NO179412B

NO179412B - Hybrid DNA-molekyl som koder for fibronektinbindende protein, mikroorganismer inneholdende slike DNA-molekyler samt fremgangsmåte ved fremstilling av slikt protein

Info

Publication number: NO179412B
Application number: NO892033A
Authority: NO
Inventors: Magnus Hook; Martin Kjell Lindberg; Per-Eric Lindgren; Lars Christer Signas
Original assignee: Alfa Laval Agri Int
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-19
Publication date: 1996-06-24
Also published as: FI103049B1; NO892033D0; ES2184728T3; US5866541A; NO892033L; FI892408A0; NO179412C; EP0343137A1; FI103049B; US6086895A; DK175809B1; CA1340910C; AU3498189A; DE68929430D1; AU628339B2; NZ229206A; JPH0284182A; DE68929430T2; JPH10286095A; US5416021A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører hybrid-DNA.- molekyler som koder for fibronektinbindende proteiner, f.eks. plasmider eller fager som omfatter minst én nukleotidsekvens som koder for de nevnte proteiner, hvilke proteiner har en aminosyresekvens som angitt i krav 1. Videre vedrører oppfinnelsen mikroorganismer som inneholder slike molekyler og anvendelsen av disse for å fremstille slike proteiner.

En gjenstand for oppfinnelsen er å oppnå fibronektin-bindende proteiner ved hjelp av genetisk konstruksjonsteknikk ved å anvende f.eks. et plasmid inneholdende en nukleotidsekvens som koder for proteinene.

Bakgrunn for oppfinnelsen

WO-A1-85/05553 beskriver bakterielle celleoverflateproteiner som har fibronektin-, fibrinogen-, kollagen- og/eller lamininbindende egenskaper. Her blir det vist at forskjellige bakterier har en evne til å binde til fibronektin, fibrinogen, kollagen og/eller laminin. Videre blir det vist at f ibronektinbindende proteiner fra Staphylococcus aureus har en molekylvekt på 165 kD, og/eller 87 kD, og det er sannsynlig at det minste proteinet er en del av det største.

Fibronektin er et stort glykoprotein med en molekylvekt på 450 kD og med to like underenheter som kan ha varierende molekyl-størrelser, avhengig av et komplisert spleisemønster som forløper-mRNA har. Proteinet er tilstede i basalmembraner og bindevev, men også i oppløst form i forskjellige kroppsvæsker, såsom blodplasma (1) . Etter at Kuusela i 1978 opprinnelig opp-daget at S. aureus binder til fibronektin (2), har det blitt vist at visse stammer av andre patogene bakterier, såsom streptokokker av forskjellige seriologiske typer (3) , E. coli (4) og Salmonella (5) kan binde til dette protein (6).

Klebing av patogene bakterier til overflater er i dag et ålment anerkjent konsept i diskusjonen om sårpatogener som bruker overflatereseptorer for å binde til forskjellige proteiner på epitelcelleoverflater, i bindevevsmatriks og i sårskorper, som f.eks. fibronektin, fibrinogen, kollagen og laminin. Problemet er at disse reseptorer er tilstede på bakteriecelle-overflaten i et relativt lite antall og at det er vanskelig å frigjøre dem. En måte som lar seg gjennomføre når reseptorene består av proteiner, er å klone genene for den angjeldende reseptor for å kunne fremstille dem i mengder som gjør det vesentig enklere å studere infeksjoner og infeksjo-ners forløp, i tillegg til profylaktisk og terapeutisk behandling av infeksjoner av sårpatogener.

Skjermingsstudier av forskjellige serologiske grupper av steptokokker, såsom A, C og G ifølge Lancefield (3) , har vist at stammene som ble undersøkt kan binde til forskjellige konnektive vevsproteiner, som fibronektin, fibrinogen, kollagen og laminin og forskjellige immunoglobuliner (7, 8) i varierende grad og med forskjellig spesifisitet.

For ytterligere å karakterisere fibronektinbindende proteiner fra streptokokker, har spesielt gener fra Streptococcus dys<q>alactiae for slike proteiner blitt klonet i E. coli. De fibronektinbindende domener av disse proteiner er også blitt lokalisert og egenskaper og funksjoner av proteiner som inneholder disse domener vil bli omtalt nedenfor.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Det har nå overraskende vist seg mulig å oppnå hybrid-DNA molekyler som omfatter nukleotidsekvenser av genene som koder for proteiner eller polypeptider som har fibronektin-bindende egenskaper. Som det fremgår av det nedenforstående, er de følgende nukleotidsekvenser tilstede henholdsvis i plasmidene pSDF102 og pSDF203, som koder for de nevnte proteiner. v' og/eller hvorved de mindre gjentagelsesregioner (jfr. fig. 3) i hvert gen ovenfor koder for de peptider som har fibronektinbindende aktivitet.

Oppfinnelsen omfatter videre en vektor såsom et plasmid som omfatter en nukleotidsekvens som koder for nevnte fibronektinbindende proteiner.

Oppfinnelsen omfatter videre mikroorganismer som inneholder minst ett hybrid-DNA-molekyl ifølge ovenstående. Slike mikroorganismer er blitt deponert ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under deponeringsnummer DSM 4614 (pSDF102) og DSM 4613(pSDF203).

Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av fibronektinbindende proteiner, omfattende overføring av minst ett hybrid-DNA molekyl ifølge ovenstående til en mikroorganisme, ved å dyrke nevnte mikroorganisme i et vekstmedium og å isolere det slik dannede protein på i og for seg kjent måte.

Eksempel 1

Konstruksjon av en genbank av kromosomalt DNA fra Streptococcus dysgalactiae

Kromosomalt DNA fra Streptococcus dysgalactiae, stamme S2, ble fremstilt i henhold til perkloratmetoden (9). DNA ble delvis spaltet ved å bruke Sau 3AI, ble fraksjonert etter størrelse på en 1% agarosegel og DNA-fragmentet innenfor størrelsesom-rådet 3 - 9 kb ble samlet, elektroeluert og renset på en Nensorb-kolonne (du Pont).

Plasmidvektor pUC18 ble spaltet med Barn HI og behandlet med fosfatase. Det delvis spaltede og fraksjonerte steptococcus-DNA ble ligert med den spaltede pUC18 vektor. Ligeringsbland-ingen ble transformert for å holde på kompetent E. coli, stamme TG1, og ble spredt på LA-plater inneholdende ampicillin (50 fig/ ml) og IPTG (0,lmM), og 0,004% X-gal, såkalte axipla-ter. Hvite kolonier ble overført til LA-plater med ampicillin (50 /ig/ml) .

" Screening"/ analyse/ undersøkelse av en genbank for identifi-sering av et fibronektinbindende protein ( FNBP)

De hvite kolonier fra axiplatene ble plukket opp med tann-pirkere og overført til LA-plater med ampicillin, 52 kolonier pr. plate. Tilsammen ble 728 transformanter oppsamlet. Disse ble undersøkt med henblikk på fibronektinbindende aktivitet ved å bruke en filterassaymetode som anført i det følgende.

Transformanter blir overført fra axi-plater til LA-plater med ampicillin, og platene blir inkubert over natten. Fra disse plater blir koloniene replikert over til nye LA-plater, og disse blir inkubert ved 37°C over natten. Et nitrocellulosefilter blir satt på hver plate med utvokste kolonier. Når filtrene er fullstendig fuktige, blir koloniene festet ved suging og filtrene blir forsiktig fjernet. Filtrene blir utsatt for kloroformdamp i 5 min, og blir så vasket 3 ganger i 10 min ved 37°C i en bufferoppløsning bestående av 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,05% Tween-40, og 150 mM NaCl. Filtrene får tørke i 3 0 min ved romtemperatur. Filtrene blir preinkubert i 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 og 1,4% fettfritt melke-pulver i 2 timer ved 37°C, eller over natten ved romtemperatur. Melkepulverbuf feren må være nytillaget. <125>I-merket fibronektin blir tilsatt (ca. 30.000 cpm pr. filter), og filtrene blir inkubert over natten ved romtemperatur. Filtrene blir vasket 3 ganger i 10 min ved 37°C med en oppløsning av 0,05 % Tween-40 og 150 mM NaCl, hvoretter filtrene blir tørket. På dette blir det plassert en ueksponert film, som blir eksponert i 3 til 5 døgn. Filmen blir fremkalt og klonene som har bundet seg til <125>I-merket fibronektin blir identifi-sert og isolert.

Filter-analyseassayet viste 3 positive kloner, som alle ble analysert videre. Den fibronektinbindende evne ble videre bestemt i et konkurranse-assay (10). Lysat av E. coli-klonene ble fremstilt ved å lysere bakteriene under anvendelse av lysozym (1 mg/ml) i en bufferoppløsning bestående av 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl og 1 mM EDTA. Den fibronektin-bindende aktivitet ble analysert ved å bestemme lysatets evne til å konkurrere med henholdsvis S. aureus, stamme Cowan I og S. d<y>s<g>alactiae. stamme S2, med hensyn til deres evne til å binde til det 125I-merkede 29 kD-fragment av fibronektin. Prøven viste at det er mulig å fjerne fibronektinbindingen til de to stafylokokke stammer, såvel som stamme S2 av S. d<y>s-galactiae når man bruker lysater av E. coli-kloner som inneholder streptokokk-DNA. Omvendt kan bindingen av 29 kD-fragmentet av fibronektin til S. dysgalactiae hemmes ved å tilsette lysat av E. coli-klon inneholdende et gen for fibronektinbindende protein av S. aureus.

Restriksionskartlegging og subkloning

Plasmid-DNA av de tre positive subkloner fra filterassayet,

kalt pSDFlOO, pSDF200 og pSDF300, ble isolert under anvendelse av LiCl-metoden (11) og bestemt til å være henholdsvis 4,9 kb, 6,9 kb og 6,5 kb ved spaltning under anvendelse av restrik-sjonsenzymer og analyse på agarosegeler. Alle tre kloner ble spaltet ved å bruke omtrent 20 av de mest vanlige restrik-sjonsenzymer som gjenkjenner en sekvens av 6 nukleotider, og utgående fra spaltningsmønster ble det laget kart. To av klonene, pSDFlOO og pSDF300, var delvis overlappende, idet de hadde en 3,9 kb-sekvens felles, og således ble bare én utvalgt for videre studier. Da pSDFlOO hadde en høyere fibronektin-bindende aktivitet enn pSDF3 00, ble den første valgt.

pSDFlOO og pSDF200 ble subklonet for å identifisere nærmere de regioner som koder for fibronektinbindende aktivitet. pSDFlOO ble spaltet ved å bruke Barn HI, hvoretter plasmidet ble religert. Denne klon med Barn HI- Barn HI-fragmentet som var fjernet, ble kalt pSDFlOl og var positiv. pSDFlOl ble ytterligere spaltet ved å bruke Xbal, som ga tre fragmenter, ett hovedsagelig bestående av pUC18-vektoren. De to andre Xbal-Xbal-fragmenter ble renset og innsatt i pUC18-vektoren. Ett av disse fragmenter koder for fibronektinbindende aktivitet. Denne klon ble kalt pSDF102. På tilsvarende måte ble det konstruert subkloner fra pSDF200. Clal-SacI-fragmentet som var

fjernet fra pSDF200 ga en klon kalt pSDF201, og videre ga B<g>_llI-EcoRI-fragmentet som er fjernet fra pSDF201, pSDF202. Endelig ble Xhol- EcoRI-fragmentet slettet fra pSDF202. Den nye klon oppnådd på denne måte ble kalt pSDF203. Alle disse subkloner er positive, dvs. de uttrykker fibronektinbindende aktivitet, jfr. fig. la og lb.

Ytterligere subkloning med EcoIII- fordøying

For å lette nukleotidsekvenseringen i henhold til dideoksy-metoden, er det nødvendig med mindre subkloner, varierende i lengde fra 150 til 200 basepar, for å oppnå overlappende DNA-sekvens. Exonuklease III fordøyer en av DNA-stammene fra 5'-overhenget eller fra den butte ende, men etterlater 3'-overhenget. Det enkeltkjedede DNA blir så fordøyet ved å bruke Sl-nuklease. Denne teknikk blir brukt i "Erase-a-Base" system-kit (Promega, Madison, USA) og gjør det mulig å konstruere serier med subkloner som har en størrelse som differerer med flere hundre nukleotider. I tilfeller av interesse ble den fibronektinbindende aktivitet undersøkt, jfr. tabell 1.

Tabell 1

Inhiberingsassav i rør

Assayblanding: 100 fil lysat av E. coli-kloner inneholdende streptokokkiske DNA-kloner (bakteriene ble dyrket på LB + 50 /xg ampicillin + 1 mM OPTG, vasket og konsentrert til OD540 = 5, 0); 100 [ il Cowan I-celler, varmedrept, OD540 = 5 ; 100 /il <125>I-merket fibronektin, 8865 cpm; 200 /xl PBS

+ 0,1 % BSA

Inkubering: 2 timer, romtemperatur

Vasking: To ganger i PBS + 0,1 % + BSA + 0,05 % Tween.

Resultatene fremgår av tabell 1.

Nukleotidsekvensering

Subkloner erholdt etter en exolll-fordøying og andre subkloner ble sekvensert ved å bruke dideoksymeoden i henhold til Gem Seq<R> dsDNA Sequencing System (Promega Biotech., Madison, USA).

Nukleotidsekvensering av pSDF102 ga den følgende sekvens:

Hvorved gjentagelsesdomenene av sekvensen

koder for et peptid som har fibronektinbindende aktivitet.

Nukleotidsekvenseringen av pSDF203 ga den følgende sekvens hvorved gjentagelsesdomenene av sekvensen

koder for et peptid som har fibronektinbindende aktivitet.

Southern blot hybridisering påviser ikke homologier på DNA-nivå mellom genene for fibronektinbindende protein av S. aureus, og de tilsvarende fra S. dys<g>alactiae. Den konkur-rerende inhibering mellom proteinene fra de respektive arter avhenger mest sannsynlig av det faktum at deres bindingsseter i fibronektinet innenfor det NH2-terminale 29 kD-fragment er nær hverandre og dermed blokkerer bindingen sterisk.

Western blot-analyser av lysat fra de to fibronektinbindende E. coli-kloner som ble studert, indikerer at ved å bruke 125I-merket fibronektin og autoradiografi, kan det påvises at subklonet pSDF203 koder for et protein med en molekylvekt på 70 kD, og suklonet pSDF102 koder for et tilsvarende protein med en molekylvekt på 110 kD.

De utledede aminosyresekvenser fra proteinene eller polypeptidene fra de ovenfor nevnte nukleotidsekvenser koder for de følgende:

Henholdsvis

De f ibronektinbindende proteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes ved immunisering, hvorved proteinene, fortrinnssvis i kombinasjon med et fusjonsprotein for å danne et større antigen til å reagere på, blir injisert i doser som utløser en immunologisk reaksjon i pattedyrverten. Slik kan de fibronektinbindende proteiner brukes for å vaksinere drøv-tyggere mot mastitis dannet av streptokokk-infeksjoner. Videre kan de fibronektinbindende proteiner brukes for å blokkere en infeksjon i en åpen hudlesjon. Sårene kan be-handles med en suspensjon som inneholder det fibronektin-bindende protein. Slik kan de fibronektinbindende proteiner anvendes for å behandle sår, f.eks. for å blokkere bakterielle bindingsseter i fibronektin, eller for immunisering (vaksinering) . I sistnevnte tilfelle produserer vertsorganismen spesi-elle antistoffer som kan beskytte mot at bakterielle stammer som inneholder slikt fibronektinbindende protein fester seg. Herved blokkerer antistoffene festing av de bakterielle stammer til skadet vev.

Eksempler på kolonisering av vevskader er:

a) kolonisering i sår i hud eller bindevev, forårsaket av et mekanisk trauma, kjemisk skade og/eller forbrenning; b) kolonisering i sår på slimhinner såsom i munnhulen, i melkekjertlene, urethra eller vagina; c) kolonisering i bindevev som har blitt utsatt for minimal vevsskade (mikrolesjoner) i forbindelse med epitel og endotel

(mastitis, hjerteklaffinfeksjoner, hofteleddsoperasjoner).

Ved bruk av de fibronektinbidende proteiner, fremstilt ved hjelp av hybrid-DNA-teknikk, ved immunisering (vaksinering) av pattedyr inklusive mennes-ker, blir proteinene eller polypeptidene dispergert i steril isotonisk saltoppløsning, eventuelt under tilsetning av et farmasøytisk akseptabelt dispergeringsmiddel. Forskjellige typer av hjelpestoffer kan også brukes for å opprettholde spredningen i vevet, og slik utsette proteinet for kroppens immunforsvarssystem i en lengre tidsperiode.

En passende dose for å oppnå immunisering er 0,5 til 5 /xg f ibronektinbindende protein pr. kg kroppsvekt og injeksjon ved vaksinering. For å oppnå varig immunisering bør vaksinasjon utføres ved etter hverandre følgende tidspunkter med et inter-vall på 1 til 3 uker, fortrinnsvis tre ganger. Det blir van-ligvis ikke tilsatt hjelpestoffer når vaksinasjonen blir

gjentatt.

Ved bruk av de fibronektinbindende proteiner eller polypeptider for lokal topisk administrasjon, blir proteinet dispergert i en isotonisk saltoppløsning til en konsentrasjon på 25 til 250 /xg pr. ml. Sårene blir så behandlet med en mengde som er stor nok til at overflatene blir fullstendig fuktet. For et gjennomsnittlig sår er det således bare nødvendig å bruke et par milliliter. Etter behandling med proteinoppløsningen blir sårene passende vasket med isotonisk saltoppløsning eller en annen oppløsning som egner seg for sårbehandling.

Det f ibronektinbindende protein eller polypeptid fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse kan ytterligere brukes for å diagnostisere bakterielle infeksjoner forårsaket av S. dys<g>alactiae-stammer, hvorved et fibronektinbindende protein fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse blir immobilisert på en fast bærer, såsom små latex- eller Sepharose<R->kuler, hvoretter sera inneholdende antistoffer får passere og reagere med det f ibronektinbindende protein som er blitt immobilisert. Agglutineringen blir så målt ved hjelp av kjente metoder.

Videre kan det fibronektinbindende protein eller polypeptid brukes i en ELISA-test (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; E. Engvall, Med. Biol. 55., 193 (1977)). Herved blir brønner i en mikrotiterplate av polystyren dekket med det fibronektinbindende protein og inkubert over natten ved 4°C. Platene blir så vasket grundig med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 og tørket. Seriefortynninger av pasientserumet i PBS-Tween blir tilsatt til brønnen og blir inkubert ved 30°C i 1,5 time. Etter skylling blir anti-humant IgG konjugert med et enzym eller pepperrot-peroksydase, eller en alkalisk fosfatase blir tilsatt til brønnene og inkubert videre ved 3 0°C i 1,5 time. Under disse inkuberinger blir henholdsvis IgG fra pasientserum tilsatt anti-humant IgG-enzymkonjugat bundet til brønnene. Etter skylling blir det tilsatt et enzymsubstrat, p-nitrofos-fat hvis det brukes en alkalisk fosfatase eller ortofenylen-diaminsubstrat (OPD) hvis det brukes en peroksydase. Brønnene i platene blir deretter skyllet med en citratbuffer inneholdende 0,055% OPD og 0,005% H202 og inkubert i 10 min ved 30°C. Enzymreaksjonen stoppes ved å tilsette en 4N oppløsning av H2S04 til hver brønn. Farveutviklingen måles med et spektro-fotometer.

Avhenging av hvilken type enzymsubstrat som brukes, kan fluorescens-måling også brukes.

En annen måte å diagnostisere S. dys<g>alactiae på, er å bruke DNA-genprobemétoden basert på nukleotidsekvensen for det f ibronektinbindende protein eller deler derav. Derved blir den naturlige eller syntetiske DNA-sekvensen festet til en fast bærer, såsom et nitrocellulosefilter, et nylonfilter eller en polystyrenplate som nevnt ovenfor, f.eks. ved å tilsette melk til overflaten hvis det diagnostiseres mastitis. DNA-genproben, eventuelt merket enzymatisk eller med en radioaktiv isotop, tilsettes deretter til den faste overflateplate som inneholder DNA-sekvensen, hvorved DNA-genproben fester seg til den membranassosierte sekvens der hvor denne opptrer. Enzymet eller den radioaktive isotop kan lett bestemmes ved kjente metoder.

Uttrykket fibronektinbindende protein som brukt ovenfor, omfatter også hvilken som helst av de polypeptidsekvenser som er angitt og som utgjør det minimalt fibronektinbindende sete av det komplette protein.

Figurtekst

Fig. 1 Restriksjonskart

Fig. la. Restriksjonskart og subkloner av 5 kb-inn-skuddet fra S. dys<g>alactiae i pUC18-vektoren kalt pSDF200.

A. Restriksjonskart av klonen.

B. Forskjellige subkloner konstruert for å bestemme den region i genet som koder for fibronektinbindende aktivitet. Den bindende aktivitet av de forskjellige genprodukter er indikert. C. Subkloner erholdt etter fordøying med ExoIII av henholdsvis pSDG102 og pSDG203. Målestokk: 1 cm = 100 bp. M er den delen av DNA-sekvensen som

koder for den membranassosierte del av proteinet (=C00H-terminal). Subklon pl02cl0 inneholder den 3' ende av genet (fig. la) . A17 A2 og A3, henholdsvis Bi/ B2°9 B3 betegner sekvensenes gjentagelsesdome-ner (cf. fig. 3).

Fig. 2 Inhiberingsassay i rør

Binding av 12<5>I-merket fibronektin til celler av henholdsvis S. dys<g>alactiae S2 og S. aureus Cowan I ved tilsetning av lysater av E. coli- kloner. De angitte prosentverdier er i forhold til bindingen av 12<5>I-merket fibronektin til celler i fravær av lysat. Som negativ kontroll ble det brukt et lysat av E. coli TG1 med pUCl8-vektor uten innskudd, som ikke hadde noen innflydelse på cellenes binding til fibronektin. E. coli klon 015 inneholder et gen fra S. aureus som koder for fibronektinbindende aktivitet. Fig. 3 viser gjentagelsessekvenser av pSDF102 og pSDF203. Fig. 4 viser nekleotidsekvensen og den deduserte

aminosyresekvens av pSDF102.

Fig. 5 viser nukleotidsekvensen og den deduserte aminosyresekvens av pSDF203.

Henvisninqe.T

1. Hymes, R.O. (1985) Annu. Rev. Cell Biol. \, 67-90.

2. Kuusela, P. (1978) Nature 276, 718-720.

3. Switalski, L. et al (1 982) Eur. J. Clin. Microbiol. 1_, 381-387. 4. Froman, G. et al. ( 1 984) J. Biol. Chem. 25_9, 1 4 899-14905. 5. Baloda, S.B. et al (1985) FENS Microbiol. Lett. 28, 1-5. 6. Wadstrom, T. et al (1985) ln Jackson, G.J. (ed), Pathogenesis of Infection, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 193-207.

7. Lopes, J.D. et al (1985) Science 229, 275-277.

8. Langone, I.I. (1 982) Adv. Immunol. 3_2, 1 57-252 .

9. Marmur, J. (1961) J. Mol. Biol. 3, 208-218.

10. Flock, J.-I. et al (1987) The EMB0 Journal 6, 2351-2357. 11. Monstein, H.-J. et al (19860 Biochem. Int. 1<_>2/ 889-896.

Claims

1. Hybrid DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens av S. dvsaalacticae som koder for et protein eller et polypeptid med aminosyresekvens og/eller i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregule-rende sekvenser og en sekvens som koder for en seleksjons-markør.

2. Hybrid DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte nukleotidsekvens av S. dvsaalacticae er inneholdt i en pUCl8-ekspre-sjonsvektor.

3. Hybrid DNA-molekyl ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det er plasmid PSDF102.

4. Hybrid DNA-molekyl ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det er plasmid PSDF203.

5. Hybrid DNA-molekyl ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter en eller fler av følgende nukleotidsekvenser: fortrinnsvis og/eller fortrinnsvis

6. Mikroorganisme, karakterisert ved at den er transformert med og uttrykker et hybrid DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 1-5.

7. Mikroorganisme ifølge krav 6, karakterisert ved at den er en E. coli-stamme, fortrinnsvis E. coli stamme TG1 med deponeringsnummer DSM 4613 eller DSM 4614 hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av et fibronektin-bindende protein eller polypeptid, karakterisert ved at a) minst ett hybrid DNA-molekyl ifølge krav 1 eller 2 introduseres i en mikroorganisme, b) nevnte mikroorganisme dyrkes i et vekstmedium, og c) proteinet slik dannet isoleres på kjent måte.