NO166467B

NO166467B - Fremgangsmaate og anordning for aa lette navigasjon av et skip.

Info

Publication number: NO166467B
Application number: NO850103A
Authority: NO
Inventors: Heinrich Rehmert
Original assignee: Prakla Seismos Ag
Priority date: 1984-01-10
Filing date: 1985-01-09
Publication date: 1991-04-15
Also published as: EP0154018A3; DK7985A; NO166467C; DK166231B; DE3400602C2; DE3400602A1; NO850103L; DK166231C; DK7985D0; EP0154018B1; EP0154018A2

Description

Sammensetning som er egnet som substrat for bestemmelse av amylasekonsentrasjon.

Foreliggende oppfinnelse yedrorer en sammensetning som er egnet som substrat for bestemmelse av amylasekonsentrasjon i forskjellige media, slik som i legemsvæsker, plante-ekstrakter og lignende. Det nevnte substrat omfatter farget stivelse, farget amylose og farget amylopectin.

Stivelse, hvis empiriske formel er (c5%Q°5^n er et polymert materiale omfattende i alt vesentlig en amylosefraksjon med formelen: og en amylopectinfraksjon med formelen:

Amylasene er enzymer som katalyserer hydrolysen av stivelse. Amylasene utgjores av to typer, oc-amylase, som kan hydrolysere både oc-1,4 og oc-1,6-bindingene i amylose og amylopectin respektivt og kan derfor hydrolysere stivelse fullstendig, og |3-amylase som bare kan hydrolysere oc-1,4-bindingen i stivelse og som således etterlater a-1,6-bindingen i amylopectin uforandret. Virkningen av a-amylase er å hydrolysere både amylosen og amylopectin vilkårlig, hvilket frem-bringer progressivt mindre polysaccharid-fragmenter inntil intet gjen-står med unntagelse av maltose og kanskje noe glukose, a-amylase ak-tiveres av kloridioner og har optimal aktivitet ved en pH på ca. 7>

Amylasene av animalsk opprinnelse er av oc-amylasetypen. Deres tilstedeværelse har blitt påvist i mange vev, men de dannes hovedsakelig av bukspytt- og spyttkjertlene. Funksjonen til amylasen som er tilstede i sekretene fra disse kjertelvev er å hjelpe fordøyel-sen av stivelse ved å hydrolysere eller splitte stivelsen til mindre molekyler, som deretter kan absorberes og fordoyes. Amylase kan også finnes i planter slik som hampefro eller maltet bygg. Amylasen som finnes i disse planter er effektive når det gjelder å utfore den samme katalytiske funksjon med omdannelse av polysaccarider til glukose ved hydrolyse.

Selv om det i over 100 år har vært kjent at amylase finnes

i blodet, har ikke den eksakte legemskilde for dette enzym i normalt serum blitt påvist. Kilden er tydeligvis ikke i bukspyttkjertelen og spyttkjertlene ettersom fjerning av disse kjertler har en ubetydelig virkning på normale serum amylasenivåer. Det har blitt observert at

serum amylasenivåer forhoyes ved flere pathologiske tilstander, men den mest betydelige hevning i serum amylasenivåer oppstår ved akutt" pancreatitis hvor plutselige okninger til 30 eller 4-0 ganger det normale nivå ikke er uvanlig. Den mekanisme som ligger til grunn for denne hevning i serum amylasenivåer i disse tilstander, synes å skyl-des obstruksjon av det sekretavlop som er forbundet med sammenbrudd av acinarcellene. De moderate forhoyelser i serum amylase som forekommer i perforert peptisk mavesår og tarmobstruksjon, forårsakes sannsynligvis av enzymutstromning fra tarmsystemet inn i den peritone-ale kavitet og reabsorbsjon fra denne kavitet inn i hovedsirkulasjons-systemet. Moderate forhoyelser forekommer også ved kusma, nyrein-suffisiens og kreft i bukspyttkjertelen. Skrumplever er kjennetegnet ved lave nivåer av serum amylase.

Amylaseaktiviteten i serumprover kan måles ved å observere graden av tap av visse egenskaper i stivelse som dette enzym kan be-virke når stivelsen hydrolyseres (amyloklastiske metoder) eller ved utvikling av reduserende stoffer (saccarogeniske metoder). De amyloklastiske metoder har benyttet måling av nedsettelsen i viskositet (viskometrisk) eller uklarhet (turbidimetrisk) når stivelses-suspen-sjonen gjores væskeformig av enzymet. Den observerte minking i blå farge som tilveiebringes ved omsetning av stivelsen med jod etter en vilkårlig inkubasjonsperiode, benyttes oftere som et mål for amylo-klastisk aktivitet.

Det har i de senere år fremkommet mange modifikasjoner av den grunnleggende jodometriske fremgangsmåte som i 1908 ble introdusert av Wohlgemuth. I noen av disse modifikasjoner er inkubasjons-tiden fastsatt og minkingen i farge måles fotometrisk, mens i andre fortsettes inkubasjonen inntil den blå fargen ikke^lenger oppnåes.

Den konstante inkubasjonsteknikk har den ulempe at den tilveiebragte optiske tetthet ikke har et lineært forhold sett i relasjon til størr-elsen av enzymatisk hydrolyse. Grunnen for dette er at stivelses-jodfargereaksjonen gjennomgår en rekke fargeforandringer fra blått til fiolett til ravgult til rodt til fargelost ettersom storrelsen på stivelsesmolekylet minker. De variable inkubasjonsteknikker nødvendig-gjor fjerningen av flere aliquoter av enzymprove-stivelsesinkubasjons-blandingen ved forskjellige tidspunkter for testing med jod. Dette er temmelig tungvindt når flere prover må testes. Alle jodometriske metoder har den ulempe at suboptimale substratkonsentrasjoner må anvendes, fordi odeleggelse av substratet er analysens endepunkt. Det er vist at den tilsynelatende amylaseaktivitet kan variere mangefoldig avhengig av stivelseskilden. Det er nylig bestemt at serumprdteiner kan forstyrre stivelse-jodfargereaksjonen og således gi falske hoye indikasjoner på amylaseaktivitet. (Clin. Chem. Acta 8: 918, 1963). Det er også observert at bare oppvarming av serum fortynnet med salt i betydelig grad forhoyer den tilsynelatende amyloklastiske aktivitet bestemt ved hjelp av jodometriske metoder, mens derimot den samme behandling opphever den tilsynelatende saccarogeniske aktivitet. (Clin. Chem. Acta 9: 515, 1964).

Den opprinnelige saccarogeniske metode til Somogyi (J.Biol. Chem. (25:399)) som ble introdusert i 1938, er fremdeles meget benyttet, skjont den i den senere tid har blitt forbedret av Somogyi og av Henry og Chiamori. Den siste metode er anbefalt. I denne frem-gangsmåten inkuberes 1 ml serum eller en annen egnet prove som inneholder en ukjent konsentrasjon av amylase, ved 40°C i 30 minutter med 7 ml buffret substrat inneholdende 75 mg stivelse. Reaksjonen av-sluttes med wolframsyre, og reduserende sukkere bestemmes ut fra det resulterende filtrat. Amylaseenheten for aktivitet, som også er kjent som Somogyi-enheten, er definert som den mengde reduserende stoffer i den inkuberte proven over en ikke-inkubert kontrollprove ekvivalent med 1 mg glukose. Normalområdet for amylase i blod er ca. 40 - 140 enheter/100 ml.

Selv med disse modifiserte fremgangsmåter er amylasebestem-melsen fremdeles tidskrevende og kompleks og er videre forbundet med de ulemper at en storre og variabel blindprove av fordannet reduserende sukkere må bestemmes. I tillegg til dette skaper ofte uhydrolysert stivelse i proven uklarhet og forstyrrer derved bestemmelsen av reduserende sukkere. Fra diskusjonen ovenfor er det tydelig at det foreligger et virkelig og alvorlig behov for en enkel, hurtig og på-litelig bestemmelsesmetode for amylase.

Ifolge foreliggende oppfinnelse er det" tilveiebragt en sammensetning som er egnet som substrat for bestemmelse av amylasekonsentrasjon, kjennetegnet ved at den omfatter en forbindelse med formelen : hvor n er et hoyt helt tall og (c5hiq^5^n er en naturlig forekommende polymer valgt fra den gruppe som består av stivelse, amylose og amylopectin, og D er resten av et reaktivt fargestoff med den generelle formel:

hvor X er halogen, substituert-alkyl eller -alkoksy, substituert-aryl eller -aryloksy og substituert-amino, hvor disse substituenter er alkyl, aryl, hydroksy, halogen, karboksy, sulfonamido, sulfon, sulf-halogen, eller merkapto, Y er N eller -C-Cl og R er en kromofor slik som azo, kompleks metallazo, anthrakinon, ftalocyanin, dioksazin, formazyl eller sulfo-substituert formazyl.

Ved bruk av foreliggende sammensetning for bestemmelse av nivået for amylaseaktivitet i en ukjent prove, som kan være legemsvæske slik som blodserum, går man frem ved å inkubere proven med et substrat omfattende en opploselig stivelse eller stivelsesfraksjon slik som amylose eller amylopectin, som på forhånd er farget med en av de velkjente reaktive fargestoffer for cellulosematerialer og deretter observere den farge som er tilbake i oppløsningen etter bunn-felling av det ureagerte substrat med en egnet reagens.

Eksempler på de benyttede fargestoffer er beskrevet i f.eks.

US patentene nr. 2 820 785, nr. 2 889 316, nr. 2 891 941, nr. 2892828, nr. 2 979 498, nr. 3 054 795, nr. 3 O36 O58, nr. 3 149 100, nr.

3 127 232 og lignende.

Som nevnt kan de substrater som anvendes i foreliggende oppfinnelse omfatte farget stivelse, farget amylose eller farget amylopectin. Ved egnet forbehandling og bruk av opplosningsmidler i over-ensstemmelse med velkjente fremgangsmåter, kan stivelse separeres i amylose og amylopectinfraksjoner. Når f.eks. fortynnede stivelses-pastaer inneholdende 2-3$ stivelse autoklavbehandles og den varme

stivelsesopplosningen mettes med en alkohol, f.eks. butanol eller pen-tanol, utfelles en fraksjon som i alt vesentlig er amylose eller en

rettkjedet stivelsesfraksjon. Den tilstedeværende hoveddel av stivelsen separeres ikke ved denne butanolbehandling. Denne del utgjores av amylopectin eller en forgrenet stivelsesfraksjon og gir rod farge med jod.

Disse hoyt rensede stivelsesfraksjoner er kommersielt til-gjengelige, og de er fullstendig beskrevet i .den litteratur som om-handler karbohydratkjemien og i detaljerte tekniske bulletiner. Den fargede" stivelse, fargede amylose eller fargede amylopectin, som benyttes som substrat i foreliggende oppfinnelse lages ved å omsette en alkalisk oppløsning av stivelse, amylose eller amylopectin i ca. 24- timer med et reaktivt fargestoff av den beskrevne klassen ved benyttelse av en reaksjonstemperatur på ca. 20°-30°C. Alkaliet i den resulterende reaksjonsblanding noytraliseres deretter med en vandig opplosning av en syre som f.eks. vandig saltsyre. Metanol blir så tilsatt for å bunnfelle den fargede stivelse, amylose eller amylopectin. Bunnfallet separeres og opploses i fosfatbuffer og eventuelt uopplost bunnfall avsentrifugeres. Eventuelt resterende ureagert fargestoff blir deretter fjernet f.eks. ved dialyse eller ved gelfiltrering. Det således tilveiebragte fargede produkt er egnet for bruk uten videre behandling som et substrat for bestemmelse av amylaseaktivitet eller det kan lyofiliseres for å gi et stabilt produkt, som etter rekonstituering er egnet for bruk selv etter forlen-get lagring.

Den noyaktige kjemiske- struktur for de resulterende fargede produkter er ikke kjent, men det antas at fargestoffene på samme måte som de reaktive fargestoffene kobles med alkalibehandlet cellulose, også forbinder seg med de frie hydroksylgrupper i den benyttede stivelse, amylose eller amylopectin. Se f.eks. US patentene nr. I88648O, nr. 3 044 843 og nr. 3 029 123. En empirisk formel: '^^ ID^ n " D er tildelt disse nye substrater hvori n er et stort helt tall, (CgH-^Q0^)n representerer en naturlig forekommende polymer slik som stivelse, amylose eller amylopectin og D er resten av eventuelt reaktivt fargestoff.

Selv om stivelse i seg selv som tilveiebragt fra poteter, mais, ris, maranta eller en annen kilde kan farges for å gi det onsk-ede substrat, foretrekkes bruken av en amylose eller..amylopectinfraksjon. Den sistnevnte er kommersielt tilgjengelig som noye standardi-serte fraksjoner og tilveiebringes fra stivelse på den beskrevne måte.

Ved utforelse av en bestemmelse av amyloseaktivitet blir det fargede amylose eller fargede amylopectin eller fargede stivelses-produkt buffret med et egnet buffersystem slik som en fosfatbuffer

-for således å gi en pH på ca. 7 hvilket resulterer i dannelsen av en farget opplosning, idet fargen avhenger av det valgte reaktive fargestoff. En liten mengde (0.1 - 0.2 ml) av en prove hvis amylaseaktivitet skal måles, slik som en pasients legemsvæske, f.eks. urin, serum, spytt, maveinnhold eller spinalvæske, inkuberes med substratet ved 37°C i ca. 10 minutter. • Ved slutten av inkubasjonsperioden til-

settes et egnet protein og stivelsesutfellingsmiddel slik som garve-syre i alkohol eller alkohol alene for å separere uhydrolysert substrat og uonsket protein fra den inkuberte proven. Dette blir således fullstendig fjernet ved sentrifugering eller filtrering, den separerte resten kasseres og supernatanten eller filtratet bibeholdes. Supernatanten eller filtratet inneholder de fargede alkoholopplose-lige hydrolytiske fraksjoner og denne væskes optiske tetthet blir så bestemt ved den maksimale absorbsjonsverdi for det spesielt benyttede fargestoff. Den optiske tetthet (absorbsjonsevne) er proporsjonal med amylasekonsentrasjonen i de undersøkte legemsvæsker og med egnet kalibrering kan amylasekonsentrasjonen avleses direkte. Andre stoffer som inneholder amylase slik som planteekstrakter eller enzymprepara-ter bestemmes analogt med den beskrevne metode.

For videre å illustrere foreliggende oppfinnelse gis fSigen-de eksempler:

Eksempel 1 Fremstilling av farget amylopectin.

10 gram amylopectin opploses i 200 ml IN natriumhydroksyd-opplosning. Til den resulterende opplosning tilsettes 2 gram av et fargestoff slik som går under benevnelsen "Geigy Reactone Red 2B" under omrøring. Dette fargestoff har strukturformelen:

Fargestoffblandingen inkuberes ved fra 20° til 30°G i 24 timer. Ved

slutten av denne inkubasjonsperiode nøytraliseres reaksjonsblandingen med 3N saltsyre og den nøytraliserte opplosning sendes deretter gjen-nom en egnet gelfiltreringsenhet for å fjerne eventuelt ureagert fargestoff. En innledende utfelling i $ 0% vandig metanol er ofte egnet til å fjerne det ureagerte fargestoff for gelfiltrering. Den således tilveiebragte opplosning blir deretter buffret med en egnet buffer slik som en fosfatbuffer for således å gi en pH på ca. 7» Den buff-

rede opplosning kan anvendes i forsoket som beskrevet i eksempel 2

eller kan lyofiliseres for å lette lagring.

Eksempel 2

0.2 ml av en prove av blodserum inkuberes med 1 ml av det

huffrede substrat tilveiebragt i eksempel 1, i 10 minutter ved 37°C.

Ved slutten av denne inkubasjonsperiode tilsettes 5 ml av en 1% gar-vesyreopplosning i 50$ metanol. Den resulterende alkoholiske opplos-

ning sentrifugeres ved ca. 2000 omdr./min. for å fjerne eventuelt ut-

"felt materiale. Supernatantens optiske tetthet bestemmes deretter ved en bolgelengde på 500 n<y>u. Som referanse underkastes også et standard serum inneholdende en kjent konsentrasjon amylase denne test.

Siden mengden av alkoholopploselig fargestoff som dannes ved hydro-

lyse av substratet av den tilstedeværende amylase, er proporsjonal

med enzymkonsentrasjonen, er den optiske tetthet også direkte propor-

sjonal med enzymkonsentrasjonen, og mengden av amylase som finnes i den ukjente proven kan lett beregnes.

Eksempel 3

Istedenfor det i eksempel 1 beskrevne substrat, benyttes et

substrat av farget amylose fremstilt på analog måte og resultatene som oppnåes ved testmetoden som beskrevet i eksempel 2, er like tilfredsstillende.

Eksempel 4

Istedenfor det i eksempel 1 beskrevne substrat, benyttes et

substrat av farget mais-stivelse fremstilt på analog måte og de re-

sultater som oppnåes ved hjelp av testmetoden i eksempel 1, er like tilfredsstillende.

Claims

Sammensetning egnet som substrat for bestemmelse av amylase-konsentras jon, karakter i_s ert ved at den omfatter en forbindelse med formelen:

' hvor n er et hoyt helt tall og ^c5H]_o°5^n er en naturliS forekommende polymer valgt fra den gruppe som består av stivelse, amylose og amylopectin, og D er resten av et reaktivt fargestoff med den generelle formel: hvor X er halogen, substituert-alkyl eller -alkoksy, substituert-aryl eller -aryloksy og substituert-amino, hvor disse substituenter er alkyl, aryl, hydroksy, halogen, karboksy, sulfonamido, sulfon, sulf-halogen, eller merkapto, Y er N eller -C-Cl og R er en kromofor slik som azo, kompleks metallazo, anthrakinon,ftalocyanin, dioksazin, formazyl eller sulfo-substituert formazyl.