NO179912B

NO179912B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk virksomt optisk aktivt pyridobenzoksazinderivat

Info

Publication number: NO179912B
Application number: NO914629A
Authority: NO
Inventors: Isao Hayakawa; Shohgo Atarashi; Yoichi Kimura; Katsuhiro Kawakami
Original assignee: Daiichi Seiyaku Co
Priority date: 1990-11-28
Filing date: 1991-11-26
Publication date: 1996-09-30
Also published as: PT99624B; IE914127A1; PT99624A; DE69124774T2; KR920009831A; FI96313B; KR0179986B1; GR3023190T3; US5463053A; ATE149169T1; DE69124774D1; EP0488227B1; CA2056345C; RU2029771C1; DK0488227T3; NO914629D0; JPH051073A; CA2056345A1; FI915572A0; NO179912C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk virksomt optisk aktivt pyridobenzoksazinderivat eller et salt derav.

Disse og ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Når det gjelder syntetiske antimikrobielle midler av typen pyridonkarboksylsyre er det kjent at substituenten i 7-stillingen i kinolinskjelettet (eller 10-stillingen i pyridobenz-oksazinskjelettet) har innvirkning på den antimikrobielle aktivitet. Forskjellige grupper er foreslått som substituent i 7-stillingen. Pyridonkarboksylsyrederivater med en 3-aminopyrrolidinylgruppe i 7-stillingen er særlig kjent for å utvise sterk antimikrobiell aktivitet og et bredt antimikrobielt spekter mot både Gram-negative og Gram-positive bakterier.

Pyridonkarboksylsyrederivater som omfatter en 3-aminopyrrolidinylgruppe og et pyridobenzoksazinskjelett antas å ha lipofile egenskaper, og deres farmakokinetiske egenskaper er ikke gode, noe som antakelig skyldes dårlig absorpsjon fra mage og tarmkanalen.

Et formål for den foreliggende oppfinnelse er således fremstilling av et 3-aminopyrrolidinyl-substituert pyridobenzoksazinderivat med forbedrede lipofile egenskaper og som utviser utmerket antimikrobiell aktivitet mot et stort spekter av mikroorganismer inkluderende Gram-positive bakterier.

Det er gjennomført utstrakte undersøkelser og man har således funnet at formålet med den foreliggende oppfinnelse er oppnådd ved fremstillingen av et optisk aktivt pyridobenzoksazinderivat med en 3-aminopyrrolidinyl-substituent hvor karbonatomet i nabostilling til karbonatomet hvortil aminogruppen er bundet, er disubstituert med en alkylgruppe, dvs. en optisk aktiv 4-amino-3,3-dialkyl-substituert pyrrolidinylgruppe med følgende strukturformel:

hvori R<1> og R<2> som er like eller forskjellige hver er en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer.

Forbindelsen fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse inkluderer også de respektive diastereomerer som er tilstede som stereoisomerer som tilskrives dens asymmetriske karbonatomer.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et optisk aktivt pyridobenzoksazinderivat eller et salt derav med formelen (I):

hvori R<1> og R<2> hver er en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, R<3> er et hydrogenatom, R<4> er en metylgruppe som er i S-konfigurasjon, R<5> er et hydrogenatom, og X er et halogenatom, og som er kjennetegnet ved at en 9,10-difluor-2,3-dihydro-3-(S)-3-metyl-7-okso-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoksazin-6-karboksylsyre eller et difluorborat derav reageres med en 4-amino-3,3-dialkylpyrrolidinforbindelse i et løsn-ingsmiddel og eventuelt i nærvær av en base.

I formel (I) er R<1> og R<2>, som kan være like eller forskjellige, f.eks. en metylgruppe, en etylgruppe, en propylgruppe eller en butylgruppe. Mest foretrukket er R<1> og R<2> en metylgruppe eller etylgruppe.

R<4> er som nevnt en metylgruppe og karbonatomet hvortil R<4> er bundet er et asymmetrisk karbonatom. Det antas at en sterkere antimikrobiell aktivitet vil oppnås når dette asymmetriske karbonatom er i S-konfigurasjon. I det foreliggende tilfellet er den absolutte konfigurasjon en (S)-konfigurasjon hvor R<4> er en metylgruppe.

X er et halogenatom og særlig et fluoratom eller et kloratom idet X foretrukket er et fluoratom.

Forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen er kjennetegnet ved at de har en 4-amino-3,3-dialkyl-substituert pyrrolidinylgruppe i 10-stillingen i pyridobenzoksazin-skjelettet. Spesifikke eksempler på 4-amino-3,3-dialkylpyrrolidinylgruppen inkluderer bl. annet en 4-amino-3,3-dimetylpyrrolidinylgruppe og en 4-amino-3-etyl-3-metylpyrrolidinylgruppe, som hver er optisk aktive, idet 4-amino-3,3-dimetylpyrrolidinylgruppen er særlig foretrukket.

Disse 4-amino-3,3-dialkylpyrrolidinylgruppene gir stereoisomerer som henføres til det asymmetriske karbonatom hvortil aminogruppen er bundet. Den steriske konfigurasjon i karbonatomet hvortil aminogruppen er bundet er foretrukket en (S)-konfigurasjon på bakgrunn av den oppnådde antimikrobielle aktivitet. I pyridonbenzoksazinskjelettet er på den annen side karbonatomet hvortil R<4> er bundet et asymmetrisk karbonatom. Substituenten R<4> i dette asymmetriske karbonatom er i S-konfigurasjon for å oppnå større antimikrobiell aktivitet.

Forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen inneholder således hver minst to asymmetriske karbonatomer. Der er således minst fire stereoisomerer for hver forbindelse, inkluderende diastereomerer. For anvendelse som et syntetisk antimikrobielt middel, er en forbindelse som kun omfatter en stereoisomer foretrukket i en rekke tilfeller fremfor en blanding av disse stereoisomerene.

Forbindelsene syntetiseres som nevnt ved at 9,10-difluor-2,3-dihydro-3-(S)-3-metyl-7-okso-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoksazin-6-karboksylsyre eller et difluorborat derav (dvs. en forbindelse med en -C(=0)0-BF2 enhet istedet for COOH i 6-stillingen) reageres med 4-amino-3,3-dialkylpyrrolidin i et løsningsmiddel og eventuelt i nærvær av en base.

Difluorboratet fremstilles lett fra den tilsvarende frie karboksylsyre med en passende bortrifluoridforbindelse, f.eks. bortrifluorideterkomplekset, som angitt i U.S. patentskrift 5.053.407.

Reaksjonen for innføring av et 4-amino-3,3-dialkylpyrrolidin gjennomføres vanligvis i nærvær av en syrefjerner. Syre-fjerneren som anvendes inkluderer organiske baser og uorganiske baser, og organiske baser anvendes generelt foretrukket.

De organiske basene inkluderer foretrukket tertiære aminer. Spesifikke eksempler på passende tertiære aminer er trialkyl-aminer som f.eks. trietylamin, tripropylamin, N,N-diisopropyl-etylamin og tributylamin, aniliner som f.eks. N,N-dimetyl-anilin og N,N-dietylanilin og heterosykliske forbindelser som f.eks. N-metylmorfolin, pyridin og N,N-dimetylaminopyridin.

Anvendbare uorganiske baser inkluderer hydroksyder, karbonater eller hydrogenkarbonater av alkalimetaller som litium, natrium og kalium, f.eks. litiumhydroksyd, natriumhydroksyd, kalium-hydroksyd, vannfri natriumkarbonat, vannfri kaliumkarbonat, natriumhydrogenkarbonat og kaliumhydrogenkarbonat.

4-amino-3,3-dialkylpyrrolidin som en av reaksjonskomponentene kan anvendes i en mengde som er minst to ganger ekvivalenten nødvendig for reaksjonen for også å tjene som en syrefjerner.

De oppløsningsmidler som kan anvendes i reaksjonen er ikke spesielt begrenset så lenge de er inerte overfor reaksjonen og inkluderer for eksempel acetonitril, amider som f.eks. N,N-dimetylformamid, N-metyl-2-pyrrolidon og N,N-dimetylacetamid, aromatiske hydrokarboner som f.eks. benzen, toluen og xylen, aprotiske polare løsningsmidler som f.eks. dimetylsulfoksyd og sulfolan, lavere alkoholer som f.eks. metanol, etanol, propa-nol, butanol, amylalkohol, isoamylalkohol, sykloheksylalkohol og 3-metoksybutanol, og estere som f.eks. dioksan, dimetyl-cellosolv, dietylcellosolv og diglym. Vannoppløselige løsn-ingsmidler kan anvendes som et vandig løsningsmiddel. Når dette er tilfelle, er det anbefalt å anvende en organisk base som en syrefjerner.

Reaksjonstemperaturen strekker seg fra romtemperatur til omtrent 180°C. Reaksjonen fullføres innen 10 minutter til 48 timer og vanligvis fra 30 minutter til 30 timer.

Når det 4-amino-3,3-dialkylpyrrolidinet som skal innføres inneholder en beskyttet gruppe på pyrrolidinrlngen, kan den beskyttende gruppe fjernes etter reaksjonen på en vanlig måte som valgt i henhold til beskyttelsesgruppen.

4-amino-3,3-dialkylpyrrolidinet som for eksempel 4-amino-3,3-dimetylpyrrolidin kan syntetiseres i henhold til det undereksempel som er beskrevet i det etterfølgende og den kan også oppnås i henhold til det påfølgende reaksjonsskjerna:

Der en difluorboratforbindelse hvor karboksylgruppen i 6-stillingen inneholder bor anvendes som utgangsforbindelse, kan det oppnådde produkt omdannes til en fri karboksylsyre ved behandling med en protisk substans som vann og alkoholer. Pro-duktet behandles for eksempel med etano-1 i nærvær av trietylamin og enten i nærvær eller fravær av en syrefjerner.

Det oppnådde pyridonkarboksylsyrederivat med formel (I) renses ved rekrystallisering, represipitering, behandling med aktivt karbon, kromatografi eller lignende, enten individuelt eller i kombinasjon derav.

Pyridonkarboksylsyrederivatene med en 4-amino-3,3-dialkyl-pyrrolidinylgruppe fremstilt i henhold til oppfinnelsen har forbedrede lipofile egenskaper i forhold til de tilsvarende forbindelser med en aminopyrrolidinylgruppe uten alkylgrup-pene, og forventes derfor å absorberes tilstrekkelig ved oral tilførsel for derved å utvise en mye bedre antimikrobiell aktivitet.

Pyridonkarboksylsyrederivatene fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan anvendes som frie forbindelser, som syreaddisjonssalter eller salter av karboksylgruppene derav. Eksempler på slike syreaddisjonssalter inkluderer salter av uorganiske syrer som hydroklorid, sulfat, nitrat, hydrobromid, hydrojodid og fosfat, og salter av organiske syrer som acetat, metansulfonat, benzensulfonat, toluensulfonat, citrat, maleat, fumarat og laktat.

Eksempler på salter av karboksylgrupper inkluderer uorganiske og organiske salter som for eksempel alkalimetallsalter som litiumsalter, natriumsalter og kaliumsalter, jordalkalimetall-salter som magnesiumsalt og kalsiumsalt, ammoniumsalter, trietylaminsalt, N-metylglukamat og tris(hydroksymetyl)amino-metansalt.

Disse frie forbindelser, syreaddisjonssalter og salter av karboksylgrupper av pyridobenzoksazin-6-karboksylsyrederivater kan eksistere som hydrater.

På den annen side er pyridobenzoksazin-6-karboksylsyrederi-vatene hvor karboksylenhetene er estere, anvendbare som syntetiske mellomprodukter eller prodrug-forbindelser. Alkyl-estere, benzylestere, alkoksyalkylestere, fenylalkylestere og fenylestere er for eksempel anvendbare som syntetiske mellomprodukter .

De esterne som kan anvendes som prodrug-forbindelser er dem som lett" spaltes i kroppen til å gi en f ri- karboksylsyre. Acetoksymetylester, pivaloyloksymetylester, etoksykarbonyl-oksyester, cholinester, dimetylaminoetylester, 5-indanylester, ftalidinylester, 5-substituert-2-okso-l,3-diokso-4-yl-metyl-ester og forskjellige oksoalkylestere som 3-acetoksy-2-okso-butylester er således for eksempel passende.

Forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen har sterk antimikrobiell aktivitet og kan således anvendes som medisin for mennesker og dyr, eller som fiskemedisin.

Dosen av forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen som aktiv bestanddel i medisin for anvendelse i mennesker er i området fra 50 mg til 1 g, foretrukket fra 100 mg til 300 mg pr. dag for voksne personer. Dosen som anvendes som medisin til dyr er i området fra 1 til 200 mg og foretrukket fra 5 til 100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag. Den daglige dose bør justeres i overensstemmelse med slike faktorer som tilsiktet anvendelse (som terapeutisk eller forebyggende), type, størrelse eller alder av mennesket eller dyret som skal helbredes, typen patogene organismer som skal behandles, utviklede symptomer osv. Den ovennevnte daglige dose kan oppdeles i 1 til 4 doser pr. dag. Det kan være nødvendig å avvike fra den ovennevnte mengde avhengig av de forårsakende organismer eller av alvor-ligheten av utviste symptomer.

Forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen er aktive mot et bredt spektrum av mikroorganismer som forårsaker alvorlige infeksjonssykdommer og det er mulig å forebygge, lindre og/eller helbrede sykdommer som er forårsaket av slike patogener. Eksempler på bakterier eller bakterielignende mikroorganismer som forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen virker på inkluderer Staphylococcus sp., Streptococcus pyogenes, Streptococcus haemolyticus, Streptococcus fecalis, Streptococcus pneumoniae, Peptostreptococcus sp., Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Citrobacter sp., Shigella sp., Klebsiella pneumoniae, Enterobacter sp., Serratiå sp., Proteus sp., Pseudomonas åeruginosa, Haemophilus influenzae, Acinetobacter sp., Campylobacter sp. og Chlamydo-zoon trachomatis.

Sykdommer som er forårsaket av disse patogene mikroorganismer og som kan forebygges, lindres eller helbredes ved hjelp av forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen inkluderer follikulitt, furunkel, furunklose, karbunkel, erysipelas, flegmone, lymfangitt/lymfadenitt, feion, subkutan abscess, spiradenitt, akne conglobata, infeksiøs aterom, perianal abscess, mastadenitt, overfladiske sekundærinfeksjoner etter traumer, forbrenninger eller operative traumer, faryngolaryn-gitt, akutt bronkitt, tonsillitt, kronisk bronkitt, bronki-ektasi, diffus panbronkiolitt, sekundære infeksjoner ved kroniske respirasjonssykdommer, pneumoni, pyelonefritt, cystitt, prostatitt, epidigymitt, gonokokkuretritt, ikke-gonokokkuretritt, cholecystitt, cholangitt, basillær dysenteri, enteritt, adnexitt, intrauterine infeksjoner, bartholinitt, blefaritt, hordeolum, dakryocystitt, tarsadenitt, keratohelcosis, otitis media, sinusitt, para-dentose, perikoronitt, gnathitt, peritonitt, endokarditt, septikemi, meningitt og hudinfeksjoner.

Forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen er også effektive mot forskjellige mikroorganismer som gir dyresykdommer, som dem som tilhører slekten Escherichia sp., Salmon-ella sp., Pasteurella sp., Haemophilus sp., Bordetella sp., Staphylococcus sp. og Mycoplasma sp.

Illustrative eksempler på slike dyresykdommer inkluderer dem som angriper fjærfe, som kolibacillose, pullorum-sykdom, avian paratyfose, fjærfe-kolera, infeksiøs coryza, staphylomykose og mykoplasmose; sykdommer som angriper svin, som kolibacillose, salmonellose, pasteurellose, haemofylus—infeksjoner, atropisk rhinitt, eksudativ epidermitt og mykoplasmose; sykdommer som angriper kveg, som kolibacillose, salmonellose, blødende septicemi, mykoplasmose, bovin smittsom pleuropneumoni og bovin mastitt; sykdommer som angriper hunder, som kolisepsis, salmonellose, blødende septikemi, pyometra og cystitt; sykdommer som angriper katter, som blødende pleurisi, cystitt, kronisk rhinitt og haemofylus-infeksjoner; og sykdommer som angriper kattunger, som bakteriell entritt og mykoplasmose.

Doseformer for de farmasøytiske preparater som inneholder en eller flere forbindelser fremstilt i henhold til oppfinnelsen som aktiv bestanddel kan passende velges i henhold til til-førselsmåten og de kan fremstilles ved konvensjonelle metoder. Eksempler på doseformer for oral tilførsel inkluderer tab-letter, pulvere, granuler, kapsler, oppløsninger, siruper, eliksirer og oljeaktige eller vandige suspensjoner.

Injiserbare preparater kan innehoTde hjelpestoffer som stabilisatorer, konserveringsmidler og oppløseliggjørende midler. Den injiserbare oppløsning som kan inneholde disse hjelpestoffer kan fylles i en beholder som f.eks. ampuller og små medisinflasker, og den kan omgjøres til et faststoff ved for eksempel frysetørking for å fremstille et fast preparat som kan oppløses ved tidspunkter for anvendelse. Beholderen kan enten inneholde en enkelt dose eller flere doser.

Typiske preparater inkluderer oppløsninger, suspensjoner, emulsjoner, salver, geler, kremer, lotioner og sprayer.

Faste preparater kan inneholde farmasøytisk tålbare tilset-ningsmidler som fyllstoffer, ekstendere, bindemidler, fuktig-hetsbevarende midler, absorpsjonsakseleratorer, fuktemidler, adsorberende midler og smøremidler.

Flytende preparater inkluderer oppløsninger, suspensjoner og emulsjoner. De kan inneholde hjelpestoffer som suspensjons-midler, emulgeringsmidler, stabilisatorer og konserveringsmidler .

Forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan også tilføres til dyr som oral eller ikke-oral veterinærmedisin. Slike medisiner kan tilføres i form av en blanding med forstoff eller med vann. Preparatene for veterinærmedisin eller tilsetningsmidlene kan fremstilles i henhold til vanlige metoder og slike preparater inkluderer pulvere, fine granuler, granuler, oppløste pulvere, sirup, oppløsninger og injek-sjoner .

I det etterfølgende er det gitt eksempler på preparater.

PREPARATEKSEMPEL 1

Kapsler

PREPARATEKSEMPEL 2

Oppløsning

PREPARATEKSEMPEL 3

Pulver for blanding med forstoff

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere .

UNDEREKSEMPEL 1

N- [ 1-( R)- fenyletyll- 3- oksobutanamid

En oppløsning av 21 g diketen i 15 ml tørket metylenklorid ble tilsatt dråpevis til en oppløsning av 31 g (R)-D-(+)-fenyl-etylamin i 85 ml tørket metylenklorid under omrøring og av-kjøling med is. Den maksimale reaksjonstemperatur som ble nådd under den dråpevise tilsetningen var 15°C. Den oppnådde oppløsning ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Reaksjonsblandingen ble vasket påfølgende med en 10 % vandig sitronsyreløsning og en mettet vandig natriumhydrogenkarbonat-løsning og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsnings-midlet ble fjernet under redusert trykk til å gi 53,7 g av tittel forbindelsen.

'H-NMR (CDCIj) 6: 1.48 (3H, d, J=5.4Hz), 2.24 (3H, s),

3.40 (2H, s), 5.14 (1H, q, J=5.4Hz),

7.35 (5H, s)

UNDEREKSEMPEL 2

2, 2- dimetyl- N- fl-( R)- fenyletyll- 3- oksobutanamid

Til en løsning av 48,5 g N-[1-(R)-fenyletyl]-3-oksobutanamid i 250 ml tørket N,N-dimetylformamid ble det tilsatt 84 g metyljodid, og 65,3 g kaliumkarbonat ble tilsatt dertil under av-kjøling med is etterfulgt av omrøring ved romtemperatur i 1 uke. 72 timer etter at reaksjonen startet ble det tilsatt 10 g metyljodid og 35 g kaliumkarbonat. 144 timer etter at reaksjonen startet ble 10 g metyljodid ytterligere tilsatt. Uoppløselig substans ble fjernet fra reaksjonsblandingen ved filtrering og løsningsmidlet i filtratet ble fjernet under redusert trykk. Til resten ble det tilsatt 100 ml vann og blandingen ble ekstrahert med 400 ml etylacetat. Ekstraktet ble vasket med vann og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk til å gi 50 g av en uren krystall av tittelforbindelsen. Denne urene krystall ble vasket med isopropylalkohol til å gi 33 g av et renset produkt. .'H-NMR (CDCl}) 6: 1.40 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.50 (3H, d,

J=5.4Hz), 2.17 (3H, s), 5.08 (1H, q,

J=5.4Hz), 6.18 (1H, brs), 7.32 (5H, s)

UNDEREKSEMPEL 3

2-metyl-2-[1-metyl-l-[N-(R)-1-fenyletyllkarbamoyl] eter- 1, 3- dioksolan

I 220 ml benzen ble det oppløst 11,65 g 2,2-dimetyl-N-fl-(R)-fenyletyl]-3-oksobutanamid, og til oppløsningen ble det tilsatt 18 g etylenglykol og 1 g p-toluensulfonsyre. Blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 3 døgn idet produktvann ble fjernet med et Dean-Stark apparat. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen helt over i 50 ml av en mettet vandig natriumhydrogenkarbonat-løsning med påfølgende' rysting. Det organiske lag ble separert og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk til å gi 15,2 g av tittelforbindelsen.

'H-NMR (CDClj) 6: 1.20 (3H, s), 1.22 (3H, s), 1.23 (3H,

s), 1.50 (3H, d, J=5.4Hz), 3.95 (4H, s),

5.12 (1H, q, J=5.4Hz), 7.12 (1H, brs.),

7.32 (5H s )

UNDEREKSEMPEL 4

2-brommetyl-2-[1-metyl-l-[N-(R)-1-fenyletyl] karbamoylletyl- 1, 3- dioksolan

I 400 ml tørket 1,4-dioksolan ble det oppløst 37,68 g 2-metyl-2-[1-metyl-l-[N-(R)-1-fenyletyl]karbamoyl]etyl-1,3-dioksolan og 22 g brom ble tilsatt dråpevis ved romtemperatur etterfulgt av omrøring i 4 timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet fra reaksjonsblandingen under redusert trykk og til resten ble det tilsatt 500 ml kloroform. Kloroformlaget ble vasket påfølgende med en mettet vandig natriumhydrogenkarbonat-løsning, en 5 % vandig natriumtiosulfat-løsning og vann, og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk til å gi 45,25 g av tittelforbindelsen. 1 H-NMR (CDC13) 6: 1.24 (3H, d, J = 3 . 6Hz) , 1.42 (3H, s),

1.54 (3H, s), 3.58 (2H, ABq, J=10.8Hz),

3.90-4.50 ( 4H, m), 5.05 (1H, q,

J=3.6Hz), 7.00 (1H, brs), 7.30 (5H, s)

UNDEREKSEMPEL 5

9,9-dimetyl-8-okso-7-[1-(R)-fenyl-etyl1- 7- aza- l, 4- dioksaspiro[ 4, 41nonan

I 150 ml tørket N,N-dimetylformamid ble det oppløst 45,25 g 2-brommetyl-2-[1-metyl-l-[N-(R)-1-fenyletyl]karbamoyl]etyl-1, 3-dioksolan, og 6,5 g 60 % natriumhydrid ble tilsatt dertil under avkjøling på is etterfulgt av omrøring ved romtemperatur i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble helt over i 3 00 ml isvann og ekstrahert med 600 ml benzen. Ekstraktet ble vasket med vann og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og resten ble renset ved kolonnekromatografi (pakket med 3 50 g silikagel) ved anvendelse av en 3:1 (v/v) blanding av n-heksan og etylacetat som elueringsmiddel. Fraksjoner som inneholdt den ønskede forbindelse ble kombinert og løsningsmidlet ble fjernet derfra under redusert trykk til å gi 18,23 g av tittelforbindelsen.

1 H-NMR (CDClj) 6: 1.18 (3H, d, J = 4.OHz) , 1.50 og 1.58

(hver 3H, s), 3.04 (2H, ABq, J=10Hz),

3.75-4.10 (4H, m), 5.60 (1H, q, j=4Hz),

7.32 (5H, s)

UNDEREKSEMPEL 6

3, 3- dimetyl- l-[ 1-( R)- fenyletyl]- pyrrolidin- 2, 4- dion

I 250 ml aceton ble det oppløst 18,23 g 9,9-dimetyl-8-okso-7-[1-(R)-fenyletyl]-7-aza-l,4-dioksaspiro[4,4]nonan, og 70 ml saltsyre og 20 g p-toluensulfonsyre ble tilsatt til oppløsn-ingen. Blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 2 0 timer. Etter 7 timer fra reaksjonsstart ble 20 g p-toluensulfonsyre tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter reaksjonen ble aceton fjernet fra blandingen under redusert trykk og resten ble ekstrahert med 400 ml kloroform. Kloroformlaget ble vasket med en mettet vandig natriumhydrogenkarbonat-løsning og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og resten ble renset ved silikagel-kolonnekromatografi (3 50 g) ved anvendelse av 4:1 (v/v) blanding av n-heksan og etylacetat som elueringsmiddel. Fra de kombinerte fraksjoner som inneholdt den ønskede forbindelse ble løsningsmidlet fjernet under redusert trykk til å gi 11,85 g av tittelforbindelsen.

'H-NMR (CDClj) 6: 1.20 og 1-26 (hver 3H, 5), 1.60 (3H, å,

J = 7.2Hz), 3.60 (2H, ABq, J = 16Hz), 5.80

( 1H, q, J = 7 ■ 2Hz ) , 7.32 ( :">H , s )

UNDEREKSEMPEL 7

3,3-dimetyl-4-hydroksyimino-l-[ 1-( R)- fenyletyl]- pyrrolidin- 2- on

I 100 ml etanol ble det oppløst 11,85 g- 3,3-dimetyl-l-[1-(R)-fenyletyl]-pyrrolidin-2,4-dion. Til løsningen ble det tilsatt 8 g hydroksylaminhydroklorid og 45 ml trietylamin etterfulgt av behandling med tilbakeløp i 1 time. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og 300 ml kloroform ble tilsatt til resten. Kloroformløsningen ble vasket påfølgende med en 10 % vandig sitronsyreløsning og vann og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk til å gi 11,5 g av tittelforbindelsen.

'H-NMR (CDC13) 5: 1.3 0 og i-34 (hver 3H, 5), 1.5 8 (3H, d,

J=7.2Hz), 3.90 (2H, ABq, J=16.2Hz), 5.65

(1H, q, J=7.2Hz), 7.36 ;5H, s)

UNDEREKSEMPEL 8

4- amino- 3, 3- dimetyl- l-[ 1-( R)- fenyletyl]- pyrrolidin- 2- on

I 300 ml metanol ble det oppløst 11,5 g 3,3-dimetyl-4-hydr-oksyimino-1-[1-(R)-fenyletyl]-pyrrolidin-2-on og omtrent 20 ml Raney-nikkel vasket med metanol ble tilsatt til oppløsningen. Reduksjonen ble gjennomført ved romtemperatur i 16 timer i en avrundet kolbe. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og løsningsmidlet i filtratet ble fjernet under redusert trykk. Resten ble underkastet silikagel-(400 g)-kolonnekromatografi ved anvendelse av en 30:1 (v/v) blanding av kloroform og metanol som elueringsmiddel til å gi 3,75 g av fraksjon 1 (mindre polart material) og 10,2 g av en blanding av fraksjon 1 og fraksjon 2 (mere polart material).

'H-NMR (CDClj) 6 (mindre polar forbindelse):

0.95 og 1.18 (hver 3H, s), 1.52 (3H, d,

J=7.2Hz), 2.40-2.55 ( 1H, n;), 3.00-3.50 (2H, m) ,

5.52 (1H, q, J=7.2Hz), 7.30 (5H, s)

UNDEREKSEMPEL 9

4- amino- 3, 3- dimetyl- l-[ 1-( R)- fenyletyl]- pyrrolidin

I 150 ml tørket tetrahydrofuran ble det oppløst 3,7 g av fraksjon 1 oppnådd i undereksempel 8 (lavpolar 4-amino-3,3-dimetyl-l- [ 1- (R) -f enyletyl ] -pyrrolidin-2-on) og 2 g litium-aluminiumhydrid ble tilsatt sakte til blandingen under avkjøl-ing med is etterfulgt av oppvarming med tilbakeløp i 13 timer. Etter avkjøling ble 2 ml vann, 2 ml av en 15 % vandig natriumhydroksyd-løsning og 6 ml vann ble tilsatt til reaksjonsblandingen i denne rekkefølge under avkjøling på is, etterfulgt av omrøring ved romtemperatur i 1 time. Enhver uoppløselig substans ble fjernet ved filtrering og løsningsmidlet ble fjernet fra filtratet under redusert trykk til å gi 3,69 g av tittelforbindelsen. Denne forbindelse ble anvendt i den neste reak-sjon uten ytterligere rensing.

UNDEREKSEMPEL 10

4-t-butoksykarbonylamino-3,3-dimetyl-1- fl-( R)- fenyletyl]- pyrrolidin

I 40 ml tørket tetrahydrofuran ble det oppløst 3,69 g 4-amino-3,3-dimetyl-l-[1-(R)-fenyletyl]-pyrrolidin oppnådd i undereksempel 9 og 4,92 g 2-(t-butoksykarbonylamino)-2-fenylaceto-nitril (BOC-ON) ble tilsatt dertil under avkjøling på is. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur' i - 1 time. Løsnings-midlet ble fjernet under redusert trykk og til resten ble det tilsatt 100 ml etylacetat. Blandingen ble vasket tre ganger med en IN vandig natriumhydroksydløsning. Etylacetatlaget ble tørket over vannfritt natriumsulfat og løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk. Resten ble renset ved silikagel-(200 g)-kolonnekromatografi med anvendelse av 1 % og 5 % metanolholdig kloroform som elueringsmiddel til å gi 4,32 g av tittelforbindelsen.

'H-NMR (CDClj) 6: i.00 og 1.16 (3H, s), 1.40 (3H, d,

J=7.2Hz), 1.52 (9H, s), 2.00-3.62 (5H,

m), 3.35-4.10 (1H, m), 4.90 (1H, brs ) ,

7.3 8 (5K, s)

UNDEREKSEMPEL 11

4- t- butoksvkarbonylamino- 3, 3- dimetyl- pyrrolidin

I 90 ml etanol ble det oppløst 4,32 g 4-t-butoksykarbonyl-amino-3,3-dimetyl-l-[1-(R)-fenyletyl]-pyrrolidin og 4 g 10 % palladium-på-karbon ble tilsatt dertil for å gjennomføre reaksjonen ved et hydrogentrykk på 4 atm. under oppvarming ved bestråling med en wolfram-lampe. Etter omtrent 7 timer ble katalysatoren fjernet ved filtrering og løsningsmidlet i filtratet ble fjernet under redusert trykk. Til resten ble det tilsatt 2 00 ml etylacetat hvorpå blandingen ble vasket to ganger med en 10 % vandig sitronsyreoppløsning. Laget av vandig sitronsyreoppløsning ble gjort alkalisk (pH: ca. 10) med en vandig natriumhydroksydløsning og deretter ekstrahert med 2 00 ml kloroform. Ekstraktet ble tørket over vannfritt natriumsulfat og løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk til å gi 2,5 g av tittelforbindelsen.

'H-NMR (CDC13) S: 0.98 og 1.08 (hver 3H, s), 1.48 (9H,

s ) , 2.30-4.00 ( 6H , in) , 4.50 ( J H , brs )

EKSEMPEL

10-(4-amino-3,3-dimetyl-l-pyrrolidinyl)-9-fluor-2,3-dihydro-3-(S)-3-metyl-7-okso-7H-pyrido[ 1, 2, 3- de][ 1, 4] benzoksazin- 6- karboksylsyre

I 3 ml tørket dimetylsulfoksyd ble det suspendert 493,5 mg 9,10-difluor-2,3-dihydro-3-(S)-3-metyl-7-okso-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoksazin-6-karboksylsyre-difluorborchelat. Til suspensjonen ble det tilsatt 800 mg 4-t-butoksykarbonylamino-3,3-dimetyl-pyrrolidin som oppnådd i undereksempel 11 og 0,5 ml trietylamin ved romtemperatur etterfulgt av omrøring i 3 0 minutter. Vann ble tilsatt til reaksjonsblandingen under av-kjøling på is og den utfelte krystall ble samlet ved filtrering og vasket med vann. Krystallen ble oppløst i 30 ml 90 % metanol og 4 ml trietylamin ble tilsatt etterfulgt av oppvarming med tilbakeløp i 6 timer. Løsningsmidlet ble fjernet fra reaksjonsblandingen under redusert trykk. Til resten ble det tilsatt 5 ml konsentrert saltsyre etterfulgt av omrøring ved romtemperatur i omtrent 1 time. Reaksjonsblandingen ble vasket med kloroform og det vandige lag ble justert til pH 7 med 50 % og IN vandige natriumhydroksydløsninger og deretter ekstrahert med 100 ml kloroform. Kloroformlaget ble tørket over vannfritt natriumsulfat og løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk til å gi omtrent 500 mg av en uren krystall av tittelforbindelsen. Denne krystall ble rekrystallisert fra etanol som inneholdt en liten mengde vandig ammoniakk med samtidig behandling med aktivert karbon til å gi 337 mg av en krystall.

Smp.: 263-268°C (spalting)

[a]D: +'147,6° (c = 1,085, INNaOH)

Elementanalyser for C19<H>22<N>304F:

Beregnet (%): C 60,79; H 5,91; N 11,19

Funnet (%): C 60,59; H 5,84; N 10,99

FORSØKSEKSEMPEL

Antimikrobiell aktivitet av forbindelsen fra eksempel 1, og for sammenligning, av 10-(3-amino-l-pyrrolidinyl)-9-fluor-2,3-dihydro-3-(S)-3-metyl-7-okso-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]-benzoksazin-6-karboksylsyre på forskjellige testorganismer som angitt i det etterfølgende ble bestemt i overensstemmelse med den metoden som er spesifisert av Japan Society of Chemotherapy (Chemotherapy 29 (1), 76 (1981)), og de minste inhiberende konsentrasjoner (|xg/ml) som ble oppnådd er vist i den etterfølgende tabell 1.

YTTERLIGERE FORSØKSRESULTATER

(1) For å demonstrere forskjellen i antimikrobiell aktivitet mellom en forbindelse fremstilt i henhold til oppfinnelsen (eks. 1) og en forbindelse i henhold til EP-A 022 08210 (Masuzawa et al), er sammenligninger av disse forbindelser blitt gjennomført:

Forbindelse fremstilt EP-A-0 208 210

ifølge oppfinnelsen ( forbindelse fra eksempel 31)

Den antimikrobielle aktivitet ble bestemt ved en lav konsentrasjon i overensstemmelse med metoden som er spesifisert av Japan Society of Chemotherapy, dvs. de samme analyser for antimikrobiell aktivitet som beskrevet i det foregående, og de minste inhiberende konsentrasjoner (|ig/ml) som er oppnådd er vist i de vedlagte tabeller 2, 3 og 4 .

Da forbindelsen fra eksempel 31 i Masuzawa et al er en blanding av to diastereoisomerer, ble en av diastereo-isomerene syntetisert som en sammenligningsforbindelse. Derfor viser Masuzawas forbindelse anvendt i dette sammenligningsforsøk høyere antibakteriell aktivitet enn det som er beskrevet i EP-A 0 208 210.

Som det fremgår fra resultatene vist i den vedlagte tabell 3, viser forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen nærmest samme antimikrobielle aktivitetsnivå overfor Gram-positive bakterier som forbindelsen ifølge Masuzawa et al. Man vil også se at de helt store forskjeller i antimikrobielt aktivitetsnivå overfor Gram-negative bakterier heller ikke er observert for forbindelsene, mens aktiviteten overfor Ps. aeruginosa for forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen er noe mindre enn aktiviteten for forbindelsen ifølge Masuzawa et al. Som det fremgår fra ..den vedlagte tabell 2, har imidlertid forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen en høy antimikrobiell aktivitet overfor MRSA (Methicillin-resistent Staphylococcus Aureus), og som er to ganger den for forbindelsen ifølge Masuzawa et al. Siden MRSA er resistent overfor en rekke antibiotika er den antimikrobielle aktivitet overfor MRSA for de konvensjonelle antibiotika svært liten og toksisiteten er også svært høy, noe som gir høy dødelighet i forbindelse med infeksjonssykdommer .

Anvendelse av den ovenfor angitte forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer således uventede og utmerkede resultater med hensyn til den antimikrobielle aktivitet mot MRSA og som er bedre enn det som oppnås ved anvendelse av den strukturelt analoge pyridobenzoksazinfor-bindelsen som angitt i Masuzawa et al.

(2) For å vise forskjell i farmakologiske egenskaper i et levende individ mellom forbindelsen ifølge Masuzawa et al og den ovenfor angitte forbindelse fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse, ble det gjennomført farmakokinetiske studier av forbindelsene.

Forbindelsen fra eksempel 31 i Masuzawa et al og forbindelsen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble målt og sammenlignet med hensyn til deres bevegelse i det levende individ, og resultatene er angitt i det etter-følgende .

Forsøksmetode.

Både forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen og forbindelsen ifølge Masuzawa et al ble suspendert i en vandig oppløsning av karboksymetylcellulose-natrium (CMC-Na), og deretter administrert oralt til fastende rotter i en dose på 20 mg/kg.

Serumprøver: Rottene ble avlivet 0,25, 0,5, 1,2 og 4 timer etter administrering og fullblod ble samlet.fra hvert dyr for å oppnå serumprøver.

Utskillelsestest: Hver av rottene som hadde fått administrert medikament ble satt i et metabolisme-bur, og urinprøve ble samlet 4 og 2 4 timer deretter i rør som ble satt på et isbad.

Kvantitative analyser: Kvantitative analyser av serum- og urinprøver ble gjennomført ved hjelp av et biologisk forsøk (tynnsjikt-diffusjonsmetode) ved anvendelse av B. subtilis ATCC 6051.

(2)-l. Medikamentkonsentrasjon i blod

Som vist i tabell A var maksimal blodkonsentrasjon av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen etter oral administrering derav, 2,98 fig/ml som var større enn maksimums-verdien (1,27 (ig/ml) for forbindelsen i henhold til Masuzawa et al.

Halveringstiden i blod for forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen var 0,95 time, noe som var lengre enn halveringstiden for forbindelsen ifølge Masuzawa et al (0,75 time).

Følgelig og sammenlignet med forbindelsen ifølge Masuzawa et al, kan forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen bevege seg raskere inn i blodbanen og forbli i blodbanen i en høyere konsentrasjon og i en lengre tidsperiode.

I tillegg .viser AUC data som er beregnet ut fra kurver for blod-medikamentkonsentrasjoner at forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen absorberes i større grad enn forbindelsen ifølge Masuzawa et al når de administreres i den samme dose.

(2)-2. Ur inut ski Helse

Resultater fra evalueringen av mengden utskilt i urinen be-kreftet at denne er høyere for forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen enn for forbindelsen ifølge Masuzawa et al.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk virksomt optisk aktivt pyridobenzoksazinderivat eller et salt derav med formel (I): hvori R<1> og R<2> hver er en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, R<3> er et hydrogenatom, R<4> er en metylgruppe som er i S-konfigurasjon, R<5> er et hydrogenatom og X er et halogenatom, karakterisert ved at en 9,10-difluor-2,3 - dihydro-3-(S)-3-metyl-7-okso-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoksazin-6-karboksylsyre eller et difluorborat derav reageres med en 4-amino-3,3-dialkylpyrrolidinforbindelse i et løsningsmiddel og eventuelt i nærvær av en base.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et pyridobenzoksazinderivat eller et salt derav med formel (I) som angitt i krav 1 hvori R<1> og R<2> hver er en metylgruppe, karakterisert ved at de tilsvarende ut-gangsforbindelser anvendes.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en 10-(4-amino-3,3-dimetyl-l-pyrrolidinyl)-9-fluor-2,3-dihydro-3-(S)-3-metyl-7-okso-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoksazin-6-karboksylsyre med formel (I) som angitt i krav 1, karakterisert ved at de tilsvarende ut-gangs forbindelser anvendes.