12-02
Also published as: NO334066B1

Abstract

En fremgangsmåte og et automatisk apparat for å utføre "at-line" analyser av koliforme bakterier i en vannprøver hentet fra en drikkevannsforsyning, og en flytende reagens for tilsetting til en vannprøve til bruk i utførelsen av en slik "at-line" analyse. Fremgangsmåten omfatter og apparatet utfører automatisk minst én syklus av trinnene: a) levere en første mengde vannprøve til en inkubatorbeholder, b) levere en sekundær mengde flytende reagens til inkubatorbeholderen, c) varme opp inkubatorbeholderen og dens flytende innhold til minst en temperatur i området 30 ° C - 50 ° C, fortrinnsvis 35 0 C-45 ° C, d) føre til at minst ett enzym fra nevnte bakterier aktiverer reaktantene i nevnte reagens, e) belyse blandingen av vannprøve og reagens med lys fra minst én lyskilde, f) observere overnevnte blanding ved hjelp av minst en lyssensor og oppdage dermed intensitet og / eller tetthet av fluorescerende lys fra de tidligere nevnte enzymaktiverende reaktantene i nevnte reagens ved bestråling herav fra lyskilden, og g) fjerne blandingen fra beholderen og vaske beholderen og forsyningsslanger til og utgangsslanger fra med en syreholdig løsning. Apparatet gir/skaper fjernstyrt kontroll og/eller alarm om testresultater ikke oppfyller fastsatte kriterier. A method and an automatic apparatus for performing "at-line" assays of coliform bacteria in a water sample taken from a drinking water supply, and a liquid reagent for addition to a water sample for use in conducting such an "at-line" assay. The method comprises and the apparatus automatically performs at least one cycle of the steps: a) delivering a first amount of water sample to an incubator vessel, b) delivering a secondary amount of liquid reagent to the incubator vessel, c) heating the incubator vessel and its liquid contents to at least a temperature in the range of 30 D) cause at least one enzyme from said bacteria to activate the reactants in said reagent, e) illuminate the mixture of water sample and reagent with light from at least one light source, f) observing the above composition by means of at least one light sensor, thereby detecting the intensity and / or density of fluorescent light of the aforementioned enzyme activating reactants in said reagent by irradiation thereof from the light source, and g) removing the mixture from the container and washing the container and supply hoses to and output tubes. from with an acidic solution. The appliance provides / creates remote control and / or alarm if test results do not meet specified criteria.

Description

OPPFINNELSESOMRÅDET THE FIELD OF INVENTION

[001] Den gjeldende oppfinnelse relateres til en fremgangsmåte for å utføre "at-line" analyser av koliforme bakterier i en vannprøve hentet fra en drikkevannsforsyning, som definert i innledningen av krav 1. [001] The current invention relates to a method for performing "at-line" analyzes of coliform bacteria in a water sample taken from a drinking water supply, as defined in the introduction of claim 1.

[002] Videre relateres den gjeldende oppfinnelse til et apparat som utfører "at-line" analyser av koliforme bakterier i en vannprøve hentet fra en drikkevannsforsyning, som definert i innledningen av krav 17. [002] Furthermore, the current invention relates to an apparatus which performs "at-line" analyzes of coliform bacteria in a water sample taken from a drinking water supply, as defined in the introduction of claim 17.

[003] Så videre, relateres den gjeldende oppfinnelse til et flytende reagens for tilsetting til en vannprøve for bruk i utførsel av en "at-line" analyse av koliforme bakterier i vannprøven hentet fra en drikkevannsforsyning, som definert i innledningen av krav 26. [003] Furthermore, the present invention relates to a liquid reagent for addition to a water sample for use in performing an "at-line" analysis of coliform bacteria in the water sample taken from a drinking water supply, as defined in the preamble of claim 26.

[004] Mer spesifisert er denne oppfinnelsen rettet mot automatisert, "at-line" rask påvisning av fekal forurensning i drikkevann, dvs. påvisning av ethvert spor av koliforme bakterier i drikkevannet. Overnevnte koliforme bakterier er vanligvis ikke farlig for menneskers helse i seg selv, men deres tilstedeværelse brukes for å indikere at andre sykdomsfremkallende organismer av fekal opprinnelse kan være til stede. Fekale patogener inkluderer bakterier, virus eller protozoer og mange flercellede parasitter. [004] More specifically, this invention is aimed at automated, "at-line" rapid detection of faecal contamination in drinking water, i.e. detection of any trace of coliform bacteria in the drinking water. The above-mentioned coliform bacteria are not usually dangerous to human health in themselves, but their presence is used to indicate that other disease-causing organisms of faecal origin may be present. Fecal pathogens include bacteria, viruses or protozoa and many multicellular parasites.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN BACKGROUND OF THE INVENTION

[005] Overvåking av hygienisk vannkvalitet avhenger generelt av påvisning av indikatorbakterier, som inkluderer eksempelvis koliforme bakterier, Escherichia coli ( E. coli) og Enterococcus spp.. [005] Monitoring of hygienic water quality generally depends on the detection of indicator bacteria, which include, for example, coliform bacteria, Escherichia coli (E. coli) and Enterococcus spp..

[006] Tradisjonelt er påvisning av disse indikatorene gjort ved tidskrevende laboratoireanalyse som vanligvis tar opptil 24-48 timer, og gir dermed informasjon og dokumenterer en tidligere hendelse, men er av liten verdi som beslutningsverktøy for proaktiv beskyttelse av befolkningens helse/folkehelsen. I tillegg er slike analyser avhengig av manuell innsamling av vannprøver og tilgang til laboratorietjenester. [006] Traditionally, detection of these indicators has been done by time-consuming laboratory analysis which usually takes up to 24-48 hours, and thus provides information and documents a previous event, but is of little value as a decision-making tool for proactive protection of the population's health/public health. In addition, such analyzes depend on manual collection of water samples and access to laboratory services.

[007] Det er et velkjent behov for metoder som tillater rask og hyppig estimering av den hygieniske kvaliteten på drikkevann, som f.eks under tilfeldig forurensning av vannkilder, svikt i vannbehandlingsprosessen eller forurensning av distribusjonsnettet. [007] There is a well-known need for methods that allow rapid and frequent estimation of the hygienic quality of drinking water, such as during accidental contamination of water sources, failure of the water treatment process or contamination of the distribution network.

[008] Enzymatiske tester blir ofte brukt som både raske og brukervennlige mikrobiologiske metoder. Enzymatiske metoder for påvisning av Escherichia coli ( E. coli) baseres ofte på hydrolyse av 4-methyllumbelliferyl-JJ-D-glukuronid (George m.fl. 2000). I løpet av de siste 15 årene har den gjeldende søker (Colifast AS) utviklet hurtige enzymatiske mikrobiologiske metoder supplert med instrumentering for automatisk analyse. [008] Enzymatic tests are often used as both fast and user-friendly microbiological methods. Enzymatic methods for the detection of Escherichia coli (E. coli) are often based on the hydrolysis of 4-methyllumbelliferyl-JJ-D-glucuronide (George et al. 2000). During the last 15 years, the current applicant (Colifast AS) has developed rapid enzymatic microbiological methods supplemented with instrumentation for automatic analysis.

[009] En ytterligere viktig faktor er oppbevaringstid av prøver for konvensjonell analyse, da oppbevaringstid samt temperatur kan gi en signifikant innvirkning på antall indikatorbakterier påvist ved analysens tidspunkt (McDaniels m.fl. 1985). Anbefalt oppbevaringstid varierer fra 8 timer til 24 timer (Toranzos og McFeters 1997). Følgelig er en annen fordel av automatiserte analyser eliminering, eller vesentlig reduksjon, av prøvens oppbevaringstid. [009] A further important factor is the storage time of samples for conventional analysis, as storage time and temperature can have a significant impact on the number of indicator bacteria detected at the time of the analysis (McDaniels et al. 1985). Recommended storage time ranges from 8 hours to 24 hours (Toranzos and McFeters 1997). Accordingly, another advantage of automated analyzes is the elimination, or substantial reduction, of sample retention time.

[010] Formålet med den gjeldende oppfinnelsen er å løse de grunnleggende ulemper som følger med de tradisjonelle analysemetodene/teknikkene, samt å designe en frittstående, "at-line" tidlig varslingsmetode og apparat, i tillegg til et nytt reagens for påvisning av fekal forurensning i drikkevannsprøver. [010] The purpose of the current invention is to solve the basic disadvantages associated with the traditional analysis methods/techniques, as well as to design a stand-alone, "at-line" early warning method and apparatus, in addition to a new reagent for the detection of faecal contamination in drinking water samples.

[011] For å sikre høy teknisk stabilitet og kvalitet bygger den gjeldende orjpfinnelsen delvis på erfaringene fra eksisterende og velutprøvd råvannsovervåking, som for eksempel Colifast CALM ™ systemet utviklet av søkeren. [011] To ensure high technical stability and quality, the current invention is partly based on the experiences from existing and well-proven raw water monitoring, such as the Colifast CALM ™ system developed by the applicant.

[012] Beskrivelse av relevant tradisjonell teknikk i kontekst med gjeldende oppfinnelse er for eksempel tilgjengelig i EP 0,386,051 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,292,644) og EP 0,690,923 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,518,894). [012] Description of relevant traditional technique in the context of the current invention is available, for example, in EP 0,386,051 - Bl (corresponding to US 5,292,644) and EP 0,690,923 - Bl (corresponding to US 5,518,894).

[013] Gjeldende oppfinnelse, som blir nærmere definert og beskrevet nedenfor, benytter pumper og ventiler for nøyaktig væskehåndtering, en inkubator/reaksjonscelle eller beholder koblet til en detektorenhet, samt kontroll- og grensesnittutstyr. Påvisning av målbakterier er basert på selektiv vekst i flytende reagenser og hydrolyse av spesifikke bakterielle enzyme, hvor et fluorescerende sluttprodukt påfølgene måles av detektorenheten. Dette analysepirnsippet gir nøyaktige resultater ved at det påvises kun dyrkbare målbakterier, brukes vitenskapelige bekreftede metoder (DemoWaterColi 2005) og benyttes bakterieveksmedia produsert av søkeren. [013] The current invention, which is further defined and described below, uses pumps and valves for accurate liquid handling, an incubator/reaction cell or container connected to a detector unit, as well as control and interface equipment. Detection of target bacteria is based on selective growth in liquid reagents and hydrolysis of specific bacterial enzymes, where a fluorescent end product is subsequently measured by the detector unit. This analysis test gives accurate results by detecting only culturable target bacteria, using scientifically confirmed methods (DemoWaterColi 2005) and using bacterial growth media produced by the applicant.

[014] Videre er fordeler ved oppfinnelsen muligheten til å måle turbiditet i vannprøven, innsamling og lagring av en referanseprøve, samt analysering av prøver fra to separate kilder. I sammenheng med den gjeldende oppfinnelse måles turbiditet fortrinnsvis i Formazin Nefelometrisk Unit/enhet, såkalte FNUs. Måling av turbiditet er normalt relatert til lysabsorbsjon- og lysspredningegenskapene til en væske og det finnes et utvalg av forskjellige metoder for å måle disse egenskapene. [014] Furthermore, advantages of the invention are the possibility of measuring turbidity in the water sample, collecting and storing a reference sample, as well as analyzing samples from two separate sources. In the context of the current invention, turbidity is preferably measured in Formazin Nephelometric Units, so-called FNUs. The measurement of turbidity is normally related to the light absorption and light scattering properties of a liquid and there are a variety of different methods for measuring these properties.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN SUMMARY OF THE INVENTION

[015] Ifølge oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten minst én syklus av trinnene: [015] According to the invention, the method comprises at least one cycle of the steps:

- a) tilføring av en første mengde vannprøve til en inkubatorbeholder, - a) adding a first amount of water sample to an incubator container,

- b) tilføring av en andre mengde av en flytende reagens til inkubatorbeholderen, - c) oppvarming av inkubatorbeholderen og dens flytende innholdet til minst en temperatur i området 30 ° C - 50 ° C, fortrinnsvis 35<0>CM5 ° C, - d) forårsaker at minst ett enzym fra gitt bakterie aktiverer reaktantene i gitt reagens, - e) bestråling av blandingen av vannprøve og reagens med lys fra minst én lyskilde, - b) adding a second amount of a liquid reagent to the incubator container, - c) heating the incubator container and its liquid contents to at least a temperature in the range 30 ° C - 50 ° C, preferably 35<0>CM5 ° C, - d ) causes at least one enzyme from a given bacterium to activate the reactants in a given reagent, - e) irradiation of the mixture of water sample and reagent with light from at least one light source,

f) observering av den gitte blandingen ved hjelp av minst en lysdetektor og derved påviser intensitet og / eller tetthet av fluorescerende lys, som de gitte f) observing the given mixture by means of at least one light detector and thereby detecting intensity and/or density of fluorescent light, which they gave

enzymaktiverte reaktantene i gitt reagens avgir ved bestråling av lyskilden, og the enzyme-activated reactants in a given reagent emit upon irradiation of the light source, and

- g) uttømming av blandingen fra beholderen, samt vasking av beholder, tilførselsslanger og utførselsslanger med en syreholdig løsning. - g) draining the mixture from the container, as well as washing the container, supply hoses and outlet hoses with an acidic solution.

[016] Andre funksjoner i følge foreliggende fremgangsmåte vises i de relaterte underkrav2 -16. [016] Other functions according to the present method are shown in the related subclaims 2-16.

[017] Ifølge oppfinnelsen, omfatter apparatet: [017] According to the invention, the apparatus comprises:

- en inkubatorbeholder, - an incubator container,

- et kabinett som omslutter hele beholderen, - a cabinet that encloses the entire container,

- en varmeelement for oppvarming av beholderen og dens innhold, - a heating element for heating the container and its contents,

- en lokk på munningen til beholderen, - a lid on the mouth of the container,

- en væskefylt innløpsslange som strekker seg gjennom lokket og inn i beholderen, - a liquid-filled inlet hose that extends through the lid and into the container,

- en overløpsslange som strekker seg gjennom lokket og til dens utside - an overflow hose that extends through the lid and to its outside

- en væskefylt utløpsslange som strekker seg gjennom lokket fra beholderens bunn og til dens utside. - a liquid-filled outlet hose that extends through the lid from the bottom of the container to its outside.

- en kontrollerbar multi-posisjonventil, tilkoblet den væskefylte innløpsslangen, - a controllable multi-position valve, connected to the liquid-filled inlet hose,

- et første pumpe operativt forbundet med den væskefylte innløpsslangen og multiposisjonventilen, - a first pump operatively connected to the liquid-filled inlet hose and the multi-position valve,

- en sekundær pumpe tilkoblet den væskefylte utløpsslangen, - a secondary pump connected to the liquid-filled outlet hose,

- minst én lyskilde som gjennomlyser en blanding av vannprøven og reaktanter fra en væskereagens etter at prøven og reagensen er tilført beholderen fra inntaksslangen og blandingen befinner seg i beholderen, - minst én lysdetektor for å påvise intensitet og / eller tetthet av fluorescerende lys fra bakterieenzymaktiverte reaktanter av gitte reagens etter belysning fra lyskilden, og - prosessering som er operativ med minst én gitt lyskilde, minst en gitt lysdetektor, en gitt inkubator, gitt multi-posisjonsventil, og gitte første og sekundær pumper, og "output" av gitt prosessering for å kommunisere påvisning og tilhørende måleresultater. - at least one light source that illuminates a mixture of the water sample and reactants from a liquid reagent after the sample and reagent have been fed into the container from the intake hose and the mixture is in the container, - at least one light detector to detect the intensity and/or density of fluorescent light from bacterial enzyme-activated reactants of given reagent after illumination from the light source, and - processing operative with at least one given light source, at least one given light detector, a given incubator, given multi-position valve, and given first and secondary pumps, and "output" of given processing to communicate detection and associated measurement results.

[018] Andre funksjoner av apparatet i følge oppfinnelsen vises til i de relaterte underkravene 18-23. [018] Other functions of the apparatus according to the invention are referred to in the related subclaims 18-23.

[019] I samsvar med det videre aspektet ved den foreliggende oppfinnelsen, vil den flytende reagensen som tilsettes en vannprøve, for å brukes i utførelse av "at-line" analyse av koliforme bakterier i vannprøven samlet inn fra en drikkevannsforsyning, omfatte ingredienser som pepton, gjærekstrakt, enzym aktivator, salter, pyruvat, et vaskemiddel, gallesalter og et methylumbelliferone fluoroserende substrat. Reagensen er nærmere beskrevet i patent EP 0,386,051 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,292,644) og EP 0,690,923 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,518,894). [019] In accordance with the further aspect of the present invention, the liquid reagent added to a water sample for use in performing at-line analysis of coliform bacteria in the water sample collected from a drinking water supply will include ingredients such as peptone , yeast extract, enzyme activator, salts, pyruvate, a detergent, bile salts and a methylumbelliferone fluorescing substrate. The reagent is described in more detail in patent EP 0,386,051 - Bl (corresponding to US 5,292,644) and EP 0,690,923 - Bl (corresponding to US 5,518,894).

[020] Foreliggend e oppfinnelse omfatter derfor en flytende reagens i tillegg til en vannprøve for bruk i utføringen av "at-line" analyse av koliforme bakterier i vannprøve samlet inn fra en drikkevannsforsyning, hvor reagenset omfatter ingrediensene pepton, gjærekstrakt, enzym aktivator, salter, pyruvat, et vaskemiddel, gallesalter og et methylumbelliferone fluoroserende substrat. [020] The present invention therefore comprises a liquid reagent in addition to a water sample for use in performing "at-line" analysis of coliform bacteria in a water sample collected from a drinking water supply, where the reagent comprises the ingredients peptone, yeast extract, enzyme activator, salts , pyruvate, a detergent, bile salts and a methylumbelliferone fluorescing substrate.

[021] Oppfinnelsen vil nå bli nærmere beskrevet med henvisning til vedlagte figurer, som viser foretrukne, ikke-begrensende spesifikasjoner av oppfinnelsen. [021] The invention will now be described in more detail with reference to the attached figures, which show preferred, non-limiting specifications of the invention.

BESKRIVELSE AV FIGURENE DESCRIPTION OF THE FIGURES

[022] Fig. 1 viser en forenklet teknisk oversikt over et apparat i henhold til oppfinnelsen. [022] Fig. 1 shows a simplified technical overview of an apparatus according to the invention.

[023] Fig. 2 viser en mer detaljert skisse av analysatorapparatet som er nyttig i den foreliggende oppfinnelsen. [023] Fig. 2 shows a more detailed sketch of the analyzer apparatus useful in the present invention.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[024] Oppfinnelsen, og da særlig apparatet, er i den videre beskrivelse omtalt som Colifast ALARM™. [024] The invention, and in particular the device, is referred to in the further description as Colifast ALARM™.

[025] Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til en rask fremgangsmåte for analyse av totalkoliforme bakterier, dvs. både E. coli og termotolerante koliforme bakterier. Betydelige tester ble utført ved hjelp av Colifast ALARM ™ og danner grunnlag for analyser basert på et nærvær / fraværmetodeprinsipp. [025] The present invention relates to a rapid method for the analysis of total coliform bacteria, i.e. both E. coli and thermotolerant coliform bacteria. Significant tests were carried out using Colifast ALARM ™ and form the basis for analyzes based on a presence / absence method principle.

[026] I et typisk oppsett ble en 100 ml vannprøve av drikkevann trukket ut automatisk av apparatet i følge oppfinnelsen, i forprogrammerte intervaller, fra en ekstern vannkilde, en ekstern prøveflaske for laboratoireformål som inneholder vann og med magnetisk røring. Apparatet pumpet typisk inn 47 ml konsentrert flytende reagens i vannprøven. Typiske nyttige reagenser som ble brukt var Colifast 6 ™ eller Colifast E. coli medium™ laget av Colifast AS, Lysaker, Norge. Prøvene ble inkubert ved 37 ° C [ E. coli og totalkoliforme bakterier) eller ved 44 ° C (termotolerante koliforme bakterier) og avlest automatisk av det nyoppfunnede apparatet en gang i timen over en total testperiode i området 6-13,14 eller 15 timer. Nærvær / fråvær resultater ble anslått av apparatet basert på høy eller lav fluorescens i den inkuberte prøven. [026] In a typical setup, a 100 ml water sample of drinking water was extracted automatically by the device according to the invention, at pre-programmed intervals, from an external water source, an external sample bottle for laboratory purposes containing water and with magnetic stirring. The apparatus typically pumped 47 ml of concentrated liquid reagent into the water sample. Typical useful reagents used were Colifast 6™ or Colifast E. coli medium™ made by Colifast AS, Lysaker, Norway. The samples were incubated at 37 °C [E. coli and total coliform bacteria) or at 44 °C (thermotolerant coliform bacteria) and read automatically by the newly invented device once an hour over a total test period in the range of 6-13,14 or 15 hours . Presence/absence results were estimated by the device based on high or low fluorescence in the incubated sample.

[027] For å kunne vurdere nøyaktigheten til fremgangsmåten som brukes med den foreliggende oppfinnelse, ble referansemetoder anvendt og bekreftet nøyaktigheten gitt av oppfinnelsen. E. coli ble kvantifisert ved membranifltrering (0.45um pore størrelse, 45 mm diameter, sterile, cellulose membranfilter, Sartorius, Gottingen, Tyskland) på MFC agar (Difco, Maryland, USA). Platene ble inkubert ved 44 ° i 24 timer. Karakteristiske kolonier ble bekreftet som angivelige E. coli av indolreaksjon som beskrevet i ISO 1900a. Som en alternativ referansemetode, ble en Colilert ® 18 reagens tilsatt en prøve i en steril flaske og inkubert ved 35 ° C i 18 timer. Resultatene ble lest og tolket i henhold til instruksjonene fra produsenten (Idexx, Maine, USA). Resultatene ble rapportert som tilstedeværelse eller fravær av målbakterier, og bekreftet riktigheten av analysen gitt av den gjeldende oppfinnelsen. [027] In order to assess the accuracy of the method used with the present invention, reference methods were used and confirmed the accuracy provided by the invention. E. coli was quantified by membrane filtration (0.45 µm pore size, 45 mm diameter, sterile, cellulose membrane filter, Sartorius, Gottingen, Germany) on MFC agar (Difco, Maryland, USA). The plates were incubated at 44° for 24 hours. Characteristic colonies were confirmed as putative E. coli by indole reaction as described in ISO 1900a. As an alternative reference method, a Colilert ® 18 reagent was added to a sample in a sterile bottle and incubated at 35 °C for 18 hours. The results were read and interpreted according to the manufacturer's instructions (Idexx, Maine, USA). The results were reported as presence or absence of target bacteria, confirming the accuracy of the assay provided by the present invention.

[028] Alle prøver brukt for testing av oppfinnelsen og, til sammenligning, vesentlig mer tidkrevende tester, var basert på behandlet vann fra springen med lavt eller fraværende klornivå. Prøvene ble utarbeidet ved poding av E. coli laboratoriestamme eller ved tilsetting av prøver fra Lysakerelven i Oslo, Norge. Prøvene ble fortynnet for å oppnå et målnivå på 1-20 koliforme bakterier per 100 ml prøvevolum. En gang om dagen samlet det gjeldende Colifast ALARM ™ apparatet automatisk inn og analyserte umiddelbart prøver. Prøvene for referansemetodene ble oppbevart ved in-situ temparaturer (10-20 ° C) og analysert innen to timer. [028] All samples used for testing the invention and, by comparison, significantly more time-consuming tests, were based on treated tap water with low or no chlorine levels. The samples were prepared by inoculation of E. coli laboratory strain or by adding samples from the Lysakerelven in Oslo, Norway. The samples were diluted to achieve a target level of 1-20 coliform bacteria per 100 ml sample volume. Once a day, the current Colifast ALARM ™ device automatically collected and immediately analyzed samples. The samples for the reference methods were stored at in-situ temperatures (10-20 °C) and analyzed within two hours.

[029] Sammen med Colifast ALARM ™ apparatet ble det brukt et flytende reagens som omfatter ingrediensene pepton, gjærekstrakt, enzym aktivator, salter, pyruvat, et vaskemiddel, gallesalter og et methylumbelliferone fluoroserende substrat. Reagenset er nærmere beskrevet i patent EP 0,386,051 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,292,644) og EP 0,690,923 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,518,894). [029] Along with the Colifast ALARM ™ device, a liquid reagent was used that includes the ingredients peptone, yeast extract, enzyme activator, salts, pyruvate, a detergent, bile salts and a methylumbelliferone fluorescing substrate. The reagent is described in more detail in patent EP 0,386,051 - Bl (corresponding to US 5,292,644) and EP 0,690,923 - Bl (corresponding to US 5,518,894).

[030] Apparatet i følge oppfinnelsen blir nå kort beskrevet med referanse til fig. 1 og 2. [030] The apparatus according to the invention will now be briefly described with reference to fig. 1 and 2.

[031] Colifast ALARM ™ apparatet 1 på fig. 1 og 2 har en inkubatorbeholder 2, et kabinett 3 som omslutter hele beholder 2. [031] The Colifast ALARM ™ device 1 in fig. 1 and 2 have an incubator container 2, a cabinet 3 which encloses the entire container 2.

[032] Kabinett 3 er laget av et ikke-transperent materiale, dette på grunn av lyssensiviteten til den flytende reagensen. Kabinettet har en bunn med et varmeapparat 4 for oppvarming av beholder 2 og dens innhold. Kabinettet 3 kan være av et varmeisolerende materiale for å holde på temperaturen til det oppvarmede innholdet i beholderen, eller være delvis varmeisolerende og delvis varmeledende (nærmest kammeret). En lokk 5 er plassert på en munning V av beholderen 2 til forsegling av beholderen. [032] Cabinet 3 is made of a non-transparent material, this due to the light sensitivity of the liquid reagent. The cabinet has a bottom with a heater 4 for heating container 2 and its contents. The cabinet 3 can be made of a heat-insulating material to maintain the temperature of the heated contents in the container, or be partly heat-insulating and partly heat-conducting (closest to the chamber). A lid 5 is placed on a mouth V of the container 2 to seal the container.

[033] En væskefylt inntaksslange 6 strekker seg gjennom lokket 5 og inn i beholderen 2, en væskefylt overløpsslange 7 strekker seg gjennom lokket 5 fra kammeret 2 til utsiden, og en væskefylt utløpsslange 8 går gjennom lokket 5 fra bunnen 2 ' av beholder 2 til utsiden av beholder 2. En kontrollerbar multi-posisjonsventil 9 er operativ med væskefylt inntaksslange 6 via en pumpe 10, den væskefylt inntaksslange 6 er operativt koblet til pumpen 10 på dennes første port, og med et ventilhjul Vh av kontrollerbar multi-posisjonventil 9 koblet til pumpen 10 på dennes sekundære port. Pumpen 10 bør være i stand til å ha minst to volumetriske innstillinger, for eksempel 100 ml og 47 ml. [033] A liquid-filled inlet hose 6 extends through the lid 5 into the container 2, a liquid-filled overflow hose 7 extends through the lid 5 from the chamber 2 to the outside, and a liquid-filled outlet hose 8 passes through the lid 5 from the bottom 2' of the container 2 to the outside of container 2. A controllable multi-position valve 9 is operative with liquid-filled inlet hose 6 via a pump 10, the liquid-filled inlet hose 6 is operatively connected to the pump 10 at its first port, and with a valve wheel Vh of controllable multi-position valve 9 connected to the pump 10 on its secondary port. The pump 10 should be capable of at least two volumetric settings, for example 100 ml and 47 ml.

[034] Ventilen 9 betjenes av en aktuator 11, f.eks en stepper-motor, som styres fra en prosessor 12, f.eks en mikroprosessor, en vanlig stasjonær eller bærbar datamaskin, eller en tilpasset prosessor. Dessuten er pumpen 10 drevet av en aktuator 13, f.eks en motor med et gir i samspill med et stativ på en stempelstang 10 'av stempelet 10 "i pumpen 10. [034] The valve 9 is operated by an actuator 11, for example a stepper motor, which is controlled from a processor 12, for example a microprocessor, a regular desktop or laptop computer, or a customized processor. Moreover, the pump 10 is driven by an actuator 13, e.g. a motor with a gear in interaction with a rack on a piston rod 10' of the piston 10 "in the pump 10.

[035] Den væskefylte utløpsslangen 8 er operativt interaktiv med en kontrollerbar pumpe 14, pumpen kan f.eks være av en kjent type som handler på utsiden av slange 8 med en eksentrisk drivakse eller den kan ha elliptisk form. Pumpen 14 er operert fra prosessoren 12 via en drivmotor 15. [035] The liquid-filled outlet hose 8 is operatively interactive with a controllable pump 14, the pump may for example be of a known type which acts on the outside of the hose 8 with an eccentric drive axis or it may have an elliptical shape. The pump 14 is operated from the processor 12 via a drive motor 15.

[036] Minst en lyskilde 16 sørger for bestråling av innholdet 17 i beholder 2, dvs en blanding av vannprøven og en flytende reagens når slike blandinger er tilstede i beholder 2. Minst en lysdetektor 18 er til stede for å påvise intensitet og / eller tetthet av fluorescerende lys fra bakterieenzymaktiverte reaktanter i den gitte reagensen ved bestråling fra lyskilden 16, og for måling av turbiditet i blandingen 17, dvs. lysabsorbsjon og lysspredningsegenskaper i blandingen 17. Prosessoren 12 er operativt tilknyttet minst én lyskilde 16 og minst en lysdetektor 18, f.eks via optiske fibre og passende grensesnitt eller via vanlig kabling. [036] At least one light source 16 provides irradiation of the contents 17 in container 2, i.e. a mixture of the water sample and a liquid reagent when such mixtures are present in container 2. At least one light detector 18 is present to detect intensity and/or density of fluorescent light from bacterial enzyme-activated reactants in the given reagent by irradiation from the light source 16, and for measuring turbidity in the mixture 17, i.e. light absorption and light scattering properties in the mixture 17. The processor 12 is operatively connected to at least one light source 16 and at least one light detector 18, f .eg via optical fibers and suitable interfaces or via normal cabling.

[037] Den kontrollerbare mulitposisjonsventilen 9 er selektivt koblingsklar til minst et flertall av: - en vannforsyning 19 på ventilinnløpet VI for å skaffe vann til testing av en stikkprøve derav, - en klor-i-vannprøve nøytrahsatorforsyning 20 på ventilløpet V2 for å tilsette f.eks natrium-tiosulfat (Na-tiosulfat) til vannprøven hvis vannprøven inneholder klor, - en flytende reagensforsyning 21 via et filter og / eller énveisventil 22 ved ventilinnløpet V3, ventilen 22 for å hindre at vann eller infisert vann eller til og med luft å trenge inn i en reservoarforsyning av gitt reagens, - en syreholdig løsningtilførsel 23, f.eks saltsyre (HC1), ved ventilinnløp V4 for vasketilførselsslange 6 til- og utførselsslange 7 og 8 fra beholder 2, og - en væskefylt avfallsslange 24 som strekker seg fra ventilutløp V5, slangen for f.eks. tømming av innhold i ventil 9 eller flytende rester i pumpe 10. [037] The controllable multi-position valve 9 is selectively connectable to at least a majority of: - a water supply 19 on the valve inlet VI to obtain water for testing a sample thereof, - a chlorine-in-water sample neutralizer supply 20 on the valve barrel V2 to add f .eg sodium thiosulphate (Na-thiosulphate) to the water sample if the water sample contains chlorine, - a liquid reagent supply 21 via a filter and / or one-way valve 22 at the valve inlet V3, the valve 22 to prevent water or infected water or even air to penetrate into a reservoir supply of given reagent, - an acidic solution supply 23, e.g. hydrochloric acid (HC1), at valve inlet V4 for washing supply hose 6 to and outlet hoses 7 and 8 from container 2, and - a liquid-filled waste hose 24 extending from valve outlet V5, the hose for e.g. emptying contents in valve 9 or liquid residues in pump 10.

[038] Det er viktig å merke seg at overløpsslange 7 og avløpsslange 8 er separate slanger, og ikke er knyttet til tilførselsslange 6 eller ventil 9 for å unngå enhver risiko for bakteriell krysskontaminering. [038] It is important to note that overflow hose 7 and drain hose 8 are separate hoses, and are not connected to supply hose 6 or valve 9 to avoid any risk of bacterial cross-contamination.

[039] Oppvarmeren 4 kan varme inkubatorbeholderen 2 og dens flytende innhold 17 (blandingen) og holde den deretter på minst én temperaturen i området 30<0>C - 50 ° C, fortrinnsvis 35 ° C-45 ° C. Først er det mest passende med temperaturen 37 0 C for å påvise E.coli bakterier eller total koliforme bakterier og en annen temperatur er 44 ° C for å påvise termotolerante koliforme bakterier. [039] The heater 4 can heat the incubator container 2 and its liquid contents 17 (the mixture) and then keep it at at least one temperature in the range 30<0>C - 50 ° C, preferably 35 ° C-45 ° C. First, the most suitable with the temperature 37 0 C to detect E.coli bacteria or total coliform bacteria and another temperature is 44 ° C to detect thermotolerant coliform bacteria.

[040] Minimum må minst den ene lyskilden 16, som skal belyse blanding 17 for måling av turbiditet, være en lyskilde, f.eks en lysdiode (LED), som konfigureres til å operere i det infrarøde spektrum (IR) f.eks med en bølgelengde på 860 ± 60 nanometer, og turbiditetpåvisning av lysspredningen fra blandingen må gjøre bruk av minst en lysdetektor 18 som ligger med en vinkel på 90 ± 2,5 grader i forhold til den innfallende lysstrålen. Turbiditeten er definert i form av Formazin nefelometrisk Units (FNU). [040] At a minimum, at least one light source 16, which is to illuminate mixture 17 for measuring turbidity, must be a light source, e.g. a light emitting diode (LED), which is configured to operate in the infrared spectrum (IR) e.g. with a wavelength of 860 ± 60 nanometers, and turbidity detection of the light scattering from the mixture must make use of at least one light detector 18 located at an angle of 90 ± 2.5 degrees in relation to the incident light beam. The turbidity is defined in terms of Formazin Nephelometric Units (FNU).

[041] Minst én lyskilde 16, som skal belyse blanding 17 for måling av fluorescens, må være en lyskilde, f.eks en lysdiode (LED), som konfigureres til å operere UV spekteret med f.eks en bølgelengde på 200 ± 200 nanometer (f.eks 365nm), og fluorescensdeteksjon av lyset (f.eks 420nm) fra blandingen må gjøre bruk av minst en lysdetektor 18 som ligger med en vinkel på 90 ± 2,5 grader til den innfallende lysstråle. [041] At least one light source 16, which is to illuminate mixture 17 for measuring fluorescence, must be a light source, e.g. a light emitting diode (LED), which is configured to operate in the UV spectrum with e.g. a wavelength of 200 ± 200 nanometers (e.g. 365nm), and fluorescence detection of the light (e.g. 420nm) from the mixture must make use of at least one light detector 18 located at an angle of 90 ± 2.5 degrees to the incident light beam.

[042] Fortrinnsvis er det minst to lyskilder 16, der en av de minimum to gitte lyskildene er en lyskilde som konfigureres til å operere i UV spekteret og der den andre av de rninimum to gitte lyskildene er en lyskilde som konfigureres til å operere i IR spekteret. [042] Preferably there are at least two light sources 16, where one of the minimum two given light sources is a light source configured to operate in the UV spectrum and where the other of the minimum two given light sources is a light source configured to operate in the IR the spectrum.

[043] Apparatet 1 har utganger 25 fra prosessor 12 som sørger for fjernstyrt kontroll og / eller alarmer for å hjelpe og / eller varsle en operatør eller beslutningstaker med hensyn til tiltak som skal treffes for midlertidig å stoppe vannforsyninger, tilsette mer klor for å drepe bakterier eller varsle samfunnet / forbrukere til å iverksette hensiktsmessige tiltak, som f.eks. å koke vann som skal brukes til drikke eller mat. Måter å kommunisere på kan f.eks være via GSM, LAN, PLS eller direkte kabling. [043] The apparatus 1 has outputs 25 from the processor 12 which provide for remote control and/or alarms to assist and/or alert an operator or decision-maker with regard to measures to be taken to temporarily stop water supplies, add more chlorine to kill bacteria or notify society / consumers to take appropriate measures, such as e.g. to boil water to be used for drinking or food. Ways to communicate can be, for example, via GSM, LAN, PLC or direct cabling.

[044] Nå som apparatet 1 er beskrevet, er det passende å oppsummere fremgangsmåten for å utføre "at-line" analyse av koliforme bakterier i en vannprøve hentet fra en drikkevannsforsyning. Fremgangsmåten omfatter minst én syklus av trinnene: - a) tilføring av en første mengde rennende vannprøve 19 til en inkubatorbeholder 2, [044] Now that the apparatus 1 has been described, it is appropriate to summarize the procedure for performing "at-line" analysis of coliform bacteria in a water sample obtained from a drinking water supply. The method comprises at least one cycle of the steps: - a) supplying a first amount of flowing water sample 19 to an incubator container 2,

- b) tilføring av en andre mengde flytende reagens 21 til inkubatorbeholder 2, - b) adding a second amount of liquid reagent 21 to incubator container 2,

- c) oppvarming av inkubatorbeholder 2 og dens flytende innholdet til minst en temperatur i området 30 ° C - 50 ° C, fortrinnsvis 35 0 C-45 ° C, - d) forårsaker at minst ett enzym fra en gitt bakterie aktiverer reaktantene i gitte reagens, - e) bestråling av blanding 17 av vannprøve og reagens med lys fra minst én lyskilde 16, - f) observering av den gitte blandingen ved hjelp av minst en lysdetektor 18 og derved påvise intensitet og / eller tetthet av fluorescerende lys, som de gitte enzymaktiverte reaktantene i gitt reagens avgir ved bestråling av lyskilde 16, og - g) uttømming av blanding 17 fra beholderen, samt vasking av beholder 2, tilførselsslanger 6 og utførselsslanger7,8 med en syreholdig løsning. - c) heating incubator container 2 and its liquid contents to at least a temperature in the range 30 ° C - 50 ° C, preferably 35 0 C - 45 ° C, - d) causing at least one enzyme from a given bacterium to activate the reactants in given reagent, - e) irradiation of mixture 17 of water sample and reagent with light from at least one light source 16, - f) observation of the given mixture by means of at least one light detector 18 and thereby detect intensity and / or density of fluorescent light, which they the given enzyme-activated reactants in the given reagent are released by irradiation of light source 16, and - g) draining mixture 17 from the container, as well as washing container 2, supply hoses 6 and outlet hoses 7,8 with an acidic solution.

[045] Minst én temperatur velges fra Tl = 35 - 37 ° C og T2 = 44 °, Tl er knyttet til måling av E. coli og totalkoliforme bakterier, og T2 er relatert til måling av termotolerante koliforme bakterier. [045] At least one temperature is selected from Tl = 35 - 37 ° C and T2 = 44 °, Tl is related to the measurement of E. coli and total coliform bacteria, and T2 is related to the measurement of thermotolerant coliform bacteria.

[046] Som indikert ovenfor, kan trinn f) videre omfatte måling av turbiditet i blanding 17, dvs. lysabsorbsjons- og lysspredningsegenskapene til blandingen. Turbiditeten defineres i form av Formazin nefelometrisk Unit/enhet, lyset til blanding 17 for måling av turbiditet er i det infrarøde spekteret, med f.eks. en bølgelengde på 860 ± 60 nanometer, og påvisning av lysspredning fra blandingen er gjort med en innfallsvinkel på 90 ± 2,5 grader på lysstrålen. Reagenset som beskrevet tidligere til bruk i utføringen av "at-line" analysen er også et aspekt av foreliggende oppfinnelsen og kan beskrives som følger; et flytende reagens i tillegg til en vannprøve for bruk i utføringen av "at-line" analyse av koliforme bakterier i vannprøve samlet inn fra en drikkevannsforsyning, hvor reagenset omfatter ingredienser pepton, gjærekstrakt, enzym aktivator, salter, pyruvat, et vaskemiddel, gallesalter og et methylumbelliferone fluoroserende substrat. [046] As indicated above, step f) may further comprise measurement of turbidity in mixture 17, i.e. the light absorption and light scattering properties of the mixture. The turbidity is defined in the form of Formazin nephelometric unit, the light of mixture 17 for measuring turbidity is in the infrared spectrum, with e.g. a wavelength of 860 ± 60 nanometers, and detection of light scattering from the mixture is done with an angle of incidence of 90 ± 2.5 degrees on the light beam. The reagent as described earlier for use in performing the "at-line" analysis is also an aspect of the present invention and can be described as follows; a liquid reagent in addition to a water sample for use in performing "at-line" analysis of coliform bacteria in a water sample collected from a drinking water supply, the reagent comprising ingredients peptone, yeast extract, enzyme activator, salts, pyruvate, a detergent, bile salts and a methylumbelliferone fluorescing substrate.

[047] I noen tilfeller inneholder offentlig vannforsyning en viss mengde klor for å fjerne flesteparten av de forventede bakterier i vanninnløpet til en vannpumpestasjon, hvor filtrering og eventuell tilførsel av klor og / eller kalk skjer før levering til distribusjonslinjer i grunnen, for videre forgreninger til boliger, kontorbygg og offentlige anlegg. For å unngå at dette kloret forstyrrer testingen, omfatter trinn a) tilsetning av natriumtiosulfat (Na-tiosulfat) til vannprøven dersom vannprøven inneholder klor. Det tilsatte volumet av natriumtiosulfat er ca 5% av vannets prøvevolum. [047] In some cases, public water supplies contain a certain amount of chlorine to remove most of the expected bacteria in the water inlet to a water pumping station, where filtration and possible addition of chlorine and / or lime takes place before delivery to distribution lines in the ground, for further branches to housing, office buildings and public facilities. To avoid this chlorine interfering with the testing, step a) includes adding sodium thiosulphate (Na-thiosulphate) to the water sample if the water sample contains chlorine. The added volume of sodium thiosulphate is about 5% of the water's sample volume.

[048] Den syreholdige løsningen for rengjøring av apparatets slanger, ventiler og beholdere er f.eks saltsyre (HC1), selv om f.eks alkohol vil kunne brukes. Imidlertid er ikke alkohol å foretrekke for øyeblikket på grunn av kostnader og brennbarhet. Mengden av den syrlige løsningen er ca 30% av vannets prøvevolum hvis ingen koliforme bakterier er funnet i blandingen, og ca 60% hvis koliforme bakterier finnes i blandingen. Normalt vil 0,1 M HC1 være tilstrekkelig. [048] The acidic solution for cleaning the device's hoses, valves and containers is, for example, hydrochloric acid (HC1), although alcohol, for example, can be used. However, alcohol is not currently preferred due to cost and flammability. The amount of the acidic solution is approximately 30% of the water's sample volume if no coliform bacteria are found in the mixture, and approximately 60% if coliform bacteria are present in the mixture. Normally 0.1 M HC1 will be sufficient.

[049] I tilfelle pH verdien i blanding 17, som gis gjennom trinn a) og b), er for høy, kan den bli redusert før påvisning av fluorescens- og turbiditetsmåling. Dette vil imidlertid nødvendiggjøre et ytterligere væskeinnløp i ventil 9, og et kontrollerbart tilsig av en 100% bakteriefri basisk løsning i beholder 2. Slike prosedyremessige skritt er ikke nødvendig under normal drift. [049] In case the pH value in mixture 17, which is given through steps a) and b), is too high, it can be reduced before detection by fluorescence and turbidity measurement. However, this will necessitate an additional liquid inlet in valve 9, and a controllable influx of a 100% bacteria-free basic solution in container 2. Such procedural steps are not necessary during normal operation.

[050] Som indikert over, er det volumetriske forholdet mellom drikkevannsprøven og reagensen omlag 2:1, og tilstrekkelig volum av reagensen er 44 - 49% av vannprøvens volum. [050] As indicated above, the volumetric ratio between the drinking water sample and the reagent is about 2:1, and the sufficient volume of the reagent is 44 - 49% of the volume of the water sample.

[051] I en utforming, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, utgjør den gitte reagensen et næringsstoff, som støtter metabolismen til de levende koliforme organismene og et fluoriserende substrat (som MU glucuronide), som reagerer med bakterielle enzymer som frigir et produkt som avgir et lys med én bølgelengde når den bestråles med lys av en annen bølgelengde. Reagenset omfatter ingrediensene pepton, gjærekstrakt, enzym aktivator, salter, pyruvat, et vaskemiddel, gallesalter og et methylumbelliferone fluoroserende substrat. Reagensen er beskrevet i patent EP 0,386,051 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,292,644) og EP 0,690,923 - Bl (tilsvarende amerikanske 5,518,894). [051] In one embodiment, in accordance with the present invention, the given reagent constitutes a nutrient, which supports the metabolism of the living coliform organisms and a fluorescent substrate (such as MU glucuronide), which reacts with bacterial enzymes that release a product that emits a light of one wavelength when irradiated with light of another wavelength. The reagent comprises the ingredients peptone, yeast extract, enzyme activator, salts, pyruvate, a detergent, bile salts and a methylumbelliferone fluorescing substrate. The reagent is described in patent EP 0,386,051 - Bl (corresponding to US 5,292,644) and EP 0,690,923 - Bl (corresponding to US 5,518,894).

[052] Aspektet ved å unngå krysskontaminering og systemdesinfeksjon har blitt beskrevet i oppfinnelsen. Risiko for krysskontaminering og forurensning av drikkevannskilde er vesentlig redusert ved at apparatets slanger, pumper, ventiler er separert i en ren og en uren del. 3 fysiske barrierer og en kontrollmekanisme bestående av en luftlås i inkubatorbeholder, 2 separate ventiler, samt et overløpssystem som sikrer at barrierene fungerer og beskytter apparatet mot forurensning av den rene delen og forurensning av drikkevannskilde. [052] The aspect of avoiding cross-contamination and system disinfection has been described in the invention. The risk of cross-contamination and contamination of the drinking water source is significantly reduced by the device's hoses, pumps and valves being separated into a clean and an unclean part. 3 physical barriers and a control mechanism consisting of an airlock in the incubator container, 2 separate valves, as well as an overflow system which ensures that the barriers work and protects the device against contamination of the clean part and contamination of the drinking water source.

Resultater fra utførte analyseforsøk oppfylte tiltenkte spesifikasjoner, og fleksibilitet og brukervennlighet av apparatet og fremgangsmåten ble bekreftet og forsøkene ble videreført til det forelå tilstrekkelige data for verifisering av fremgangsmåten og dens deteksjonsgrenser. 131 prøver ble analysert av apparatet i følge oppfinnelsen og av to kjente referansemetoder. Prøver som inneholdt lave nivåer av målbakterier ble generert ved hjelp av både E. coli laboratoirestammer og miljøprøver. Miljøprøvene ble valgt for å øke variasjonen og stressnivået til målbakteriene. En oppsummering av Colifast ALARM ™ resultatene er vist i Tabell 1 nedenfor. Results from performed analytical tests met the intended specifications, and flexibility and ease of use of the apparatus and method were confirmed and the experiments were continued until sufficient data were available for verification of the method and its detection limits. 131 samples were analyzed by the apparatus according to the invention and by two known reference methods. Samples containing low levels of target bacteria were generated using both E. coli laboratory strains and environmental samples. The environmental samples were chosen to increase the variety and stress level of the target bacteria. A summary of the Colifast ALARM ™ results is shown in Table 1 below.

[054] Studien genererte noen falske positive og falske negative prøver som er å forvente når det brukes prøver med bakterielle nivåer nær null. Det lave antallet målbakterier i den voluminøse preliminære vannprøven (for instrument og referanseprøvetaking) kan statistisk sett føre til en ujevn fordeling av målbakterier i de ulike delprøvene innhentet fra hovedvannprøven. Korrelasjonen mellom de to referansemetodene viste tilsvarende overensstemmelse (90%) med den prosentvise overensstemmelsen for apparatet, med hensyn til co/j-analyse, sammenlignet med referansemetodene. Også et høyere antall prøver ville sannsynligvis forsterket korrelasjonen mellom de ulike metodene. [054] The study generated some false positive and false negative samples which is to be expected when using samples with bacterial levels close to zero. The low number of target bacteria in the voluminous preliminary water sample (for instrument and reference sampling) can statistically lead to an uneven distribution of target bacteria in the various sub-samples obtained from the main water sample. The correlation between the two reference methods showed similar agreement (90%) with the percentage agreement for the apparatus, with respect to co/j analysis, compared to the reference methods. Also, a higher number of samples would probably strengthen the correlation between the different methods.

[055] Tidligere studier har vist at Colifast E.coli medium ™ påviser mer enn 95% av E.coli bakterier etter 12 timers inkubering ved 37 ° C med en sensitivitet og spesifisitet på henholdsvis 98% og 97%. Lignende resultater ble påvist for Colifast 6 medium ™ som benyttes for deteksjon av total og termotolerante koliforme bakterier (DemoWaterColi, 2005). Disse resultatene er basert på tid-til-påvisning med en satt terskelverdi for påvisning av levedyktige bakterier som går inn i en eksponentiell vekstfase og dermed øker fluorescensen til et høyt nivå (Tryland et al 2001). [055] Previous studies have shown that Colifast E.coli medium ™ detects more than 95% of E.coli bacteria after 12 hours of incubation at 37 °C with a sensitivity and specificity of 98% and 97%, respectively. Similar results were demonstrated for Colifast 6 medium ™ which is used for the detection of total and thermotolerant coliform bacteria (DemoWaterColi, 2005). These results are based on time-to-detection with a set threshold value for the detection of viable bacteria entering an exponential growth phase and thus increasing fluorescence to a high level (Tryland et al 2001).

[056] Instrumentets tid-til-resultat ble overvåket under analysen av de tre parametrene, og påvisningsuden ble satt i henhold til maksimal tid registrert for påvisning av 1-2 målbakterier per 100 ml vannprøve. Testspesifikasjonene til Colifast ALARM ™ er trukket frem i tabell 2 under. [056] The instrument's time-to-result was monitored during the analysis of the three parameters, and the detection threshold was set according to the maximum time recorded for the detection of 1-2 target bacteria per 100 ml of water sample. The test specifications for Colifast ALARM ™ are highlighted in table 2 below.

[058] Det ble observert god korrelasjon mellom de overvåkede E. coli og koliforme nivåene ved Colifast ALARM ™ og referansemetodene under en utvidet, ikke-offentlig testperiode som strakk seg over ca 10 måneder. De falske positive og negative i studien var forventet på grunn av det lave nivået av målorganismer som statistisk gir en ujevn fordeling i det totale prøvevolumet. [058] Good correlation was observed between the monitored E. coli and coliform levels by Colifast ALARM ™ and the reference methods during an extended, non-public testing period spanning approximately 10 months. The false positives and negatives in the study were expected due to the low level of target organisms which statistically give an uneven distribution in the total sample volume.

[059] Apparatet krever lite vedlikehold og vil normalt ha behov for service hver 20 dag, for etterfylling av reagenser og omstart av apparatet. Colifast ALARM ™ er utformet for enkel håndtering og installasjon. Den er laget som en kompakt enhet med et støvsikkert og vanntett kabinett som sikrer stabil drift under ulike miljøforhold. Den helautomatiske prøvetakingen og analysen apparatet gjør, samt den tilhørende fremgangsmåten, eliminerer også de eventuelle menneskelige feilene ved bruk av tradisjonelle laboratorieanalyser, som involverer mange håndteringer i løpet av prøvetaking, transport, lagring, forberedelser, analyser og rapportering, som kan forandre resultatet. [059] The apparatus requires little maintenance and will normally need service every 20 days, for refilling reagents and restarting the apparatus. Colifast ALARM ™ is designed for easy handling and installation. It is made as a compact unit with a dust-proof and waterproof cabinet that ensures stable operation under various environmental conditions. The fully automatic sampling and analysis performed by the device, as well as the associated procedure, also eliminates the possible human errors when using traditional laboratory analyses, which involve many handlings during sampling, transport, storage, preparation, analysis and reporting, which can change the result.

[060] Den tidlige varslingen og nøyaktigheten i påvisning av E.coli og koliforme bakterier apparatet og oppfinnelsens fremgangsmåte gir, er et nyttig verktøy for automatisert og rask på-stedet-analyse. Tester og relaterte studier har vist at dette "at-line" apparatet og fremgangsmåten som brukes er velegnet for automatisert og kontinuerlig overvåkning av E.coli og koliforme nivåer i vannforsyninger og distribusjonssystemer. [060] The early warning and accuracy in detection of E.coli and coliform bacteria provided by the device and the method of the invention is a useful tool for automated and rapid on-site analysis. Tests and related studies have shown that this "at-line" device and the method used are suitable for automated and continuous monitoring of E.coli and coliform levels in water supplies and distribution systems.

Claims

1. Method for carrying out "at-line" analysis of coliform bacteria in a water sample taken from a drinking water supply, characterized in that it comprises at least one cycle of the steps: a) supply of a first amount of water sample to an incubator container, - b) supply of a second amount of a liquid reagent to the incubator container, c) heating the incubator container and its liquid contents to at least a temperature in the range 30 0 C - 50 ° C, preferably 35 ° C-45 ° C, - d) causing at least one enzyme from given bacteria activates the reactants in a given reagent, - e) irradiation of the mixture of water sample and reagent with light from at least one light source, f) observation of the given mixture by means of at least one light detector and thereby detect the intensity and / or density of fluorescent light, which the given enzyme-activated reactants in the given reagent emit upon irradiation of the light source, and - g) emptying the mixture from the container, as well as washing the container, supply hoses and outlet hoses with a acidic solution.

2. Method according to claim 1, where at least one temperature is selected from Tl = 35 - 37 ° C and T2 = 44 °, where Tl is related to the measurement of E. coli and total coliform bacteria, and T2 is related to the measurement of thermotolerant coliforms bacteria.

3. Method according to claim 1, where step f) further comprises measurement of turbidity in the mixture, i.e. the light-absorbing and light-refracting properties of the mixture.

4. Method according to claim 3, where turbidity is defined in terms of Formazin Nephelometric Unit.

5. Method according to claim 3 or 4, where light to the mixture for measuring turbidity is in the infrared spectrum, for example with a wavelength of 860 ± 60 nanometers, and where detection of light scattering from the mixture is carried out at an angle of 90 ± 2.5 degrees to the incident light beam.

6. Method according to any one of claims 1-5, where step a) comprises adding sodium thiosulphate (Na-thiosulphate) to the water sample if the water sample contains chlorine.

7. Method according to claim 6, where the volume of sodium thiosulphate is approximately 5% of the volume of the water sample.

8. Method according to any one of claims 1-7, wherein the given acidic solution is hydrochloric acid (HCl).

9. Method according to any one of claims 1-8, where the amount of acidic solution is about 30% of the volume of the water sample if no coliform bacteria are found in the mixture, and about 60% if coliform bacteria are found in the mixture.

10. Method according to any one of claims 1-9, where the pH value of the mixture given through steps a) and b) is increased before detection of fluorescence.

11. The method of any one of claims 1-10, wherein the volumetric ratio of the water sample to the reagent is about 2:1.

12. Method according to claim 11, where the volume of the reagent is 44 - 49% of the volume of the water sample.

13. A method according to any one of claims 1-12, wherein the reagent comprises the ingredients peptone, yeast extract, enzyme activator, salts, pyruvate, a detergent, bile salts and a methylumbelliferone fluorescing substrate.

14. Apparatus for carrying out "at-line" analysis of coliform bacteria in a water sample taken from a drinking water supply, characterized in that the apparatus comprises: - an incubator container, - a cabinet that encloses the entire container, - an incubator for heating the container and its contents, - a lid on the mouth of the container, - a liquid-filled inlet hose that extends through the lid and into the container, - an overflow hose that extends through the lid and to its outside, - a liquid-filled outlet hose that extends through the lid from the bottom of the container to its outside . - a controllable multi-position valve operating with the liquid-filled inlet hose, - a first pump operatively connected to the inlet hose and the multi-position valve, - a secondary pump operating with the liquid-filled outlet hose, - at least one light source that illuminates a mixture of the water sample and reactants from a liquid reagent after the sample and reagent have been supplied to the container from the intake hose and the mixture is in the container, - at least one light detector to detect intensity and / or density of fluorescent light from bacterial enzyme-activated reactants of given reagent after illumination from the light source, and - processing which is operative with at least one given light source, at least one given light detector, a given incubator, given multi-position valve, and given first and secondary pumps, and "output" of given processing to communicate detection and associated measurement results.

15. Apparatus according to claim 14, wherein the liquid-filled inlet hose is operatively connected to a pump having at least two volumetric settings.

16. Apparatus according to claim 15, wherein the liquid-filled inlet hose is operatively connected to the pump at a port, and wherein the controllable multi-position valve is connected to the continuously operative pump at a secondary port.

17. Apparatus according to claim 14, wherein the controllable multi-position valve is selectively connectable to at least a plurality of: - a water supply providing water for testing a sample thereof, - a chlorine-in-water sample neutralizer supply, - a liquid-filled reagent supply, - a acidic solution supply for washing the supply hose to and outlet hose from the container, and - a liquid-filled waste hose.

18. Apparatus according to claim 14, where the function of the incubator is to heat the incubator container and its liquid contents to at least one temperature in the range between 30°C - 50°C, preferably 35°C - 45°C.

19. Apparatus according to claim 14, in which previously mentioned at least one light source and previously mentioned at least one light detector additionally provide for detecting turbidity in the mixture, i.e. light-absorbing and light-scattering properties in the mixture,

20. Apparatus according to claim 14, wherein previously mentioned at least one light source for illuminating the mixture for measuring turbidity has a light emitting diode (LED) configured to operate in the infrared spectrum, for example with a wavelength of 860 ± 60 nanometers, and wherein said turbidity detection of the light scattering in the mixture uses a light detector that sees the mixture at an angle of 90 ± 2.5 degrees in relation to the incident light beam.

21. Apparatus according to claim 14 or 20, where turbidity is defined in terms of Formazin Nephelometric Unit (FNU).

22. Apparatus according to claim 14, where the cabinet is made of a non-transparent material which is completely or partially heat-insulating.

23 Apparatus according to claim 14, where the risk of cross-contamination and contamination of the drinking water source is substantially reduced by the device's hoses, pumps and valves being separated into a clean and an unclean part. 3 physical barriers and a control mechanism consisting of an airlock in the incubator container, 2 separate valves, as well as an overflow system that ensures that the barriers work and protects the device against contamination of the clean part and contamination of the drinking water source.

24. A liquid reagent in addition to a water sample for use in performing "at-line" analysis of coliform bacteria in a water sample collected from a (Mkke water supply, where the reagent comprises the ingredients peptone, yeast extract, enzyme activator, salts, pyruvate, a detergent, bile salts and a methylumbelliferone fluorescing substrate.