NO171476B - Fremgangsmaate for deteksjon og kvantifisering av virusnoeytraliserende antistoffer i en vandig proeve - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for deteksjon og kvantifisering av virusnøytraliserende antistoffer i en vandig prøve som fortrinnsvis et kroppsfluid, og mer spesielt plasma eller partielt renset immunoglobulin.

Betegnelsen "perturbert" oligosakkaridenhet som "benyttes i foreliggende beskrivelse, er ment å omfatte en hver modifikasjon som (1) endrer den kjemiske eller fysikalske strukturen av en karbohydratrest som naturlig er tilstede; (2) fjerner, helt eller delvis, en karbohydratrest som naturlig er tilstede; og/eller (3) forhindrer eller endrer addisjonen av en karbohydratrest (dvs. forhindrer eller endrer glykosylering).

De pertuberte virusene, de virale antigenene og fragmentene derav fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er nyttige for in vitro diagnostiske og prognostiske anvendelser, så vel som for in vivo profylaktiske og terapeutiske anvendelser.

Viruser er viktige etiologiske midler for en lang rekke sykdommer. I dyr omfatter immunresponsen en av de grunnlegg-ende mekanismene for bekjempelse av virusinfeksjoner. Klassisk sett omfatter immunresponsen to trekk; B-lymfocytt-antistoffresponsen, betegnet som humoral immunitet og en T-lymfocytt-formidlet respons, kjent som celle-formidlet immunitet. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt antistoffresponsen.

Selv om spesifikt antistoff fra klassene IgG, IgM og IgÅ kan bindes til en hvilken som helst tilgjengelig epitop på et overflateprotein av et virion, er bare de antistoffene som bindes i rimelig høy grad til spesielle epitoper på et spesielt protein i det ytre kapsidet eller omhyllingen i stand til å nøytralisere infektiviteten av virionet. Disse betegnes "nøytraliserende antistoffer". "Nøytralisering" slik betegnelsen benyttes i foreliggende beskrivelse, skal innbefatte ikke bare (1) klassisk virusnøytralisering som oppnås når antistoff bindes til et overflateantigen av et virion som ordinært bindes til en reseptor på overflaten av en tilgjengelig celle og derved forhindrer infeksjon av en tilgjengelig celle eller fører til opsonisering, men også innbefatter (2) interaksjoner så som bindingen av et antistoff til neuraminidase av influensavirus (IF) som resulterer i inhiberingen av frigivelse av etterkommende viruspartikler fra plasmamembranen av infiserte celler og forsinker virus-spredningen, og (3) binding av et antistoff til fusjons-protein (F) av paramyxoviruser som ikke forhindrer initiering av infeksjon, men blokkerer den direkte celle-til-celle-spredningen av nydannede virioner når infeksjonen er eta-blert. Antistoffer rettet mot irrelevante eller utilgjenge-lige epitoper av overflateproteiner, eller mot indre proteiner av virionet, eller virus-kodede ikke-strukturelle proteiner, så som virus-kodede enzymer, kan i visse tilfeller utøve indirekte immunopatologiske effekter, men behøver ikke å spille noen rolle ved eliminering av infeksjonen. Disse er "ikke-nøytraliserende antistoffer". Visse ikke-nøytraliserende antistoffer danner ikke bare skadelige sirkulerende "immunkomplekser", men kan i virkeligheten forhindre tilgjengeligheten av nøytraliserende antistoff og øke infektiviteten av virionet for visse celler. I nærvær av sub-nøytraliserende konsentrasjon av nøytraliserende antistoff eller overskudd av ikke-nøytraliserende antistoffer, opptas viruser så som togaviruser mer effektivt av makrofager (via Fc-reseptorer på makrofagen hvortil virus-antistoffkom-plekset bindes). Viruset formerer seg intracellulært til høy titer inne i makrofagene. Følgelig virker de ikke-nøytrali-serende antistoffene som "forsterkende antistoff". Spesifikke eksempler på slike viruser innbefatter denguevirustyper 1-4.

Som respons på en virusinfeksjon produseres følgelig to meget forskjellige typer antistoffer: nøytraliserende antistoffer og ikke-nøytraliserende antistoffer. Hvert er tilstede i serumet hos infiserte individer eller individer som tidligere har vært eksponert mot et virus eller et viralt antigen i varierende mengder. For å fastslå den sanne immunokompetente statusen for et individ, er det nødvendig å kjenne de absolutte og relative mengdene av både nøytraliserende og ikke-nøytraliserende antistoffer. Likevel skiller konvensjonelle serologiske analyser for antivirale antistoffer ikke, og kan heller ikke skille, disse to typene antistoffer. Konvensjonelle serologiske analyser måler nærværet av begge typer antistoffer. Følgelig finnes det ingen serologisk fremgangsmåte for å måle eller fastslå den sanne immun-statusen eller immunokompetensen for individer.

Den eneste konvensjonelle fremgangsmåten for å fastslå den virusnøytraliserende evnen av serum i individer har vært den virusnøytraliserende analysen^ som f.eks. beskrevet av Krech et al., Z. Immuno., Forsch. Bd. 141 S: 411-29 (1971). Nøytraliseringsanalyser krever: (1) anvendelse av infektiøst virus og (2) cellekulturteknikker. Slike analyser er lang-somme, omstendelige, arbeidsintensive og dyre. Følgelig foreligger et lenge følt behov for en rask, billig nøyaktig fremgangsmåte for å fastslå den immunokompetente statusen for individer.

Eksempler på spesifikke situasjoner hvor et raskt, enkelt forsøk for å fastslå immunokompetensen av et individ er spesielt viktig, innbefatter følgende. For det første medfører eksponering av en svanger kvinne mot et virus, så som rubellavirus eller cytomegolovirus, en betydelig fare for medfødte defekter på fosteret. Ved anvendelse av konvensjonelle serologiske fremgangsmåter, så som ELISA-analyser, kan titeren av alle IgM- og IgG-antistoffer mot det relevante viruset, både nøytraliserende og ikke-nøytraliserende, bestemmes. Dersom det samlede IgM-nivået er forhøyet, hvilket indikerer at responsen skyldes reaksjon av en antatt "naivt" immunsystem, anbefales en terapeutisk abort fordi det er usannsynlig at nøytraliserende antistoffer mot viruset er tilstede. Dersom imidlertid bare det samlede IgG-nivået er forhøyet, vil ingen terapeutisk abort bli anbefalt fordi forsøket ikke kan påvise om IgG'ene som er tilstede er nøytraliserende eller ikke-nøytraliserende antistoffer. Pasienten står overfor et langvarig spenningsfylt svangerskap som kan ende i et barn med medfødte defekter. For det andre vil eksponering av (eller reaktivering av tidligere infeksjon forbundet med immunosuppresjon) organtransplantasjons- eller benmargtransplantasjonspasienter mot viruser så som cytomegalovirus (CMV) utgjøre betydelig fare for kliniske sykdomstilstander innbefattende lungebetennelse, hepatitt, retinitt, encefalititt, osv. Videre vil glomerulopatin indusert av CMV i negativ retning påvirke overlevelsen av nyretransplantater, slik at nyretransplantasjonspasienter kan være utsatt for ytterligere livstruende organavvisning [se generelt, White et al., reds., i "Medical Virology", 3dje utgave, Academic Press, Inc., New York, side 419-426 (1986)]. For det tredje utgjør virusinfeksjoner betydelige, også ofte livstruende farer for pasienter med immunsvikt, innbefattende kreftpasienter som undergår kjemoterapi og de som lider av enten medfødt ervervet immunsvikt, såvel som ervervet immun-sviktsyndrom (AIDS). For det fjerde utgjør visse virusinfeksjoner som er endemiske for spesifikke geografiske områder, betydelige farer, f.eks. for militært eller diplomatisk personell stasjonert i disse områdene. Spesifikke eksempler innbefatter Rift Valley-feber, dengue osv. Vaksine kan beskytte ved aktivt å fremme produksjonen av nøytraliserende antistoffer. Vurdering av den immunokompetente statusen for personell som skal sendes til disse områdene etter vaksi-nering er viktig.

I alle de ovenfor nevnte eksemplene er det behov for raske, serologiske fremgangsmåter for å bestemme både nærværet og titeren av virusnøytraliserende antistoffer. Eksempler på prosesser som er nyttige i slike raske, serologiske fremgangsmåter innbefatter, men er ikke begrenset til, enzym-forbundet immunosorbentanalyser (ELISA), radioimmunoanalyser (RIA), immunofluorescense eller andre fluorescense-baserte analyser, agglutineringsanalyser, osv.

Hagenaars et al., J. Virol. Methods 6: 233-39 (1983) beskrev en modifisert inhiberings-ELISA-analyse som viste en viss korrelasjon mellom ELISA-titere og nøytraliseringsanalyse-titere for poliovirus type I. I motsetning til de i det følgende beskrevne analysene var imidlertid den modifiserte inhiberings-ELISA ifølge Hagenaars et al., mer kompleks og omstendelig.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende oppdagelsen at hele viruser, virale antigener og fragmenter derav, hvori strukturen av en oligosakkaridenhet av et viralt glykoprotein er "perturbert", gjenkjennes mer effektivt av serum, plasma eller immunoglobulinfraksjoner inneholdende nøytraliserende antistoffmolekyler. Slik betegnelsen benyttes i foreliggende beskrivelse skal "perturbert" oligosakkarid og oligosakkarid-"perturberinger" omfatte enhver modifikasjon som (1) endrer den kjemiske eller fysikalske strukturen av en normalt forekommende karbohydratrest; (2) fjerner, helt eller delvis, en naturlig forekommende karbohydratrest; og/eller (3) forhindrer eller endrer addisjonen av en karbohydratrest til et virus, viralt antigen eller fragment derav. En hver teknikk som er kjent innen teknikken for å oppnå slike oligosakkarid-"perturberinger" innbefattende, men ikke begrenset til, gentekniske fremgangsmåter, er ment å falle innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny fremgangsmåte for deteksjon og kvantifisering av virusnøytraliserende antistoffer i en vandig prøve som fortrinnsvis et kroppsfluid og mere spesielt serum, plasma eller partielt renset immunoglobulin, som er kjennetegnet ved at den omfatter: (a) å bringe en ligand som innbefatter et virus, et viralt antigen eller et fragment derav med en perturbert oligosakkariddel, hvori den perturberte oligosakkariddel ble opnådd ved oksydasjon ved hjelp av et middel valgt blant gruppen omfattende periodsyre, salter derav, paraperiodsyre, salter derav, metaperiodsyre, salter derav og oksydaseenzymer, av en ikke-perturbert oligosakkaridenhet, i kontakt med en vandig prøve som mistenkes for å inneholde virusnøytraliserende antistoffer i et analysesystem valgt blant gruppen enzym-bunden immunosorbentanalyse, radioimmunoanalyse, agglutin-er ingsanalyse eller immunofluorescensanalyse; (b) detektering av enhver reaksjon med liganden hvori reaksjonen med liganden indikerer nærværet av nøytraliserende antistoffer i prøven; og eventuelt c) å sammenligne enhver reaksjon mellom ligand og antistoffer med den til en standard.

Den nye fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har følgende fordeler sammenlignet med konvensjonelle analyser for nøytraliserende antistoffer: (1) krever ikke anvendelse av cellekulturteknikker; (2) krever ikke anvendelse av in-fektiøst virus; (3) omfatter en enkel serologisk analyse; og (4) er fullført på 4 timer eller mindre. Derimot krever konvensjonelle analyser for virusnøytraliserende antistoffer: (1) celler i kultur; (2) infektløst virus; (3) trenet personell; og (4) ca. 5 dager før et svar kan oppnås. Følgelig er foreliggende fremgangsmåte raskere, enklere og mindre kompleks enn konvensjonelle fremgangsmåter. Den krever ikke trenet personell med erfaring i håndtering av infektiøst virusmateriale og er sikrere å bruke fordi selv trenet personell ikke må eksponeres mot infektiøst virus.

Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen innbefatter fremgangsmåten videre trinnet med dissosiering av eventuelle immunkomplekser som kan være tilstede i den vandige prøven før liganden bringes i kontakt med prøven før liganden bringesi kontakt med prøven.

Foreliggende oppfinnelse vil lettere forstås ved hjelp av den følgende detaljerte beskrivelsen og eksempler på spesifikke utførelser.

Den nye fremgangsmåten er basert på anvendelsen av enten hele virus, virale antigener eller fragmenter av virale proteiner hvori "perturbering" av en oligosakkaridenhet gjør viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav, mer effektivt gjenkjennbart av nøytraliserende antistoffer.

1. Oligosakkaridperturberinger

Ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter oligosakkarid-"perturbering" en hver modifikasjon som "1) endrer den kjemiske eller fysikalske strukturen av en naturlig forekommende karbohydratrest; (2) fjerner, helt eller delvis, en naturlig forekommende karbohydratrest; og/eller (3) forhindrer eller endrer addisjonen av en karbohydratrest til et virus, viralt antigen eller fragment derav. Illustrerende eksempler på oligosakkaridperturberinger innbefatter, men er ikke begrenset til, følgende.

Hele viruser, virale antigener eller fragmenter derav perturberes ved mild oksydasjon av en oligosakkaridenhet av et viralt glykoprotein. For eksempel kan kjemisk oksydasjon av oligosakkaridenheten oppnås ved anvendelse av en rekke oksyderende midler så som perjodsyre, paraperjodsyre, natriummetaperjodat og kaliummetaperjodat. Oksydasjon ved anvendelse av slike oksyderende midler utføres ved kjente fremgangsmåter. For en generell diskusjon, se Jackson, i "Organic Reactions 2", side 341 (1944); Bunton, i "Oxidation Chemistry", bind 1, Wiberg, red., side 367, Academic Press, New York (1944). Mengden av oksydasjonsmidlet avhenger av typen virus eller viralt antigen, men benyttes generelt i overskudd sammenlignet med mengden av oksyderbart oligosakkarid. Den optimale mengden kan bestemmes ved rutinemessige forsøk. Det optimale området omfatter: pH fra 4 til 8, et temperaturområde fra 0° til 37°C, og en reaksjonsperiode på fra 15 minutter til 12 timer. Under oksydasjonen utelukkes lys fortrinnsvis fra reaksjonsblandingen for å forhindre overoksydasjon. Alternativt oppnås oksydasjon ved anvendelse av et enzym, så som galaktoseoksidase [Cooper et al., J. Biol. Chem. 234: 445-48 (1959)]. Innvirkningen av pH, substratkonsentrasjon, buffere og bufferkonsentrasjon på den enzymatiske oksydasjonen er angitt i Cooper et al., supra.

Hele viruser, virale antigener eller fragmenter derav perturberes ved kultivering av virusinfiserte celler i nærvær av glykosyleringsinhibitorer. For eksempel kan infiserte celler kultiveres i nærvær av glykosyleringsinhibitorer innbefattende: tunikamycin, streptovirudiner, og/eller glykosidaseinhibitorer så som karbohydratanaloger, f.eks. 2-deoksy-D-glukose og lignende, og kastanospermin, norjirimycin, 1-deoksynorjirimycin, bromocenduritol, 1-deoksymannojirimycin, og swainsonin, osv.

Hele viruser, virale antigener eller fragmenter derav perturberes ved enzymatisk fjerning, enten helt eller delvis, av en naturlig forekommende oligosakkaridenhet ved eksponering av enten virusinfiserte celler i kultur eller isolerte viruspartikler eller fragmenter derav mot et enzym som er spesifikt for glykosidrester. Nyttige enzymer innbefatter neuraminidase, endo-p-N-acetylglukosaminidaser og lignende.

Perturbering av virale antigener ved foreliggende oppfinnelse oppnås også ved anvendelse av genspleisingsteknikker. For eksempel kan et gen som koder et spesielt viralt glykoprotein eller fragment, klones og uttrykkes i en bakteriell organisme. I et slikt tilfelle finner liten eller ingen glykosylering av det uttrykkede virale proteinet sted, dette resulterer i en perturbert oligosakkarid. Alternativt kan et gen som koder det ønskede virale glykoproteinet eller fragmentet klones og uttrykkes i en eukaryotisk organisme eller cellekultur. Den eukaryotiske organismen eller cellen kultiveres deretter i nærvær av en glykosyleringsinhibitor så som tunikamycin eller en glykosidaseinhibitor, så som kastanospermin, morjirimycin og lignende, hvilket resulterer i uttrykking av et protein eller fragment som har et perturbert oligosakkarid. Nok et alternativ er å benytte sete-selektive mutageneseteknikker for å endre et gen som koder et viralt antigen eller fragment på en slik måte at setet (setene) for glykosylering fjernes eller endres.

I tilfeller hvor aminosyresekvensen for et viralt glykoprotein eller fragment er kjent, utgjør kjemiske fremgangsmåter for peptidsyntese nok en fremgangsmåte for fremstilling av et viralt antigen eller fragment derav med et perturbert oligosakkarid.

Det perturberte oligosakkaridet av viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav kan modifiseres ytterligere, f.eks. ved reduksjon med reduksjonsmidler så som natriumbor-hydrid, cyanoborhydrid eller lignende eller ved kovalent tilknytning til en oppløselig eller uoppløselig bærer eller et understøttelsesmiddel.

2. Anvendelser

Virusene, de virale antigenene og fragmentene derav anvendes fordelaktig for fremgangsmåter som er egnede for en rekke forskjellige anvendelser.

2.1. Diagnostiske og prognostiske anvendelser Viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav som har en perturbert oligosakkaridenhet kan anvendes i en rekke fremgangsmåter for analysering av en prøve av kroppsfluider så som serum, plasma eller delvis rensede immunoglobulinfraksjoner vedrørende nærværet og titeren av nøytraliserende antistoffer.

Virusene, de virale antigenene eller fragmentene derav benyttes som ligander (antigener) for å detektere nærværet av virusnøytraliserende antistoffer i analysesystemer innbefattende, men ikke begrenset til, systemer som: Enzym-forbundet immunosorbentanalyser (ELISA), radioimmunoanalyser (RIA), immunofluorescense eller andre fluorescens-baserte analyser, aglutineringsanalyser, osv. Eksempler på viruser for hvilke nøytraliserende antistofftitere analyseres, innbefatter de som er beskrevet i avsnitt 3.

Titerne som oppnås ved anvendelse av analyser med konven-sjonelt behandlede viruser, f.eks. konvensjonelle ELISA-analyser, som måler alle antistoffer uavhengig om de er nøytraliserende eller ikke-nøytraliserende, korrelerer ikke med titeren bestemt i konvensjonelle virusnøytraliserende analyser. På den annen side er titerne som oppnås ved anvendelse av foreliggende viruser, virale antigener eller fragmenter derav som har en perturbert oligosakkaridenhet (i det følgende betegnet som et "perturbert antigen") funnet å være signifikant korrelert med titeren av virusnøytrali-serende antistoffer, som bestemt ved konvensjonelle virus-nøytraliserende analyser (se f.eks. eksperimentelle resultater angitt i avsnittene 5-7, infra). Dette kan skyldes en reduksjon i bindingen av ikke-nøytraliserende antistoff. Følgelig er analyser som anvender de foreliggende perturberte antigenene nyttige for diagnostisk og/eller prognostisk forutsigelse av den immuno-kompetente statusen av en pasient med hensyn på et spesielt virus.

2.1.1. Dissosiering og reassosiering av immunkomplekser Det antas at i visse tilfeller kan virus eller virusfrag-menter være tilstede i varierende mengder i serum eller plasmaprøver. Disse virusene eller virusfragmentene kan være bundet eller knyttet til nøytraliserende og ikke-nøytraliser-ende antistoffer i immunkomplekser. Følgelig kan titeren som oppnås ved anvendelse av foreliggende perturberte antigener ved in vitro-analyser være kunstig lav (dvs. falskt negativ). Ifølge en utførelse av foreliggende oppfinnelse dissosieres følgelig slike immunkomplekser før de diagnostiske analysene

utføres. Dissosiering av immunkomplekser kan oppnås ved fremgangsmåter som er kjente for fagmannen innbefattende: anvendelse av kaotropiske midler så som perklorat (C1C>4_), tiocyanat (SCN~), osv., denatureringsmidler så som guanidin-hydroklorid, urea, osv., og anvendelse av variasjon av pE, og lignende. Etter dissosiering bringes de frigjorte antistoffene i kontakt med perturberte antigener under be-tingelser som tillater assosiering og reassosiering med nøytraliserende antistoffer.

2.2. Profylaktiske og terapeutiske anvendelser VEd en annen utførelse kan virusene, de virale antigenene eller fragmentene derav, som har en perturbert oligosakkaridenhet, anvendes som immunogener i vaksinepreparater for å stimulere en aktiv immunrespons i en vaksinert vert.

Når et helt virus som har en perturbert oligosakkaridenhet benyttes, er det nødvendig å benytte enten et svekket eller avirulent virus eller et inaktivert virus. Et inaktivert virus oppnås ved behandling av et virus med forskjellige kjemikalier så som formaldehyd; deretter perturberes et oligosakkarid ved anvendelse av en hvilken som helst av fremgangsmåtene beskrevet i avsnitt 1. Alternativt oppnås et inaktivert virus som har en perturbert oligosakkaridenhet ved kjemisk oksydasjon av et virus, f.eks. ved anvendelse av perjodsyre som beskrevet i avsnitt 1. Slike svekkede eller inaktiverte viruser som har en perturbert oligosakkaridenhet bør indusere antistoffer som er mer effektive ved nøytrali-sering av virusinfeksjoner enn konvensjonelle svekkede eller inaktiverte viruser.

Underenhetsvaksiner inneholdende bare det nødvendige og relevante immunogene materiale så som kapsidglykoproteiner av ikke-omhyllede ikosohedralviruser eller peplomerene (glyko-proteinspissene) av omhyllede viruser eller immunogene fragmenter derav kan også fremstilles hvori oligosakkaridenheten av glykoproteinet eller fragmentet derav er perturbert. Underenhetsvaksiner kan fremstilles ved isolering av den relevante underenheten fra sterkt rensede virale fraksjoner eller ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi og perturbering av oligosakkaridenheten av den relevante immunogene underenheten som beskrevet i avsnitt 1.

Vaksinepreparatene som stimulerer en aktiv immunrespons for profylakse av virusinfeksjoner kan fremstilles ved å blande viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav som har en perturbert oligosakkaridenhet i en bærer som er egnet for anvendelse in vivo. For å øke den immunologiske responsen hos verten, kan det immunogene viruset, antigenet eller fragmentet derav settes sammen med et egnet hjelpestoff. Egnede hjelpestoffer innbefatter: aluminiumhydroksyd, overflate-aktive stoffer, lysolecitin, pluroniske polyoler, polyan-ioner, peptider innbefattende muramylpeptider og oljeemul-sjoner.

Ved en alternativ utførelse fremstilles et vaksinepreparat for å stimulere en aktiv immunrespons for profylakse av virusinfeksjoner ved kobling av et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en pertubert oligosakkaridenhet til et immunogent peptid eller en forbindelse for å øke eller potensiere den immunologiske responsen hos verten.

Ifølge nok en utførelse kan vaksinepreparatet fremstilles som en multivalent vaksine. For dette formålet kan en blanding av forskjellige viruser, virale antigener eller fragmenter derav, hvorav alle inneholder en perturbert oligosakkaridenhet og som er i stand til å fremkalle en immunrespons mot et annet viralt patogen blandes sammen i et preparat.

Mange fremgangsmåter kan benyttes for å innføre vaksinepreparatene beskrevet ovenfor i en vert. Disse innbefatter: intradermal, intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs, subkutan, og intranasal administrering.

Virusene, de virale antigenene og fragmentene derav, som har en perturbert oligosakkaridenhet, kan anvendes i en rekke fremgangsmåter for fremstilling av nøytraliserende antistoffer som kan administreres for å gi kortvarig passiv immunitet for profylakse og/eller behandling av virusinfeksjon. I en utgave av denne utførelsen benyttes et virus, et viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet som et immunogen i en hvilken som helst teknikk som muliggjør fremstillingen av antistoffmolekyler ved hjelp av kontinuerlige cellelinjer i kultur. For eksempel kan de foreliggende immunogenene anvendes i hybridomfremgangsmåtene som opprinnelig er utviklet av Kohler og Milstein, og beskrevet av dem i Sei. Amer. 243: 66-74 (1980), så vel som i de humane B-cellehybridomfremgangsmåtene beskrevet av Kozbor et al., Immunology Today .4: 72 (1983) og EBV-hybridomfremgangsmåtene for fremstilling av humane monoklonale antistoffer beskrevet av Cole et al., i "Mono-clonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., side 77-96 (1985) og lignende. De fremstilte monoklonale antistoffene gir en lett tilgjengelig, konsistent kilde for nøytraliserende antistoffer spesifikke for det relevante viruset som kan administreres for passiv immunisering.

Denne utførelsen omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat for administrering til et dyr eller et menneske for å gi kortvarig passiv immunitet eller for profylakse eller behandling av en virusindusert infeksjon innbefattende: høsting av monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av en hybridomcellelinje dannet ved å smelte sammen en myelom- eller hybridom-celle og en celle som er i stand til å produsere antistoff mot et virus, et viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet. Den omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat for administrering til et dyr eller et menneske for å gi kortvarig passiv immunitet eller for profylakse eller behandling av en virusindusert infeksjon innbefattende: høsting av monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av en lymfocyttcellelinje dannet ved transformasjon ved hjelp av et EBV-virus av en pattedyrlymfocyttcelle som er i stand til å produsere antistoff mot et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet. I tillegg omfatter den en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat for administrering til et dyr eller menneske for å gi kortvarig passiv immunitet eller for profylakse eller behandling av en virusindusert infeksjon innbefattende: (a) en prøve inneholdende antivirale antistoffer bringes i kontakt med et antigen innbefattende et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet slik at det dannes et antistoff -ant igenkompleks ; (b) separering av antistoff-antigen-komplekset fra prøven; og (c) dissosiering av antistoff-antigenkomplekset slik at det oppnås et renset antiviralt antistoffpreparat.

I en annen utgave av denne utførelsen anvendes et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet i en kartleggingsanalyse for å identifi-sere de viralspesifikke monoklonale antistoffene som, selv om de er kjente innen teknikken, ikke er gjenkjent som nøytrali-serende antistoffer. Følgelig kartlegger og identifiserer denne fremgangsmåten nøytraliserende monoklonale antistoffer som deretter kan administreres for passiv immunisering.

I nok en alternativ utgave av denne utførelsen benyttes et virus, viralt antigen eller fragment derav for å fremstille nøytraliserende antistoffer fra serum, plasma eller fraksjoner av immunoglubuliner avledet fra disse. For eksempel immobiliseres et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet og benyttes i en preparativ affinitetskromatografiutførelse for å isolere relevante nøytraliserende antistoffer fra serum eller plasma ved dannelsen av immunkomplekser. De polyklonale nøytrali-serende antistoffene separeres deretter fra immunkompleksene ved konvensjonelle teknikker.

De nøytraliserende antistoffene som reagerer spesifikt med preparatene inneholdende en perturbert oligosakkaridenhet kan formuleres slik at det gir kortvarig passiv immunitet til verten. Hjelpestoffer er ikke påkrevet i denne typen preparat fordi formålet ikke er å stimulere en immunrespons, men heller å inaktivere eller binde et viralt patogen. Følgelig kan en hvilken som helst egnet farmasøytisk bærer benyttes. Passiv immunisering ved anvendelse av slike preparater kan anvendes på en nødsbasis for øyeblikkelig beskyttelse av uimmuniserte individer som utsettes for spesielle farer for virusinfeksjoner. I tillegg kan slike preparater benyttes profylaktisk for virusinfeksjoner så som meslinger og hepatitt.

3. Viruser og virale antigener

Virusene, de virale antigenene og fragmentene derav som her omtales innbefatter en lang rekke viruser så som DNA- og RNA-viruser innbefattende, men ikke begrenset til, retroviruser.

Spesifikke eksempler innbefatter: DNA-viruser så som: Adenoviridae så som adenovirusundergrupper B, C, D, E, F og G, osv.; Herpesviridae så som herpes simplex I og II, cytomegalovirus, Epstein-Bass-virus, varicella-zoster, osv.; Orthomyxoviridae så som influensaviruser, osv.; Hepadna-viridae så som hepatitt B, hepatitt ikke-A, ikke-B, osv.; Parvoviridae så som parvoviruser, osv.; RNA-viruser så som Togaviridae så som rubella, osv.; Paramyxoviridae så som meslinger, parainfluensa, respiratorisk syncytialt virus, osv.; Flaviviridae så som dengue-virus typer 1-4, gulfeber-virus, blodmidd-borende feberviruser, osv.; Rhabdoviridae så som rabies, vesikulær stomatitisvirus, Marburg-Ebolavirus, osv.; Bunyaviridae så som Rift Valley-feber, California Encefalitt-virusgruppe, sandfluefebervirus, osv.; Arena-viridae så som Lassa-febervirus, Jinin-virus, lymfocytisk koriomeningittvirus, osv.; Reoviridae så som rotovirus, osv.; Picornaviridae så som poliovirus, coxsackieviruser, hepatitt A-virus, rhinovirus, osv.; Retroviridae så som humant lymfadenopati-tilknyttet virus (LAV, HIV, HTLV-III), humane T-cellelymfotropfiske virustyper I, II, III, katteleukemi-virus, osv.

De følgende eksemplene er gitt for å illustrere foreliggende oppfinnelse.

I ELISA-analysene beskrevet nedenfor hvori viruset ble kovalent tilknyttet til mikrotiterplaten, var mikrotiter-platene formettet ved anvendelse av enten 200 pl av 0,5$ kalve-IgG i 0,14 M NaCl eller 300 pl av 0,5$ bovint serumalbumin i 0,5 M tris-citratbuffer inneholdende 0,1$ "Tween-20", pH 8,1, for å eliminere den ikke-spesifikke adsorpsjonen av virus eller serumproteiner eller IgG. I ELISA-analysene beskrevet nedenfor hvori viruset var tilknyttet til platen ved hjelp av adsorpsjon, fikk viruset adsorberes til platen og deretter ble platene mettet ved anvendelse av enten kalve-IgG i 0,14 M NaCl eller bovint serumalbumin i 0,5 M tris-citratbuf f er .

5. Eksempler: Bestemmelse av nøytraliserende antistoffer i renset humant IgG fra sera

5.1. Deteks. ion av nøytraliserende anti- CMV- antistoffer i

humant IgG

Den følgende serien av forsøk demonstrerer at ELISA-analyser hvori oligosakkaridenheten av det virale antigenet var perturbert er nyttige for bestemmelse av titeren av virus-nøytraliserende antistoffer. Derimot var konvensjonelle ELISA-analyser hvori viruset enten var adsorbert eller kovalent tilknyttet uten perturbering av oligosakkaridenheten ikke nyttige for dette formålet.

Antigenet som ble benyttet i analysene var helt cytomegalovirus CMV) oppnådd fra homogenater av kultiverte humane fibroblastceller (MRC5) infisert med CMV i seks til åtte dager. Mikrotiterbrønnene inneholdende en ekvivalent mengde

(ca. 1 pg/brønn) av CMV ble fremstilt for de forskjellige ELISA-analysene på følgende måte: (A) ELISA'er ved anvendelse av antigen med perturbert oligosakkarid. (1) Virus kovalent tilknyttet via oksydert oligosakkarid enhet: Karbohydratenheten av CMV ble oksydert ved anvendelse av natriumperjodat (NalC^) som beskrevet ovenfor og kovalent koblet til et reaktivt amin på en sidekjede av polyhydrazidostyrenet av brønnen. Addisjon av en reaktiv amingruppe til polystyren (eller mikrotiterbrønnen) ble utført ved fremgangsmåten ifølge Chin og Lanks [Anal. Biochem, 83: 709-19

(1977)]. Polystyren ble først omvandlet til nitrostyren som deretter ble redusert til aminostyren. Polyaminostyren ble deretter omvandlet til polyhydrazidostyren i en to-trinns-prosess: (1) polyaminostyren ble succinylert; og deretter (2) ble en amidbinding dannet mellom hydrazin og det succinylerte polyaminostyrenet ved anvendelse av karbodiimid. (Ox. oligosakkaridtilknyttet ELISA.) (2) Virus kovalent tilknyttet via amingruppe, oksydert oligosakkaridenhet: CMV-viruset ble kovalent tilknyttet til polykarbostyrenet via en peptidbinding dannet ved anvendelse av karbodiimid for å koble en aminrest av viruset til en aktivert karboksyl av polykarbostyrenet. Karbohydratenheten av viruset ble deretter oksydert in situ ved en anvendelse av NaI04 som beskrevet ovenfor. (Amintilknyttet oligosakkarid Ox. ELISA.). (B) Konvensjonelle ELISA'er ved anvendelse av antigen med ikke-perturbert oligosakkarid.

(l) Virus kovalent tilknyttet via amingruppe:

CMV ble tilknyttet ved anvendelse av karbodiimid for dannelse av en peptidbinding mellom en amingruppe av en aminosyrerest av viruset og en fri karboksylgruppe av en polykarbostyren av brønnen (amintilknyttet ELISA).

(2) Virus ikke-kovalent tilknyttet:

CMV ble enkelt ikke-kovalent fiksert ved adsorpsjon på en ikke-modifisert polystyrenbrønn (adsorpsjon ELISA).

Delvis renset humant IgG ble oppnådd fra humane serumprøver ved anvendelse av konvensjonelle ammoniumsulfatutfellings-teknikker. Etter utfelling ble rørene sentrifugert ved 12 000 opm i 5 minutter. Supernatanten ble avhelt, pelleten ble vasket, resentrifugert og resuspendert i 0,14 M NaCl. De delvis rensede humane IgG-prøvene ble serievis fortynnet i buffer I av følgende sammensetning:

innstilt på pE 8,1 med 1,0 M HC1. 100 pl av hver fortynning ble fordelt i brønnene av platen inneholdende CMV. Etter 2 timers inkubering ved 37 "C ble platene vasket i buffer I, men uten kalve-IgG.

Deretter ble 100 pl av en geiteserumoppløsning inneholdende anti-humant IgG merket med alkalisk fosfatase, fortynnet til 1/1000 i den følgende buffer II, innført i hver brønn:

Etter en kontakttid på en time ved 37°C ble brønnene vasket med buffer II, men uten bovinserumalbumin (BSA). Den enzymatiske aktiviteten ble bestemt ved 37°C ved anvendelse av p-nitrofenylfosfat som substrat ved en konsentrasjon på 0, 2%

(p/v) oppløst i en buffer inneholdende: 2-amino-2-metyl-l-propanol (0,625 M) og MgCl2 (2,0 mM), pH 10,25. Den optiske tettheten ble målt ved 405 nM hvert femte minutt i løpet av et tidsrom på 30 minutter eller etter 30 minutters inkubering.

En konvensjonell CMV infeksjonskraft-nøytraliseringsanalyse ble utført ved anvendelse av MRCs-celler i kultur som beskrevet av Krech et al., Z. Immun.-Forsch, Bd. 141S: 411-29

(1971).

Resultatene er illustrert i tabell 1. Antistofftiteren oppnådd ved anvendelse av ELISA-analysene og de konvensjonelle virusnøytraliseringsanalysene ble beregnet som en proteinkonsentrasjon på 1 mg/ml av ikke-fortynnet IgG-prøve. Tabell 2 angir de lineære korrelasjonskoeffisientene oppnådd når titerne oppnådd ved de forskjellige analysene ble sammenlignet. Som demonstrert i tabellene 1 og 2, var titeren oppnådd ved anvendelse av ELISA-analyser ifølge foreliggende oppfinnelse, dvs. oks. oligosakkaridtilknyttet ELISA og amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA, sterkt positivt korrelert med titeren oppnådd ved anvendelse av den konvensjonelle nøytral-iseringsnalysen (korrelasjonskoeffisienter, henholdsvis: 0,90 og 0,87). På den annen side viste titeren oppnådd ved anvendelse av den konvensjonelle amintilknyttede ELISA ingen signifikant korrelasjon med titeren for nøytraliserende antistoff (korrelasjonskoeffisient: 0,52). Amintilknyttet ELISA viste mye svakere, ikke-signifikant korrelasjon med titer for nøytraliserende antistoff (korrelasjonskoeffisient: 0,74)..

Tabell 2 demonsterer videre at det var en signifikant positiv korrelasjon mellom titeren oppnådd ved anvendelse av oks. oligosakkarid tilknyttet ELISA og amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA (korrelasjonskoeffisient: 0,93). Samtidig ble imidlertid ingen signifikant korrelasjon observert mellom titerne oppnådd ved anvendelse av absorpsjons-ELISA og amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA, eller amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA og amintilknyttet ELISA. Dette indikerer at den signifikante korrelasjonen som ble observert mellom titerne for nøytraliserende antistoff ved anvendelse av nøytraliseringsanalysen og både den amintilknyttede oligosakkarid oks. ELISA og oks. oligosakkarid tilknyttet ELISA ikke er relatert til fremgangsmåten for kovalent tilknytning, men derimot kan være relatert til perturberingen av oligosakkaridenheten oppnådd ved oksydasjon. Videre antyder disse resultatene at det ikke spiller noen rolle om oligosakkaridperturberingen finner sted før eller etter kovalent tilknytning av viruset til mikrotiterbrønnen.

5.2. Reproduserbarhet for nøytraliserende antistofftiter Det følgende forsøket demonstrerer reproduserbarheten av resultater oppnådd ved anvendelse av en ELISA-analyse hvori

viruset var kovalent tilknyttet til en uoppløselig bærer via en oksydert karbohydratenhet av viruset.

En serie ELISA-analyser for å bestemme titeren av nøytrali-serende anti-CMV antistoffer ble utført som beskrevet i avsnitt 5.1 hvori CMV ble kovalent tilknyttet til et reaktivt amin på en sidekjede av en uoppløselig bærer via en oksydert karbohydratenhet av CMV-antigenet. De benyttede prøvene var renset IgG oppnådd fra de samme serumprøvene som ble benyttet for forsøkene beskrevet i avsnitt 5.1. En serie ELISA'er ble utført på en porsjon av rensede IgG'er, og en duplikatserie analyser ble utført på en annen porsjon av de samme IgG'ene ca. 17,5 måneder senere. Prøvene ble lagret nedfrosset ved

-70°C i mellomtiden. Resultatene er gjengitt i tabell 3.

Som demonstrert i tabell 3 er resultatene for antistofftitere, oppnådd ved anvendelse av ELISA-analysen hvori viruset var kovalent tilknyttet via en perturbert oligosakkaridenhet, meget reproduserbare.

6. Eksempel: Deteksjon av nøytraliserende antistoffer i

serumprøver

Følgende serie av analyser demonstrerer at en ELISA-analyse hvori oligosakkaridenheten av et virusantigen var perturbert er nyttig for bestemmelse av titeren av nøytraliserende antistoff i humane serumprøver.

En ELISA-analyse ble utført som beskrevet i avsnitt 5.1 hvori oligosakkaridenheten av CMV-viruset var oksydert og kovalent koblet til en hydrazidogruppe på polyhydrazidostyrenet av mikrotiterbrønnen. En konvensjonell ELISA-analyse ble utført som beskrevet i avsnitt 5.1 hvori CMV bare var adsorbert til mikrotiterbrønnen. En virusnøytraliseringsanalyse som beskrevet i avsnitt 5.1 ble også utført.

Resultatene fra alle tre analyser er sammenlignet i tabell 4.

Som demonstrert i tabell 4 var det en sterkt signifikant positiv korrelasjon mellom titeren for antistoffer i humane serumprøver målt ved hjelp av nøytraliseringsanalysen og ved hjelp av en ELISA-analyse hvori oligosakkaridenheten av CMV var oksydert og kovalent koblet til mikrotiterbrønnen. Ved anvendelse av polyklonale sera, er følgelig denne ELISA-analysen "forutsigende" for den immunokompetente statusen for pasienten. Derimot ble ingen korrelasjon observert mellom antistofftiteren målt ved hjelp av nøytraliseringsanalysen og den som ble oppnådd ved anvendelse av konvensjonell ELISA hvori ikke-perturbert CMV-virus bare var adsorbert på mikrotiterbrønnen.

7. Eksempel: Perturbering av oligosakkaridenhet av virus og

tilknytning av virus til en fast bærer

Som antydet av resultatene gjengitt i avsnitt 5.1 ovenfor spiller det, når et perturbert antigen benyttes for å bestemme titeren av nøytraliserende antistoffer i en ELISA-fremgangsmåte hvori antigenet er kovalent tilknyttet til mikrotiterbrønnen, ingen rolle om oligosakkaridenheten perturberes før eller etter kovalent tilknytning til mikro-titerbrønnen. Den følgende serien av forsøk ble utført for å undersøke virkningen av perturbering av oligosakkaridenheten på evnen av viruset til å tilknyttes til en mikrotiterplate.

Oligosakkaridenheten av CMV-virus ble perturbert ved oksydasjon ved anvendelse av NaI04 i 16 timer ved 4°C som beskrevet i avsnitt 4. ELISA-analyser for anti-CMV-antistoffer ble gjennomført som beskrevet i avsnitt 5.1, hvori: (1) CMV som har en perturbert oligosakkaridenhet i PBS ble adsorbert til en polystyrenmikrotiterplate. (2) CMV som har en perturbert oligosakkaridenhet ble kovalent koblet via karbohydratenheten til en reaktiv amingruppe av en polyhydrazidostyrenmikro-titerplate i nærvær av fosfatbuffer inneholdende 0, 1% "Tween-20" (PBT). PBT ble benyttet for å forhindre ikke-kovalent adsorpsjon av CMV til polyhydrazidostyrenplaten. (3) Ikke-perturbert CMV i PBS ble adsorbert til en polystyrenmikrotiterplate.

Resultatene er angitt i tabell 5.

Som demonstrert i tabell 5 var det ingen forskjell i ELISA-titere oppnådd hvori et perturbert antigen enten var kovalent tilknyttet eller bare adsorbert til mikrotiterbrønnen. Når det perturberte CMV ble inkubert i mikrotiterbrønnene i nærvær av PBT, var titeren som ble oppnådd 0 fordi det perturberte viruset ikke adsorberes i nærvær av "Tween-20"

(resultater ikke vist).

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for deteksjon og kvantifisering av virus-nøytraliserende antistoffer i en vandig prøve som fortrinnsvis et kroppsfluid og mere spesielt serum, plasma eller partielt renset immunoglobulin, karakterisert ved at den omfatter: (a) å bringe en ligand som innbefatter et virus, et viralt antigen eller et fragment derav med en perturbert oligosakkariddel, hvori den perturberte oligosakkariddel ble opnådd ved oksydasjon ved hjelp av et middel valgt blant gruppen omfattende periodsyre, salter derav, paraperiodsyre, salter derav, metaperiodsyre, salter derav og oksydaseenzymer, av en ikke-perturbert oligosakkaridenhet, i kontakt med en vandig prøve som mistenkes for å inneholde virusnøytraliserende antistoffer i et analysesystem valgt blant gruppen enzym-bunden immunosorbentanalyse, radioimmunoanalyse, agglutin-eringsanalyse eller immunofluorescensanalyse; (b) detektering av enhver reaksjon med liganden hvori reaksjonen med liganden indikerer nærværet av nøytraliserende antistoffer i prøven; og eventuelt c) å sammenligne enhver reaksjon mellom ligand og antistoffer med den til en standard.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre innbefatter trinnet med dissosiering av eventuelle immunkomplekser som kan være tilstede i den vandige prøven før liganden bringes i kontakt med prøven.