NO171476B - PROCEDURE FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANTI-VIRTUALIZING ANTIBODIES IN A TRIAL TEST - Google Patents
PROCEDURE FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANTI-VIRTUALIZING ANTIBODIES IN A TRIAL TEST Download PDFInfo
- Publication number
- NO171476B NO171476B NO87873102A NO873102A NO171476B NO 171476 B NO171476 B NO 171476B NO 87873102 A NO87873102 A NO 87873102A NO 873102 A NO873102 A NO 873102A NO 171476 B NO171476 B NO 171476B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- virus
- perturbed
- oligosaccharide
- antibodies
- neutralizing
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 103
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims description 71
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 55
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 52
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 52
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 41
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 31
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 12
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 12
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 12
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 25
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 23
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 18
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 15
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 10
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940121672 Glycosylation inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- VYEWZWBILJHHCU-OMQUDAQFSA-N (e)-n-[(2s,3r,4r,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5s,6s)-3-acetamido-5-amino-4-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[2-[(2r,3s,4r,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl]-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]-5-methylhex-2-enamide Chemical compound N1([C@@H]2O[C@@H]([C@H]([C@H]2O)O)C(O)C[C@@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@H]([C@@H](O2)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)C=CC(=O)NC1=O VYEWZWBILJHHCU-OMQUDAQFSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- JDVVGAQPNNXQDW-WCMLQCRESA-N Castanospermine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H]2[C@@H](O)CCN2C[C@H]1O JDVVGAQPNNXQDW-WCMLQCRESA-N 0.000 description 2
- JDVVGAQPNNXQDW-TVNFTVLESA-N Castinospermine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2[C@@H](O)CCN21 JDVVGAQPNNXQDW-TVNFTVLESA-N 0.000 description 2
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 208000000705 Rift Valley Fever Diseases 0.000 description 2
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- -1 castanospermine Chemical compound 0.000 description 2
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003316 glycosidase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000003094 perturbing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 1
- LXBIFEVIBLOUGU-FSIIMWSLSA-N 1-Deoxymannojirimycin Natural products OC[C@@H]1NC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LXBIFEVIBLOUGU-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 229940058020 2-amino-2-methyl-1-propanol Drugs 0.000 description 1
- PIAOLBVUVDXHHL-UHFFFAOYSA-N 2-nitroethenylbenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C=CC1=CC=CC=C1 PIAOLBVUVDXHHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWRZIZXBOLBCON-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethenamine Chemical compound NC=CC1=CC=CC=C1 UWRZIZXBOLBCON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000712892 Arenaviridae Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001493160 California encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102100035149 Cytosolic endo-beta-N-acetylglucosaminidase Human genes 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- LXBIFEVIBLOUGU-UHFFFAOYSA-N Deoxymannojirimycin Natural products OCC1NCC(O)C(O)C1O LXBIFEVIBLOUGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 101710144190 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000022461 Glomerular disease Diseases 0.000 description 1
- 229940122069 Glycosidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 206010023927 Lassa fever Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241001135555 Sandfly fever Sicilian virus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N aminomethyl propanol Chemical compound CC(C)(N)CO CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- LXBIFEVIBLOUGU-JGWLITMVSA-N duvoglustat Chemical compound OC[C@H]1NC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LXBIFEVIBLOUGU-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004944 mitochondria-rich cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000006053 organic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- FJVZDOGVDJCCCR-UHFFFAOYSA-M potassium periodate Chemical compound [K+].[O-]I(=O)(=O)=O FJVZDOGVDJCCCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- FXUAIOOAOAVCGD-UHFFFAOYSA-N swainsonine Natural products C1CCC(O)C2C(O)C(O)CN21 FXUAIOOAOAVCGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXUAIOOAOAVCGD-FKSUSPILSA-N swainsonine Chemical compound C1CC[C@H](O)[C@H]2[C@H](O)[C@H](O)CN21 FXUAIOOAOAVCGD-FKSUSPILSA-N 0.000 description 1
- 229960005566 swainsonine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for deteksjon og kvantifisering av virusnøytraliserende antistoffer i en vandig prøve som fortrinnsvis et kroppsfluid, og mer spesielt plasma eller partielt renset immunoglobulin. The present invention relates to a method for the detection and quantification of virus neutralizing antibodies in an aqueous sample, preferably a body fluid, and more particularly plasma or partially purified immunoglobulin.
Betegnelsen "perturbert" oligosakkaridenhet som "benyttes i foreliggende beskrivelse, er ment å omfatte en hver modifikasjon som (1) endrer den kjemiske eller fysikalske strukturen av en karbohydratrest som naturlig er tilstede; (2) fjerner, helt eller delvis, en karbohydratrest som naturlig er tilstede; og/eller (3) forhindrer eller endrer addisjonen av en karbohydratrest (dvs. forhindrer eller endrer glykosylering). The term "perturbed" oligosaccharide unit as used herein is intended to include any modification that (1) alters the chemical or physical structure of a naturally occurring carbohydrate residue; (2) removes, in whole or in part, a naturally occurring carbohydrate residue is present; and/or (3) prevents or alters the addition of a carbohydrate residue (ie, prevents or alters glycosylation).
De pertuberte virusene, de virale antigenene og fragmentene derav fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er nyttige for in vitro diagnostiske og prognostiske anvendelser, så vel som for in vivo profylaktiske og terapeutiske anvendelser. The perturbed viruses, viral antigens and fragments thereof prepared according to the present invention are useful for in vitro diagnostic and prognostic applications, as well as for in vivo prophylactic and therapeutic applications.
Viruser er viktige etiologiske midler for en lang rekke sykdommer. I dyr omfatter immunresponsen en av de grunnlegg-ende mekanismene for bekjempelse av virusinfeksjoner. Klassisk sett omfatter immunresponsen to trekk; B-lymfocytt-antistoffresponsen, betegnet som humoral immunitet og en T-lymfocytt-formidlet respons, kjent som celle-formidlet immunitet. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt antistoffresponsen. Viruses are important etiological agents for a wide range of diseases. In animals, the immune response comprises one of the basic mechanisms for combating viral infections. Classically, the immune response comprises two features; the B-lymphocyte antibody response, termed humoral immunity and a T-lymphocyte-mediated response, known as cell-mediated immunity. The present invention relates in particular to the antibody response.
Selv om spesifikt antistoff fra klassene IgG, IgM og IgÅ kan bindes til en hvilken som helst tilgjengelig epitop på et overflateprotein av et virion, er bare de antistoffene som bindes i rimelig høy grad til spesielle epitoper på et spesielt protein i det ytre kapsidet eller omhyllingen i stand til å nøytralisere infektiviteten av virionet. Disse betegnes "nøytraliserende antistoffer". "Nøytralisering" slik betegnelsen benyttes i foreliggende beskrivelse, skal innbefatte ikke bare (1) klassisk virusnøytralisering som oppnås når antistoff bindes til et overflateantigen av et virion som ordinært bindes til en reseptor på overflaten av en tilgjengelig celle og derved forhindrer infeksjon av en tilgjengelig celle eller fører til opsonisering, men også innbefatter (2) interaksjoner så som bindingen av et antistoff til neuraminidase av influensavirus (IF) som resulterer i inhiberingen av frigivelse av etterkommende viruspartikler fra plasmamembranen av infiserte celler og forsinker virus-spredningen, og (3) binding av et antistoff til fusjons-protein (F) av paramyxoviruser som ikke forhindrer initiering av infeksjon, men blokkerer den direkte celle-til-celle-spredningen av nydannede virioner når infeksjonen er eta-blert. Antistoffer rettet mot irrelevante eller utilgjenge-lige epitoper av overflateproteiner, eller mot indre proteiner av virionet, eller virus-kodede ikke-strukturelle proteiner, så som virus-kodede enzymer, kan i visse tilfeller utøve indirekte immunopatologiske effekter, men behøver ikke å spille noen rolle ved eliminering av infeksjonen. Disse er "ikke-nøytraliserende antistoffer". Visse ikke-nøytraliserende antistoffer danner ikke bare skadelige sirkulerende "immunkomplekser", men kan i virkeligheten forhindre tilgjengeligheten av nøytraliserende antistoff og øke infektiviteten av virionet for visse celler. I nærvær av sub-nøytraliserende konsentrasjon av nøytraliserende antistoff eller overskudd av ikke-nøytraliserende antistoffer, opptas viruser så som togaviruser mer effektivt av makrofager (via Fc-reseptorer på makrofagen hvortil virus-antistoffkom-plekset bindes). Viruset formerer seg intracellulært til høy titer inne i makrofagene. Følgelig virker de ikke-nøytrali-serende antistoffene som "forsterkende antistoff". Spesifikke eksempler på slike viruser innbefatter denguevirustyper 1-4. Although specific antibody of the classes IgG, IgM and IgÅ can bind to any available epitope on a surface protein of a virion, only those antibodies that bind to a reasonably high degree to particular epitopes on a particular protein in the outer capsid or envelope able to neutralize the infectivity of the virion. These are termed "neutralizing antibodies". "Neutralization" as the term is used in the present description shall include not only (1) classical virus neutralization which is achieved when antibody binds to a surface antigen of a virion which ordinarily binds to a receptor on the surface of an accessible cell and thereby prevents infection of an accessible cell or leads to opsonization, but also includes (2) interactions such as the binding of an antibody to influenza virus neuraminidase (IF) which results in the inhibition of the release of subsequent virus particles from the plasma membrane of infected cells and delays virus spread, and (3) binding of an antibody to the fusion protein (F) of paramyxoviruses which does not prevent the initiation of infection, but blocks the direct cell-to-cell spread of newly formed virions once the infection is established. Antibodies directed against irrelevant or inaccessible epitopes of surface proteins, or against internal proteins of the virion, or virus-encoded non-structural proteins, such as virus-encoded enzymes, may in certain cases exert indirect immunopathological effects, but need not play any role in eliminating the infection. These are "non-neutralizing antibodies". Certain non-neutralizing antibodies not only form harmful circulating "immune complexes" but may actually prevent the availability of neutralizing antibody and increase the infectivity of the virion to certain cells. In the presence of sub-neutralizing concentration of neutralizing antibody or excess of non-neutralizing antibodies, viruses such as togaviruses are taken up more efficiently by macrophages (via Fc receptors on the macrophage to which the virus-antibody complex binds). The virus multiplies intracellularly to a high titer inside the macrophages. Accordingly, the non-neutralizing antibodies act as "enhancing antibody". Specific examples of such viruses include dengue virus types 1-4.
Som respons på en virusinfeksjon produseres følgelig to meget forskjellige typer antistoffer: nøytraliserende antistoffer og ikke-nøytraliserende antistoffer. Hvert er tilstede i serumet hos infiserte individer eller individer som tidligere har vært eksponert mot et virus eller et viralt antigen i varierende mengder. For å fastslå den sanne immunokompetente statusen for et individ, er det nødvendig å kjenne de absolutte og relative mengdene av både nøytraliserende og ikke-nøytraliserende antistoffer. Likevel skiller konvensjonelle serologiske analyser for antivirale antistoffer ikke, og kan heller ikke skille, disse to typene antistoffer. Konvensjonelle serologiske analyser måler nærværet av begge typer antistoffer. Følgelig finnes det ingen serologisk fremgangsmåte for å måle eller fastslå den sanne immun-statusen eller immunokompetensen for individer. Consequently, in response to a viral infection, two very different types of antibodies are produced: neutralizing antibodies and non-neutralizing antibodies. Each is present in the serum of infected individuals or individuals previously exposed to a virus or viral antigen in varying amounts. To determine the true immunocompetent status of an individual, it is necessary to know the absolute and relative amounts of both neutralizing and non-neutralizing antibodies. Nevertheless, conventional serological assays for antiviral antibodies do not, and cannot, differentiate these two types of antibodies. Conventional serological assays measure the presence of both types of antibodies. Consequently, there is no serological method to measure or determine the true immune status or immunocompetence of individuals.
Den eneste konvensjonelle fremgangsmåten for å fastslå den virusnøytraliserende evnen av serum i individer har vært den virusnøytraliserende analysen^ som f.eks. beskrevet av Krech et al., Z. Immuno., Forsch. Bd. 141 S: 411-29 (1971). Nøytraliseringsanalyser krever: (1) anvendelse av infektiøst virus og (2) cellekulturteknikker. Slike analyser er lang-somme, omstendelige, arbeidsintensive og dyre. Følgelig foreligger et lenge følt behov for en rask, billig nøyaktig fremgangsmåte for å fastslå den immunokompetente statusen for individer. The only conventional method for determining the virus-neutralizing ability of serum in individuals has been the virus-neutralizing assay^ which, e.g. described by Krech et al., Z. Immuno., Forsch. Vol. 141 S: 411-29 (1971). Neutralization assays require: (1) the use of infectious virus and (2) cell culture techniques. Such analyzes are slow, cumbersome, labor-intensive and expensive. Accordingly, there is a long-felt need for a rapid, inexpensive, accurate method of determining the immunocompetent status of individuals.
Eksempler på spesifikke situasjoner hvor et raskt, enkelt forsøk for å fastslå immunokompetensen av et individ er spesielt viktig, innbefatter følgende. For det første medfører eksponering av en svanger kvinne mot et virus, så som rubellavirus eller cytomegolovirus, en betydelig fare for medfødte defekter på fosteret. Ved anvendelse av konvensjonelle serologiske fremgangsmåter, så som ELISA-analyser, kan titeren av alle IgM- og IgG-antistoffer mot det relevante viruset, både nøytraliserende og ikke-nøytraliserende, bestemmes. Dersom det samlede IgM-nivået er forhøyet, hvilket indikerer at responsen skyldes reaksjon av en antatt "naivt" immunsystem, anbefales en terapeutisk abort fordi det er usannsynlig at nøytraliserende antistoffer mot viruset er tilstede. Dersom imidlertid bare det samlede IgG-nivået er forhøyet, vil ingen terapeutisk abort bli anbefalt fordi forsøket ikke kan påvise om IgG'ene som er tilstede er nøytraliserende eller ikke-nøytraliserende antistoffer. Pasienten står overfor et langvarig spenningsfylt svangerskap som kan ende i et barn med medfødte defekter. For det andre vil eksponering av (eller reaktivering av tidligere infeksjon forbundet med immunosuppresjon) organtransplantasjons- eller benmargtransplantasjonspasienter mot viruser så som cytomegalovirus (CMV) utgjøre betydelig fare for kliniske sykdomstilstander innbefattende lungebetennelse, hepatitt, retinitt, encefalititt, osv. Videre vil glomerulopatin indusert av CMV i negativ retning påvirke overlevelsen av nyretransplantater, slik at nyretransplantasjonspasienter kan være utsatt for ytterligere livstruende organavvisning [se generelt, White et al., reds., i "Medical Virology", 3dje utgave, Academic Press, Inc., New York, side 419-426 (1986)]. For det tredje utgjør virusinfeksjoner betydelige, også ofte livstruende farer for pasienter med immunsvikt, innbefattende kreftpasienter som undergår kjemoterapi og de som lider av enten medfødt ervervet immunsvikt, såvel som ervervet immun-sviktsyndrom (AIDS). For det fjerde utgjør visse virusinfeksjoner som er endemiske for spesifikke geografiske områder, betydelige farer, f.eks. for militært eller diplomatisk personell stasjonert i disse områdene. Spesifikke eksempler innbefatter Rift Valley-feber, dengue osv. Vaksine kan beskytte ved aktivt å fremme produksjonen av nøytraliserende antistoffer. Vurdering av den immunokompetente statusen for personell som skal sendes til disse områdene etter vaksi-nering er viktig. Examples of specific situations where a quick, simple test to determine the immunocompetence of an individual is particularly important include the following. First, exposure of a pregnant woman to a virus, such as rubella virus or cytomegalovirus, carries a significant risk of congenital defects in the fetus. Using conventional serological methods, such as ELISA assays, the titer of all IgM and IgG antibodies against the relevant virus, both neutralizing and non-neutralizing, can be determined. If the total IgM level is elevated, indicating that the response is due to the reaction of a presumed "naïve" immune system, a therapeutic abortion is recommended because it is unlikely that neutralizing antibodies against the virus are present. However, if only the total IgG level is elevated, no therapeutic abortion will be recommended because the test cannot detect whether the IgGs present are neutralizing or non-neutralizing antibodies. The patient faces a long, tense pregnancy that may end in a child with congenital defects. Second, exposure of (or reactivation of previous infection associated with immunosuppression) organ transplant or bone marrow transplant patients to viruses such as cytomegalovirus (CMV) will pose a significant risk for clinical disease states including pneumonia, hepatitis, retinitis, encephalitis, etc. Furthermore, the glomerulopathy induced by CMV adversely affects the survival of kidney transplants, so that kidney transplant patients may be at risk of further life-threatening organ rejection [see generally, White et al., eds., in "Medical Virology", 3rd ed., Academic Press, Inc., New York, p 419-426 (1986)]. Third, viral infections pose significant, often life-threatening, dangers to immunocompromised patients, including cancer patients undergoing chemotherapy and those suffering from either congenitally acquired immunodeficiency, as well as acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Fourth, certain viral infections endemic to specific geographical areas pose significant dangers, e.g. for military or diplomatic personnel stationed in these areas. Specific examples include Rift Valley fever, dengue, etc. Vaccine can protect by actively promoting the production of neutralizing antibodies. Assessment of the immunocompetent status of personnel to be sent to these areas after vaccination is important.
I alle de ovenfor nevnte eksemplene er det behov for raske, serologiske fremgangsmåter for å bestemme både nærværet og titeren av virusnøytraliserende antistoffer. Eksempler på prosesser som er nyttige i slike raske, serologiske fremgangsmåter innbefatter, men er ikke begrenset til, enzym-forbundet immunosorbentanalyser (ELISA), radioimmunoanalyser (RIA), immunofluorescense eller andre fluorescense-baserte analyser, agglutineringsanalyser, osv. In all of the above-mentioned examples, rapid serological methods are needed to determine both the presence and the titer of virus-neutralizing antibodies. Examples of procedures useful in such rapid serological methods include, but are not limited to, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIA), immunofluorescence or other fluorescence-based assays, agglutination assays, etc.
Hagenaars et al., J. Virol. Methods 6: 233-39 (1983) beskrev en modifisert inhiberings-ELISA-analyse som viste en viss korrelasjon mellom ELISA-titere og nøytraliseringsanalyse-titere for poliovirus type I. I motsetning til de i det følgende beskrevne analysene var imidlertid den modifiserte inhiberings-ELISA ifølge Hagenaars et al., mer kompleks og omstendelig. Hagenaars et al., J. Virol. Methods 6: 233-39 (1983) described a modified inhibition ELISA assay which showed some correlation between ELISA titers and neutralization assay titers for poliovirus type I. However, in contrast to the assays described below, the modified inhibition ELISA according to Hagenaars et al., more complex and laborious.
Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende oppdagelsen at hele viruser, virale antigener og fragmenter derav, hvori strukturen av en oligosakkaridenhet av et viralt glykoprotein er "perturbert", gjenkjennes mer effektivt av serum, plasma eller immunoglobulinfraksjoner inneholdende nøytraliserende antistoffmolekyler. Slik betegnelsen benyttes i foreliggende beskrivelse skal "perturbert" oligosakkarid og oligosakkarid-"perturberinger" omfatte enhver modifikasjon som (1) endrer den kjemiske eller fysikalske strukturen av en normalt forekommende karbohydratrest; (2) fjerner, helt eller delvis, en naturlig forekommende karbohydratrest; og/eller (3) forhindrer eller endrer addisjonen av en karbohydratrest til et virus, viralt antigen eller fragment derav. En hver teknikk som er kjent innen teknikken for å oppnå slike oligosakkarid-"perturberinger" innbefattende, men ikke begrenset til, gentekniske fremgangsmåter, er ment å falle innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. The present invention is based on the surprising discovery that whole viruses, viral antigens and fragments thereof, in which the structure of an oligosaccharide unit of a viral glycoprotein is "perturbed", are recognized more effectively by serum, plasma or immunoglobulin fractions containing neutralizing antibody molecules. As the term is used in the present description, "perturbed" oligosaccharide and oligosaccharide "perturbations" include any modification that (1) changes the chemical or physical structure of a normally occurring carbohydrate residue; (2) removes, in whole or in part, a naturally occurring carbohydrate residue; and/or (3) prevents or alters the addition of a carbohydrate residue to a virus, viral antigen or fragment thereof. Any technique known in the art to achieve such oligosaccharide "perturbations" including, but not limited to, genetic engineering methods, is intended to fall within the scope of the present invention.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny fremgangsmåte for deteksjon og kvantifisering av virusnøytraliserende antistoffer i en vandig prøve som fortrinnsvis et kroppsfluid og mere spesielt serum, plasma eller partielt renset immunoglobulin, som er kjennetegnet ved at den omfatter: (a) å bringe en ligand som innbefatter et virus, et viralt antigen eller et fragment derav med en perturbert oligosakkariddel, hvori den perturberte oligosakkariddel ble opnådd ved oksydasjon ved hjelp av et middel valgt blant gruppen omfattende periodsyre, salter derav, paraperiodsyre, salter derav, metaperiodsyre, salter derav og oksydaseenzymer, av en ikke-perturbert oligosakkaridenhet, i kontakt med en vandig prøve som mistenkes for å inneholde virusnøytraliserende antistoffer i et analysesystem valgt blant gruppen enzym-bunden immunosorbentanalyse, radioimmunoanalyse, agglutin-er ingsanalyse eller immunofluorescensanalyse; (b) detektering av enhver reaksjon med liganden hvori reaksjonen med liganden indikerer nærværet av nøytraliserende antistoffer i prøven; og eventuelt c) å sammenligne enhver reaksjon mellom ligand og antistoffer med den til en standard. The present invention provides a new method for the detection and quantification of virus neutralizing antibodies in an aqueous sample, preferably a body fluid and more particularly serum, plasma or partially purified immunoglobulin, which is characterized in that it comprises: (a) bringing a ligand comprising a virus, a viral antigen or a fragment thereof with a perturbed oligosaccharide moiety, wherein the perturbed oligosaccharide moiety was obtained by oxidation using an agent selected from the group comprising periodic acid, salts thereof, paraperiodic acid, salts thereof, metaperiodic acid, salts thereof and oxidase enzymes, by a unperturbed oligosaccharide unit, in contact with an aqueous sample suspected of containing virus-neutralizing antibodies in an assay system selected from the group of enzyme-linked immunosorbent assay, radioimmunoassay, agglutination assay, or immunofluorescence assay; (b) detecting any reaction with the ligand wherein the reaction with the ligand indicates the presence of neutralizing antibodies in the sample; and optionally c) comparing any reaction between ligand and antibodies to that of a standard.
Den nye fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har følgende fordeler sammenlignet med konvensjonelle analyser for nøytraliserende antistoffer: (1) krever ikke anvendelse av cellekulturteknikker; (2) krever ikke anvendelse av in-fektiøst virus; (3) omfatter en enkel serologisk analyse; og (4) er fullført på 4 timer eller mindre. Derimot krever konvensjonelle analyser for virusnøytraliserende antistoffer: (1) celler i kultur; (2) infektløst virus; (3) trenet personell; og (4) ca. 5 dager før et svar kan oppnås. Følgelig er foreliggende fremgangsmåte raskere, enklere og mindre kompleks enn konvensjonelle fremgangsmåter. Den krever ikke trenet personell med erfaring i håndtering av infektiøst virusmateriale og er sikrere å bruke fordi selv trenet personell ikke må eksponeres mot infektiøst virus. The new method according to the invention has the following advantages compared to conventional assays for neutralizing antibodies: (1) does not require the use of cell culture techniques; (2) does not require the use of infectious virus; (3) includes a simple serological analysis; and (4) is completed in 4 hours or less. In contrast, conventional assays for virus-neutralizing antibodies require: (1) cells in culture; (2) infectious virus; (3) trained personnel; and (4) approx. 5 days before a response can be obtained. Accordingly, the present method is faster, simpler and less complex than conventional methods. It does not require trained personnel with experience in handling infectious virus material and is safer to use because even trained personnel do not have to be exposed to infectious virus.
Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen innbefatter fremgangsmåten videre trinnet med dissosiering av eventuelle immunkomplekser som kan være tilstede i den vandige prøven før liganden bringes i kontakt med prøven før liganden bringesi kontakt med prøven. According to an embodiment of the invention, the method further includes the step of dissociating any immune complexes that may be present in the aqueous sample before the ligand is brought into contact with the sample before the ligand is brought into contact with the sample.
Foreliggende oppfinnelse vil lettere forstås ved hjelp av den følgende detaljerte beskrivelsen og eksempler på spesifikke utførelser. The present invention will be more easily understood with the help of the following detailed description and examples of specific embodiments.
Den nye fremgangsmåten er basert på anvendelsen av enten hele virus, virale antigener eller fragmenter av virale proteiner hvori "perturbering" av en oligosakkaridenhet gjør viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav, mer effektivt gjenkjennbart av nøytraliserende antistoffer. The new method is based on the use of either whole viruses, viral antigens or fragments of viral proteins in which "perturbation" of an oligosaccharide unit makes the virus, viral antigen or fragment thereof, more efficiently recognized by neutralizing antibodies.
1. Oligosakkaridperturberinger 1. Oligosaccharide perturbations
Ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter oligosakkarid-"perturbering" en hver modifikasjon som "1) endrer den kjemiske eller fysikalske strukturen av en naturlig forekommende karbohydratrest; (2) fjerner, helt eller delvis, en naturlig forekommende karbohydratrest; og/eller (3) forhindrer eller endrer addisjonen av en karbohydratrest til et virus, viralt antigen eller fragment derav. Illustrerende eksempler på oligosakkaridperturberinger innbefatter, men er ikke begrenset til, følgende. According to the present invention, oligosaccharide "perturbation" includes any modification that "1) alters the chemical or physical structure of a naturally occurring carbohydrate residue; (2) removes, in whole or in part, a naturally occurring carbohydrate residue; and/or (3) prevents or alters the addition of a carbohydrate residue to a virus, viral antigen, or fragment thereof Illustrative examples of oligosaccharide perturbations include, but are not limited to, the following.
Hele viruser, virale antigener eller fragmenter derav perturberes ved mild oksydasjon av en oligosakkaridenhet av et viralt glykoprotein. For eksempel kan kjemisk oksydasjon av oligosakkaridenheten oppnås ved anvendelse av en rekke oksyderende midler så som perjodsyre, paraperjodsyre, natriummetaperjodat og kaliummetaperjodat. Oksydasjon ved anvendelse av slike oksyderende midler utføres ved kjente fremgangsmåter. For en generell diskusjon, se Jackson, i "Organic Reactions 2", side 341 (1944); Bunton, i "Oxidation Chemistry", bind 1, Wiberg, red., side 367, Academic Press, New York (1944). Mengden av oksydasjonsmidlet avhenger av typen virus eller viralt antigen, men benyttes generelt i overskudd sammenlignet med mengden av oksyderbart oligosakkarid. Den optimale mengden kan bestemmes ved rutinemessige forsøk. Det optimale området omfatter: pH fra 4 til 8, et temperaturområde fra 0° til 37°C, og en reaksjonsperiode på fra 15 minutter til 12 timer. Under oksydasjonen utelukkes lys fortrinnsvis fra reaksjonsblandingen for å forhindre overoksydasjon. Alternativt oppnås oksydasjon ved anvendelse av et enzym, så som galaktoseoksidase [Cooper et al., J. Biol. Chem. 234: 445-48 (1959)]. Innvirkningen av pH, substratkonsentrasjon, buffere og bufferkonsentrasjon på den enzymatiske oksydasjonen er angitt i Cooper et al., supra. Whole viruses, viral antigens or fragments thereof are perturbed by mild oxidation of an oligosaccharide unit of a viral glycoprotein. For example, chemical oxidation of the oligosaccharide unit can be achieved using a variety of oxidizing agents such as periodic acid, paraperiodic acid, sodium metaperiodate and potassium metaperiodate. Oxidation using such oxidizing agents is carried out by known methods. For a general discussion, see Jackson, in "Organic Reactions 2", page 341 (1944); Bunton, in "Oxidation Chemistry", Volume 1, Wiberg, Ed., page 367, Academic Press, New York (1944). The amount of the oxidizing agent depends on the type of virus or viral antigen, but is generally used in excess compared to the amount of oxidizable oligosaccharide. The optimum amount can be determined by routine experiments. The optimal range includes: pH from 4 to 8, a temperature range from 0° to 37°C, and a reaction period of from 15 minutes to 12 hours. During the oxidation, light is preferably excluded from the reaction mixture to prevent overoxidation. Alternatively, oxidation is achieved using an enzyme, such as galactose oxidase [Cooper et al., J. Biol. Chem. 234: 445-48 (1959)]. The effect of pH, substrate concentration, buffers and buffer concentration on the enzymatic oxidation is indicated in Cooper et al., supra.
Hele viruser, virale antigener eller fragmenter derav perturberes ved kultivering av virusinfiserte celler i nærvær av glykosyleringsinhibitorer. For eksempel kan infiserte celler kultiveres i nærvær av glykosyleringsinhibitorer innbefattende: tunikamycin, streptovirudiner, og/eller glykosidaseinhibitorer så som karbohydratanaloger, f.eks. 2-deoksy-D-glukose og lignende, og kastanospermin, norjirimycin, 1-deoksynorjirimycin, bromocenduritol, 1-deoksymannojirimycin, og swainsonin, osv. Whole viruses, viral antigens or fragments thereof are perturbed by culturing virus-infected cells in the presence of glycosylation inhibitors. For example, infected cells can be cultured in the presence of glycosylation inhibitors including: tunicamycin, streptovirudins, and/or glycosidase inhibitors such as carbohydrate analogs, e.g. 2-deoxy-D-glucose and the like, and castanospermine, norjirimycin, 1-deoxynorjirimycin, bromocenduritol, 1-deoxymannojirimycin, and swainsonine, etc.
Hele viruser, virale antigener eller fragmenter derav perturberes ved enzymatisk fjerning, enten helt eller delvis, av en naturlig forekommende oligosakkaridenhet ved eksponering av enten virusinfiserte celler i kultur eller isolerte viruspartikler eller fragmenter derav mot et enzym som er spesifikt for glykosidrester. Nyttige enzymer innbefatter neuraminidase, endo-p-N-acetylglukosaminidaser og lignende. Whole viruses, viral antigens or fragments thereof are perturbed by enzymatic removal, either in whole or in part, of a naturally occurring oligosaccharide unit by exposure of either virus-infected cells in culture or isolated virus particles or fragments thereof to an enzyme specific for glycosidic residues. Useful enzymes include neuraminidase, endo-β-N-acetylglucosaminidases and the like.
Perturbering av virale antigener ved foreliggende oppfinnelse oppnås også ved anvendelse av genspleisingsteknikker. For eksempel kan et gen som koder et spesielt viralt glykoprotein eller fragment, klones og uttrykkes i en bakteriell organisme. I et slikt tilfelle finner liten eller ingen glykosylering av det uttrykkede virale proteinet sted, dette resulterer i en perturbert oligosakkarid. Alternativt kan et gen som koder det ønskede virale glykoproteinet eller fragmentet klones og uttrykkes i en eukaryotisk organisme eller cellekultur. Den eukaryotiske organismen eller cellen kultiveres deretter i nærvær av en glykosyleringsinhibitor så som tunikamycin eller en glykosidaseinhibitor, så som kastanospermin, morjirimycin og lignende, hvilket resulterer i uttrykking av et protein eller fragment som har et perturbert oligosakkarid. Nok et alternativ er å benytte sete-selektive mutageneseteknikker for å endre et gen som koder et viralt antigen eller fragment på en slik måte at setet (setene) for glykosylering fjernes eller endres. Perturbation of viral antigens in the present invention is also achieved using gene splicing techniques. For example, a gene encoding a particular viral glycoprotein or fragment can be cloned and expressed in a bacterial organism. In such a case, little or no glycosylation of the expressed viral protein takes place, resulting in a perturbed oligosaccharide. Alternatively, a gene encoding the desired viral glycoprotein or fragment can be cloned and expressed in a eukaryotic organism or cell culture. The eukaryotic organism or cell is then cultured in the presence of a glycosylation inhibitor such as tunicamycin or a glycosidase inhibitor such as castanospermine, morjirimycin and the like, resulting in the expression of a protein or fragment having a perturbed oligosaccharide. Yet another alternative is to use site-selective mutagenesis techniques to alter a gene encoding a viral antigen or fragment in such a way that the site(s) of glycosylation is removed or altered.
I tilfeller hvor aminosyresekvensen for et viralt glykoprotein eller fragment er kjent, utgjør kjemiske fremgangsmåter for peptidsyntese nok en fremgangsmåte for fremstilling av et viralt antigen eller fragment derav med et perturbert oligosakkarid. In cases where the amino acid sequence for a viral glycoprotein or fragment is known, chemical methods for peptide synthesis constitute yet another method for producing a viral antigen or fragment thereof with a perturbed oligosaccharide.
Det perturberte oligosakkaridet av viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav kan modifiseres ytterligere, f.eks. ved reduksjon med reduksjonsmidler så som natriumbor-hydrid, cyanoborhydrid eller lignende eller ved kovalent tilknytning til en oppløselig eller uoppløselig bærer eller et understøttelsesmiddel. The perturbed oligosaccharide of the virus, viral antigen or fragment thereof can be further modified, e.g. by reduction with reducing agents such as sodium borohydride, cyanoborohydride or the like or by covalent attachment to a soluble or insoluble carrier or a supporting agent.
2. Anvendelser 2. Applications
Virusene, de virale antigenene og fragmentene derav anvendes fordelaktig for fremgangsmåter som er egnede for en rekke forskjellige anvendelser. The viruses, viral antigens and fragments thereof are advantageously used for methods suitable for a variety of applications.
2.1. Diagnostiske og prognostiske anvendelser Viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav som har en perturbert oligosakkaridenhet kan anvendes i en rekke fremgangsmåter for analysering av en prøve av kroppsfluider så som serum, plasma eller delvis rensede immunoglobulinfraksjoner vedrørende nærværet og titeren av nøytraliserende antistoffer. 2.1. Diagnostic and prognostic applications The virus, the viral antigen or its fragment having a perturbed oligosaccharide unit can be used in a number of methods for analyzing a sample of body fluids such as serum, plasma or partially purified immunoglobulin fractions regarding the presence and titer of neutralizing antibodies.
Virusene, de virale antigenene eller fragmentene derav benyttes som ligander (antigener) for å detektere nærværet av virusnøytraliserende antistoffer i analysesystemer innbefattende, men ikke begrenset til, systemer som: Enzym-forbundet immunosorbentanalyser (ELISA), radioimmunoanalyser (RIA), immunofluorescense eller andre fluorescens-baserte analyser, aglutineringsanalyser, osv. Eksempler på viruser for hvilke nøytraliserende antistofftitere analyseres, innbefatter de som er beskrevet i avsnitt 3. The viruses, the viral antigens or their fragments are used as ligands (antigens) to detect the presence of virus-neutralizing antibodies in analysis systems including, but not limited to, systems such as: Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIA), immunofluorescence or other fluorescence -based assays, agglutination assays, etc. Examples of viruses for which neutralizing antibody titers are assayed include those described in section 3.
Titerne som oppnås ved anvendelse av analyser med konven-sjonelt behandlede viruser, f.eks. konvensjonelle ELISA-analyser, som måler alle antistoffer uavhengig om de er nøytraliserende eller ikke-nøytraliserende, korrelerer ikke med titeren bestemt i konvensjonelle virusnøytraliserende analyser. På den annen side er titerne som oppnås ved anvendelse av foreliggende viruser, virale antigener eller fragmenter derav som har en perturbert oligosakkaridenhet (i det følgende betegnet som et "perturbert antigen") funnet å være signifikant korrelert med titeren av virusnøytrali-serende antistoffer, som bestemt ved konvensjonelle virus-nøytraliserende analyser (se f.eks. eksperimentelle resultater angitt i avsnittene 5-7, infra). Dette kan skyldes en reduksjon i bindingen av ikke-nøytraliserende antistoff. Følgelig er analyser som anvender de foreliggende perturberte antigenene nyttige for diagnostisk og/eller prognostisk forutsigelse av den immuno-kompetente statusen av en pasient med hensyn på et spesielt virus. The titers obtained using assays with conventionally treated viruses, e.g. conventional ELISA assays, which measure all antibodies regardless of whether they are neutralizing or non-neutralizing, do not correlate with the titer determined in conventional virus neutralizing assays. On the other hand, the titers obtained using the present viruses, viral antigens or fragments thereof having a perturbed oligosaccharide unit (hereinafter referred to as a "perturbed antigen") have been found to be significantly correlated with the titer of virus neutralizing antibodies, which determined by conventional virus-neutralizing assays (see, e.g., experimental results set forth in Sections 5-7, infra). This may be due to a reduction in the binding of non-neutralizing antibody. Accordingly, assays using the present perturbed antigens are useful for diagnostic and/or prognostic prediction of the immunocompetent status of a patient with respect to a particular virus.
2.1.1. Dissosiering og reassosiering av immunkomplekser Det antas at i visse tilfeller kan virus eller virusfrag-menter være tilstede i varierende mengder i serum eller plasmaprøver. Disse virusene eller virusfragmentene kan være bundet eller knyttet til nøytraliserende og ikke-nøytraliser-ende antistoffer i immunkomplekser. Følgelig kan titeren som oppnås ved anvendelse av foreliggende perturberte antigener ved in vitro-analyser være kunstig lav (dvs. falskt negativ). Ifølge en utførelse av foreliggende oppfinnelse dissosieres følgelig slike immunkomplekser før de diagnostiske analysene 2.1.1. Dissociation and reassociation of immune complexes It is believed that in certain cases virus or virus fragments may be present in varying amounts in serum or plasma samples. These viruses or virus fragments may be bound or linked to neutralizing and non-neutralizing antibodies in immune complexes. Consequently, the titer obtained using present perturbed antigens in in vitro assays may be artificially low (ie, false negative). Accordingly, according to an embodiment of the present invention, such immune complexes are dissociated before the diagnostic analyses
utføres. Dissosiering av immunkomplekser kan oppnås ved fremgangsmåter som er kjente for fagmannen innbefattende: anvendelse av kaotropiske midler så som perklorat (C1C>4_), tiocyanat (SCN~), osv., denatureringsmidler så som guanidin-hydroklorid, urea, osv., og anvendelse av variasjon av pE, og lignende. Etter dissosiering bringes de frigjorte antistoffene i kontakt med perturberte antigener under be-tingelser som tillater assosiering og reassosiering med nøytraliserende antistoffer. is performed. Dissociation of immune complexes can be achieved by methods known to those skilled in the art including: use of chaotropic agents such as perchlorate (C1C>4_), thiocyanate (SCN~), etc., denaturants such as guanidine hydrochloride, urea, etc., and use of variation of pE, and the like. After dissociation, the released antibodies are brought into contact with perturbed antigens under conditions that allow association and reassociation with neutralizing antibodies.
2.2. Profylaktiske og terapeutiske anvendelser VEd en annen utførelse kan virusene, de virale antigenene eller fragmentene derav, som har en perturbert oligosakkaridenhet, anvendes som immunogener i vaksinepreparater for å stimulere en aktiv immunrespons i en vaksinert vert. 2.2. Prophylactic and therapeutic applications In another embodiment, the viruses, viral antigens or fragments thereof, which have a perturbed oligosaccharide unit, can be used as immunogens in vaccine preparations to stimulate an active immune response in a vaccinated host.
Når et helt virus som har en perturbert oligosakkaridenhet benyttes, er det nødvendig å benytte enten et svekket eller avirulent virus eller et inaktivert virus. Et inaktivert virus oppnås ved behandling av et virus med forskjellige kjemikalier så som formaldehyd; deretter perturberes et oligosakkarid ved anvendelse av en hvilken som helst av fremgangsmåtene beskrevet i avsnitt 1. Alternativt oppnås et inaktivert virus som har en perturbert oligosakkaridenhet ved kjemisk oksydasjon av et virus, f.eks. ved anvendelse av perjodsyre som beskrevet i avsnitt 1. Slike svekkede eller inaktiverte viruser som har en perturbert oligosakkaridenhet bør indusere antistoffer som er mer effektive ved nøytrali-sering av virusinfeksjoner enn konvensjonelle svekkede eller inaktiverte viruser. When a whole virus having a perturbed oligosaccharide unit is used, it is necessary to use either an attenuated or avirulent virus or an inactivated virus. An inactivated virus is obtained by treating a virus with various chemicals such as formaldehyde; then an oligosaccharide is perturbed using any of the methods described in section 1. Alternatively, an inactivated virus having a perturbed oligosaccharide unit is obtained by chemical oxidation of a virus, e.g. using periodic acid as described in section 1. Such attenuated or inactivated viruses having a perturbed oligosaccharide unit should induce antibodies that are more effective in neutralizing viral infections than conventional attenuated or inactivated viruses.
Underenhetsvaksiner inneholdende bare det nødvendige og relevante immunogene materiale så som kapsidglykoproteiner av ikke-omhyllede ikosohedralviruser eller peplomerene (glyko-proteinspissene) av omhyllede viruser eller immunogene fragmenter derav kan også fremstilles hvori oligosakkaridenheten av glykoproteinet eller fragmentet derav er perturbert. Underenhetsvaksiner kan fremstilles ved isolering av den relevante underenheten fra sterkt rensede virale fraksjoner eller ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi og perturbering av oligosakkaridenheten av den relevante immunogene underenheten som beskrevet i avsnitt 1. Subunit vaccines containing only the necessary and relevant immunogenic material such as capsid glycoproteins of non-enveloped icosohedral viruses or the peplomers (glyco-protein tips) of enveloped viruses or immunogenic fragments thereof can also be prepared in which the oligosaccharide unit of the glycoprotein or fragment thereof is perturbed. Subunit vaccines can be prepared by isolating the relevant subunit from highly purified viral fractions or by using recombinant DNA technology and perturbing the oligosaccharide unit of the relevant immunogenic subunit as described in section 1.
Vaksinepreparatene som stimulerer en aktiv immunrespons for profylakse av virusinfeksjoner kan fremstilles ved å blande viruset, det virale antigenet eller fragmentet derav som har en perturbert oligosakkaridenhet i en bærer som er egnet for anvendelse in vivo. For å øke den immunologiske responsen hos verten, kan det immunogene viruset, antigenet eller fragmentet derav settes sammen med et egnet hjelpestoff. Egnede hjelpestoffer innbefatter: aluminiumhydroksyd, overflate-aktive stoffer, lysolecitin, pluroniske polyoler, polyan-ioner, peptider innbefattende muramylpeptider og oljeemul-sjoner. The vaccine preparations which stimulate an active immune response for the prophylaxis of viral infections can be prepared by mixing the virus, the viral antigen or the fragment thereof having a perturbed oligosaccharide unit in a carrier suitable for use in vivo. In order to increase the immunological response in the host, the immunogenic virus, antigen or fragment thereof can be combined with a suitable adjuvant. Suitable excipients include: aluminum hydroxide, surfactants, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides including muramyl peptides and oil emulsions.
Ved en alternativ utførelse fremstilles et vaksinepreparat for å stimulere en aktiv immunrespons for profylakse av virusinfeksjoner ved kobling av et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en pertubert oligosakkaridenhet til et immunogent peptid eller en forbindelse for å øke eller potensiere den immunologiske responsen hos verten. In an alternative embodiment, a vaccine preparation is prepared to stimulate an active immune response for the prophylaxis of viral infections by linking a virus, viral antigen or fragment thereof having a perturbed oligosaccharide unit to an immunogenic peptide or compound to increase or potentiate the immunological response in the host .
Ifølge nok en utførelse kan vaksinepreparatet fremstilles som en multivalent vaksine. For dette formålet kan en blanding av forskjellige viruser, virale antigener eller fragmenter derav, hvorav alle inneholder en perturbert oligosakkaridenhet og som er i stand til å fremkalle en immunrespons mot et annet viralt patogen blandes sammen i et preparat. According to yet another embodiment, the vaccine preparation can be produced as a multivalent vaccine. For this purpose, a mixture of different viruses, viral antigens or fragments thereof, all of which contain a perturbed oligosaccharide unit and which are capable of eliciting an immune response against another viral pathogen can be mixed together in a preparation.
Mange fremgangsmåter kan benyttes for å innføre vaksinepreparatene beskrevet ovenfor i en vert. Disse innbefatter: intradermal, intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs, subkutan, og intranasal administrering. Many methods can be used to introduce the vaccine preparations described above into a host. These include: intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, and intranasal administration.
Virusene, de virale antigenene og fragmentene derav, som har en perturbert oligosakkaridenhet, kan anvendes i en rekke fremgangsmåter for fremstilling av nøytraliserende antistoffer som kan administreres for å gi kortvarig passiv immunitet for profylakse og/eller behandling av virusinfeksjon. I en utgave av denne utførelsen benyttes et virus, et viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet som et immunogen i en hvilken som helst teknikk som muliggjør fremstillingen av antistoffmolekyler ved hjelp av kontinuerlige cellelinjer i kultur. For eksempel kan de foreliggende immunogenene anvendes i hybridomfremgangsmåtene som opprinnelig er utviklet av Kohler og Milstein, og beskrevet av dem i Sei. Amer. 243: 66-74 (1980), så vel som i de humane B-cellehybridomfremgangsmåtene beskrevet av Kozbor et al., Immunology Today .4: 72 (1983) og EBV-hybridomfremgangsmåtene for fremstilling av humane monoklonale antistoffer beskrevet av Cole et al., i "Mono-clonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., side 77-96 (1985) og lignende. De fremstilte monoklonale antistoffene gir en lett tilgjengelig, konsistent kilde for nøytraliserende antistoffer spesifikke for det relevante viruset som kan administreres for passiv immunisering. The viruses, viral antigens and fragments thereof, which have a perturbed oligosaccharide unit, can be used in a variety of methods for the production of neutralizing antibodies that can be administered to provide short-term passive immunity for the prophylaxis and/or treatment of viral infection. In one version of this embodiment, a virus, a viral antigen or fragment thereof having a perturbed oligosaccharide unit is used as an immunogen in any technique that enables the production of antibody molecules using continuous cell lines in culture. For example, the present immunogens can be used in the hybridoma procedures originally developed by Kohler and Milstein, and described by them in Sei. Amer. 243: 66-74 (1980), as well as in the human B cell hybridoma methods described by Kozbor et al., Immunology Today .4: 72 (1983) and the EBV hybridoma methods for the production of human monoclonal antibodies described by Cole et al. , in "Mono-clonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985) and the like. The monoclonal antibodies produced provide a readily available, consistent source of neutralizing antibodies specific for the relevant virus that can be administered for passive immunization.
Denne utførelsen omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat for administrering til et dyr eller et menneske for å gi kortvarig passiv immunitet eller for profylakse eller behandling av en virusindusert infeksjon innbefattende: høsting av monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av en hybridomcellelinje dannet ved å smelte sammen en myelom- eller hybridom-celle og en celle som er i stand til å produsere antistoff mot et virus, et viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet. Den omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat for administrering til et dyr eller et menneske for å gi kortvarig passiv immunitet eller for profylakse eller behandling av en virusindusert infeksjon innbefattende: høsting av monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av en lymfocyttcellelinje dannet ved transformasjon ved hjelp av et EBV-virus av en pattedyrlymfocyttcelle som er i stand til å produsere antistoff mot et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet. I tillegg omfatter den en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat for administrering til et dyr eller menneske for å gi kortvarig passiv immunitet eller for profylakse eller behandling av en virusindusert infeksjon innbefattende: (a) en prøve inneholdende antivirale antistoffer bringes i kontakt med et antigen innbefattende et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet slik at det dannes et antistoff -ant igenkompleks ; (b) separering av antistoff-antigen-komplekset fra prøven; og (c) dissosiering av antistoff-antigenkomplekset slik at det oppnås et renset antiviralt antistoffpreparat. This embodiment comprises a method of preparing a composition for administration to an animal or human to provide short-term passive immunity or for the prophylaxis or treatment of a virus-induced infection comprising: harvesting monoclonal antibodies produced using a hybridoma cell line formed by fusing a myeloma or hybridoma cell and a cell capable of producing antibody against a virus, viral antigen or fragment thereof having a perturbed oligosaccharide unit. It further comprises a method of preparing a composition for administration to an animal or human to provide short-term passive immunity or for the prophylaxis or treatment of a virus-induced infection comprising: harvesting monoclonal antibodies produced using a lymphocyte cell line formed by transformation using of an EBV virus by a mammalian lymphocyte cell capable of producing antibody against a virus, viral antigen or fragment thereof having a perturbed oligosaccharide unit. In addition, it comprises a method of preparing a composition for administration to an animal or human to provide short-term passive immunity or for the prophylaxis or treatment of a virus-induced infection comprising: (a) a sample containing antiviral antibodies is brought into contact with an antigen comprising a virus, viral antigen or fragment thereof which has a perturbed oligosaccharide unit so that an antibody-antigen complex is formed; (b) separating the antibody-antigen complex from the sample; and (c) dissociating the antibody-antigen complex to obtain a purified antiviral antibody preparation.
I en annen utgave av denne utførelsen anvendes et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet i en kartleggingsanalyse for å identifi-sere de viralspesifikke monoklonale antistoffene som, selv om de er kjente innen teknikken, ikke er gjenkjent som nøytrali-serende antistoffer. Følgelig kartlegger og identifiserer denne fremgangsmåten nøytraliserende monoklonale antistoffer som deretter kan administreres for passiv immunisering. In another version of this embodiment, a virus, viral antigen or fragment thereof having a perturbed oligosaccharide unit is used in a mapping assay to identify the viral-specific monoclonal antibodies which, although known in the art, are not recognized as neutralizing antibodies. Accordingly, this method maps and identifies neutralizing monoclonal antibodies that can then be administered for passive immunization.
I nok en alternativ utgave av denne utførelsen benyttes et virus, viralt antigen eller fragment derav for å fremstille nøytraliserende antistoffer fra serum, plasma eller fraksjoner av immunoglubuliner avledet fra disse. For eksempel immobiliseres et virus, viralt antigen eller fragment derav som har en perturbert oligosakkaridenhet og benyttes i en preparativ affinitetskromatografiutførelse for å isolere relevante nøytraliserende antistoffer fra serum eller plasma ved dannelsen av immunkomplekser. De polyklonale nøytrali-serende antistoffene separeres deretter fra immunkompleksene ved konvensjonelle teknikker. In yet another alternative version of this embodiment, a virus, viral antigen or fragment thereof is used to produce neutralizing antibodies from serum, plasma or fractions of immunoglobulins derived from these. For example, a virus, viral antigen or fragment thereof that has a perturbed oligosaccharide unit is immobilized and used in a preparative affinity chromatography procedure to isolate relevant neutralizing antibodies from serum or plasma during the formation of immune complexes. The polyclonal neutralizing antibodies are then separated from the immune complexes by conventional techniques.
De nøytraliserende antistoffene som reagerer spesifikt med preparatene inneholdende en perturbert oligosakkaridenhet kan formuleres slik at det gir kortvarig passiv immunitet til verten. Hjelpestoffer er ikke påkrevet i denne typen preparat fordi formålet ikke er å stimulere en immunrespons, men heller å inaktivere eller binde et viralt patogen. Følgelig kan en hvilken som helst egnet farmasøytisk bærer benyttes. Passiv immunisering ved anvendelse av slike preparater kan anvendes på en nødsbasis for øyeblikkelig beskyttelse av uimmuniserte individer som utsettes for spesielle farer for virusinfeksjoner. I tillegg kan slike preparater benyttes profylaktisk for virusinfeksjoner så som meslinger og hepatitt. The neutralizing antibodies that react specifically with the preparations containing a perturbed oligosaccharide unit can be formulated so as to provide short-term passive immunity to the host. Excipients are not required in this type of preparation because the purpose is not to stimulate an immune response, but rather to inactivate or bind a viral pathogen. Accordingly, any suitable pharmaceutical carrier may be used. Passive immunization using such preparations can be used on an emergency basis for the immediate protection of unimmunized individuals who are exposed to particular dangers of viral infections. In addition, such preparations can be used prophylactically for viral infections such as measles and hepatitis.
3. Viruser og virale antigener 3. Viruses and viral antigens
Virusene, de virale antigenene og fragmentene derav som her omtales innbefatter en lang rekke viruser så som DNA- og RNA-viruser innbefattende, men ikke begrenset til, retroviruser. The viruses, viral antigens and fragments thereof referred to herein include a wide variety of viruses such as DNA and RNA viruses including, but not limited to, retroviruses.
Spesifikke eksempler innbefatter: DNA-viruser så som: Adenoviridae så som adenovirusundergrupper B, C, D, E, F og G, osv.; Herpesviridae så som herpes simplex I og II, cytomegalovirus, Epstein-Bass-virus, varicella-zoster, osv.; Orthomyxoviridae så som influensaviruser, osv.; Hepadna-viridae så som hepatitt B, hepatitt ikke-A, ikke-B, osv.; Parvoviridae så som parvoviruser, osv.; RNA-viruser så som Togaviridae så som rubella, osv.; Paramyxoviridae så som meslinger, parainfluensa, respiratorisk syncytialt virus, osv.; Flaviviridae så som dengue-virus typer 1-4, gulfeber-virus, blodmidd-borende feberviruser, osv.; Rhabdoviridae så som rabies, vesikulær stomatitisvirus, Marburg-Ebolavirus, osv.; Bunyaviridae så som Rift Valley-feber, California Encefalitt-virusgruppe, sandfluefebervirus, osv.; Arena-viridae så som Lassa-febervirus, Jinin-virus, lymfocytisk koriomeningittvirus, osv.; Reoviridae så som rotovirus, osv.; Picornaviridae så som poliovirus, coxsackieviruser, hepatitt A-virus, rhinovirus, osv.; Retroviridae så som humant lymfadenopati-tilknyttet virus (LAV, HIV, HTLV-III), humane T-cellelymfotropfiske virustyper I, II, III, katteleukemi-virus, osv. Specific examples include: DNA viruses such as: Adenoviridae such as adenovirus subgroups B, C, D, E, F and G, etc.; Herpesviridae such as herpes simplex I and II, cytomegalovirus, Epstein-Bass virus, varicella-zoster, etc.; Orthomyxoviridae such as influenza viruses, etc.; Hepadna viridae such as hepatitis B, hepatitis non-A, non-B, etc.; Parvoviridae such as parvoviruses, etc.; RNA viruses such as Togaviridae such as rubella, etc.; Paramyxoviridae such as measles, parainfluenza, respiratory syncytial virus, etc.; Flaviviridae such as dengue virus types 1-4, yellow fever virus, blood mite-boring fever viruses, etc.; Rhabdoviridae such as rabies, vesicular stomatitis virus, Marburg-Ebola virus, etc.; Bunyaviridae such as Rift Valley fever, California Encephalitis virus group, Sandfly fever virus, etc.; Arena viridae such as Lassa fever virus, Jinin virus, lymphocytic choriomeningitis virus, etc.; Reoviridae such as rotovirus, etc.; Picornaviridae such as poliovirus, coxsackievirus, hepatitis A virus, rhinovirus, etc.; Retroviridae such as human lymphadenopathy-associated virus (LAV, HIV, HTLV-III), human T-cell lymphotropic virus types I, II, III, feline leukemia virus, etc.
De følgende eksemplene er gitt for å illustrere foreliggende oppfinnelse. The following examples are given to illustrate the present invention.
I ELISA-analysene beskrevet nedenfor hvori viruset ble kovalent tilknyttet til mikrotiterplaten, var mikrotiter-platene formettet ved anvendelse av enten 200 pl av 0,5$ kalve-IgG i 0,14 M NaCl eller 300 pl av 0,5$ bovint serumalbumin i 0,5 M tris-citratbuffer inneholdende 0,1$ "Tween-20", pH 8,1, for å eliminere den ikke-spesifikke adsorpsjonen av virus eller serumproteiner eller IgG. I ELISA-analysene beskrevet nedenfor hvori viruset var tilknyttet til platen ved hjelp av adsorpsjon, fikk viruset adsorberes til platen og deretter ble platene mettet ved anvendelse av enten kalve-IgG i 0,14 M NaCl eller bovint serumalbumin i 0,5 M tris-citratbuf f er . In the ELISA assays described below in which the virus was covalently attached to the microtiter plate, the microtiter plates were presaturated using either 200 µl of 0.5% calf IgG in 0.14 M NaCl or 300 µl of 0.5% bovine serum albumin in 0.5 M tris-citrate buffer containing 0.1% "Tween-20", pH 8.1, to eliminate the non-specific adsorption of viruses or serum proteins or IgG. In the ELISA assays described below in which the virus was attached to the plate by adsorption, the virus was allowed to adsorb to the plate and then the plates were saturated using either calf IgG in 0.14 M NaCl or bovine serum albumin in 0.5 M tris- citrate buf f is .
5. Eksempler: Bestemmelse av nøytraliserende antistoffer i renset humant IgG fra sera 5. Examples: Determination of neutralizing antibodies in purified human IgG from sera
5.1. Deteks. ion av nøytraliserende anti- CMV- antistoffer i 5.1. Detection. ion of neutralizing anti-CMV antibodies i
humant IgG human IgG
Den følgende serien av forsøk demonstrerer at ELISA-analyser hvori oligosakkaridenheten av det virale antigenet var perturbert er nyttige for bestemmelse av titeren av virus-nøytraliserende antistoffer. Derimot var konvensjonelle ELISA-analyser hvori viruset enten var adsorbert eller kovalent tilknyttet uten perturbering av oligosakkaridenheten ikke nyttige for dette formålet. The following series of experiments demonstrate that ELISA assays in which the oligosaccharide unit of the viral antigen has been perturbed are useful for determining the titer of virus-neutralizing antibodies. In contrast, conventional ELISA assays in which the virus was either adsorbed or covalently attached without perturbation of the oligosaccharide unit were not useful for this purpose.
Antigenet som ble benyttet i analysene var helt cytomegalovirus CMV) oppnådd fra homogenater av kultiverte humane fibroblastceller (MRC5) infisert med CMV i seks til åtte dager. Mikrotiterbrønnene inneholdende en ekvivalent mengde The antigen used in the assays was whole cytomegalovirus (CMV) obtained from homogenates of cultured human fibroblast cells (MRC5) infected with CMV for six to eight days. The microtiter wells containing an equivalent amount
(ca. 1 pg/brønn) av CMV ble fremstilt for de forskjellige ELISA-analysene på følgende måte: (A) ELISA'er ved anvendelse av antigen med perturbert oligosakkarid. (1) Virus kovalent tilknyttet via oksydert oligosakkarid enhet: Karbohydratenheten av CMV ble oksydert ved anvendelse av natriumperjodat (NalC^) som beskrevet ovenfor og kovalent koblet til et reaktivt amin på en sidekjede av polyhydrazidostyrenet av brønnen. Addisjon av en reaktiv amingruppe til polystyren (eller mikrotiterbrønnen) ble utført ved fremgangsmåten ifølge Chin og Lanks [Anal. Biochem, 83: 709-19 (approx. 1 pg/well) of CMV was prepared for the various ELISA assays as follows: (A) ELISAs using perturbed oligosaccharide antigen. (1) Virus covalently attached via oxidized oligosaccharide unit: The carbohydrate unit of CMV was oxidized using sodium periodate (NalC^) as described above and covalently linked to a reactive amine on a side chain of the polyhydrazidostyrene of the well. Addition of a reactive amine group to the polystyrene (or the microtiter well) was carried out by the method of Chin and Lanks [Anal. Biochem, 83: 709-19
(1977)]. Polystyren ble først omvandlet til nitrostyren som deretter ble redusert til aminostyren. Polyaminostyren ble deretter omvandlet til polyhydrazidostyren i en to-trinns-prosess: (1) polyaminostyren ble succinylert; og deretter (2) ble en amidbinding dannet mellom hydrazin og det succinylerte polyaminostyrenet ved anvendelse av karbodiimid. (Ox. oligosakkaridtilknyttet ELISA.) (2) Virus kovalent tilknyttet via amingruppe, oksydert oligosakkaridenhet: CMV-viruset ble kovalent tilknyttet til polykarbostyrenet via en peptidbinding dannet ved anvendelse av karbodiimid for å koble en aminrest av viruset til en aktivert karboksyl av polykarbostyrenet. Karbohydratenheten av viruset ble deretter oksydert in situ ved en anvendelse av NaI04 som beskrevet ovenfor. (Amintilknyttet oligosakkarid Ox. ELISA.). (B) Konvensjonelle ELISA'er ved anvendelse av antigen med ikke-perturbert oligosakkarid. (1977)]. Polystyrene was first converted to nitrostyrene which was then reduced to aminostyrene. The polyaminostyrene was then converted to polyhydrazidostyrene in a two-step process: (1) the polyaminostyrene was succinylated; and then (2) an amide bond was formed between hydrazine and the succinylated polyaminostyrene using carbodiimide. (Ox. oligosaccharide-linked ELISA.) (2) Virus covalently attached via amine group, oxidized oligosaccharide unit: The CMV virus was covalently attached to the polycarbostyrene via a peptide bond formed by using carbodiimide to link an amine residue of the virus to an activated carboxyl of the polycarbostyrene. The carbohydrate unit of the virus was then oxidized in situ using NaI04 as described above. (Amine linked oligosaccharide Ox. ELISA.). (B) Conventional ELISAs using unperturbed oligosaccharide antigen.
(l) Virus kovalent tilknyttet via amingruppe: (l) Virus covalently attached via amine group:
CMV ble tilknyttet ved anvendelse av karbodiimid for dannelse av en peptidbinding mellom en amingruppe av en aminosyrerest av viruset og en fri karboksylgruppe av en polykarbostyren av brønnen (amintilknyttet ELISA). CMV was linked using carbodiimide to form a peptide bond between an amine group of an amino acid residue of the virus and a free carboxyl group of a polycarbostyrene of the well (amine linked ELISA).
(2) Virus ikke-kovalent tilknyttet: (2) Viruses non-covalently attached:
CMV ble enkelt ikke-kovalent fiksert ved adsorpsjon på en ikke-modifisert polystyrenbrønn (adsorpsjon ELISA). CMV was simply non-covalently fixed by adsorption onto an unmodified polystyrene well (adsorption ELISA).
Delvis renset humant IgG ble oppnådd fra humane serumprøver ved anvendelse av konvensjonelle ammoniumsulfatutfellings-teknikker. Etter utfelling ble rørene sentrifugert ved 12 000 opm i 5 minutter. Supernatanten ble avhelt, pelleten ble vasket, resentrifugert og resuspendert i 0,14 M NaCl. De delvis rensede humane IgG-prøvene ble serievis fortynnet i buffer I av følgende sammensetning: Partially purified human IgG was obtained from human serum samples using conventional ammonium sulfate precipitation techniques. After precipitation, the tubes were centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was decanted, the pellet was washed, recentrifuged and resuspended in 0.14 M NaCl. The partially purified human IgG samples were serially diluted in buffer I of the following composition:
innstilt på pE 8,1 med 1,0 M HC1. 100 pl av hver fortynning ble fordelt i brønnene av platen inneholdende CMV. Etter 2 timers inkubering ved 37 "C ble platene vasket i buffer I, men uten kalve-IgG. adjusted to pE 8.1 with 1.0 M HCl. 100 µl of each dilution was dispensed into the wells of the plate containing CMV. After 2 hours of incubation at 37°C, the plates were washed in buffer I, but without calf IgG.
Deretter ble 100 pl av en geiteserumoppløsning inneholdende anti-humant IgG merket med alkalisk fosfatase, fortynnet til 1/1000 i den følgende buffer II, innført i hver brønn: Then 100 µl of a goat serum solution containing anti-human IgG labeled with alkaline phosphatase, diluted to 1/1000 in the following buffer II, was introduced into each well:
Etter en kontakttid på en time ved 37°C ble brønnene vasket med buffer II, men uten bovinserumalbumin (BSA). Den enzymatiske aktiviteten ble bestemt ved 37°C ved anvendelse av p-nitrofenylfosfat som substrat ved en konsentrasjon på 0, 2% After a contact time of one hour at 37°C, the wells were washed with buffer II, but without bovine serum albumin (BSA). The enzymatic activity was determined at 37°C using p-nitrophenyl phosphate as substrate at a concentration of 0.2%
(p/v) oppløst i en buffer inneholdende: 2-amino-2-metyl-l-propanol (0,625 M) og MgCl2 (2,0 mM), pH 10,25. Den optiske tettheten ble målt ved 405 nM hvert femte minutt i løpet av et tidsrom på 30 minutter eller etter 30 minutters inkubering. (p/v) dissolved in a buffer containing: 2-amino-2-methyl-1-propanol (0.625 M) and MgCl2 (2.0 mM), pH 10.25. The optical density was measured at 405 nM every five minutes over a period of 30 minutes or after 30 minutes of incubation.
En konvensjonell CMV infeksjonskraft-nøytraliseringsanalyse ble utført ved anvendelse av MRCs-celler i kultur som beskrevet av Krech et al., Z. Immun.-Forsch, Bd. 141S: 411-29 A conventional CMV infectivity neutralization assay was performed using MRCs cells in culture as described by Krech et al., Z. Immun.-Forsch, Bd. 141S: 411-29
(1971). (1971).
Resultatene er illustrert i tabell 1. Antistofftiteren oppnådd ved anvendelse av ELISA-analysene og de konvensjonelle virusnøytraliseringsanalysene ble beregnet som en proteinkonsentrasjon på 1 mg/ml av ikke-fortynnet IgG-prøve. Tabell 2 angir de lineære korrelasjonskoeffisientene oppnådd når titerne oppnådd ved de forskjellige analysene ble sammenlignet. Som demonstrert i tabellene 1 og 2, var titeren oppnådd ved anvendelse av ELISA-analyser ifølge foreliggende oppfinnelse, dvs. oks. oligosakkaridtilknyttet ELISA og amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA, sterkt positivt korrelert med titeren oppnådd ved anvendelse av den konvensjonelle nøytral-iseringsnalysen (korrelasjonskoeffisienter, henholdsvis: 0,90 og 0,87). På den annen side viste titeren oppnådd ved anvendelse av den konvensjonelle amintilknyttede ELISA ingen signifikant korrelasjon med titeren for nøytraliserende antistoff (korrelasjonskoeffisient: 0,52). Amintilknyttet ELISA viste mye svakere, ikke-signifikant korrelasjon med titer for nøytraliserende antistoff (korrelasjonskoeffisient: 0,74).. The results are illustrated in Table 1. The antibody titer obtained using the ELISA assays and the conventional virus neutralization assays was calculated as a protein concentration of 1 mg/ml of undiluted IgG sample. Table 2 indicates the linear correlation coefficients obtained when the titers obtained by the different assays were compared. As demonstrated in Tables 1 and 2, the titer obtained using ELISA assays according to the present invention, i.e. approx. oligosaccharide-linked ELISA and amine-linked oligosaccharide ox. ELISA, strongly positively correlated with the titer obtained using the conventional neutralization assay (correlation coefficients, respectively: 0.90 and 0.87). On the other hand, the titer obtained using the conventional amine-linked ELISA showed no significant correlation with the neutralizing antibody titer (correlation coefficient: 0.52). Amine-linked ELISA showed much weaker, non-significant correlation with neutralizing antibody titer (correlation coefficient: 0.74).
Tabell 2 demonsterer videre at det var en signifikant positiv korrelasjon mellom titeren oppnådd ved anvendelse av oks. oligosakkarid tilknyttet ELISA og amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA (korrelasjonskoeffisient: 0,93). Samtidig ble imidlertid ingen signifikant korrelasjon observert mellom titerne oppnådd ved anvendelse av absorpsjons-ELISA og amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA, eller amintilknyttet oligosakkarid oks. ELISA og amintilknyttet ELISA. Dette indikerer at den signifikante korrelasjonen som ble observert mellom titerne for nøytraliserende antistoff ved anvendelse av nøytraliseringsanalysen og både den amintilknyttede oligosakkarid oks. ELISA og oks. oligosakkarid tilknyttet ELISA ikke er relatert til fremgangsmåten for kovalent tilknytning, men derimot kan være relatert til perturberingen av oligosakkaridenheten oppnådd ved oksydasjon. Videre antyder disse resultatene at det ikke spiller noen rolle om oligosakkaridperturberingen finner sted før eller etter kovalent tilknytning av viruset til mikrotiterbrønnen. Table 2 further demonstrates that there was a significant positive correlation between the titer obtained when using ox. oligosaccharide associated with ELISA and amine-linked oligosaccharide ox. ELISA (correlation coefficient: 0.93). At the same time, however, no significant correlation was observed between the titers obtained using absorption ELISA and amine-linked oligosaccharide ox. ELISA, or amine-linked oligosaccharide ox. ELISA and amine-linked ELISA. This indicates that the significant correlation observed between the neutralizing antibody titers using the neutralization assay and both the amine-linked oligosaccharide ox. ELISA and ox. oligosaccharide associated with ELISA is not related to the method of covalent attachment, but on the other hand may be related to the perturbation of the oligosaccharide unit obtained by oxidation. Furthermore, these results suggest that it does not matter whether the oligosaccharide perturbation takes place before or after covalent attachment of the virus to the microtiter well.
5.2. Reproduserbarhet for nøytraliserende antistofftiter Det følgende forsøket demonstrerer reproduserbarheten av resultater oppnådd ved anvendelse av en ELISA-analyse hvori 5.2. Reproducibility of Neutralizing Antibody Titers The following experiment demonstrates the reproducibility of results obtained using an ELISA assay in which
viruset var kovalent tilknyttet til en uoppløselig bærer via en oksydert karbohydratenhet av viruset. the virus was covalently attached to an insoluble carrier via an oxidized carbohydrate unit of the virus.
En serie ELISA-analyser for å bestemme titeren av nøytrali-serende anti-CMV antistoffer ble utført som beskrevet i avsnitt 5.1 hvori CMV ble kovalent tilknyttet til et reaktivt amin på en sidekjede av en uoppløselig bærer via en oksydert karbohydratenhet av CMV-antigenet. De benyttede prøvene var renset IgG oppnådd fra de samme serumprøvene som ble benyttet for forsøkene beskrevet i avsnitt 5.1. En serie ELISA'er ble utført på en porsjon av rensede IgG'er, og en duplikatserie analyser ble utført på en annen porsjon av de samme IgG'ene ca. 17,5 måneder senere. Prøvene ble lagret nedfrosset ved A series of ELISA assays to determine the titer of neutralizing anti-CMV antibodies was performed as described in section 5.1 in which CMV was covalently attached to a reactive amine on a side chain of an insoluble carrier via an oxidized carbohydrate unit of the CMV antigen. The samples used were purified IgG obtained from the same serum samples that were used for the experiments described in section 5.1. A series of ELISAs was performed on one portion of purified IgGs, and a duplicate series of analyzes was performed on another portion of the same IgGs approx. 17.5 months later. The samples were stored frozen at
-70°C i mellomtiden. Resultatene er gjengitt i tabell 3. -70°C in the meantime. The results are reproduced in table 3.
Som demonstrert i tabell 3 er resultatene for antistofftitere, oppnådd ved anvendelse av ELISA-analysen hvori viruset var kovalent tilknyttet via en perturbert oligosakkaridenhet, meget reproduserbare. As demonstrated in Table 3, the results for antibody titers obtained using the ELISA assay in which the virus was covalently attached via a perturbed oligosaccharide unit are highly reproducible.
6. Eksempel: Deteksjon av nøytraliserende antistoffer i 6. Example: Detection of neutralizing antibodies i
serumprøver serum samples
Følgende serie av analyser demonstrerer at en ELISA-analyse hvori oligosakkaridenheten av et virusantigen var perturbert er nyttig for bestemmelse av titeren av nøytraliserende antistoff i humane serumprøver. The following series of assays demonstrates that an ELISA assay in which the oligosaccharide unit of a viral antigen has been perturbed is useful for determining the titer of neutralizing antibody in human serum samples.
En ELISA-analyse ble utført som beskrevet i avsnitt 5.1 hvori oligosakkaridenheten av CMV-viruset var oksydert og kovalent koblet til en hydrazidogruppe på polyhydrazidostyrenet av mikrotiterbrønnen. En konvensjonell ELISA-analyse ble utført som beskrevet i avsnitt 5.1 hvori CMV bare var adsorbert til mikrotiterbrønnen. En virusnøytraliseringsanalyse som beskrevet i avsnitt 5.1 ble også utført. An ELISA analysis was performed as described in section 5.1 in which the oligosaccharide unit of the CMV virus was oxidized and covalently linked to a hydrazido group on the polyhydrazidostyrene of the microtiter well. A conventional ELISA assay was performed as described in section 5.1 in which CMV was only adsorbed to the microtiter well. A virus neutralization assay as described in section 5.1 was also performed.
Resultatene fra alle tre analyser er sammenlignet i tabell 4. The results from all three analyzes are compared in table 4.
Som demonstrert i tabell 4 var det en sterkt signifikant positiv korrelasjon mellom titeren for antistoffer i humane serumprøver målt ved hjelp av nøytraliseringsanalysen og ved hjelp av en ELISA-analyse hvori oligosakkaridenheten av CMV var oksydert og kovalent koblet til mikrotiterbrønnen. Ved anvendelse av polyklonale sera, er følgelig denne ELISA-analysen "forutsigende" for den immunokompetente statusen for pasienten. Derimot ble ingen korrelasjon observert mellom antistofftiteren målt ved hjelp av nøytraliseringsanalysen og den som ble oppnådd ved anvendelse av konvensjonell ELISA hvori ikke-perturbert CMV-virus bare var adsorbert på mikrotiterbrønnen. As demonstrated in Table 4, there was a highly significant positive correlation between the titer of antibodies in human serum samples measured by the neutralization assay and by an ELISA assay in which the oligosaccharide unit of CMV was oxidized and covalently linked to the microtiter well. Accordingly, when using polyclonal sera, this ELISA assay is "predictive" of the immunocompetent status of the patient. In contrast, no correlation was observed between the antibody titer measured by the neutralization assay and that obtained using conventional ELISA in which unperturbed CMV virus was only adsorbed on the microtiter well.
7. Eksempel: Perturbering av oligosakkaridenhet av virus og 7. Example: Perturbation of the oligosaccharide unit by viruses and
tilknytning av virus til en fast bærer attachment of virus to a fixed carrier
Som antydet av resultatene gjengitt i avsnitt 5.1 ovenfor spiller det, når et perturbert antigen benyttes for å bestemme titeren av nøytraliserende antistoffer i en ELISA-fremgangsmåte hvori antigenet er kovalent tilknyttet til mikrotiterbrønnen, ingen rolle om oligosakkaridenheten perturberes før eller etter kovalent tilknytning til mikro-titerbrønnen. Den følgende serien av forsøk ble utført for å undersøke virkningen av perturbering av oligosakkaridenheten på evnen av viruset til å tilknyttes til en mikrotiterplate. As indicated by the results reproduced in section 5.1 above, when a perturbed antigen is used to determine the titer of neutralizing antibodies in an ELISA method in which the antigen is covalently attached to the microtiter well, it does not matter whether the oligosaccharide unit is perturbed before or after covalent attachment to the micro- the titer well. The following series of experiments were performed to examine the effect of perturbing the oligosaccharide unit on the ability of the virus to attach to a microtiter plate.
Oligosakkaridenheten av CMV-virus ble perturbert ved oksydasjon ved anvendelse av NaI04 i 16 timer ved 4°C som beskrevet i avsnitt 4. ELISA-analyser for anti-CMV-antistoffer ble gjennomført som beskrevet i avsnitt 5.1, hvori: (1) CMV som har en perturbert oligosakkaridenhet i PBS ble adsorbert til en polystyrenmikrotiterplate. (2) CMV som har en perturbert oligosakkaridenhet ble kovalent koblet via karbohydratenheten til en reaktiv amingruppe av en polyhydrazidostyrenmikro-titerplate i nærvær av fosfatbuffer inneholdende 0, 1% "Tween-20" (PBT). PBT ble benyttet for å forhindre ikke-kovalent adsorpsjon av CMV til polyhydrazidostyrenplaten. (3) Ikke-perturbert CMV i PBS ble adsorbert til en polystyrenmikrotiterplate. The oligosaccharide unit of CMV virus was perturbed by oxidation using NaI04 for 16 hours at 4°C as described in Section 4. ELISA assays for anti-CMV antibodies were conducted as described in Section 5.1, in which: (1) CMV as has a perturbed oligosaccharide unit in PBS was adsorbed to a polystyrene microtiter plate. (2) CMV having a perturbed oligosaccharide unit was covalently linked via the carbohydrate unit to a reactive amine group of a polyhydrazidostyrene microtiter plate in the presence of phosphate buffer containing 0.1% "Tween-20" (PBT). PBT was used to prevent non-covalent adsorption of CMV to the polyhydrazidostyrene plate. (3) Unperturbed CMV in PBS was adsorbed to a polystyrene microtiter plate.
Resultatene er angitt i tabell 5. The results are shown in table 5.
Som demonstrert i tabell 5 var det ingen forskjell i ELISA-titere oppnådd hvori et perturbert antigen enten var kovalent tilknyttet eller bare adsorbert til mikrotiterbrønnen. Når det perturberte CMV ble inkubert i mikrotiterbrønnene i nærvær av PBT, var titeren som ble oppnådd 0 fordi det perturberte viruset ikke adsorberes i nærvær av "Tween-20" As demonstrated in Table 5, there was no difference in ELISA titers obtained in which a perturbed antigen was either covalently attached or simply adsorbed to the microtiter well. When the perturbed CMV was incubated in the microtiter wells in the presence of PBT, the titer obtained was 0 because the perturbed virus does not adsorb in the presence of "Tween-20"
(resultater ikke vist). (results not shown).
Claims (2)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8517377A FR2590674B1 (en) | 1985-11-25 | 1985-11-25 | NEW DIAGNOSTIC REAGENTS |
| US93863186A | 1986-11-18 | 1986-11-18 | |
| PCT/US1986/002524 WO1987003206A1 (en) | 1985-11-25 | 1986-11-21 | Modified viral glycoproteins, diagnostic and therapeutic uses therefore |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO873102D0 NO873102D0 (en) | 1987-07-23 |
| NO873102L NO873102L (en) | 1987-07-23 |
| NO171476B true NO171476B (en) | 1992-12-07 |
| NO171476C NO171476C (en) | 1993-03-17 |
Family
ID=41663166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO87873102A NO171476C (en) | 1985-11-25 | 1987-07-23 | PROCEDURE FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANTI-VIRTUALIZING ANTIBODIES IN A TRIAL TEST |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK388387A (en) |
| NO (1) | NO171476C (en) |
-
1987
- 1987-07-23 NO NO87873102A patent/NO171476C/en unknown
- 1987-07-24 DK DK388387A patent/DK388387A/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO171476C (en) | 1993-03-17 |
| NO873102D0 (en) | 1987-07-23 |
| DK388387D0 (en) | 1987-07-24 |
| DK388387A (en) | 1987-09-24 |
| NO873102L (en) | 1987-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4853326A (en) | Carbohydrate perturbations of viruses or viral antigens and utilization for diagnostic prophylactic and/or therapeutic applications | |
| EP1801591B1 (en) | Methods for detection or measurement of viruses | |
| JP3408793B2 (en) | Virus detection or measurement method | |
| Diomede et al. | Passively transmitted gp41 antibodies in babies born from HIV-1 subtype C-seropositive women: correlation between fine specificity and protection | |
| WO1991009872A1 (en) | Hiv-1 env fragment fusion protein | |
| Robertson et al. | Maternal antibodies to gp120 V3 sequence do not correlate with protection against vertical transmission of human immunodeficiency virus | |
| CA2126247A1 (en) | Monoclonal antibody to hiv-2 and uses thereof | |
| EP0229546B1 (en) | Carbohydrate perturbations of viruses or viral antigens and utilization for diagnostic, prophylactic and/or therapeutic applications | |
| JP3142126B2 (en) | Monoclonal antibodies to specific antigens of human immunodeficiency virus and methods of use. | |
| Du et al. | Development and application of an indirect ELISA for the detection of gp45 antibodies to equine infectious anemia virus | |
| Auwanit et al. | Unusually high seroprevalence of Borna disease virus in clade E human immunodeficiency virus type 1-infected patients with sexually transmitted diseases in Thailand | |
| JPH04507409A (en) | Rubella E1 peptide | |
| NO171476B (en) | PROCEDURE FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANTI-VIRTUALIZING ANTIBODIES IN A TRIAL TEST | |
| CN114371286A (en) | Kit for detecting neutralizing antibody of new coronavirus and preparation method thereof | |
| Gómez et al. | An immunoassay with bovine serum albumin coupled peptides for the improved detection of anti V3 antibodies in HIV-1 positive human sera | |
| Falkensammer et al. | Changes in HIV-specific antibody responses and neutralization titers in patients under ART | |
| Cho et al. | Use of hydrophilic extra-viral domain of canine distemper virus H protein for enzyme-linked immunosorbent assay development | |
| NO319698B1 (en) | Horse artery virus peptide or peptide conjugate comprising one or more epitopes capable of eliciting an immune response in animals | |
| US11353454B2 (en) | Methods for detection of flavivirus antibodies | |
| Gray et al. | An enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) to determine Simian Varicella Virus antibody titers in infected rhesus monkeys (Macaca mulatta) | |
| Orlik et al. | Polyclonal bovine sera but not virus-neutralizing monoclonal antibodies block bovine leukemia virus (BLV) gp51 binding to recombinant BLV receptor BLVRcp1 | |
| EP0424931A2 (en) | Immunoassays which select virus-specific neutralizing antibodies | |
| KR880014375A (en) | ADIS Diagnostics, Vaccines and Serum Therapy Based on the Detection of Various Isotype Responses | |
| Cho KiHyun et al. | Use of hydrophilic extra-viral domain of canine distemper virus H protein for enzyme-linked immunosorbent assay development. | |
| Parkyn | The role of antibody during ovine lentivirus disease in experimentally infected sheep |