NO161446B

NO161446B - PROCEDURE FOR CULTING CELLS RELATED TO ANCHORING.

Info

Publication number: NO161446B
Application number: NO820796A
Authority: NO
Inventors: Allan P Jarvis Jr; Franklin Lim
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1981-03-13
Filing date: 1982-03-11
Publication date: 1989-05-08
Also published as: FR2501715A1; CH662363A5; CA1172586A; GB2094832A; DE3209098A1; JPS57202289A; IT8220138A0; JPS6038111B2; DK112482A; DE3209098C2; IT1150680B; NO161446C; FR2501715B1; GB2094832B; BE892478A; NO820796L; SE452335B; SE8201555L

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for dyrkning av forankringsavhengige celler, dvs. celler av den type som nor- The invention relates to a method for cultivating anchorage-dependent cells, i.e. cells of the type that nor-

malt må dyrkes som et eller flere sjikt på et substrat og ikke kan dyrkes i suspensjon. malt must be grown as one or more layers on a substrate and cannot be grown in suspension.

Fremskritt i cellebiologien har vist at de forankringsavhengige celler hos forskjellige høyere organismer kan produsere små mengder av substanser som har signifikant potensiell eller demonstrerbar nytte for behandling av sykdommer, f.eks. interferon. Slike celler er også nyttige for forsknings-formål . Advances in cell biology have shown that the anchorage-dependent cells of various higher organisms can produce small amounts of substances that have significant potential or demonstrable utility for the treatment of diseases, e.g. interferon. Such cells are also useful for research purposes.

I slike cellekulturer er det stadig en fare til stede for bakteriell eller annen kontaminering. Dessuten er i de fleste tilfeller de mengder av den substans som er av interesse som produseres av cellekulturene, meget liten. Siden forankringsavhengige celler, til forskjell fra suspensjonskulturer, ikke kan dyrkes for å fylle et volum, menes det for tiden ikke å eksistere noen praktisk fremgangsmåte for å dyrke de store antall celler som kreves for produksjon av signifikante mengder av substanser av interesse som produseres av slike celler. In such cell cultures, there is always a danger of bacterial or other contamination. Moreover, in most cases the amounts of the substance of interest produced by the cell cultures are very small. Since anchorage-dependent cells, unlike suspension cultures, cannot be grown to fill a volume, there is currently believed to be no practical method for growing the large numbers of cells required for the production of significant amounts of substances of interest produced by such cells.

For tiden må forankringsavhengige celler slik som normale fibroblaster og visse nyre- og epitelceller, dyrkes på et substrat. Plastark for bruk som substrater er kommersielt tilgjengelige. Noen typer av forankringsavhengige celler vil reprodusere inntil arket er dekket med et monosjikt av celler og deretter opphøre å formere seg. Andre vil fortsette å Currently, anchorage-dependent cells such as normal fibroblasts and certain kidney and epithelial cells must be cultured on a substrate. Plastic sheets for use as substrates are commercially available. Some types of anchorage-dependent cells will reproduce until the sheet is covered with a monolayer of cells and then cease to reproduce. Others will continue to

formere seg i flere sjikt. multiply in several layers.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for dyrkning The invention provides a method of cultivation

av forankringsavhengige celler i suspensjon og muliggjør der- of anchorage-dependent cells in suspension and enables there-

ved større antall celler å bli dyrket pr. volumenhet av kulturmedium i sammenligning med ensjiktskulturer. with larger numbers of cells to be cultured per volume unit of culture medium in comparison with monolayer cultures.

I overensstemmelse med oppfinnelsen innkapsles en kim- In accordance with the invention, a germ-

kultur av forankringsavhengige celler i et flertall av mikrokapsler som omfatter semipermeable membraner. Syntese av membranene styres slik at de har en selektert øvre permeabilitetsgrense, dvs. membranene definerer mikroporer med dimensjo- culture of anchorage-dependent cells in a plurality of microcapsules comprising semipermeable membranes. Synthesis of the membranes is controlled so that they have a selected upper permeability limit, i.e. the membranes define micropores with dimensions

ner som ef tilstrekkelige til å tillate passasje av moleky- ners that are sufficient to allow the passage of molecular

ler som har molekylvekt på opp til f.eks. 2 x IO<5> daltons, men i alt vesentlig å utelukke passasje av materialer med høyere clay that has a molecular weight of up to e.g. 2 x IO<5> daltons, but essentially to exclude the passage of materials with higher

molekylvekt. Kapselmembranen definerer således et mikromiljø innen hvilket cellene sammen med serumkomponenter med høy molekylvekt er avgrenset, men som tillater cellene fri adgang til cellenæringsstoffer med lavere molekylvekt, f.eks. amino-syrer, og tillater cellemetabolitter med lav molekylvekt å diffundere. molecular weight. The capsule membrane thus defines a microenvironment within which the cells together with serum components with a high molecular weight are delimited, but which allows the cells free access to cell nutrients with a lower molecular weight, e.g. amino acids, and allows low molecular weight cell metabolites to diffuse.

Mikrokapslene som inneholder celler dispergeres deretter The microcapsules containing cells are then dispersed

i et konvensjonelt kulturmedium. De indre overflater av kapselmembranen og/eller visse høymolekylære vanndispergerbare materialer som er inkludert i mikrokapselen, tjener som substrat som cellene fester seg til. Da forholdet mellom over-flatearealet til kapslene og volumet til det ekstrakapsulære medium kan være ganske stort, gis individuelle celler adekvat adgang til nødvendige næringsstoffer, og det areal som cellene kart gro på, økes i sammenligning med konvensjonelle monosjikt-kulturer. Generelt kan den gjennomsnittlige diameter for mikrokapslene varieres mellom noen få Mm og 1 mm eller mer. En foretrukket gjennomsnittsstørrelse er 100-500 nm i diameter. in a conventional culture medium. The inner surfaces of the capsule membrane and/or certain high molecular weight water-dispersible materials included in the microcapsule serve as the substrate to which the cells adhere. As the ratio between the surface area of the capsules and the volume of the extracapsular medium can be quite large, individual cells are given adequate access to necessary nutrients, and the area on which the cells have grown is increased in comparison with conventional monolayer cultures. In general, the average diameter of the microcapsules can be varied between a few mm and 1 mm or more. A preferred average size is 100-500 nm in diameter.

Hvis et forankringssubstrat som f.eks. kollagen eller lignende inkluderes i kapslene, så vokser også fibroblaster innover i kapselmembranene og vil vise normal fibroblastisk morfologi. If an anchoring substrate such as collagen or similar is included in the capsules, then fibroblasts also grow into the capsule membranes and will show normal fibroblastic morphology.

Det er et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for dyrkning av forankringsavhengige celler. Et annet formål er å forbedre utbyttet av forankringsavhengige eller kontakt-inhiberte celler dyrket in vitro. It is an object of the invention to provide an improved method for cultivating anchorage-dependent cells. Another purpose is to improve the yield of anchorage-dependent or contact-inhibited cells cultured in vitro.

Et annet formål er å tilveiebringe gjennom hele volumet av et cellevekstmedium et stort overflateareal som er egnet som substrat for forankringsavhengige celler. Disse og andre formål og trekk ved oppfinnelsen vil fremgå av den følgende beskrivelse og av det vedlagte mikrofotografi (200X) som viser forankringsavhengige celler dyrket i en mikrokapsel i overensstemmelse med oppfinnelsen og som illustrer klassisk fibroblastisk morfologi. Det henvises dessuten til de medfølgende krav. Another purpose is to provide, throughout the entire volume of a cell growth medium, a large surface area that is suitable as a substrate for anchorage-dependent cells. These and other objects and features of the invention will be apparent from the following description and from the attached photomicrograph (200X) which shows anchorage-dependent cells grown in a microcapsule in accordance with the invention and which illustrates classic fibroblastic morphology. Reference is also made to the accompanying requirements.

Celler som vokser i suspensjonen kan også innkapsles. Mikrokapslene tjener som mikromiljø for cellene sammen med minst høymolekylære komponenter i sitt kulturmedium, og separerer cellene fra et ekstrakapsulært vandig medium. Bakterier og andre relativt store kontaminanter kan ikke penetrere membranene. Cells growing in suspension can also be encapsulated. The microcapsules serve as a microenvironment for the cells together with at least high-molecular components in their culture medium, and separate the cells from an extracapsular aqueous medium. Bacteria and other relatively large contaminants cannot penetrate the membranes.

< <

Forankringsavhengige celler av pattedyropprinnelse, f.eks. fibroblast, epitel- eller nyreceller, krever for fortsatt viabilitet nærvær av serumkomponenter, hvorav en del kan ha molekylvekt i overkant av membranens øvre permeabilitetsgrense. Slike komponenter kan inkluderes sammen med de innkapslede celler og trenger ikke være til stede i det ekstrakapsulære medium. Anchorage-dependent cells of mammalian origin, e.g. fibroblast, epithelial or kidney cells, for continued viability, require the presence of serum components, some of which may have a molecular weight in excess of the membrane's upper permeability limit. Such components may be included with the encapsulated cells and need not be present in the extracapsular medium.

Det er også nødvendig å inkludere i mikrokapslene et materiale med høy molekylvekt som skal tjene som forankringssubstrat. Kollagen, et naturlig protein som er en hovedbestanddel i bindevev, har vært brukt med hell. Andre forlikelige, vanndispergerbare proteiner med høy molekylvekt kan også anvendes, f.eks. polylysin. Hvis proteinene har frie aminogrupper, kan de gjøres vann-uløselige ved omsetning med en vannløselig gummi under membrandannelse, hvilket skal omtales i det følgende. Anvendelse av slike materialer menes å resultere i produksjon av en matriks inne i det intrakapsulære volum. Innlemmelse av et slikt materiale kan forbedre celletettheten i kapslene, da cellene vokser inne i det intrakapsulære volum istedenfor, eller i tillegg til, å vokse rundt det indre av kapselmembranen. It is also necessary to include in the microcapsules a material with a high molecular weight that will serve as an anchoring substrate. Collagen, a natural protein that is a major component of connective tissue, has been used successfully. Other compatible, water-dispersible high molecular weight proteins can also be used, e.g. polylysine. If the proteins have free amino groups, they can be made water-insoluble by reaction with a water-soluble rubber during membrane formation, which will be discussed below. Use of such materials is believed to result in the production of a matrix within the intracapsular volume. Incorporation of such a material can improve cell density in the capsules, as the cells grow within the intracapsular volume instead of, or in addition to, growing around the interior of the capsule membrane.

Den innkapslede kimkultur suspenderes deretter i et passende vekstmedium av den type som anvendes for vekst av konvensjonelle kulturer. Serumproteiner som ikke opptas av cellene kan utelates fra det ekstrakapsulære medium. Imidlertid bør pH, temperatur, ionekonsentrasjon og lignende være det samme som i konvensjonelle medier. Dessuten kan oksygen- og CO2-overføring påskyndes ved de samme hjelpemidler som i konvensjonell kulturer, da disse oppløste gasser fritt går gjennom membranen. The encapsulated seed culture is then suspended in a suitable growth medium of the type used for the growth of conventional cultures. Serum proteins that are not taken up by the cells can be omitted from the extracapsular medium. However, pH, temperature, ion concentration and the like should be the same as in conventional media. Furthermore, oxygen and CO2 transfer can be accelerated by the same aids as in conventional cultures, as these dissolved gases pass freely through the membrane.

Inkubering av den innkapslede cellekultur resulterer i cellemitose. Fibroblastcellevekster viser klassisk fibroblastisk morfologi og danner rekker av celler på det indre av membranen eller på forankringssubstratet som inneholdes i kapslene. Friskt vekstmedium kan tilføres etter behov enten kontinuerlig eller avbrutt ved endring av det ekstrakapsulære medium.. Hvis formålet med kulturen er å produsere en celle-metabolitt av interesse, kan metabolitten innhøstes enten fra det intrakapsulære volum eller det ekstrakapsulære medium, avhengig av dets molekylvekt og membranenes øvre permeabilitetsgrense (se den samtidige søknad nr. 82 0794) . Incubation of the encapsulated cell culture results in cell mitosis. Fibroblast cell growths show classic fibroblastic morphology and form rows of cells on the interior of the membrane or on the anchoring substrate contained within the capsules. Fresh growth medium can be supplied as needed either continuously or intermittently by changing the extracapsular medium. If the purpose of the culture is to produce a cell metabolite of interest, the metabolite can be harvested either from the intracapsular volume or the extracapsular medium, depending on its molecular weight and the membranes' upper permeability limit (see concurrent application no. 82 0794).

I en foretrukken utførelsestorm av fremgangsmåten er membranene av en type som selektivt kan oppbrytes uten skade på cellene. Dette tillater cellene å bli frigjort fra kapslene etter ønske (se norsk patent nr. 158 284). In a preferred embodiment of the method, the membranes are of a type that can be selectively disrupted without damage to the cells. This allows the cells to be released from the capsules at will (see Norwegian patent no. 158 284).

En grunn for å frigjøre cellene etter deres vekstperiode er å stimulere produksjon av en substans av interesse ved hjelp av cellene. Et eksempel er produksjon av interferon fra human-fibroblaster,■leukocytter eller lymfoblastoidcel-ler som induseres for å skille ut interferon ved behandling med visse viruser eller nukleinsyrer med høy molekylvekt. I en slik situasjon, hvis den øvre permeabilitetsgrense for membranene er mindre enn molekylvekten for den induserende faktor, One reason for releasing the cells after their growth period is to stimulate production of a substance of interest by the cells. An example is the production of interferon from human fibroblasts, leukocytes or lymphoblastoid cells which are induced to secrete interferon by treatment with certain viruses or high molecular weight nucleic acids. In such a situation, if the upper permeability limit of the membranes is less than the molecular weight of the inducing factor,

må cellene utsettes for interferoninduksjon før innkapsling, eller kapselmembranene, etter dyrkning av cellene, må oppbrytes selektivt for å tillate slike materialer med høy molekylvekt å komme i kontakt med cellen. the cells must be subjected to interferon induction prior to encapsulation, or the capsular membranes, after culturing the cells, must be selectively disrupted to allow such high molecular weight materials to contact the cell.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er avhengig av ens evne til å danne semipermeable membraner rundt celler uten samtidig å innvirke negativt på deres fortsatte viabilitet. Én egnet innkapslingsprosess skal beskrives i detalj i det følgende . The method according to the invention relies on one's ability to form semipermeable membranes around cells without at the same time adversely affecting their continued viability. One suitable encapsulation process will be described in detail below.

Celleinnkapsling Cell encapsulation

Vevet eller cellene som skal innkapsles, suspenderes i et vandig_medium, fortrinnsvis egnet for dyrkning av den celletype som er involvert. Medier som er egnet for dette formål er kommersielt tilgjengelige. Gjennomsnittsdiameteren for materialet som skal innkapsles kan variere innen vide grenser, mellom noen få ^m og opp til ca.l mm. Imidlertid oppnås de beste resultater med kapsler av størrelse i området 100-500 Mm. Individuelle forankringsavhengige celler, f.eks. fibroblaster fra human- eller annet animalsk vev, nyreceller og epitelceller, kan innkapsles etter ønske. Også andre cel- The tissue or cells to be encapsulated are suspended in an aqueous medium, preferably suitable for growing the cell type involved. Media suitable for this purpose are commercially available. The average diameter of the material to be encapsulated can vary within wide limits, between a few ^m and up to approx.1 mm. However, the best results are obtained with capsules of size in the range of 100-500 mm. Individual anchorage-dependent cells, e.g. fibroblasts from human or other animal tissue, kidney cells and epithelial cells, can be encapsulated as desired. Also other cel-

ler, f.eks. leukocytter, lymfoblastoider, pankreatiske Ø-cel- laughing, e.g. leukocytes, lymphoblastoids, pancreatic Ø cells

ler, a-celler, 5-celler, forskjellige forhold mellom disse, ler, a-cells, 5-cells, different ratios between these,

eller andre vevenheter kan innkapsles. or other tissue units can be encapsulated.

Den fortsatte viabilitet hos slikt levende materiale er The continued viability of such living material is

bl.a. avhengig av tilgjengeligheten av nødvendige næringsstof- blue. depending on the availability of necessary nutrients

fer, oksygenoverføring, fravær av toksiske substanser i mediet og mediets pH-verdi. Hittil har det ikke vært mulig å opprettholde slikt levende materiale i et fysiologisk forlikelig mil- fer, oxygen transfer, absence of toxic substances in the medium and the medium's pH value. Until now, it has not been possible to maintain such living material in a physiologically compatible environment.

jø med samtidig innkapsling. Problemet har vært at de betingelser som kreves for membrandannelse har vært letale eller skadelige for vevet, og før oppfinnelsen i henhold til US- sea with simultaneous encapsulation. The problem has been that the conditions required for membrane formation have been lethal or harmful to the tissue, and before the invention according to US-

patent nr. 4.352.883 ble gjort, var det ikke kjent noen fremgangsmåte for membrandannelse som tillot vev å overleve i patent no. 4,352,883 was made, no method of membrane formation was known that allowed tissue to survive in

sunn tilstand. healthy state.

Imidlertid er det oppdaget at visse vannløselige substanser som er fysiologisk forlikelige med levende vev og kan gjøres vann-uløselige slik at det dannes en formbevarende koherent masse, kan anvendes for dannelse av en "temporær kapsel" eller et beskyttende sjikt rundt individuelle celler, eller grupper av celler, og at denne temporære kapsel kan behandles for å deponere en mer permanent semipermeabel membran rundt cellene uten skade på cellene. En slik substans tilsettes, typisk i en konsentrasjon av størrelsesorden under 1,0 vekt% til vevkultur-mediet som også inneholder celler av kimkulturen, serumkomponenter og kollagen eller et annet vanndispergerbart materiale med høy molekylvekt, som tjener som forankringssubstrat. Konsentrasjonen av det materiale som anvendes som substrat bør ligge i området fra 10 pg/ml til 1 mg/ml, men er fortrinnsvis av størrelsesorden 100-500 pg/ml. However, it has been discovered that certain water-soluble substances which are physiologically compatible with living tissue and can be made water-insoluble to form a shape-retaining coherent mass can be used to form a "temporary capsule" or protective layer around individual cells, or groups of cells, and that this temporary capsule can be treated to deposit a more permanent semipermeable membrane around the cells without damage to the cells. Such a substance is added, typically in a concentration of the order of magnitude below 1.0% by weight, to the tissue culture medium which also contains cells of the germ culture, serum components and collagen or another water-dispersible material with a high molecular weight, which serves as an anchoring substrate. The concentration of the material used as substrate should be in the range from 10 pg/ml to 1 mg/ml, but is preferably of the order of 100-500 pg/ml.

Løsningen dannes deretter til dråper som inneholder vev The solution is then formed into droplets containing tissue

sammen med'sitt medium og gjøres umiddelbart vann-uløselig og geleres, i det minste i et overflatesjikt. Deretter forsynes de formbevarende temporære kapsler med en mer permanent membran together with its medium and is immediately rendered water-insoluble and gelled, at least in a surface layer. The shape-retaining temporary capsules are then fitted with a more permanent membrane

som selv etterpå kan oppbrytes selektivt hvis det er ønskelig, for å frigjøre vevet uten skade. Der hvor materialet anvendt for å danne de temporøre kapsler tillater det, kan kapselens indre gjøres flytende igjen etter dannelse av den permanente membran. Dette gjøres ved å reetablere betingelsene i mediet ved hvilke materialet er løselig. which even afterwards can be selectively broken up if desired, to release the tissue without damage. Where the material used to form the tempo-stirring capsules allows it, the interior of the capsule can be liquefied again after formation of the permanent membrane. This is done by re-establishing the conditions in the medium at which the material is soluble.

Det materiale som anvendes for å danne de temporære kapsler, kan være hvilket som helst ikke-toksisk, vannløselig materiale som, ved en endring i det omgivende ioniske miljø eller konsentrasjonen, kan omdannes til en formbevarende masse. Materialet bør også inneholde et flertall av lett ioniserte anioniske grupper, f.eks. karboksylgrupper, som kan reagere ved saltdannelse med polymerer som inneholder flere kationiske grupper. Som det skal forklares nedenunder, muliggjør denne type materiale deponering av en permanent membran med selektert øvre permeabilitetsgrense (generelt ikke større enn 100 000 The material used to form the temporary capsules can be any non-toxic, water-soluble material which, upon a change in the surrounding ionic environment or concentration, can be converted into a shape-retaining mass. The material should also contain a majority of easily ionized anionic groups, e.g. carboxyl groups, which can react by salt formation with polymers containing more cationic groups. As will be explained below, this type of material enables the deposition of a permanent membrane with a selected upper permeability limit (generally no greater than 100,000

til 150 000 daltons) uten vanskelighet i overflatesjikt i den temporære kapsel. to 150,000 daltons) without difficulty in the surface layer of the temporal capsule.

De materialer som for tiden foretrekkes for å danne den temporære kapsel er sure, vannløselige, naturlige eller syntetiske polysakkaridgummier. Slike materialer er kommersielt tilgjengelige. De ekstraheres typisk fra vegetabilsk materiale og anvendes ofte som additiver til forskjellige matvarer. Natriumalginat er den vannløselige gummi som for tiden foretrekkes. Alginat i molekylvektområdet 150 000+ daltons kan anvendes, men på grunn av dets molekyldimensjoner og viskositet vil det vanligvis være uegnet til å permetrere de endelig dannedo kapselmembraner. Alginat med lavere molekylvekt, f.eks. The currently preferred materials for forming the temporary capsule are acidic, water-soluble, natural or synthetic polysaccharide gums. Such materials are commercially available. They are typically extracted from vegetable material and are often used as additives to various foods. Sodium alginate is the water-soluble gum currently preferred. Alginate in the molecular weight range of 150,000+ daltons can be used, but due to its molecular dimensions and viscosity it will usually be unsuitable for permeating the final capsule membranes. Lower molecular weight alginate, e.g.

50 000 - 80 000 daltons, fjernes lettere fra det intrakapsulæ- 50,000 - 80,000 daltons, is more easily removed from the intracapsular

re volum ved diffundering gjennom en membran med tilstrekkelig porøsitet og foretrekkes derfor. Andre brukbare gummier inkluderer sure fraksjoner av guargummi, karagen, pektin, tragant-gummi eller xantangummi. re volume by diffusion through a membrane with sufficient porosity and is therefore preferred. Other useful gums include acidic fractions of guar gum, carrageenan, pectin, tragacanth gum or xanthan gum.

Disse materialer omfatter glykosidbundne sakkaridkjeder. Deres frie syregrupper er ofte til stede i alkalimetallione-formen, f.eks. natriumformen. Hvis et flerverdig ion, f.eks. kalsium eller strontium, utbyttes med alkalimetallionet, "tverrbindes" de vannløselige polysakkaridmolekyler slik at det dannes en vann-uløselig, formbevarende gel som kan resolubilise-res ved fjerning av ionene ved ionebytting eller via et sekve-streringsraiddel. Selv om i alt vesentlig ethvert flerverdia ion som kan danne et salt med den sure gummi kan benyttes, foretrekkes det at fysiologisk forlikelige ioner, f.éks. kalsium, anvendes. Dette er tilbøyelig til å konservere vevet i levende tilstand. Andre flerverdige kationer kan anvendes. Magnesiumioner er ineffektive med hensyn til å gelere natriumalginat. These materials comprise glycoside-linked saccharide chains. Their free acid groups are often present in the alkali metal ion form, e.g. the sodium form. If a multivalent ion, e.g. calcium or strontium, is exchanged with the alkali metal ion, the water-soluble polysaccharide molecules are "cross-linked" so that a water-insoluble, shape-retaining gel is formed which can be resolubilized by removing the ions by ion exchange or via a sequestration device. Although essentially any multivalent ion which can form a salt with the acidic gum can be used, it is preferred that physiologically compatible ions, e.g. calcium, is used. This tends to preserve the tissue in a living state. Other multivalent cations can be used. Magnesium ions are ineffective in gelling sodium alginate.

En typisk løsningsammensetning omfatter like volumdeler av en cellekultur i sitt medium (med et forankrings- A typical solution composition includes equal volume parts of a cell culture in its medium (with an anchoring

substrat) og en 1 eller 2 % løsning av gummi i fysiologisk saltvann. Ved anvendelse av natriumalginat har en 1,0-1,5 % løsning vist seg å være vellykket. Kollagen eller et annet vanndispergerbart protein eller polypeptid med høy molekylvekt, enten naturlig eller syntetisk, inkluderes i cellekulturen og vil bli avgrenset innen det intrakapsulære volum av de resulterende kapsler. Hvis en polymer som har et flertall kationiske grupper anvendes, f.eks. polylysin, reagerer de kationiske grupper med anioniske plasser i den vannløselige gummi slik at det dannes en i alt vesentlig vann-uløselig matriks som er sammenflettet med gummien. Foretrukne konsentrasjoner for slike materialer er av størrelsesorden 100-500 Mg/ml av suspensjon (inklusive gummiløsning). substrate) and a 1 or 2% solution of gum in physiological saline. When using sodium alginate, a 1.0-1.5% solution has been found to be successful. Collagen or another high molecular weight water-dispersible protein or polypeptide, either natural or synthetic, is included in the cell culture and will be confined within the intracapsular volume of the resulting capsules. If a polymer having a majority of cationic groups is used, e.g. polylysine, the cationic groups react with anionic sites in the water-soluble rubber so that an essentially water-insoluble matrix is formed which is intertwined with the rubber. Preferred concentrations for such materials are of the order of 100-500 Mg/ml of suspension (including rubber solution).

I neste trinn i innkapslingsprosessen dannes gummiløs-ningen som inneholder vevet til dråper av en ønsket størrelse, og dråpene geleres umiddelbart slik at det dannes formbevarende sfæriske eller sfæroidale masser. Dråpedannelsene kan fore-tas på følgende måte: Et rør som inneholder en vandig løsning av flerverdige kationer, f.eks. 1,5 % CaC^-løsning, forsynes med en propp som holder en dråpeformende apparatur. Apparaturen omfatter et hus som har en øvre luftinntaksmunning og en avlang, hul-legeme-friksjon innpasset i proppen. En 10 cm 3 sprøyte som er forsynt med en trinnpumpe monteres på toppen av huset med f. eks. en 0,254 mm I,D.Teflon-belagt nål som fører gjennom lengden av huset. Det indre av huset er slik konstruert at nålespissen utsettes for en konstant laminær luftstrømning som tjener som en luftkniv. I bruk, med sprøyten full av løsning som inneholder det materiale som skal innkapsles, aktiveres trinnpumpen for porsjonsvis å tvinge dråper av løsning fra nålespissen. Hver dråpe "kuttes av" ved hjelp av luftstrøm-men og faller tilnærmet 2,5 cm ned i CaC^-løsningen hvor den umiddelbart geleres ved absorpsjon av kalsiumioner. Avstan-• den mellom nålespissen og overflaten av CaC^-løsnihgen er i dette tilfelle stor nok til å tillate natriumalginat/cellesuspensjonen å anta den fysisk gunstigste form; en kule (maksimalt volum med minimalt overflateareal). Luft inne i røret "blør" gjennom en åpning i proppen. Dette resulterer i "tverrbinding" av gelen og i dannelse av en formbevarende beskyttende, temporær kapsel med høy viskositet som inneholdes i det suspenderte vev og dets medium. Kapslene oppsamles i løsningen som en separat fase og separeres ved aspirering. In the next step in the encapsulation process, the rubber solution containing the tissue is formed into droplets of a desired size, and the droplets gel immediately so that shape-retaining spherical or spheroidal masses are formed. The droplet formations can be carried out in the following way: A tube containing an aqueous solution of polyvalent cations, e.g. 1.5% CaC^ solution, is supplied with a stopper that holds a droplet-forming apparatus. The apparatus includes a housing having an upper air intake orifice and an elongated, hollow-body friction fit in the plug. A 10 cm 3 syringe which is equipped with a step pump is mounted on top of the housing with e.g. a 0.254 mm I,D.Teflon-coated needle that runs through the length of the housing. The interior of the housing is constructed in such a way that the needle tip is exposed to a constant laminar air flow which serves as an air knife. In use, with the syringe full of solution containing the material to be encapsulated, the stepper pump is activated to force droplets of solution from the needle tip in portions. Each droplet is "cut off" by means of air flow and falls approximately 2.5 cm into the CaC^ solution where it is immediately gelled by absorption of calcium ions. The distance between the needle tip and the surface of the CaC^ solution is in this case large enough to allow the sodium alginate/cell suspension to assume the most physically favorable form; a sphere (maximum volume with minimum surface area). Air inside the tube "bleeds" through an opening in the plug. This results in "cross-linking" of the gel and in the formation of a shape-retaining, protective, temporary, high-viscosity capsule contained within the suspended tissue and its medium. The capsules are collected in the solution as a separate phase and separated by aspiration.

I neste trinn av prosessen deponeres en semipermeabel membran rundt overflaten av de temporære kapsler ved "tverrbinding" av overflatesjikt. Dette kan utføres ved at de gelerte temporære kapsler utsettes for en vandig løsning av en polymer som inneholder kationiske grupper som er reaktive med anioniske funksjonaliteter i gelmolekylene. Polymerer som inneholder syrereaktive grupper, f.eks. frie imin- eller amin-grupper, foretrekkes. I denne situasjon tverrbindes poly-sakkaridgummien ved vekselvirkning (saltbindingsdannelse) mellom karboksylgruppene og amin- eller imingruppene. Permeabiliteten kan reguleres innen grenser ved selektering av molekylvekten for den tverrbindende polymer som anvendes, og ved å regulere konsentrasjonen av polymerløsningen og varigheten og temperaturen for eksponeringen. En løsning av polymer med lav molekylvekt, i et gitt tidsrom, vil penetrere videre inn i de temporære kapsler enn hva en polymer med høy molekylvekt vil gjøre. Penetreringsgraden for tverrbindere er jevnført med den resulterende permeabilitet. Generelt kan man si at jo høyere molekylvekten og jo mindre penetreringen er, desto stør-re er porestørrelsen. Grovt sett kan polymerer innen molekylvektområdet 3000-100 000 daltons eller høyere anvendes, avhengig av varigheten av reaksjonen, konsentrasjonen av polymerløs-ningen og den ønskede permeabilitetsgrad. Ett vellykket sett med reaksjonsbetingelser, hvor det anvendes polylysin med gjennomsnittlig molekylvekt ca. 35 000 daltons, involverte re-aksjon i 2 minutter, under røring, av en fysiologisk saltløs-ning som inneholdet 0,0167 % polylysin. Dette resulterer i membraner som har en øvre permeabilitetsgrense på ca. In the next step of the process, a semi-permeable membrane is deposited around the surface of the temporary capsules by "cross-linking" of the surface layer. This can be carried out by exposing the gelled temporary capsules to an aqueous solution of a polymer containing cationic groups which are reactive with anionic functionalities in the gel molecules. Polymers containing acid-reactive groups, e.g. free imine or amine groups are preferred. In this situation, the polysaccharide gum is cross-linked by interaction (salt bond formation) between the carboxyl groups and the amine or imine groups. The permeability can be regulated within limits by selecting the molecular weight of the cross-linking polymer used, and by regulating the concentration of the polymer solution and the duration and temperature of the exposure. A solution of low molecular weight polymer, in a given period of time, will penetrate further into the temporary capsules than a high molecular weight polymer will. The degree of penetration of crosslinkers is equated with the resulting permeability. In general, it can be said that the higher the molecular weight and the lower the penetration, the larger the pore size. Roughly speaking, polymers within the molecular weight range of 3,000-100,000 daltons or higher can be used, depending on the duration of the reaction, the concentration of the polymer solution and the desired degree of permeability. A successful set of reaction conditions, where polylysine with an average molecular weight of approx. 35,000 daltons, involved reaction for 2 minutes, with stirring, of a physiological saline solution containing 0.0167% polylysine. This results in membranes that have an upper permeability limit of approx.

100 000 daltons. Optimale reaksjonsbetirigelser som er egnet for regulering av permeabiliteten i et gitt system, kan lett bestemmes empirisk på bakgrunn av de ovenfor gitte retnings-linjer. Ved å anvende denne metode er det mulig å sette den øvre permeabilitetsgrense for membranene på et selektert nivå, generelt under ca. 150 000 daltons. 100,000 daltons. Optimal reaction conditions that are suitable for regulating the permeability in a given system can easily be determined empirically on the basis of the guidelines given above. By using this method, it is possible to set the upper permeability limit for the membranes at a selected level, generally below approx. 150,000 daltons.

Eksempler på egnede tverc<r>bindingspolymerer inkluderer proteiner og polypeptider, enten naturlige eller syntetiske, som har frie amino- eller iminogrupper, polyetylenaminer, polyety-leniminer og polyvinylaminer. Polylysin, både i D- og L-form, har vært brukt med hell. Proteiner som f.eks. polyarginin, polycitrullin eller polyornitin, er også brukbare. Polymerer i det høyere område for positiv ladningstetthet, f.eks. poly-vinylamin, adhererer kraftig til de anioniske grupper i gelmolekylene slik at det dannes stabile membraner, men membranene er noe vanskeligere å oppbryte. Examples of suitable crosslinking polymers include proteins and polypeptides, whether natural or synthetic, having free amino or imino groups, polyethyleneamines, polyethyleneimines and polyvinylamines. Polylysine, in both the D and L forms, has been used successfully. Proteins such as polyarginine, polycitrulline or polyornithine are also usable. Polymers in the higher positive charge density range, e.g. polyvinylamine, strongly adheres to the anionic groups in the gel molecules so that stable membranes are formed, but the membranes are somewhat more difficult to break down.

Behandling med en fortynnet løsning av gummi eller en zwitterionisk puffer vil stanse frie aminogrupper på overfla-tene av kapslene som ellers kan gi kapslene tendens til å danne klumper. Treatment with a dilute solution of rubber or a zwitterionic puffer will stop free amino groups on the surfaces of the capsules which can otherwise give the capsules a tendency to form lumps.

På dette punkt i innkapslingen kan kapsler oppsamles som omfatter en semipermeabel membran som omgir en gelert løsning av gummi, et forlikelig dyrkningsmedium av celletype, celler, og en intern matriks av kollagen eller et annet forankringssubstrat. Siden masseoverføring bør påskyndes inne i kapslene og tvers over membranene, foretrekkes det å gjøre gelen flytende igjen til sin vannløselige form. Dette kan gjøres ved å reetablere de betingelser under hvilke gummien er en væske, f.eks. ved å fjerne kalsiumet eller andre multifunksjonelle kationer fra den indre gel. Mediet i kapselen kan resolubili-seres ganske enkelt ved å neddyppe kapslene i fosfatpufret saltvann, som inneholder alkalimetallioner og hydrogenioner. En-verdige ioner byttes med kalsiumet eller andre multifunksjonelle ioner i gummien når kapslene neddyppes i løsningen under røring. Natriumcitratløsningen kan anvendes for samme formål og tjener til å sekvestrere de toverdige ioner. At this point in the encapsulation, capsules may be assembled comprising a semipermeable membrane surrounding a gelled solution of rubber, a compatible cell-type culture medium, cells, and an internal matrix of collagen or other anchoring substrate. Since mass transfer should be accelerated inside the capsules and across the membranes, it is preferred to re-liquefy the gel to its water-soluble form. This can be done by re-establishing the conditions under which the rubber is a liquid, e.g. by removing the calcium or other multifunctional cations from the inner gel. The medium in the capsule can be resolubilised simply by immersing the capsules in phosphate-buffered saline, which contains alkali metal ions and hydrogen ions. Monovalent ions are exchanged with the calcium or other multifunctional ions in the rubber when the capsules are immersed in the solution while stirring. The sodium citrate solution can be used for the same purpose and serves to sequester the divalent ions.

Cellekulturer som er innkapslet som beskrevet ovenfor, kan suspenderes i vekstmedium som er konstruert spesifikt for å tilfredsstille alle kravene til den spesielle celletype som er involvert, og vil fortsette å gjennomgå normal in vitro-metabolisme og mitose. Hvis kulturen krever et miljø med komponenter med høy molekylvekt som f.eks. serumkomponenter, kan disse utelates fra det ekstrakapsulære medium. Typisk er de K'omponenter som normalt opptas av cellene, av relativt lav molekylvekt og difunderer lett gjennom kapselmembranene i mikromiljøet i cellene hvor de permetrerer cellemembranen. Metabolit-ter av cellene som utskilles inn i det intrakapsulære medium, hvis de har molekylvekt under den øvre permeabilitetsgrense for kapselmembranen, diffunderer likeledes over dette og oppsamles i det ekstrakapsulære medium. Cell cultures encapsulated as described above can be suspended in growth medium specifically engineered to satisfy all the requirements of the particular cell type involved and will continue to undergo normal in vitro metabolism and mitosis. If the culture requires an environment with high molecular weight components such as e.g. serum components, these can be omitted from the extracapsular medium. Typically, the K'omponents that are normally taken up by the cells are of relatively low molecular weight and easily diffuse through the capsule membranes in the microenvironment of the cells where they permeate the cell membrane. Metabolites of the cells that are secreted into the intracapsular medium, if they have a molecular weight below the upper permeability limit for the capsule membrane, likewise diffuse over this and are collected in the extracapsular medium.

De innkapslede celler dyrkes under betingelser med hensyn til f.eks temperatur, pH og ionestyrke, som er identisk med konvensjonelle kulturers. Cellemetabolitter kan innhøstes fra det ekstrakapsulære medium eller fra det intrakapsulære volum ved konvensjonelle teknikker. Imidlertid har den dyrkningstek-nikk som her er åpenbart, følgende fordeler: 1. Cellene i kulturen beskyttes mot kontaminering ved faktorer som har dimensjoner i overkant av den øvre permeabilitetsgrense for membranene. Dette betyr at sterilitetskrav normalt rådende for dyrkningsprosesser kan være noe avslappet, siden mikroorganismer ikke kan nå de innkapslede celler. 2. Kapslene immobiliserer i virkeligheten cellene i et miljø i hvilket det avgrenses innelukkede materialer med høy molekylvekt, men allikevel fjernes og innføres laveremolekylære celler lett.Dette tillater næringsmediet å bli oppsamlet avbrutt eller kontinuerlig og også suppleres etter ønske, uten at cellene forstyrres. 3. Substanser av interesse som er produsert av cellene, utvinnes lettere. Celleprodukter med molekyldimensjoner som er små nok til å permetrere kapselmembranene, oppsamles i det ekstrakapsula:re medium i blanding med næringsstoffer. Imidlertid frigjøres ikke høymolekylære serumkomponenter og lignende inn i det ekstrakapsulære medium, hvilket således forenkler utvinning av et celleprodukt av interesse. Celleprodukter med molekyldimensjoner i overkant av den øvre permeabilicetsgrense for membranene oppsamles inne i kapslene. Disse kan utvinnes i relativt konsentrert form ved at kapslene isoleres og membranene etterpå oppbrytes selektivt under anvendelse av f.eks. The encapsulated cells are grown under conditions with respect to, for example, temperature, pH and ionic strength, which are identical to those of conventional cultures. Cell metabolites can be harvested from the extracapsular medium or from the intracapsular volume by conventional techniques. However, the culture technique disclosed here has the following advantages: 1. The cells in the culture are protected against contamination by factors that have dimensions in excess of the upper permeability limit for the membranes. This means that sterility requirements normally prevailing for cultivation processes can be somewhat relaxed, since microorganisms cannot reach the encapsulated cells. 2. The capsules actually immobilize the cells in an environment in which enclosed high molecular weight materials are delineated, yet lower molecular weight cells are easily removed and introduced. This allows the nutrient medium to be collected intermittently or continuously and also supplemented as desired, without disturbing the cells. 3. Substances of interest produced by the cells are more easily extracted. Cell products with molecular dimensions that are small enough to permeate the capsular membranes are collected in the extracapsular medium in a mixture with nutrients. However, high molecular weight serum components and the like are not released into the extracapsular medium, which thus facilitates recovery of a cell product of interest. Cell products with molecular dimensions in excess of the upper permeability limit for the membranes are collected inside the capsules. These can be extracted in a relatively concentrated form by isolating the capsules and subsequently breaking up the membranes selectively using e.g.

den teknikk som skal beskrives i det følgende. the technique to be described in the following.

4. Det intrakapsulære volum tilveiebringer et miljø som er vel egnet for celledeling. Suspensjonskulturer-er observert å gjennomgå mitose inne i kapselen. Forankringsavhengige celler som i normale kulturer vokser i et todimensjonalt monosjikt formerer seg slik at det dannes en rekke i kapselen. Slike celler bruker de innvendige overflater i membranen som et substrat og/eller anker for de høymolekylære materialer som er angitt ovenfor, som er fordelt inne i kapsélen. Dette fører til signifikante økninger i celletetthet i sammenligning med konvensjonelle kulturer. Den fortsatte viabilitet hos slike cellebunter optimaliseres ved at overflateareal: volum-forholdene til kapslene kan være ganske store, og således har alle celler adgang til de krevede næringsstoffer, oksygen osv. 4. The intracapsular volume provides an environment that is well suited for cell division. Suspension cultures-are observed to undergo mitosis inside the capsule. Anchorage-dependent cells that in normal cultures grow in a two-dimensional monolayer multiply so that a row is formed in the capsule. Such cells use the internal surfaces of the membrane as a substrate and/or anchor for the high molecular weight materials noted above which are distributed within the capsule. This leads to significant increases in cell density compared to conventional cultures. The continued viability of such cell bundles is optimized by the fact that the surface area: volume ratios of the capsules can be quite large, and thus all cells have access to the required nutrients, oxygen, etc.

I visse situasjoner er det fordelaktig å nedbryte kapselmembranene selektivt for å frigjøre cellene uten skade. Ett bemerkelsesverdig eksempel er ved produksjon av interferon (INF). Celler med evne til å produsere INF må utsettes for visse viruser eller nukleinsyrer ved fremstilling for INF-produksjonstrinnet. Dessuten tilsettes, i flere INF-induk-sjonsprosesser, reagenser til kulturen for å inhibere protein-syntese. Følgelig må veksttrinnet i dyrkningsprosessen ledes under betingelser som er helt forskjellig fra INF-induk-sjonstrinnet. Hvis de substanser som anvendes for INF-induk-sjon har molekylvekt i overkant av kapselmembranenes øvre permeabilitetsgrense (hvilket vil være tilfelle i virus-induk-sjoner), kan induksjonsprosessen ikke fullføres i den innkapslede cellekultur. Følgelig ville INF-produserende celler, hvis de dyrkes inne i kapselen, måtte bli frigjort ved nedbrytning av membraren for å bxi underkastet induksjonsprosessen. In certain situations, it is advantageous to selectively disrupt the capsular membranes to release the cells without damage. One notable example is in the production of interferon (INF). Cells capable of producing INF must be exposed to certain viruses or nucleic acids in preparation for the INF production step. Also, in several INF induction processes, reagents are added to the culture to inhibit protein synthesis. Accordingly, the growth step of the cultivation process must be conducted under conditions that are completely different from the INF induction step. If the substances used for INF induction have a molecular weight in excess of the upper permeability limit of the capsule membranes (which will be the case in virus inductions), the induction process cannot be completed in the encapsulated cell culture. Consequently, INF-producing cells, if cultured inside the capsule, would have to be released by membrane disruption to bxi undergo the induction process.

Nedbrytning av membraner Breakdown of membranes

Celler som er avgrenset i membraner av den type som er beskrevet ovenfor, kan frigjøres ved en fremgangsmåte som in-volverer kommersielt tilgjengelige reagenser som har egenska-per som ikke signifikant uheldig innvirker på de innkapslede celler. For det første separeres kapslene fra sitt suspende-ringsmedium, vaskes grundig for fjerning av eventuelle Cells that are confined in membranes of the type described above can be released by a method involving commercially available reagents that have properties that do not significantly adversely affect the encapsulated cells. Firstly, the capsules are separated from their suspension medium, washed thoroughly to remove any

kontaminanter som er til stede på det ytre av mikrokapslene, contaminants present on the exterior of the microcapsules,

oa disperqeres deretter, under agitering, i en blandet løsning av monoatorainke, flerverdige kationer, f.eks. kalsiumioner, og oa are then dispersed, under agitation, in a mixed solution of monoator ink, polyvalent cations, e.g. calcium ions, and

en polymer som har et flertall anioniske grupper, f.eks. et salt av en polysulfon- eller polyfosforsyre. Heparin, et naturlig sulfonert polysakkarid, foretrekkes for dette trinn. a polymer having a plurality of anionic groups, e.g. a salt of a polysulfonic or polyphosphoric acid. Heparin, a naturally occurring sulfonated polysaccharide, is preferred for this step.

Den anioniske ladningstetthet for polymeren som anvendes, bør være lik eller fortrinnsvis større enn ladningstettheten for den sure gummi som opprinnelig ble anvendt for å danne membranene. Molekylvekten til polymeren bør være minst sammenlignbar med og fortrinnsvis større enn molekylvekten til den polymer med et flertall kationiske grupper som ble anvendt ved dannelse av membranen. I suspensjonen av kapsler i den blandede løsning konkurrerer kalsiumionene med de kationiske polymerkjeder som er anvendt for dannelse av membranen, om anioniske plasser på den vannløselige gummi. Samtidig konkurrerer heparinet eller en annen polymer med et flertall anioniske grupper oppløst i løsningen, med den anioniske gummi i membranen om kationiske plasser på polymerkjedene. Dette resulterer i et vanndispergerbart eller fortrinnsvis vannløselig kompleks av f.eks. polylysin og heparin, og i assosiasjon mellom de monatomiske kationer og molekyler i gelen. The anionic charge density of the polymer used should be equal to or preferably greater than the charge density of the acid gum originally used to form the membranes. The molecular weight of the polymer should be at least comparable to and preferably greater than the molecular weight of the polymer with a majority of cationic groups that was used in forming the membrane. In the suspension of capsules in the mixed solution, the calcium ions compete with the cationic polymer chains used to form the membrane for anionic sites on the water-soluble rubber. At the same time, the heparin or another polymer with a majority of anionic groups dissolved in the solution competes with the anionic rubber in the membrane for cationic places on the polymer chains. This results in a water-dispersible or preferably water-soluble complex of e.g. polylysine and heparin, and in association between the monatomic cations and molecules in the gel.

Dette trinn gjør membranen utsatt for oppløsning ved et-terfølgende eksponering for et sekvestreringsmiddel som fullfø-rer oppbrytningsprosessen ved å oppta monoatoraiske ioner fra gelen. Kapselmembran -rester som eventuelt er igjen i mediet, kan lett separeres fra cellene. This step renders the membrane susceptible to dissolution upon subsequent exposure to a sequestering agent which completes the breakdown process by absorbing monoatomic ions from the gel. Capsular membrane residues that may be left in the medium can be easily separated from the cells.

Den løsning som for tiden foretrekkes for det første trinn i den selektive ned brytningsprosess omfatter 1,1 vekt/vol.% kalsiumklorid og mellom 500 og 1500 enheter heparin pr. ml løs-ning. Et volum av mikrokapsler tilsettes til denne løsning som er tilstrekkelig til å utgjøre mellom ca. 20 og 30 % av det totale volum av suspensjonen. Kalsiumklorid og heparin foretrekkes, siden begge reagenser er fysiologisk forlikelige med de fleste celler og derfor reduserer muligheten for celle-skader til et minimum. Blandinger av strontiumsalter eller andre flerverdige kationer (men ikke Mg<++->ioner) kan også anvendes sammen med polysulfon- eller polyfosforsyresaltene av den type som er beskrevet ovenfor. The solution currently preferred for the first step in the selective degradation process comprises 1.1 wt/vol.% calcium chloride and between 500 and 1500 units of heparin per ml solution. A volume of microcapsules is added to this solution which is sufficient to make up between approx. 20 and 30% of the total volume of the suspension. Calcium chloride and heparin are preferred, since both reagents are physiologically compatible with most cells and therefore minimize the possibility of cell damage. Mixtures of strontium salts or other polyvalent cations (but not Mg<++> ions) can also be used together with the polysulfonic or polyphosphoric acid salts of the type described above.

Generelt kan konsentrasjonene av monoatomiské ioner og anionisk polymer som anvendes i dette trinn, variere innen vide grenser. Optimale konsentrasjoner kan lett bestemmes empirisk og er avhengig av eksponeringstiden såvel som den spesielle polymer som anvendes for dannelse av membranene. In general, the concentrations of monoatomic ions and anionic polymer used in this step can vary within wide limits. Optimal concentrations can easily be determined empirically and are dependent on the exposure time as well as the particular polymer used to form the membranes.

Det sekvestreringsmddel som for tiden foretrekkes for å utføre den selektiv? nedbrytning er natriumcitrat, selv om andre alkalimetallcitratsalter og alkalimetall-EDTA også kan anvendes. Hvis natriumcitrat anvendes, så er den optimale konsentrasjon av størrelsesorden 50-60 mM. Det foretrekkes å oppløse citratet eller et annet sekvestreringsmiddel i isotonisk saltvann for å redusere celleskadene til et minimum. The currently preferred sequestering agent to perform it selectively? decomposition is sodium citrate, although other alkali metal citrate salts and alkali metal EDTA may also be used. If sodium citrate is used, then the optimum concentration is of the order of 50-60 mM. It is preferred to dissolve the citrate or other sequestering agent in isotonic saline to minimize cell damage.

Eksempel 1; Humanfibroblaster Example 1; Human fibroblasts

Human-fibroblaster oppnådd ved å behandle konvensjonell monosjiktkultur med trypsin og EDTA i 5 minutter ved 3 7°C på kjent måte, suspenderes i et komplett vekstmedium (CMLR 1969 i supplert med 40 vol.% renset føtalt kalveserum, 0,8 % natriumalginat og 200 yf/ml renset kalvehudkollagen. Tettheten til cellesuspensjonen er ca. Human fibroblasts obtained by treating conventional monolayer culture with trypsin and EDTA for 5 minutes at 37°C in a known manner are suspended in a complete growth medium (CMLR 1969 in supplemented with 40 vol.% purified fetal calf serum, 0.8% sodium alginate and 200 yf/ml purified calf skin collagen The density of the cell suspension is approx.

1,5 x 10<7> celler/ml. 1.5 x 10<7> cells/ml.

Deretter anvendes en 1,5 % kalsiumkloridløsning for å gelere dråper dannet ved anvendelse av en dråpedannelsesappa-ratur som beskrevet ovenfor. Dråper av størrelsesorden 50-500 \ im i diameter forlater nålespissen og gelerer umiddelbart etter at de er kommet inn i kalsiumløsningen. A 1.5% calcium chloride solution is then used to gel droplets formed using a droplet forming apparatus as described above. Droplets of the order of 50-500 µm in diameter leave the needle tip and gel immediately after entering the calcium solution.

Etter 5 minutter fjernes den supernatante løsning ved aspirering. De gelerte kapsler overføres deretter til et begerglass som inneholder 15 ml av en løsning som omfatter en del av en 2 % 2 (cykloheksylamino)etansulfonsyre-pufferløs-ning i 0,6 % NaCl (isotonisk, pH=8,2) fortynnet med 20 deler 1 % CaCl2. Etter 3 minutters neddypping vaskes kapslene to ganger i 1 % CaC^. After 5 minutes, the supernatant solution is removed by aspiration. The gelled capsules are then transferred to a beaker containing 15 ml of a solution comprising a portion of a 2% 2-(cyclohexylamino)ethanesulfonic acid buffer solution in 0.6% NaCl (isotonic, pH=8.2) diluted with 20 share 1% CaCl2. After 3 minutes of immersion, the capsules are washed twice in 1% CaC^.

Kapslene overføres deretter til en 32 ml løsning som omfatter 0,005 vekt/vol.% polylysin (gjennomsnittlig MV 43 000 daltons) i fysiologisk saltvann. Etter 3 minutter dekanteres polylysinløsningen. De resulterende kapsler, som har The capsules are then transferred to a 32 mL solution comprising 0.005% w/v polylysine (average MW 43,000 daltons) in physiological saline. After 3 minutes, the polylysine solution is decanted. The resulting capsules, which have

"permanente" semipermeable membraner, vaskes deretter to gan- "permanent" semipermeable membranes, then washed twice

ger med 1 % CaCl2f to ganger med fysiologisk saltvann og ger with 1% CaCl2f twice with physiological saline and

blandes med lO ml av 0,03 % alginatløsning. mixed with 10 ml of 0.03% alginate solution.

Kapslene motstår klumpdannelse, og alle kan sees å inne- The capsules resist clumping and all can be seen to contain

holde fibroblaster. Gel på det innvendige av kapslene gjøres flytende igjen ved at kapslene neddyppes i en blanding av salt- keep fibroblasts. Gel on the inside of the capsules is re-liquefied by immersing the capsules in a mixture of salt-

vann og citratpuffer (pH=7,4) i 5 minutter. Alle de foran om- water and citrate buffer (pH=7.4) for 5 minutes. All those in front of-

talte prosesser utføres ved 22-37°C. said processes are carried out at 22-37°C.

Under mikroskopet observeres disse kapsler å omfatte en Under the microscope, these capsules are observed to include a

meget tynn membran som omhyller celler. Molekyler med molekyl- very thin membrane that surrounds cells. Molecules with molecular

vekt opp til ca. 100 O00 kan gå gjennom membranene. weight up to approx. 100 O00 can pass through the membranes.

De resulterende kapsler suspenderes i CMLR-1969 supplert md The resulting capsules are suspended in CMLR-1969 supplemented md

10 % føtalt kalveserum. Etter inkubering ved 37°C i 4-5 da- 10% fetal calf serum. After incubation at 37°C for 4-5 days-

ger vil kapslene, hvis de undersøkes under mikroskopet, finnes å inneholde fibroblaster som har gjennomgått mitose og viser en klassisk fibroblastisk morfologi i mikrokapslene. therefore, the capsules, if examined under the microscope, will be found to contain fibroblasts that have undergone mitosis and show a classic fibroblastic morphology in the microcapsules.

Kapselmembranene kan oppbrytes uten skade på cellene ved The capsule membranes can be broken up without damage to the cells by

å tillate en 10 ml porsjon av mikrokapselsuspensjonen som inneholder ca. 500-1000 kapsler pr. ml å sette seg. Etter aspire- to allow a 10 ml portion of the microcapsule suspension containing approx. 500-1000 capsules per ml to sit down. After aspirating

ring av mediet vaskes kapslene to ganger med saltvann. De vas- ring off the medium, wash the capsules twice with salt water. They were

kede kapsler blandes deretter med en 3,0 ml alikvot som innehol- boiled capsules are then mixed with a 3.0 ml aliquot containing

der 1000 enheter/ml heparin og 1,1 vekt/vol.% CaCl2• Suspen- where 1000 units/ml heparin and 1.1 wt/vol.% CaCl2• Suspen-

sjonen agiteres ved 37°C i 3 minutter, hvoretter kapslene til- The solution is agitated at 37°C for 3 minutes, after which the capsules add

lates å sette seg, supernatanten aspireres fra, og kapslene vaskes to ganger med 3,0 ml av 0,1M NaCl. Etter aspirering av den annen vaskeløsning blandes, kapslene med 2,0 av en blandet løsning som omfatter like volumdeler av 110 mM natriumcitrat og 0,15M NaCl (pH=7,4). Blandingen håndsentrifugeres i 1 mi- allowed to settle, the supernatant aspirated, and the capsules washed twice with 3.0 ml of 0.1 M NaCl. After aspiration of the second washing solution, the capsules are mixed with 2.0 of a mixed solution comprising equal parts by volume of 110 mM sodium citrate and 0.15 M NaCl (pH=7.4). The mixture is hand centrifuged for 1 mi-

nutt for å indusere oppløsning av membranene hvoretter cellene vaskes to ganger i medium. nutt to induce dissolution of the membranes after which the cells are washed twice in medium.

Fibroblastene utsettes for en INF-3-superinduksjons- The fibroblasts are exposed to an INF-3 superinduction

teknikk etter Vilceks metode. Under en 5 % C02 atmosfære technique according to Vilcek's method. Under a 5% C02 atmosphere

(95 % luft) inkuberes cellesuspensjonen ved 37°C i 1 time i (95% air) the cell suspension is incubated at 37°C for 1 hour in

nærvær av 100 Mg/ml Poly I-Poly C, en dobbeltstrenget RNA presence of 100 Mg/ml Poly I-Poly C, a double-stranded RNA

(kjent INF-induktor) og 50 pg/ml cykloheksimid (proteinsyntese-inhibitor). Etter 1 time vaskes de suspenderte celler i medium (CMLR-1969) som inneholder 50 jjg/ml cykloheksim<i>d og resuspenderes deretter i den samme løsning i 3 timer ved 37°C under en 5 % C02-atmosfære. Ved fullførelsen (known INF inducer) and 50 pg/ml cycloheximide (protein synthesis inhibitor). After 1 hour, the suspended cells are washed in medium (CMLR-1969) containing 50 µg/ml cyclohexim<i>d and then resuspended in the same solution for 3 hours at 37°C under a 5% CO 2 atmosphere. Upon completion

av denne inkubasjon gjentas vasketrinnet,og cellene resuspenderes i medium som inneholder 50 Mg/ml cykloheksimid og 5 ug/ ml actimomycin D (en kjent RNA-synteseinhibitor) of this incubation, the washing step is repeated, and the cells are resuspended in medium containing 50 Mg/ml cycloheximide and 5 ug/ml actimomycin D (a known RNA synthesis inhibitor)

og inkuberes i 2 timer ved 3 7°C under en 5 % CO2 atmosfære. Cellene vaskes så to ganger i medium og suspenderes i serum-fritt medium ved 37°C i 18-24 timer, i hvilket tidsrom fibroblastene utskiller INF-Ø, som har molekylvekt av størrelsesorden 21 000 daltons og kan innhøstes fra det ekstrakapsulære medium. and incubated for 2 hours at 37°C under a 5% CO2 atmosphere. The cells are then washed twice in medium and suspended in serum-free medium at 37°C for 18-24 hours, during which time the fibroblasts secrete INF-Ø, which has a molecular weight of the order of 21,000 daltons and can be harvested from the extracapsular medium.

I ett eksperiment utført med Poly I-Poly C(5S) (sedimen-tas jonsverdi , Poly I og Poly 'C varmebehandlet for dannelse av dobbeltstrenget RNA) ble 2500 enheter av INF-0 produsert pr-10^ celler i kulturen. Et identisk utbytte ble oppnådd i et neste forsøk under anvendelse av Poly I-Poly C(12S) (innkjøpt dobbeltstrenget) . In one experiment performed with Poly I-Poly C(5S) (sediment ion value, Poly I and Poly 'C heat-treated to form double-stranded RNA) 2500 units of INF-0 were produced per -10^ cells in the culture. An identical yield was obtained in a next experiment using Poly I-Poly C(12S) (purchased double stranded).

Claims

1. Method for culturing anchorage-dependent cells, characterized by the following steps: A. suspending cells in a medium containing an anchorage substrate material and high molecular weight components necessary to maintain viability and to support mitosis of the cells; B. encapsulating the cells together with the medium and the anchoring substrate material in a semipermeable membrane having an upper permeability limit sufficient to allow low molecular weight molecules to diffuse through the membrane; C. suspending the product of step B in a culture medium sufficient to maintain viability and support mitosis of the encapsulated cells; and D. to allow the cells to undergo mitosis inside the membrane.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that in step A an anchoring substrate which is a protein is used.

3. Method as stated in claim 1, characterized in that collagen is used as anchoring substrate.

4. Method as stated in claim 1, characterized in that calf skin collagen is used as the anchoring substrate and is included in the suspension at a concentration between 10 pg/ml and 1.0 mg/ml.

5. Method as stated in claim 1, characterized by the further step of selectively breaking up the membranes after step D to release the cells.

6. Method as stated in claim 1, characterized in that cells comprising fibroblasts are suspended.

7. Method as stated in claim 1, characterized in that a medium is used which contains serum components as components with a high molecular weight.

8. Method as stated in claim 1, characterized in that cells comprising human fibroblasts with the ability to secrete interferon are suspended.

9. Method as stated in claim 1, characterized in that in the encapsulation step spheroidal membranes are produced which have an average diameter in the range of 100-500 µm.

10. Method as stated in claim 1, characterized in that an anchoring substrate is used which comprises a protein with several free cationic groups.